JP7310055B1 - 細胞含有液用保存液及び細胞含有液用保存容器 - Google Patents

Abstract

細胞含有液と保存液との混合液を冷蔵保存した場合に、細胞外へのゲノムＤＮＡの漏出を抑えることができる細胞含有液用保存液を提供する。本発明に係る細胞含有液用保存液は、ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）と、無機塩、有機酸又は有機塩である化合物（Ｂ）とを含み、電気伝導率が、３ｍｓ／ｃｍ以上２０ｍｓ／ｃｍ以下である。

Description

本発明は、細胞含有液を保存するために用いられる保存液に関する。また、本発明は、上記保存液を備える細胞含有液用保存容器に関する。

血液、血漿、血清及び尿等の体液には、遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡ，ｃｆＤＮＡ）が含まれる。悪性腫瘍を有する人及び感染症に罹患した人などの体液中には、健常者と比べて、ｃｆＤＮＡが高濃度で存在することが知られている。

近年、がん及び遺伝子疾患等の領域において、ｃｆＤＮＡを検体とする検査等が行われている。ｃｆＤＮＡを検体とする検査は、患者から病変組織を採取して行う検査と比べて、患者への負担が小さい。

また、母体血中には胎児由来の遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ，ｃｆｆＤＮＡ）が含まれる。出生前遺伝学的検査では、ｃｆｆＤＮＡを検体とする検査が行われている。

ｃｆＤＮＡを検体とする検査は、ｑＰＣＲ装置や次世代シーケンサー（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，ＮＧＳ）等の専用の装置を有する専門機関でなければ実施することが困難である。このため、病院等で採取された血液等の細胞含有液は、専門機関に輸送される必要があり、細胞含有液の採取から分析までに、ある程度の日数を要する。この間、上記細胞含有液は、所定の容器で保存されている。

下記の特許文献１，２には、全血中に存在する細胞、特に白血球を安定化させることによって、ｃｆＤＮＡを安定的に回収する方法が記載されている。

また、下記の特許文献３には、血清を含まず、凍結保護物質としてヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシエチルメチルセルロースからなる群より選択された少なくとも一種の水溶性セルロース系凍結保護物質を含有する動物細胞のガラス化凍結保存液が開示されている。特許文献３には、上記ガラス化凍結保存液が、特定の細胞膜透過性凍結保護物質又は特定の細胞膜非透過性凍結保護物質を含むことが好ましいことが記載されている。

ＷＯ２０１３／１２３０３０Ａ１ ＣＮ１０７０８３３８２Ａ 特開２０１１－１１１４０６号公報

血液等の細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡを検体とする検査が行われている。血液等の細胞含有液は、保存液が収容された保存容器に採取された後、ｑＰＣＲ装置や次世代シーケンサーを有する専門機関に輸送される。専門機関までの輸送は、凍結環境下で行われることもあるが、輸送コストを抑える観点及び輸送中のトラブルを抑える観点から、冷蔵環境下で行われることが望ましい。

しかしながら、特許文献１～３に記載のような従来の方法では、細胞含有液が冷蔵環境下で保存された場合に、細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が漏出することがある。例えば、従来の保存液が収容された保存容器では、細胞含有液が冷蔵環境下で保存された場合に、該細胞含有液に含まれる細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞からゲノムＤＮＡが漏出することがある。

ｃｆＤＮＡを検体とする検査では、ゲノムＤＮＡが細胞外へ漏出すると、検査結果に大きな影響を与える。

本発明の目的は、細胞含有液と保存液との混合液を冷蔵保存した場合に、細胞外へのゲノムＤＮＡの漏出を抑えることができる細胞含有液用保存液を提供することである。また、本発明は、上記細胞含有液用保存液を備える細胞含有液用保存容器を提供することも目的とする。

本発明の広い局面によれば、ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）と、無機塩、有機酸又は有機塩である化合物（Ｂ）とを含み、電気伝導率が、３ｍｓ／ｃｍ以上２０ｍｓ／ｃｍ以下である、細胞含有液用保存液（以下、「保存液」と略記することがある）が提供される。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記保存液が、分子量が１００以下でありかつ０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物（Ｃ）を含む。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記細胞膜透過性化合物（Ｃ）が、多価アルコールである。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記細胞膜透過性化合物（Ｃ）が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、１，３－プロパンジオール、又はブチレングリコールである。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記保存液が、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物（Ｄ）を含む。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の分子量が１０００以上である。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）が、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、多糖類、多糖類の誘導体、糖アルコール、又はフィコールである。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）が、ＤＭＤＭヒダントイン、又は１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントインである。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記化合物（Ｂ）が、クエン酸、クエン酸塩、又は塩化ナトリウムである。

本発明の保存液のある特定の局面では、前記細胞含有液が、血液である。

本発明の広い局面によれば、所定量の細胞含有液が採取される細胞含有液用保存容器であって、容器本体と、前記容器本体内に収容された保存液とを備え、前記保存液が、上述した細胞含有液用保存液である、細胞含有液用保存容器が提供される。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記細胞含有液用保存容器が、以下の構成Ｐを備える。

構成Ｐ：生理食塩水１Ｌに対して次亜塩素酸ナトリウム７．４ｇが混合された溶液Ｐａを得て、細胞含有液用保存容器に採取される細胞含有液の所定量と等量の前記溶液Ｐａを細胞含有液用保存容器に採取して、該溶液Ｐａと前記保存液とを混合した混合液Ｐを得たときに、前記混合液Ｐにおいて、ホルムアルデヒドの含有量が、１００ｍｇ／Ｌ以上４００ｍｇ／Ｌ以下である。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記細胞含有液用保存容器が、以下の構成Ｑを備える。

構成Ｑ：細胞含有液用保存容器に採取される細胞含有液の所定量と等量の生理食塩水を細胞含有液用保存容器に採取して、該生理食塩水と前記保存液とを混合した混合液Ｑを得たときに、前記混合液Ｑの浸透圧が、３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上１１００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記保存液が、分子量が１００以下でありかつ０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物（Ｃ）を含み、前記細胞含有液用保存容器が、以下の構成Ｒを備える。

構成Ｒ：前記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と前記保存液とを混合した混合液Ｒを得たときに、前記混合液Ｒにおいて、前記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量が、１ｖｏｌ％以上５ｖｏｌ％以下である。

本発明の細胞含有液用保存容器のある特定の局面では、前記保存液が、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物（Ｄ）を含み、前記細胞含有液用保存容器が、以下の構成Ｓを備える。

構成Ｓ：前記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と前記保存液とを混合した混合液Ｓを得たときに、前記混合液Ｓにおいて、前記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量が、０．５μｍｏｌ／Ｌ以上５μｍｏｌ／Ｌ以下である。

本発明に係る細胞含有液用保存液は、ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）と、無機塩、有機酸又は有機塩である化合物（Ｂ）とを含み、電気伝導率が、３ｍｓ／ｃｍ以上２０ｍｓ／ｃｍ以下である。本発明に係る細胞含有液用保存液では、上記の構成が備えられているので、細胞含有液と保存液との混合液を冷蔵保存した場合に、細胞外へのゲノムＤＮＡの漏出を抑えることができる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明に係る細胞含有液用保存液（以下、「保存液」と略記することがある）は、ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）と、無機塩、有機酸又は有機塩である化合物（Ｂ）とを含み、電気伝導率が、３ｍｓ／ｃｍ以上２０ｍｓ／ｃｍ以下である。

本発明に係る保存液では、上記の構成が備えられているので、細胞含有液と保存液との混合液を冷蔵保存した場合に、細胞外へのゲノムＤＮＡの漏出を抑えることができる。本発明に係る保存液では、例えば、細胞含有液と保存液との混合液を４℃で保存した場合でも細胞外へのゲノムＤＮＡの漏出を抑えることができる。本発明では、冷蔵環境下での保存中に、上記細胞含有液に含まれる細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のゲノムＤＮＡが細胞含有液に混入することを効果的に抑えることができる。このため、本発明では、ｃｆＤＮＡの保存安定性を高めることができる。

上記細胞含有液は、細胞を含む液である。上記細胞含有液としては、体液等が挙げられ、具体的には、全血等の血液、尿及び髄液等が挙げられる。血液には、細胞として白血球等が含まれる。

本発明の効果がより一層効果的に発揮されることから、上記細胞含有液は、血液であることが好ましい。上記保存液は、血液用保存液であることが好ましい。上記細胞含有液が血液である場合に、本発明では、冷蔵保存中の溶血も効果的に抑えることができる。

（細胞含有液用保存液）
上記保存液は、２５℃で液状である。

本発明の効果を発揮する観点から、上記保存液の電気伝導率は、３ｍｓ／ｃｍ以上２０ｍｓ／ｃｍ以下である。

上記保存液の電気伝導率は、好ましくは３．５ｍｓ／ｃｍ以上、より好ましくは４ｍｓ／ｃｍ以上、更に好ましくは４．５ｍｓ／ｃｍ以上、好ましくは１８ｍｓ／ｃｍ以下、より好ましくは１４ｍｓ／ｃｍ以下、更に好ましくは１０ｍｓ／ｃｍ以下、特に好ましくは７ｍｓ／ｃｍ以下である。上記電気伝導率が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。また、上記電気伝導率が上記下限以上及び上記上限以下であると、上記細胞含有液が血液である場合に、溶血をより一層効果的に抑えることができる。

上記保存液の電気伝導率は、セル定数が０．９４９×０．１ｃｍ^－１のセルと、電気伝導率計とを用いて、２５．０℃にて測定される。具体的には、電極を保存液１５ｍＬに浸して、電気伝導率を測定することができる。上記電気伝導率計としては、例えば、ＨＯＲＩＢＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製「ＤＳ－７１」を用いることができる。

＜ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）＞
上記保存液は、ホルムアルデヒドドナー化合物（本明細書において、「ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）」と記載することがある）を含む。上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）は、ホルムアルデヒドを遊離可能な化合物である。上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）を用いることにより、細胞含有液と保存液とを混合したときに、ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）から遊離したホルムアルデヒドの作用により、細胞の膜タンパク質が架橋され、細胞の安定性を高めることができる。ホルムアルデヒドドナー化合物を含む従来の保存液では、冷蔵環境下での保存中に、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの断片長変化が生じやすい。これに対して、本発明では、保存液がホルムアルデヒドドナー化合物を含む場合でも、ｃｆＤＮＡの断片長変化を生じにくくすることができる。上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されていてもよい。

上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）としては、ヒダントイン化合物、イミダゾリジニルウレア、ジアゾリジニルウレア、ヘキサメチレンテトラミン、Ｎ，Ｎ’’－メチレンビス－［Ｎ’－（３－ヒドロキシメチル－２，５－ジアオキソ－４－イミダゾリジニル）ウレア］、３級アミン化合物、２級アミン化合物、及び１級アミン化合物等が挙げられる。

上記ヒダントイン化合物としては、ＤＭＤＭヒダントイン、１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントイン、１，３－ジメチロール－５，５－ヒダントイン、及び１，３－ジクロロ－５，５－ジメチルヒダントイン等が挙げられる。

本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）は、ヒダントイン化合物であることが好ましく、ＤＭＤＭヒダントイン、又は１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントインであることがより好ましい。

上記保存液中の上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）の含有量は、特に限定されない。上記保存液中の上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）の含有量は、例えば、後述の混合液Ｐにおいて、ホルムアルデヒドの含有量が後述の範囲を満足するように適宜変更することができる。上記保存液中の上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）の含有量は、上記細胞含有液と上記保存液との混合比、及びホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）の種類等に応じて適宜変更することができる。

上記保存液中の上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）の含有量は、好ましくは０．１ｗ／ｖ％以上、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％以上、更に好ましくは１ｗ／ｖ％以上、好ましくは５．０ｗ／ｖ％以下、より好ましくは４．５ｗ／ｖ％以下、更に好ましくは４．０ｗ／ｖ％以下である。上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）からホルムアルデヒドが良好に遊離し、その結果、細胞の安定性を高めることができ、かつ、ｃｆＤＮＡの分解を抑えることができる。

＜無機塩、有機酸又は有機塩である化合物（Ｂ）＞
上記保存液は、無機塩、有機酸又は有機塩である化合物（本明細書において、「化合物（Ｂ）」と記載することがある）を含む。上記化合物（Ｂ）を用いることにより、保存液のイオン強度を良好に調整することができ、保存液の電気伝導率を適切な範囲に調整することができる。上記化合物（Ｂ）は、無機塩であってもよく、有機酸であってもよく、有機塩であってもよく、これらの混合物であってもよい。上記化合物（Ｂ）は、無機塩、有機酸及び有機塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物である。上記化合物（Ｂ）は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

上記無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸塩、炭酸塩等、及びホウ酸塩が挙げられる。上記リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及びリン酸二カリウム等が挙げられる。上記炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム及び炭酸アンモニウム等が挙げられる。上記ホウ酸塩としては、ホウ酸ナトリウム等が挙げられる。上記無機塩は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

上記有機酸としては、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、アジピン酸、酒石酸、安息香酸、ピロリドンカルボン酸、及びサリチル酸等が挙げられる。上記有機酸は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

上記有機塩としては、クエン酸塩、コハク酸塩、及び酢酸塩等が挙げられる。上記クエン酸塩としては、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウム等が挙げられる。上記コハク酸塩としては、コハク酸二ナトリウム等が挙げられる。上記酢酸塩としては、酢酸カルシウム及び酢酸ナトリウム等が挙げられる。上記有機塩は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

上記化合物（Ｂ）の分子量は、５０以上であってもよく、１００以上であってもよく、４００以下であってもよく、３００以下であってもよい。上記無機塩である化合物（Ｂ）の分子量は、５０以上であってもよく、１００以上であってもよく、３００以下であってもよく、２００以下であってもよい。上記有機酸である化合物（Ｂ）の分子量は、５０以上であってもよく、１００以上であってもよく、２００以下であってもよく、１５０以下であってもよい。上記有機塩である化合物（Ｂ）の分子量は、５０以上であってもよく、１００以上であってもよく、４００以下であってもよく、２００以下であってもよい。

保存液の電気伝導率を容易に調整する観点からは、上記化合物（Ｂ）は、クエン酸、クエン酸塩、又は塩化ナトリウムであることが好ましい。また、ＤＮａｓｅはマグネシウムイオンによって活性化するため、上記化合物（Ｂ）がクエン酸又はクエン酸塩である場合には、細胞含有液中でのｃｆＤＮＡの分解を効果的に抑えることができる。さらに、上記化合物（Ｂ）がクエン酸又はクエン酸塩である場合には、上記細胞含有液が血液であるときに、抗凝固作用も発揮させることができる。

上記保存液中の上記化合物（Ｂ）の含有量は、保存液の電気伝導率が上述の範囲となる限り特に限定されない。

上記保存液中の上記化合物（Ｂ）の含有量は、好ましくは０．１ｗ／ｖ％以上、より好ましくは２ｗ／ｖ％以上、更に好ましくは３ｗ／ｖ％以上、好ましくは３０ｗ／ｖ％以下、より好ましくは２０ｗ／ｖ％以下、更に好ましくは１０ｗ／ｖ％以下である。上記化合物（Ｂ）の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、保存液の電気伝導率を好適な範囲に容易に調整することができる。

上記保存液は、分子量が１００以下でありかつ０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物（Ｃ）、又は、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物（Ｄ）を含むことが好ましい。上記保存液は、分子量が１００以下でありかつ０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物（Ｃ）と、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物（Ｄ）とを含むことがより好ましい。この場合には、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができ、また、細胞含有液に含まれるｃｆＤＮＡの保存安定性をより一層高めることができる。

ある化合物が、細胞膜透過性化合物であるか、又は、細胞膜非透過性化合物であるかは、通常、その化合物の分子量、電荷、極性等によって決まる。電荷を有しない化合物は、受動的な拡散により、細胞膜を透過可能であるため、通常、細胞膜透過性化合物に分類される。また、例えば、電荷を有する化合物は、受動的な拡散により、細胞膜を透過できないため、通常、細胞膜非透過性化合物に分類される。

＜分子量が１００以下でありかつ０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物（Ｃ）＞
上記保存液は、分子量が１００以下でありかつ０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物（本明細書において、「細胞膜透過性化合物（Ｃ）」と記載することがある）を含むことが好ましい。上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）は、細胞膜を透過可能な化合物である。上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）は、上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）とは異なり、上記化合物（Ｂ）とは異なる。上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）を用いることにより、細胞内を良好に脱水することができ、また、細胞内に上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）を良好に保持させることができる。そのため、保存中に、細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のゲノムＤＮＡが細胞含有液に混入することを効果的に抑えることができる。上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）は、細胞の凍結保護剤としても知られている。上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されていてもよい。

上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の分子量は１００以下である。上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の分子量は３０以上であってもよく、５０以上であってもよく、９５以下であってもよい。

上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）は、０℃で液状であることが好ましく、２５℃で液状であることが好ましい。

上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）としては、多価アルコール、ジメチルスルホキシド、及びアセトアミド等が挙げられる。上記多価アルコールとしては、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、１，３－プロパンジオール、及びブチレングリコール等が挙げられる。

上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）は、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、１，３－プロパンジオール、又はブチレングリコールであることが好ましく、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、又はジメチルスルホキシドであることがより好ましい。また、上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）は、多価アルコール又はジメチルスルホキシドであることが好ましく、多価アルコールであることがより好ましい。この場合には、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができ、また、ｃｆＤＮＡの保存安定性もより一層高めることができる。

上記保存液中の上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量は、特に限定されない。上記保存液中の上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量は、例えば、後述の混合液Ｒにおいて、上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量が後述の範囲を満足するように適宜変更することができる。上記保存液中の上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量は、上記細胞含有液と上記保存液との混合比等に応じて適宜変更することができる。

上記保存液中の上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量は、好ましくは２ｖｏｌ％以上、より好ましくは１０ｖｏｌ％以上、更に好ましくは２０ｖｏｌ％以上、好ましくは５０ｖｏｌ％以下、より好ましくは４０ｖｏｌ％以下、更に好ましくは３５ｖｏｌ％以下、特に好ましくは３０ｖｏｌ％以下である。上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞含有液と保存液との混合液（混合液Ｒ）中の細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量を後述の範囲に調整しやすくなり、その結果、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

＜分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物（Ｄ）＞
上記保存液は、分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物（本明細書において、「細胞膜非透過性化合物（Ｄ）」と記載することがある）を含むことが好ましい。上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）は、上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）とは異なり、上記化合物（Ｂ）とは異なる。上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）を用いることにより、細胞の凝集を効果的に抑えることができ、また、細胞膜の保護効果を高めることができる。そのため、保存中に、細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のゲノムＤＮＡが細胞含有液に混入することを効果的に抑えることができる。上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されていてもよい。

上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の分子量は３００以上である。上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の分子量は、該細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の構造式が特定できる場合には、当該構造式から算出できる分子量を意味し、構造式が特定できない場合には、重量平均分子量を意味する。

上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の分子量（重量平均分子量）は、好ましくは１０００以上、より好ましくは１万以上、更に好ましくは１０万以上、好ましくは４００万以下、より好ましくは１００万以下である。上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の分子量（重量平均分子量）が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

上記重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定されたポリスチレン換算での重量平均分子量を意味する。

上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）としては、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、多糖類、多糖類の誘導体、糖アルコール、及びフィコール等が挙げられる。上記多糖類としては、セルロース、及びデキストラン等が挙げられる。上記多糖類の誘導体としては、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）は、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、多糖類、多糖類の誘導体、糖アルコール、又はフィコールであることが好ましい。本発明の効果を更に一層効果的に発揮する観点からは、上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）は、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、又はヒドロキシプロピルセルロースであることがより好ましく、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、又はポリビニルアルコールであることが更に好ましい。

上記保存液中の上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量は、特に限定されない。上記保存液中の上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量は、例えば、後述の混合液Ｓにおいて、上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量が後述の範囲を満足するように適宜変更することができる。上記保存液中の上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量は、上記細胞含有液と上記保存液との混合比等に応じて適宜変更することができる。

上記保存液中の上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量は、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは５μｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは１００μｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは５０μｍｏｌ／Ｌ以下である。上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞含有液と保存液との混合液（混合液Ｓ）中の細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量を後述の範囲に調整しやすくなり、その結果、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

＜クエン酸及びクエン酸塩の双方とは異なりかつキレート作用を有する化合物（Ｅ）＞
上記保存液は、クエン酸及びクエン酸塩の双方とは異なりかつキレート作用を有する化合物（本明細書において、「キレート作用を有する化合物（Ｅ）」と記載することがある）を含むことが好ましい。上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）はクエン酸及びクエン酸塩の双方とは異なる。上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）は、ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）とは異なり、化合物（Ｂ）とは異なり、細胞膜透過性化合物（Ｃ）とは異なり、細胞膜非透過性化合物（Ｄ）とは異なる。ＤＮａｓｅはマグネシウムイオンによって活性化するため、上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）を用いることにより、細胞含有液中でのｃｆＤＮＡの分解を効果的に抑えることができる。上記細胞含有液が血液である場合、上記保存液は上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）として、抗凝固剤（クエン酸及びクエン酸塩の双方とは異なる抗凝固剤）を含むことが好ましい。この場合には、ｃｆＤＮＡの分解を効果的に抑えることに加えて、保存中の血液の凝固を効果的に抑えることができる。上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されていてもよい。

上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及びグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等が挙げられる。

ｃｆＤＮＡの分解をより一層効果的に抑える観点及び上記細胞含有液が血液である場合に、保存中の血液の凝固をより一層効果的に抑える観点からは、上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）は、ＥＤＴＡを含むことが好ましく、ＥＤＴＡであることが好ましい。

上記保存液中の上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）の含有量は、上記細胞含有液と上記保存液との混合比、及びキレート作用を有する化合物（Ｅ）の種類等に応じて適宜変更することができる。

＜単糖類又は二糖類＞
上記保存液は、単糖類又は二糖類を含むことが好ましい。上記単糖類又は二糖類は、ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）とは異なり、化合物（Ｂ）とは異なり、細胞膜透過性化合物（Ｃ）とは異なり、細胞膜非透過性化合物（Ｄ）とは異なり、キレート作用を有する化合物（Ｅ）とは異なる。上記単糖類又は二糖類を用いることにより、細胞含有液と保存液とを混合した液の浸透圧を効果的に高くすることができ、また、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。上記保存液は、単糖類を含んでいてもよく、二糖類を含んでいてもよく、単糖類と二糖類とを含んでいてもよい。

上記単糖類としては、グルコース、フルクトース、及びガラクトース等が挙げられる。上記単糖類は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

上記二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、及びトレハロース等が挙げられる。上記二糖類は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記単糖類又は二糖類は、グルコース又はスクロースであることが好ましく、グルコースであることがより好ましい。

上記保存液中の上記単糖類又は二糖類の含有量は、特に限定されない。上記保存液中の上記単糖類又は二糖類の含有量は、例えば、後述の保存液又は混合液Ｑの浸透圧が後述の範囲を満足するように適宜変更することができる。

＜他の成分＞
上記保存液は、上述した成分以外の他の成分を含んでいてもよい。上記他の成分としては、アミノ酸、水、ｐＨ調整剤等が挙げられる。上記他の成分は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

上記保存液は、水を含むことが好ましい。上記保存液１００重量％中、水の含有量は、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは４０重量％以上、好ましくは８０重量％以下、より好ましくは７０重量％以上、更に好ましくは６０重量％以下である。

＜保存液の他の詳細＞
上記保存液の浸透圧は、好ましくは３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上、より好ましくは６００ｍＯｓｍ／Ｌ以上、好ましくは４０００ｍＯｓｍ／Ｌ以下、より好ましくは３０００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。上記保存液の浸透圧が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

上記保存液の浸透圧は、浸透圧計（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製「オズモメーター３２５０」）を用いて測定することができる。

上記保存液のｐＨは、好ましくは５．０以上、より好ましくは６．０以上、好ましくは８．０以下、より好ましくは７．５以下である。上記ｐＨが上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

（細胞含有液用保存容器）
本発明に係る細胞含有液用保存容器（以下、「保存容器」と略記することがある）は、所定量の細胞含有液が採取される保存容器である。本発明に係る保存容器は、細胞含有液を保存するための容器である。本発明に係る保存容器は、容器本体と、上記容器本体内に収容された保存液とを備える。本発明に係る保存容器では、上記保存液が、上述した保存液である。本発明に係る保存容器は、所定量の細胞含有液が採取され、該細胞含有液と保存液との混合液を保存するための容器である。本発明に係る保存容器は、採取された細胞含有液と上記保存液とが混合された混合液を保存するために用いられる。本発明に係る保存容器は、上記混合液を冷蔵保存するために用いられることが好ましい。

上記保存容器は、以下の構成Ｐを備えることが好ましい。

構成Ｐ：生理食塩水１Ｌに対して次亜塩素酸ナトリウム７．４ｇが混合された溶液Ｐａを得る。細胞含有液用保存容器に採取される細胞含有液の所定量と等量の上記溶液Ｐａを細胞含有液用保存容器に採取して、該溶液Ｐａと上記保存液とを混合した混合液Ｐを得たときに、上記混合液Ｐにおいて、ホルムアルデヒドの含有量が、１００ｍｇ／Ｌ以上４００ｍｇ／Ｌ以下である。

なお、上記溶液Ｐａは、細胞含有液を模擬した溶液である。上記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）からホルムアルデヒドが遊離することにより、上記混合液Ｐは、ホルムアルデヒドを含む。

上記混合液Ｐは、具体的には、以下のようにして調製される。

上記保存容器に採取される細胞含有液の所定量と等量の上記溶液Ｐａを、該保存容器に採取する。例えば、５ｍＬの血液が採取される保存容器では、５ｍＬの溶液Ｐａを該保存容器に採取する。採取した上記所定量の溶液Ｐａと、上記保存液とを転倒混和により混合して、混合液Ｐを得る。

上記混合液Ｐにおいて、ホルムアルデヒドの含有量は、好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１５０ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは４００ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３００ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは２００ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは１９０ｍｇ／Ｌ以下である。上記混合液Ｐにおける上記ホルムアルデヒドの含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞含有液と保存液との混合液中でのホルムアルデヒドの濃度を適切に制御することができる。そのため、細胞の安定性を高めることができ、かつ、本発明の効果がより一層効果的に発揮され、また、ｃｆＤＮＡの分解を抑えることができる。なお、上記混合液Ｐ中のホルムアルデヒドの含有量が４００ｍｇ／Ｌを超えると、４００ｍｇ／Ｌ以下である場合と比べて、ｃｆＤＮＡ同士又はｃｆＤＮＡと膜タンパク質とが架橋されやすく、ｃｆＤＮＡの保存安定性が低下することがある。

上記混合液Ｐ中の上記ホルムアルデヒドの含有量は、ＭＢＴＨ比色法によって求められる。

上記保存容器は、以下の構成Ｑを備えることが好ましい。

構成Ｑ：細胞含有液用保存容器に採取される細胞含有液の所定量と等量の生理食塩水を細胞含有液用保存容器に採取して、該生理食塩水と上記保存液とを混合した混合液Ｑを得たときに、上記混合液Ｑの浸透圧が、３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上１１００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。

上記混合液Ｑは、具体的には、以下のようにして調製される。

上記保存容器に採取される細胞含有液の所定量と等量の上記生理食塩水を、該保存容器に採取する。例えば、５ｍＬの血液が採取される保存容器では、５ｍＬの生理食塩水を該保存容器に採取する。採取した上記所定量の生理食塩水と、上記保存液とを転倒混和により混合して、混合液Ｑを得る。

上記混合液Ｑの浸透圧は、好ましくは３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上、より好ましくは３５０ｍＯｓｍ／Ｌ以上、好ましくは１１００ｍＯｓｍ／Ｌ以下、より好ましくは１０００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。上記混合液Ｑの浸透圧が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞含有液と保存液との混合液中での浸透圧を良好にすることができる。そのため、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

上記混合液Ｑの浸透圧は、浸透圧計（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製「オズモメーター３２５０」）を用いて測定することができる。

上記保存液が上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）を含む場合に、上記保存容器は、以下の構成Ｒを備えることが好ましい。

構成Ｒ：上記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と上記保存液とを混合した混合液Ｒを得たときに、上記混合液Ｒにおいて、上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量が、１ｖｏｌ％以上５ｖｏｌ％以下である。

上記混合液Ｒは、具体的には、以下のようにして調製される。

上記保存容器に採取される所定量の細胞含有液を、該保存容器に採取する。例えば、５ｍＬの血液が採取される保存容器では、５ｍＬの血液を該保存容器に採取する。採取した上記所定量の細胞含有液と、上記保存液とを転倒混和により混合して、混合液Ｒを得る。

上記混合液Ｒにおいて、上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量は、好ましくは１ｖｏｌ％以上、より好ましくは２ｖｏｌ％以上、好ましくは５ｖｏｌ％以下、より好ましくは４ｖｏｌ％以下である。すなわち、上記混合液Ｒにおいて、上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量は、好ましくは１体積％以上、より好ましくは２体積％以上、好ましくは５体積％以下、より好ましくは４体積％以下である。上記混合液Ｒにおける上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞内をより一層良好に脱水することができ、また、細胞内に上記細胞膜透過性化合物（Ｃ）をより一層良好に保持させることができる。そのため、保存中に、細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のゲノムＤＮＡが細胞含有液に混入することをより一層効果的に抑えることができる。

上記保存液が上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）を含む場合に、上記保存容器は、以下の構成Ｓを備えることが好ましい。

構成Ｓ：上記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と上記保存液とを混合した混合液Ｓを得たときに、上記混合液Ｓにおいて、上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量が、０．５μｍｏｌ／Ｌ以上５μｍｏｌ／Ｌ以下である。

上記混合液Ｓは、具体的には、以下のようにして調製される。

上記保存容器に採取される所定量の細胞含有液を、該保存容器に採取する。例えば、５ｍＬの血液が採取される保存容器では、５ｍＬの血液を該保存容器に採取する。採取した上記所定量の細胞含有液と、上記保存液とを転倒混和により混合して、混合液Ｓを得る。なお、上記混合液Ｒと上記混合液Ｓとは同じ液である。

上記混合液Ｓにおいて、上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量は、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは５μｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは４μｍｏｌ／Ｌ以下である。上記混合液Ｓにおける上記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞の凝集をより一層効果的に抑えることができ、また、細胞膜の保護効果をより一層高めることができる。そのため、保存中に、細胞が破壊されたり、死滅したりして、該細胞中のゲノムＤＮＡが細胞含有液に混入することをより一層効果的に抑えることができる。

上記保存液が上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）を含む場合に、上記保存容器は、以下の構成Ｔを備えることが好ましい。

構成Ｔ：上記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と上記保存液とを混合した混合液Ｔを得たときに、上記混合液Ｔにおいて上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）の含有量が、０．０３ｗ／ｖ％以上０．５ｗ／ｖ％以下である。

上記混合液Ｔは、具体的には、以下のようにして調製される。

上記保存容器に採取される所定量の細胞含有液を、該保存容器に採取する。例えば、５ｍＬの血液が採取される保存容器では、５ｍＬの血液を該保存容器に採取する。採取した上記所定量の細胞含有液と、上記保存液とを転倒混和により混合して、混合液Ｔを得る。なお、上記混合液Ｒと上記混合液Ｓと上記混合液Ｔとは同じ液である。

上記混合液Ｔにおいて、上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）の含有量は、好ましくは０．０４ｗ／ｖ％以上、より好ましくは０．０６ｗ／ｖ％以上、好ましくは０．４０ｗ／ｖ％以下、より好ましくは０．３０ｗ／ｖ％以下である。上記混合液Ｔにおける上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、ｃｆＤＮＡの分解をより一層効果的に抑えることができる。また、上記キレート作用を有する化合物（Ｅ）の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、上記細胞含有液が血液である場合に、血液の保存中の凝固をより一層効果的に抑えることができる。

＜容器本体＞
上記容器本体の形状としては、特に限定されない。上記容器本体の形状は、有底の容器であることが好ましく、有底の管状容器であることがより好ましい。

上記容器本体の素材は特に限定されない。上記容器本体の素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル等の熱可塑性樹脂；不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ－アクリレート樹脂等の熱硬化性樹脂；酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、エチルセルロース、エチルキチン等の変性天然樹脂；ソーダ石灰ガラス、リンケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のケイ酸塩ガラス、石英ガラス等のガラスが挙げられる。上記容器本体の素材は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

＜栓体＞
上記保存容器は、栓体を備えることが好ましい。上記栓体として、従来公知の栓体を用いることができる。上記栓体は、容器本体の開口に、気密的かつ液密的に取付けることが可能な素材、形状からなる栓体であることが好ましい。上記細胞含有液が血液である場合には、上記栓体は、採血針が刺通され得るように構成されていることが好ましい。

上記栓体としては、容器本体の開口に嵌合する形状を有する栓体、シート状のシール栓体等が挙げられる。

また、上記栓体は、ゴム栓等の栓本体と、プラスチック等で構成されたキャップ部材とを備える栓体であってもよい。この場合には、血液の採取後に、容器本体の開口から栓体を引き抜く際に、血液が人体と接触するリスクを抑えることができる。

上記栓体（又は上記栓本体）の材料としては、例えば、合成樹脂、エラストマー、ゴム、金属箔等が挙げられる。上記ゴムとしては、ブチルゴム、及びハロゲン化ブチルゴム等が挙げられる。上記金属箔としては、アルミニウム箔等が挙げられる。密封性を高める観点からは、上記栓体の材料は、ブチルゴムであることが好ましい。上記栓体は、ブチルゴム栓であることが好ましい。

（保存容器及び保存液の他の詳細）
上記保存容器には、所定量の細胞含有液が採取される。上記保存容器は、所定量の細胞含有液を採取及び保存するための容器である。上記保存容器は、上記細胞含有液と上記保存液とが混合された状態で保存するための容器である。上記保存容器に採取される上記細胞含有液の上記所定量は、該保存容器のサイズ等により適宜変更される。上記保存容器に採取される上記細胞含有液の上記所定量としては、例えば、１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、又は２０ｍＬである。上記保存容器に採取される上記細胞含有液の上記所定量は、０．５ｍＬ以上であってもよく、１ｍＬ以上であってもよく、５ｍＬ以上であってもよく、２５ｍＬ以下であってもよく、２０ｍＬ以下であってもよく、１５ｍＬ以下であってもよい。

上記保存容器は、上記細胞含有液を液状で保存するための容器であることが好ましく、上記細胞含有液を凍結せずに保存するための容器であることが好ましい。上記保存容器は、上記細胞含有液を、０℃以上で保存するための容器であることが好ましく、１℃以上で保存するための容器であることがより好ましく、４０℃以下で保存するための容器であることが好ましく、２５℃以下で保存するための容器であることがより好ましく、１０℃以下で保存するための容器であることが更に好ましい。

上記保存液は、上記細胞含有液を、０℃以上で保存するために用いられることが好ましく、１℃以上で保存するために用いられることがより好ましく、４０℃以下で保存するために用いられることが好ましく、２５℃以下で保存するために用いられることがより好ましく、１０℃以下で保存するために用いられることが更に好ましい。

採取される細胞含有液１ｍＬに対して、上記容器本体内に収容される保存液の量は、好ましくは０．０５ｍＬ以上、より好ましくは０．１ｍＬ以上、好ましくは１ｍＬ以下、より好ましくは０．５ｍＬ以下である。上記保存液の量が上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞含有液が過度に希釈されることなく、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

上記保存液は、採取される細胞含有液１ｍＬに対して、０．０５ｍＬ以上で混合して用いられることが好ましく、０．１ｍＬ以上で混合して用いられることがより好ましく、１ｍＬ以下で混合して用いられることが好ましく、０．５ｍＬ以下で混合して用いられることがより好ましい。この場合には、細胞含有液が過度に希釈されることなく、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。

上記保存容器の内圧は特に限定されない。上記保存容器の内圧は、減圧されていることが好ましい。上記保存容器が減圧容器である場合には、所定量の細胞含有液を簡便に保存容器に採取することができる。上記保存容器は、内部が排気された上で、上記栓体によって密閉された真空採血管として用いることもできる。真空採血管である場合、採血者の技術差によらず一定量の血液採取を簡便に行うことができる。

細菌感染を防止する観点から、保存容器の内部はＩＳＯ又はＪＩＳの基準に則って滅菌されていることが好ましい。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。

保存液の材料として、以下を用意した。

（ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ））
１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントイン
ＤＭＤＭヒダントイン
イミダゾリジニル尿素

（無機塩、有機酸又は有機塩である化合物（Ｂ））
クエン酸３Ｎａ・２Ｈ_２Ｏ（有機塩としてクエン酸３Ｎａを含む）
クエン酸・Ｈ_２Ｏ（有機酸としてクエン酸を含む）
塩化ナトリウム

（細胞膜透過性化合物（Ｃ））
プロピレングリコール
ジメチルスルホキシド

（細胞膜非透過性化合物（Ｄ））
ポリエチンレングリコール（重量平均分子量５０万）
デキストラン（重量平均分子量２０万）

（キレート作用を有する化合物（Ｅ））
ＥＤＴＡ（抗凝固剤）

（その他）
グルコース
グリシン
水

（実施例１～８及び比較例２，３）
保存液の作製：
水に対して、表１～３に示す配合成分を表１～３に示す配合量で配合し、保存液を得た。なお、化合物（Ｂ）の有機酸及び有機塩の配合量については、水和物の状態での配合量で示した。

保存容器の作製：
容器本体として、長さ１００ｍｍ、開口部の内径１４ｍｍのポリエチレンテレフタレート有底管（ＰＥＴ有底管）を用意した。ＰＥＴ有底管に、得られた保存液０．５ｍＬを収容した。保存容器内部を５０ｋＰａに減圧し、ブチルゴム栓により密封した。このようにして血液５ｍＬを採取及び保存するための保存容器を作製した。

（比較例１）
保存液の作製：
水に対して、表３に示す配合成分を表３に示す配合量で配合し、保存液を得た。

保存容器の作製：
容器本体として、長さ１００ｍｍ、開口部の内径１４ｍｍのポリエチレンテレフタレート有底管（ＰＥＴ有底管）を用意した。ＰＥＴ有底管に、得られた保存液０．０５ｍＬを収容した。保存容器内部を５０ｋＰａに減圧し、ブチルゴム栓により密封した。このようにして血液５ｍＬを採取及び保存するための保存容器を作製した。

（評価）
（１）保存液の電気伝導率
得られた保存液１５ｍＬに、電極を浸して、電気伝導率を測定した。なお、セル定数が０．９４９×０．１ｃｍ^－１のセルと、電気伝導率計（ＨＯＲＩＢＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製「ＤＳ－７１」）とを用いて、２５．０℃にて、保存液の電気伝導率を測定した。

（２）混合液Ｐ中のホルムアルデヒドの含有量
生理食塩水１Ｌに対して次亜塩素酸ナトリウム７．４ｇが混合された溶液Ｐａを作製した。得られた保存容器に、５ｍＬの溶液Ｐａを採取し、溶液Ｐａと保存液とを転倒混和により混合して、混合液Ｐを得た。得られた混合液Ｐ中のホルムアルデヒドの含有量（ｍｇ／Ｌ）をＭＢＴＨ比色法により求めた。

（３）混合液Ｑの浸透圧
得られた保存容器に、生理食塩水５ｍＬを採取し、生理食塩水と保存液とを転倒混和により混合して混合液Ｑを得た。得られた混合液Ｑの浸透圧を浸透圧計（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製「オズモメーター３２５０」）を用いて測定した。

（４）混合液Ｒ中の細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量
得られた保存容器に、血液５ｍＬを採取し、血液と保存液とを転倒混和により混合して混合液Ｒを得た。得られた混合液Ｒに含まれる細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量（ｖｏｌ％）を求めた。

（５）混合液Ｓ中の細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量
得られた保存容器に、血液５ｍＬを採取し、血液と保存液とを転倒混和により混合して混合液Ｓを得た。得られた混合液Ｓに含まれる細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量（μｍｏｌ／Ｌ）を求めた。

（６）保存安定性（４℃）
（６－１）溶血
得られた保存容器に、血液５ｍＬを採取し、血液と保存液とを転倒混和により混合した。次いで、上記混合液が収容された保存容器を４℃の環境下で保存した。保存から７日後に、上記混合液が収容された保存容器を遠心分離し、血漿を含む層（上方）と、細胞成分を含む層（下方）とに分離した。血漿を含む層を目視にて確認し、該血漿を含む層において溶血が生じているか否かを確認した。

＜溶血の判定基準＞
○：血漿を含む層において溶血が生じていない
×：血漿を含む層において溶血が生じている

（６－２）血漿中のＤＮＡ濃度（細胞外へのゲノムＤＮＡの漏出）
上記「（６－１）溶血」の試験を行った後、保存容器から血漿を含む層を回収した。ｃｆＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製「ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ」）を用いて、回収した血漿に含まれるＤＮＡを精製した。なお、ＤＮＡの精製操作は、保存容器から血漿を回収した日に実施した。

精製後の抽出液中のＤＮＡ濃度を、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて測定した。次いで、以下の式に従い、ＤＮＡ濃度（血漿１ｍＬあたりに含まれるＤＮＡの含量）を算出した。

ＤＮＡ濃度（ｎｇ／血漿１ｍＬ）＝［Ａ］×［Ｂ］／［Ｃ］

［Ａ］：精製後の抽出液中のＤＮＡ濃度の測定値（ｎｇ／ｍＬ）
［Ｂ］：精製後の抽出液の全用量（ｍＬ）
［Ｃ］：ＤＮＡ精製に使用した血漿の用量（ｍＬ）

上記ＤＮＡ濃度（ｎｇ／血漿１ｍＬ）が低いほど、細胞外へのゲノムＤＮＡの漏出が抑えられていることを意味する。

組成及び結果を下記の表１～３に示す。

Claims (16)

1. ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）と、
   無機塩、有機酸又は有機塩である化合物（Ｂ）と、
   分子量が１００以下でありかつ０℃で凍結しない細胞膜透過性化合物（Ｃ）と、
   分子量が３００以上である細胞膜非透過性化合物（Ｄ）と、
   水とを含み、
   前記細胞膜透過性化合物（Ｃ）が、多価アルコール、ジメチルスルホキシド、又はアセトアミドであり、
   前記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）が、ポリビニルピロリドン、ポリエチンレングリコール、ポリビニルアルコール、多糖類、多糖類の誘導体、糖アルコール、又はフィコールであり、
   細胞含有液用保存液中の前記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）の含有量が、０．１ｗ／ｖ％以上５．０ｗ／ｖ％以下であり、
   細胞含有液用保存液中の前記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量が、２ｖｏｌ％以上５０ｖｏｌ％以下であり、
   細胞含有液用保存液中の前記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量が、１μｍｏｌ／Ｌ以上１００μｍｏｌ／Ｌ以下であり、
   電気伝導率が、３ｍｓ／ｃｍ以上２０ｍｓ／ｃｍ以下である、細胞含有液用保存液。
2. 前記細胞膜透過性化合物（Ｃ）が、多価アルコールである、請求項１に記載の細胞含有液用保存液。
3. 前記細胞膜透過性化合物（Ｃ）が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド、アセトアミド、１，３－プロパンジオール、又はブチレングリコールである、請求項１に記載の細胞含有液用保存液。
4. 前記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の分子量が１０００以上である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存液。
5. 前記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）が、ＤＭＤＭヒダントイン、又は１－ヒドロキシメチル－５，５－ジメチルヒダントインである、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存液。
6. 前記化合物（Ｂ）が、クエン酸、クエン酸塩、又は塩化ナトリウムである、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存液。
7. 細胞含有液用保存液中の前記化合物（Ｂ）の含有量が、０．１ｗ／ｖ％以上３０ｗ／ｖ％以下である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存液。
8. 細胞含有液用保存液中の前記ホルムアルデヒドドナー化合物（Ａ）の含有量が、１ｗ／ｖ％以上５．０ｗ／ｖ％以下であり、
   細胞含有液用保存液中の前記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量が、２０ｖｏｌ％以上４０ｖｏｌ％以下であり、
   細胞含有液用保存液中の前記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量が、５μｍｏｌ／Ｌ以上５０μｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存液。
9. クエン酸及びクエン酸塩の双方とは異なりかつキレート作用を有する化合物（Ｅ）を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存液。
10. 単糖類又は二糖類を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存液。
11. 前記細胞含有液が、血液である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存液。
12. 所定量の細胞含有液が採取される細胞含有液用保存容器であって、
    容器本体と、
    前記容器本体内に収容された保存液とを備え、
    前記保存液が、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞含有液用保存液である、細胞含有液用保存容器。
13. 前記細胞含有液用保存容器が、以下の構成Ｐを備える、請求項１２に記載の細胞含有液用保存容器。
    構成Ｐ：生理食塩水１Ｌに対して次亜塩素酸ナトリウム７．４ｇが混合された溶液Ｐａを得て、細胞含有液用保存容器に採取される細胞含有液の所定量と等量の前記溶液Ｐａを細胞含有液用保存容器に採取して、該溶液Ｐａと前記保存液とを混合した混合液Ｐを得たときに、前記混合液Ｐにおいて、ホルムアルデヒドの含有量が、１００ｍｇ／Ｌ以上４００ｍｇ／Ｌ以下である。
14. 前記細胞含有液用保存容器が、以下の構成Ｑを備える、請求項１２に記載の細胞含有液用保存容器。
    構成Ｑ：細胞含有液用保存容器に採取される細胞含有液の所定量と等量の生理食塩水を細胞含有液用保存容器に採取して、該生理食塩水と前記保存液とを混合した混合液Ｑを得たときに、前記混合液Ｑの浸透圧が、３００ｍＯｓｍ／Ｌ以上１１００ｍＯｓｍ／Ｌ以下である。
15. 前記細胞含有液用保存容器が、以下の構成Ｒを備える、請求項１２に記載の細胞含有液用保存容器。
    構成Ｒ：前記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と前記保存液とを混合した混合液Ｒを得たときに、前記混合液Ｒにおいて、前記細胞膜透過性化合物（Ｃ）の含有量が、１ｖｏｌ％以上５ｖｏｌ％以下である。
16. 前記細胞含有液用保存容器が、以下の構成Ｓを備える、請求項１２に記載の細胞含有液用保存容器。
    構成Ｓ：前記所定量の細胞含有液を細胞含有液用保存容器に採取して、該細胞含有液と前記保存液とを混合した混合液Ｓを得たときに、前記混合液Ｓにおいて、前記細胞膜非透過性化合物（Ｄ）の含有量が、０．５μｍｏｌ／Ｌ以上５μｍｏｌ／Ｌ以下である。