CN116897920A - 一种临床级免疫细胞冻存液、其制备及其冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种临床级免疫细胞冻存液，包括如下组分：
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种临床级免疫细胞冻存液、其制备及其冻存方法。
背景技术
随着再生医学的发展，细胞治疗得到越来越多关注。免疫细胞作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。如T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润性T细胞(TIL)、树突状细胞(DC)、CAR-T、CAR-NK细胞等。细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使细胞代谢活动近乎停止，更重要的是可以保持细胞的特性不变。目前现有的免疫细胞冻存液具有多种配方。主要是由含胎牛血清的细胞基础培养基和二甲基亚砜制备的得到。但二甲基亚砜(DMSO)的作用是作为冷冻保护剂来保护细胞在冷冻和复苏的过程中免受损伤，在常温下对细胞有毒性作用。有文献报道，使用DMSO冻存的免疫细胞在复苏后，其活性和功能性杀伤活力有所退化。此外，细胞冻存液中一般要使用胎牛血清保护细胞膜，提高冻存复苏过程的细胞存活率。但是胎牛血清会增加动物病原污染的机率，这都会给细胞以后的使用增加不确定因素。
目前对于免疫细胞的冻存大多数使用经典冷冻方法，即使用胎牛血清、DMSO等将生物样本进行预处理，并以程序性降温做预处理，再转移至液氮中长期保存，这种方法对细胞损伤及毒性较大，影响细胞的后续应用。
因此，有必要对免疫细胞的冻存液进行改进，为临床的应用提高免疫细胞的安全性和有效性。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种临床级免疫细胞冻存液、其制备及其冻存方法，对免疫细胞的冻存液进行改进，为临床的应用提高免疫细胞的安全性和有效性。
为实现上述目的，本发明一方面提出一种临床级免疫细胞冻存液，包括如下组分：
优选地，所述人血白蛋白溶液为20％的人血白蛋白溶液。
本发明第二方面提供临床级免疫细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、按照无血清免疫细胞冻存液的配方的体积占比，取定量的海藻糖、右旋糖酐溶液装于储液瓶中，使用涡旋混匀仪充分混匀使海藻糖充分溶解；
步骤2、在储液瓶中加入定量的甘油，充分混匀后使用过滤器过滤除菌；
步骤3、过滤除菌后，在冻存液中加入定量的人血白蛋白溶液，充分混匀后放入4℃条件下保存。
本发明第三发面提供临床级免疫细胞的冻存方法，包括以下步骤：
步骤1、将培养得到的免疫细胞离心除去培养基成分；
步骤2、将除去培养基成份得到的免疫细胞加入平衡液中室温静置10分钟；
步骤3、离心、清洗免疫细胞后，将免疫细胞加入到预装有冻存液的冻存管中。
步骤4、静置3～5min后将冻存液迅速放入液氮内进行冻存。
优选地，在所述的步骤4中，在冻存过程中采取玻璃化冻存方法。
本发明公开的一种临床级免疫细胞冻存液、其制备及其冻存方法，可进行免疫细胞的长期冻存，冻存后细胞活力和表型无改变，对于免疫细胞有特异的保护作用；而且所述冻存液不含血清和培养基成份，不会引起溶血和凝血，冻存剂可供血液回输使用，可直接应用于临床。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如 所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
在本发明实施例中，本发明一方面提出一种临床级免疫细胞冻存液，包括如下组分：
进一步地，所述人血白蛋白溶液为20％的人血白蛋白溶液。
本发明经过大量的实验发现，采用渗透性冷冻保护剂甘油替代二甲基亚砜，甘油无色、无臭、外观呈澄明粘稠液态，对细胞无毒害作用，同时可以避免胞内、外产生冰晶损伤细胞；在冻存液中添加海藻糖，海藻糖是一种典型应激代谢物，能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征，同时，海藻糖还能用于保护生物体内DNA分子防止放射线引起的损伤，海藻糖与膜脂质共同拥有结合水或海藻糖本身起到代替膜结合水的功用，从而防止生物体膜和膜蛋白的变性等，增强了细胞水合作用和氢键形成，抑制冰晶形成，形成一种玻璃基质以减弱代谢活动，抑制冰晶对细胞体的损伤。
实施例1：:临床级免疫细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、按照无血清免疫细胞冻存液的配方的体积占比，取4mL的海藻糖、3mL右旋糖酐溶液装于储液瓶中，使用涡旋混匀仪充分混匀使海藻糖充分溶解；
步骤2、在储液瓶中加入5mL的甘油，充分混匀后使用过滤器过滤除菌；
步骤3、过滤除菌后，在冻存液中加入2mL的人血白蛋白溶液，充分混匀后放入4℃条件下保存。
实施例2：:临床级免疫细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、按照无血清免疫细胞冻存液的配方的体积占比，取5mL的海藻糖、4mL右旋糖酐溶液装于储液瓶中，使用涡旋混匀仪充分混匀使海藻糖充分溶解；
步骤2、在储液瓶中加入6mL的甘油，充分混匀后使用过滤器过滤除菌；
步骤3、过滤除菌后，在冻存液中加入3mL的人血白蛋白溶液，充分混匀后放入4℃条件下保存。
实施例3：:临床级免疫细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、按照无血清免疫细胞冻存液的配方的体积占比，取6mL的海藻糖、5mL右旋糖酐溶液装于储液瓶中，使用涡旋混匀仪充分混匀使海藻糖充分溶解；
步骤2、在储液瓶中加入7mL的甘油，充分混匀后使用过滤器过滤除菌；
步骤3、过滤除菌后，在冻存液中加入4mL的人血白蛋白溶液，充分混匀后放入4℃条件下保存。
本发明第三发面提供上述临床级免疫细胞的冻存方法，包括以下步骤：
步骤1、将培养得到的免疫细胞离心除去培养基成分；
步骤2、将除去培养基成份得到的免疫细胞加入平衡液中室温静置10分钟；
步骤3、离心、清洗免疫细胞后，将免疫细胞加入到预装有冻存液的冻存管中。
步骤4、静置3～5min后将冻存液迅速放入液氮内进行冻存；
进一步地，在所述的步骤4中，在冻存过程中采取玻璃化冻存方法，玻璃化冻存是将高浓度的冷冻保护液在低温或超低温下溶液由液相变为固相时，其内部的分子、离子分布不改变其原有的分布，不形成有规则外表的物质形态，可有效避免冰晶形成时对细胞内部骨架结构和亚细胞器膜的牵拉断裂和尖锐刺伤。经冻存后的免疫细胞存活率下降不明显，并且仍具有较好的杀伤活性，可在快速复苏后应用于临床等领域。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及 内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种临床级免疫细胞冻存液，其特征在于，一种临床级免疫细胞冻存液，包括如下组分：
2.根据权利要求1所述的一种临床级免疫细胞冻存液，其特征在于，所述人血白蛋白溶液为20％的人血白蛋白溶液。
3.一种临床级免疫细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、按照无血清免疫细胞冻存液的配方的体积占比，取定量的海藻糖、右旋糖酐溶液装于储液瓶中，使用涡旋混匀仪充分混匀使海藻糖充分溶解；
步骤2、在储液瓶中加入定量的甘油，充分混匀后使用过滤器过滤除菌；
步骤3、过滤除菌后，在冻存液中加入定量的人血白蛋白溶液，充分混匀后放入4℃条件下保存。
4.一种临床级免疫细胞冻存液的冻存方法，其特征在于，步骤1、将培养得到的免疫细胞离心除去培养基成分；
步骤2、将除去培养基成份得到的免疫细胞加入平衡液中室温静置10分钟；
步骤3、离心、清洗免疫细胞后，将免疫细胞加入到预装有冻存液的冻存管中。
步骤4、静置3～5min后将冻存液迅速放入液氮内进行冻存。
5.根据权利要求4所述的一种临床级免疫细胞冻存液的冻存方法，其特征在于：在所述的步骤4中，在冻存过程中采取玻璃化冻存方法。
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