ES2909392T3 - Procedimiento y composición para la estabilización de ácidos nucleicos libres de células y células - Google Patents
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Abstract
Uso de una composición como agente estabilizador de los ácidos nucleicos libres de células contenidos en una muestra biológica, caracterizado por que la composición en solución acuosa presenta al menos una sustancia tampón que tampona a un valor de pH de 7 o inferior, al menos un anticoagulante que preferiblemente es un agente quelante y urotropina, opcionalmente PEG.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento y composición para la estabilización de ácidos nucleicos libres de células y células
La presente invención se refiere a un procedimiento y al uso de una composición para estabilizar ácidos nucleicos libres de células, en particular ADN y/o ARN libres de células, así como adicionalmente para estabilizar células de muestras biológicas, en particular sangre completa o plasma u orina, así como al uso de la composición como agente estabilizador para ácidos nucleicos libres de células y células en una muestra biológica. La composición se puede añadir por mezcladura a una muestra libre de células o una muestra que contiene células, por ejemplo, a través de un tubo de extracción de sangre en el que se extrajo directamente sangre completa y en el que se dispone la composición, p. ej., hasta el 20% del volumen máximo de sangre para el cual está diseñado el tubo de extracción de sangre. Para la orina como muestra biológica, la composición puede colocarse en un recipiente de muestras o mezclarse con la muestra que contiene, prefiriéndose disponer o bien añadir por mezcladura la composición en una relación en volumen predeterminada con respecto a la muestra o bien para un volumen de muestra predeterminado.
El procedimiento y el uso de una composición tienen la ventaja de estabilizar los ácidos nucleicos libres de células contenidos en la muestra biológica, en particular para análisis posteriores, por ejemplo mediante hibridación, secuenciación o amplificación, opcionalmente con aislamiento previo, p. ej., mediante adsorción a un adsorbente de ácidos nucleicos y posterior elución. La estabilización de ácidos nucleicos libres de células es, en particular, el mantenimiento de la cantidad y la estructura de los ácidos nucleicos libres de células, lo que también se puede denominar como su integridad.
El uso de la composición y el procedimiento tiene preferiblemente también el efecto de estabilizar las células contenidas en la muestra, p. ej., frente a una lisis espontánea, de modo que, por un lado, en la muestra tomada los ácidos nucleicos contenidos en células no se liberan o bien lo hacen en medida reducida y no se mezclan con ácidos nucleicos libres de células en la muestra y, por otro lado, las células se pueden separar de la muestra para poder analizar las células esencialmente sin que se vean afectadas por la lisis y, p. ej., estén libres de ácidos nucleicos libres de células. En este caso, las células pueden ser las del donante de la muestra, es decir, células endógenas, p. ej., células epiteliales y/o células tumorales, y las células pueden ser células exógenas, p. ej., bacterias, hongos o bien levaduras o virus.
El análisis de células separadas de una mezcla de la composición con una muestra biológica puede incluir el análisis de proteínas intracelulares y/o de proteínas unidas a la superficie, p. ej., mediante análisis inmunológico. Preferentemente, la composición conduce a una estabilización de las proteínas unidas a la superficie de las células.
Estado de la Técnica
El documento WO 2013/123030 A2 describe para la estabilización de sangre completa para el posterior análisis de ADN libre de células la incorporación por mezcladura de un compuesto liberador de formaldehído, en particular diazolidinil urea o imidazolidinil urea, en combinación con un captador para eliminar el formaldehído libre, p. ej., de aminoácidos, en particular glicina, alquilaminas, poliaminas, en cada caso en unión con EDTA como anticoagulante.
Umetani et al., Clinical Chemistry 52:6, 1062-1069 (2006) describe para el análisis de la estabilidad de ADN libre de células en suero mediante amplificación por PCR cuantitativa de dos segmentos de secuencias repetidas ALU, de las cuales un segmento de 115 pb (ALU115) se encuentra dentro del otro segmento de 247 pb (ALU247). La relación de las cantidades de los amplicones constituye una medida de la calidad del ADN.
Un cociente de amplicones por PCR de ALU 247/ALU 115 de 1, es decir, cantidades iguales de ALU 247 y ALU 115, se considera característico del ADNg, ya que una muestra de este tipo también contiene los moldes más largos junto a los moldes pequeños. Para ADN libre de células (cf) Hao T. B., Shi W., Shen X. J., Qi J., Wu X. H., Wu Y., Tang Y. Y., Ju S. Q. "Circulating cell-free DNA in Serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorrectal cancer”, British Journal of Cancer 111, 1482 - 1489 (2014)) indican un cociente ALU 247 / ALU 115 de aproximadamente 0,3.
El documento WO 2013/045458 describe para la estabilización de sangre completa una mezcla de dihidroxiacetona como aditivo hipertónico, N,N-dimetilformamida, N,N-dietilformamida, N,N-dimetilacetamida o N,N-dietilacetamida como agente estabilizador para ácidos nucleicos extracelulares, preferiblemente un agente quelante como anticoagulante, y un inhibidor de la apoptosis, que es en particular un inhibidor de caspasa.
El documento WO 03/018757 A2 se refiere solo en general a la estabilización de las células en una muestra biológica con una composición que contiene un anticoagulante, un donante de formaldehído, p. ej., metenamina, así como opcionalmente polietilenglicol.
El documento WO 2007/073397 A1 describe una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades de la vejiga con un polisacárido aniónico y un anestésico en tampón, que puede contener metenamina (corresponde a urotropina) como agente antibacteriano.
Misión de la invención
La misión de la invención es proporcionar un uso alternativo de una composición y un procedimiento alternativo para estabilizar ácidos nucleicos libres de células, p. ej., ADN, o células en muestras biológicas, en particular en sangre completa
u orina, para el análisis posterior, siendo la composición preferiblemente estable al almacenamiento y más preferiblemente presenta un número menor de sustancias constitutivas diferentes que los agentes conocidos.
Descripción de la invención
La invención resuelve el problema con las características de las reivindicaciones y, en particular, con el uso de una composición como agente estabilizante y un método para estabilizar muestras biológicas, en particular sangre completa u orina, en particular para estabilizar el contenido y la integridad de ácidos nucleicos libres de células y para estabilizar el contenido y la integridad de las células. En solución acuosa, la composición presenta al menos una sustancia tampón que tampona a un valor de pH de 7 o inferior, preferiblemente de 3,5 a 7,0, y está diseñada en particular para tamponar la mezcla de la composición y la muestra biológica a este valor de pH , al menos un anticoagulante y/o al menos un agente quelante, en particular al menos un agente quelante para cationes divalentes, preferiblemente para iones calcio, y urotropina, opcionalmente PEG, o se compone de los mismos, en particular para su uso como agente estabilizador para sangre completa. Dado que los agentes quelantes, en particular EDTA, también son anticoagulantes, los agentes quelantes pueden ser formados por anticoagulantes para los fines de la invención. Para su uso como agente estabilizador para la orina como muestra biológica, la composición puede presentar o consistir en la sustancia tampón y urotropina como una mezcla seca, p. ej., en forma de polvo o, preferiblemente en solución acuosa, opcionalmente con al menos un anticoagulante y/o un agente quelante. Generalmente se prefiere una muestra biológica, una muestra de un tejido o de un fluido corporal de un animal o ser humano.
La al menos una sustancia tampón puede seleccionarse entre o consistir en tampón citrato, tampón acetato, MES (ácido 2-N-morfolinoetanolsulfónico), PIPES (ácido piperazina-N,N'-bis-2-etanosulfónico), MOPS (ácido 3-N-morfolinopropanosulfónico), tampón fosfato y mezclas de al menos dos de estos. El al menos un anticoagulante puede ser, p. ej., hirudina, opcionalmente mezclada con un agente quelante. Preferiblemente, el anticoagulante es un agente quelante que puede seleccionarse o consistir en, p. ej., citrato y EDTA y mezclas de los mismos.
La composición puede estar sin un compuesto añadido como captador de formaldehído libre o disuelto en agua, en particular sin glicina, y/o sin un agente quelante adicional, en particular sin EDTA (etilendiaminotetraacetato), p. ej., cuando la composición contiene citrato. La composición consiste de manera particularmente preferida en una solución de tampón citrato y urotropina en agua. Para uso como agente estabilizador de ácidos nucleicos libres de células y/o de células en orina o bien en un procedimiento para estabilizar ácidos nucleicos libres de células y/o células en orina, la composición puede consistir en tampón citrato y urotropina, opcionalmente con un anticoagulante y/o agente quelante, en mezcla seca en la que el tampón citrato se ajusta para tamponar en la muestra a un pH de 7 o inferior, preferiblemente de 3,5 a 7,0, en particular para un volumen de muestra predeterminado.
La sustancia tampón presenta preferentemente una capacidad tampón de una solución de tampón citrato que presenta una concentración en el intervalo de 0,3 a 1 M, más preferentemente de 0,4 a 0,7 M, por ejemplo 0,5 M y un valor de pH en el intervalo de 3,5 a 7, preferentemente de 4 a 6,5 para sangre completa como muestra, p. ej., pH 4 a 4,5, generalmente más preferiblemente un valor de pH de 4,5 o 4,2, y está diseñada , p. ej., para tamponar la mezcla de la muestra biológica y la composición a este valor de pH. El contenido de urotropina (hexametilentetramina) está preferiblemente en el intervalo de 1 a 30% p/v, preferiblemente 2 o 5 a 25% p/v o hasta 20% p/v, p. ej., 5 a 19 o hasta 8% p/v en la solución tampón. Preferiblemente, la sustancia tampón es tampón citrato de una concentración en el intervalo de 0,3 a 1 M, más preferiblemente de 0,4 a 0,7 M, por ejemplo 0,5 M y presenta un pH en el intervalo de 3,5 a 7, preferiblemente de pH 4 a 6,0, para sangre completa como muestra, p. ej., pH de 4 a 4,5, generalmente más preferiblemente un valor de pH de 4,5 o 4,2, y está diseñada preferiblemente para tamponar la mezcla de la muestra biológica y la composición a este valor de pH.
Se ha demostrado que el tampón citrato inhibe suficientemente la coagulación de la sangre completa, también sin contener EDTA. Por lo tanto, la al menos una sustancia tampón y el al menos un agente quelante pueden formarse a partir de tampón citrato.
Preferiblemente, en particular para sangre completa como muestra biológica, la composición según la invención se genera preparando el tampón, que es preferiblemente tampón citrato, en agua, ajustando el valor del pH y luego añadiendo y disolviendo la urotropina. El tampón se prepara preferiblemente mezclando una solución de la sustancia tampón, que es, p. ej., ácido cítrico o ácido acético, en agua con una solución de una sal de la sustancia tampón, p. ej., citrato trisódico o acetato de sodio, en agua en la concentración deseada en cada caso del tampón, p. ej., tampón citrato o bien tampón acetato.
Alternativamente, el ácido y la sal del ácido se mezclan en seco en una relación tal que cuando se añade el líquido se ajusta el valor de pH deseado.
El uso de la composición según la invención como agente estabilizante es adecuado para muestras biológicas, en particular sangre completa u orina, en particular para ácido nucleico libre de células, ADN y/o ARN contenidos en una muestra biológica, con el aislamiento posterior de una fracción libre de células, p. ej., de plasma libre de células, o bien de células. En particular, los ácidos nucleicos libres de células pueden analizarse a partir de la fracción libre de células. En este caso, se ha demostrado que la composición es adecuada para estabilizar la cantidad y la estructura de los ácidos nucleicos libres de células, en particular, el ADN libre de células o el ARN libre de células, en muestras biológicas, en particular, la sangre
completa, y esencialmente para prevenir cambios en la cantidad o estructura de estos ácidos nucleicos, de modo que mediante la composición no se provoquen cambios sustanciales en la cantidad o estructura de estos ácidos nucleicos que interfieran con el análisis posterior de los ácidos nucleicos. Se puede realizar un análisis posterior de los ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante hibridación, secuenciación o amplificación, p. ej., PCR.
El contenido opcional en PEG, p. ej., uno o una mezcla de PEG 6000 a PEG 20000, contrarresta una hemólisis. La composición no contiene PEG, en particular cuando se usa para el análisis posterior de ácido nucleico libre de células, preferiblemente con aislamiento de ácidos nucleicos por adsorción en un adsorbente para ácidos nucleicos.
Las células de una muestra biológica que ha sido mezclada con la composición según la invención, se caracterizan porque su contenido de ácidos nucleicos, en particular ADN y ARN, permanece esencialmente inalterado y no afecta al contenido de ácidos nucleicos en la fracción de células libres.
La composición según la invención tiene la ventaja de que es estable al almacenamiento, por ejemplo durante al menos un mes, más preferiblemente al menos dos meses, p. ej., hasta ocho meses o hasta seis meses a 0 hasta 30 °C, más preferiblemente a 5 hasta 20 °C con el fin de lograr el efecto estabilizador. Además, la composición también es estable al almacenamiento cuando está contenida en un tubo de extracción de sangre y se dispone en él para la sangre a extraer, o bien está contenida en un recipiente de muestra de orina y se dispone en él para llenar con orina. De manera correspondiente, la invención también se refiere al uso de un tubo de extracción de sangre para estabilizar ácidos nucleicos libres de células y/o las células de una muestra biológica, que es una muestra de sangre completa, estando contenida la composición en el tubo de extracción de sangre. De manera correspondiente, la invención también se refiere al uso de un recipiente para muestras de orina para estabilizar ácidos nucleicos libres de células y/o las células de la muestra biológica, que es una muestra de orina, estando contenida la composición en el recipiente para muestras de orina.
Se ha demostrado que la composición sin contenido de compuesto secuestrante de formaldehído libre o disuelto en agua y sin contenido adicional de anticoagulante, tal como, por ejemplo, EDTA, es adecuada para estabilizar ácidos nucleicos y/o células. La estabilidad al almacenamiento de la composición y su efecto estabilizador sobre muestras biológicas se atribuye actualmente al hecho de que la urotropina en la composición y en la mezcla con la muestra está en equilibrio con formaldehído libre, cuya concentración es suficiente para la estabilización o bien inactivación de proteínas.
La composición está preferiblemente contenida en un tubo de extracción de sangre, p. ej., en una relación en volumen de como máximo el 20%, al menos el 2%, preferiblemente del 5 al 15%, en particular del 8 al 12%, p. ej., el 10% del volumen de sangre completa que se puede aspirar en el tubo de extracción de sangre, o bien para el que el tubo de extracción de sangre está ajustado al máximo. La composición está preferiblemente contenida en un recipiente para muestras de orina, p. ej., en una relación en volumen de como máximo el 20%, al menos el 2%, preferiblemente del 5 al 15%, en particular del 8 al 12%, p. ej., hasta el 10% del volumen de orina que puede ser llenado en el recipiente para muestras de orina, o bien para el cual el recipiente para muestras de orina está configurado como máximo.
El procedimiento para estabilizar una muestra biológica, que es en particular sangre completa, presenta las etapas de
- poner en contacto la muestra con la composición para producir una mezcla de la muestra y la composición, preferiblemente en una relación de volumen de como máximo el 20%, preferiblemente el 5 al 15%, en particular el 8 al 12% de la composición, que está preferiblemente en solución acuosa, a la muestra,
- almacenar opcionalmente la mezcla a base de muestra y composición por encima de 0 °C, p. ej., de 0 a 37 °C, p. ej., de 0 a 30 °C, más preferiblemente de 5 a 20 °C o a 22,5 °C, p. ej., durante 1 h a 14 días, preferiblemente 5 h a 5 días o a 3 días o hasta 2 días,
- opcionalmente con la subsiguiente separación de la mezcla en una fracción que contiene células y una fracción libre de células,
- preferiblemente añadiendo proteinasa, p. ej., proteinasa K, después de separar la mezcla en la fracción libre de células generada, y
- analizar los ácidos nucleicos de la mezcla a partir de su fracción libre de células y/o analizar las células a partir de la fracción que contiene células.
El procedimiento para estabilizar y analizar ácidos nucleicos libres de células de una muestra biológica presenta, p. ej., las etapas de poner en contacto la muestra con la composición para su uso como agente estabilizante de los ácidos nucleicos libres de células contenidos en la muestra para preparar una mezcla de la muestra y la composición y almacenar la mezcla de la muestra y la composición a 0 a 30 °C durante al menos 1 h a 14 días, preferiblemente con la subsiguiente separación de la mezcla en una fracción que contiene células y una fracción libre de células, preferiblemente agregando proteinasa, p. ej., proteinasa K, después de separar la mezcla en la fracción libre de células generada y analizar los ácidos nucleicos de la mezcla de su fracción libre de células y/o analizar las células de la fracción que contiene células, o consiste en estas etapas
El análisis de la mezcla comprende opcionalmente aislar los ácidos nucleicos, preferiblemente poniéndolos en contacto con un adsorbente de ácidos nucleicos y subsiguiente lavado del adsorbente y eluyendo los ácidos nucleicos unidos del
adsorbente. Los adsorbentes correspondientes, p. ej., materiales de intercambio iónico, están contenidos, p. ej., en kits de aislamiento de ADN de Macherey-Nagel (NucleoSnap DNA Plasma) o Qiagen (QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit).
La separación de la mezcla puede tener lugar generalmente en una fracción que contiene células y una fracción libre de células, p. ej., por filtración o centrifugación y/o por adsorción.
En general, especialmente para la orina como muestra, el procedimiento, especialmente para la fracción libre de células, puede comprender al menos una etapa de enriquecimiento de ácidos nucleicos libres, p. ej., la precipitación de ácidos nucleicos y/o la adsorción de ácidos nucleicos en un adsorbente, p. ej., partículas paramagnéticas, que están recubiertas con un adsorbente.
El análisis de la fracción que contiene células puede incluir opcionalmente el enriquecimiento de células a partir de la fracción que contiene células, p. ej., la adsorción de células en un adsorbente, p. ej., partículas paramagnéticas que están recubiertas con un adsorbente, p. ej., un anticuerpo.
Opcionalmente, una fracción que contiene células, a partir de la cual la fracción libre de células se separa de una mezcla de la muestra biológica con la composición, se puede suspender y disgregar en una composición acuosa como se describe en el presente documento como agente estabilizador.
La invención se describirá ahora con más detalle a modo de ejemplo con referencia a las figuras que en
- la Figura 1 muestra el resultado de una amplificación por PCR de ADN libre de células de una muestra después de diferentes períodos de almacenamiento y en
- la Figura 2 muestra el resultado de las amplificaciones por PCR de dos segmentos de ADN como cociente de las concentraciones de los amplicones tras diferentes tiempos de almacenamiento.
Ejemplo 1: Aislamiento y análisis de ADN libre de células de sangre completa
La composición se preparó mezclando ácido cítrico (monohidrato) 0,5 M en agua y citrato trisódico (dihidrato) 0,5 M en agua hasta que se alcanzó un pH de 4,2, y luego se añadió y disolvió urotropina al 18% p/v.
Como ejemplo de una muestra biológica, se extrajo sangre completa a 4,9 mL de 3 donantes en cada caso 4 tubos de extracción de sangre idénticos, cada uno de los cuales contenía 0,49 mL de composición (10% en volumen de sangre completa). De estos tubos de extracción de sangre, que contenían esta mezcla de sangre completa y la composición y que se almacenaron a 22,5 °C, se trató en cada caso una el día 0 (T0), el día 3 (T3), el día 7 (T7) y el día 14 (T14) y a partir de ello se aisló y analizó el ADN libre de células. Para ello, se generó una fracción libre de células de cada uno de los tubos de extracción de sangre mediante un proceso de centrifugación en dos etapas (10 min, 2000 x g; 15 min, 15000 x g).
El ADN libre de células se aisló del plasma libre de células así generado, que contenía la composición para la estabilización, utilizando el kit de plasma de ADN NucleoSnap (disponible de Macherey-Nagel). A diferencia de las instrucciones del kit, se utilizaron 1,7 mL del plasma libre de células en lugar de 3,0 mL y el tampón de lisis VL, así como etanol también se redujeron de 3 mL a 1,7 mL. Además, el tiempo de incubación del plasma libre de células con proteinasa K a temperatura ambiente y a 56 °C se aumentó de 5 min a 15 min en cada caso.
El ADN libre de células se analizó amplificando el segmento de 115 pb ALU115 y el segmento de 247 pb ALU247 mediante PCR cuantitativa como se describe por Umetani et al. (2006).
La Figura 1 muestra el valor medio de los cocientes de la concentración de ALU115 en el momento especificado el día 0 (T0), el día 3 (T3 = Tx), el día 7 (T7 = Tx) y el día 14 (T14 = Tx) de las partes alícuotas y la concentración de ALU115 en el día 0 (T0). En este caso, un cociente (Tx/T0) de 1 indica que la concentración del ADN libre de células en la mezcla permanece sin cambios o bien estable y también que el ADN libre de células de la mezcla puede amplificarse sin cambios por PCR. Este resultado demuestra que el ADN libre de células en la mezcla a base de sangre completa y la composición se estabiliza en concentración y estructura para el análisis posterior durante un período de almacenamiento de al menos 14 días a 22,5 °C.
La Figura 2 muestra los cocientes de las cantidades absolutas de ADN libre de células (cfDNA) en el ejemplo de ALU 247 y ALU 115 en los momentos especificados de almacenamiento a 25 ° C (día 0 (0), día 3 (3), día 7 (7), día 10 (10) y día 14 (14) para la composición según la invención (cfDNA Exact) y para muestras con EDTA (EDTA) el día 0 (0) y el día 7 (7)). El resultado muestra la estabilización basada en el cociente, que es constante durante el tiempo de incubación, por la composición según la invención (Exact). En muestras anticoaguladas con EDTA no estabilizadas, la relación ALU 247 / ALU 115 aumenta con el aumento del tiempo de almacenamiento. Una estabilización insuficiente de muestras de sangre/muestras biológicas conduce a la lisis de las células y, con ello, a la liberación de ADN genómico (ADNg). Un cociente ALU 247 / ALU 115 de 1, es decir, cantidades iguales de ALU 247 y ALU 115, es característico de ADNg.
Estos resultados también demuestran que la composición es adecuada para el posterior aislamiento de ácidos nucleicos libres de células a partir de una mezcla libre de células de la composición con plasma con la adsorción de los ácidos nucleicos en un adsorbente, o bien que no perjudica este aislamiento.
Ejemplo 2: Aislamiento y análisis de células de sangre completa
Se preparó una mezcla a base de la composición y sangre completa según el Ej. 1 y se almacenó a 22,5°C. Una segunda muestra de sangre completa contenía solución salina fisiológica y EDTA (1,6 mg/mL de sangre) para evitar la coagulación en lugar de la composición según la invención. El día 0, el día 1, el día 3 y el día 5 se sometieron a lisis de eritrocitos en cada caso 5,0 mL de ambos tipos de muestras de sangre completa y las células endoteliales circulantes (cEC) se enriquecieron y analizaron con ayuda del kit de enriquecimiento y enumeración cEC de la razón social Miltenyi Biotech. En personas sanas, el número de células endoteliales circulantes es de alrededor de 1 - 20 células / mL. El número de las cECs aumenta en parte significativamente en el caso de diversas enfermedades. Los preparados estabilizadores deben garantizar que el número de cEC en muestras de sangre almacenadas sea estable. Según el análisis descrito para el kit, se demostró que el número de las CEC detectadas se mantuvo constante durante el período de almacenamiento únicamente en las muestras estabilizadas según la invención.
Ejemplo 3: Aislamiento y análisis de ADN libre de células de la orina
La composición se preparó mezclando ácido cítrico (monohidrato) 0,5 M en agua y citrato trisódico (dihidrato) 0,5 M en agua hasta que se alcanzó un pH de 4,2, luego se añadió y disolvió urotropina al el 15% p/v.
Como ejemplo de una muestra biológica, se mezclaron 90 mL de orina con 1/10 vol. de la composición inmediatamente después de la toma de muestras. De esta mezcla, que se almacenó a 22,5 °C, se procesó en cada caso una parte alícuota el día 0, el día 3, el día 7 y el día 14, y a partir de ella se aisló y analizó el ADN libre de células. Para ello, se generó una fracción libre de células a partir de una parte alícuota mediante centrifugación a 15.000 x g durante 15 min y separación de la fracción libre de células. A partir de la fracción libre de células así generada, que contenía la composición para la estabilización, se aisló el ADN libre de células utilizando el kit NucleoSnap DNA Plasma (disponible de Macherey-Nagel).
Se ha demostrado que el ADN libre de células fue estabilizado por la composición en comparación con muestras de orina que no fueron tratadas o que habían sido tratadas con un volumen igual de solución salina fisiológica o solo la sustancia tampón disuelta y almacenada de manera idéntica.
Ejemplo 4: Análisis de células estabilizadas en orina
De acuerdo con el Ej. 3, la orina se mezcló con células de carcinoma de próstata (LnCap) y se mezcló con la composición para estabilización o con solución salina fisiológica para comparación y se almacenó.
El análisis se llevó a cabo después de un tiempo de almacenamiento idéntico de las muestras comparativas sobre células sedimentadas por centrifugación. Se encontró que solo la composición según la invención permitía la detección por citometría de flujo de las células añadidas.
Se ha demostrado que la composición estabilizó los marcadores de la superficie de las células durante el almacenamiento en comparación con las muestras de orina no tratadas o mezcladas con un volumen igual de solución salina fisiológica o solo de la sustancia tampón disuelta y almacenadas de forma idéntica.
Claims (25)
1. Uso de una composición como agente estabilizador de los ácidos nucleicos libres de células contenidos en una muestra biológica, caracterizado por que la composición en solución acuosa presenta al menos una sustancia tampón que tampona a un valor de pH de 7 o inferior, al menos un anticoagulante que preferiblemente es un agente quelante y urotropina, opcionalmente PEG.
2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por que la composición se compone de la al menos una sustancia tampón, el al menos un anticoagulante que es un agente quelante, y urotropina, opcionalmente PEG, en solución acuosa.
3. Uso de una composición como agente estabilizador para los ácidos nucleicos libres de células contenidos en una muestra biológica, caracterizado por que la composición comprende, como mezcla seca, al menos una sustancia tampón que está diseñada para tamponar la muestra biológica a un valor de pH de 7 o inferior, al menos un anticoagulante que preferiblemente es un agente quelante y urotropina, opcionalmente PEG.
4. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la composición no contiene compuesto inhibidor del formaldehído libre o disuelto alguno.
5. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la al menos una sustancia tampón tampona la solución acuosa a un valor de pH en el intervalo de 3,5 a 7 y presenta una capacidad tamponadora que es igual a una concentración de citrato de 0,3 a 1 M, y en la solución está disuelta urotropina al 1 a 30% p/vol.
6. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la al menos una sustancia tampón y el al menos un anticoagulante, que es un agente quelante, están formados por tampón citrato.
7. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la al menos una sustancia tampón se selecciona de tampón citrato, tampón acetato, MES (ácido 2-N-morfolinoetanolsulfónico), PIPES (ácido piperazina-N,N'-bis-2-etanosulfónico), MOPS (ácido 3-N-morfolinopropanosulfónico), tampón fosfato y mezclas de al menos dos de estos, y el al menos un anticoagulante es un agente quelante seleccionado de citrato y EDTA, y mezclas de los mismos.
8. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso como agente estabilizador de ácidos nucleicos libres de células, que comprende el posterior aislamiento de una fracción libre de células y el análisis de los ácidos nucleicos contenidos en la fracción libre de células.
9. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso adicional como agente estabilizador de las células contenidas en la muestra biológica, y que comprende el posterior aislamiento de una fracción que contiene células y el análisis de las células contenidas en la misma.
10. Uso según la reivindicación 9, caracterizado por que el análisis de las células de la fracción que contiene células comprende el análisis de los ácidos nucleicos contenidos dentro de las células y/o el análisis inmunológico de las proteínas unidas a la superficie celular.
11. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la muestra biológica es sangre completa y la composición está contenida en un tubo de extracción de sangre en una porción en volumen de hasta el 20% del volumen máximo de muestra a extraer, para el que está diseñado el tubo de extracción de sangre.
12. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la muestra biológica es orina.
13. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la muestra biológica en mezcla con la composición es estable a 0 hasta 37 °C durante 1 h a 14 días.
14. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la composición se compone de tampón citrato que tampona a un valor de pH en el intervalo de 3,5 a 7, al menos un anticoagulante que es un agente quelante de los iones calcio y urotropina, opcionalmente PEG, en solución acuosa.
15. Uso según la reivindicación 14, caracterizado por que la composición se compone de tampón citrato como sustancia tampón y como agente quelante y urotropina en solución acuosa, y el tampón citrato tampona a un valor de pH en el intervalo de 3.5 a 7, y en la solución está disuelta urotropina al 1 a 30% p/vol.
16. Uso de un tubo de extracción de sangre para estabilizar ácidos nucleicos libres de células de una muestra biológica, caracterizado por que contiene una composición para uso como agente estabilizador para los ácidos nucleicos libres de células contenidos en una muestra biológica de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores en una porción en volumen de hasta el 20% del volumen máximo de la muestra a introducir en el tubo de extracción de sangre.
17. Uso de un recipiente para muestras de orina para estabilizar ácidos nucleicos libres de células de una muestra de orina, caracterizado por que contiene una composición para su uso como agente estabilizador de los ácidos nucleicos libres de células contenidos en una muestra biológica según una de las reivindicaciones 1 a 15.
18. Procedimiento para la estabilización y el análisis de ácidos nucleicos libres de células de una muestra biológica con las etapas de
- poner en contacto la muestra con una composición para uso según una de las reivindicaciones 1 a 14 para producir una mezcla a base de la muestra y la composición y
- almacenar la mezcla a base de la muestra y la composición a 0 hasta 37 °C durante 1 h a 14 días.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado por que la composición se pone en contacto con la muestra en una relación en volumen de como máximo el 20% del volumen de la muestra.
20. Procedimiento según una de las reivindicaciones 18 a 19, caracterizado por las etapas de
- después del almacenamiento, separar la mezcla en una fracción que contiene células y una fracción sin células y - analizar los ácidos nucleicos de la fracción libre de células.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado por la etapa de analizar los ácidos nucleicos en la fracción que contiene células.
22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 21, caracterizado por la etapa de analizar las proteínas unidas a la superficie celular en la fracción que contiene células.
23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 21, caracterizado por que después de separar la mezcla en la fracción sin células se añade proteinasa y la mezcla se incuba posteriormente.
24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 21, caracterizado por que los ácidos nucleicos se aíslan de la fracción libre de células y se analizan posteriormente.
25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado por que la muestra biológica es sangre completa u orina.
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| DE4338704A1 (de) * | 1993-11-12 | 1995-05-18 | Hoechst Ag | Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung |
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| JP2005501236A (ja) * | 2001-08-23 | 2005-01-13 | イムニベスト・コーポレイション | 分析用の細胞および生物学的検体の安定化 |
| US20040043505A1 (en) * | 2002-05-07 | 2004-03-04 | Matthew Walenciak | Collection assembly |
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| DE102004056655B4 (de) * | 2004-11-23 | 2007-03-29 | Sarstedt Ag & Co. | Probenröhrchen zur Aufnahme von Körperflüssigkeit, insbesondere Blut |
| EP2839830B1 (en) * | 2005-01-14 | 2019-05-15 | Urigen, Inc. | Kits and compositions for treating lower urinary tract disorders |
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| CA2680801A1 (en) * | 2007-03-14 | 2008-09-18 | Sierra Molecular Corporation | Compositions, systems, and methods for preservation and/or stabilizationof a cell and/or macromolecule |
| CN101024645A (zh) * | 2007-03-26 | 2007-08-29 | 刘长飞 | 甘氨酸脱醇母液回收乌洛托品和甘氨酸的方法 |
| EP2198042B1 (en) * | 2007-09-17 | 2016-11-02 | MDxHealth SA | Novel markers for bladder cancer detection |
| US20110065108A1 (en) * | 2008-02-01 | 2011-03-17 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Urine Transport Medium |
| FR2935704B1 (fr) * | 2008-09-09 | 2010-08-27 | Rhodia Operations | Procede de fabrication d'amines |
| ES2649572T3 (es) * | 2009-02-18 | 2018-01-12 | Streck Inc. | Conservación de ácidos nucleicos fuera de las células |
| KR101029154B1 (ko) * | 2009-05-20 | 2011-04-13 | 한국생명공학연구원 | 산화아연 나노구조체 마이크로패턴 및 그 제작방법 |
| JP5826752B2 (ja) * | 2009-09-14 | 2015-12-02 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 細胞学用培地に固定された組織サンプルから核酸またはタンパク質を回収するための組成物および方法 |
| CN101717112A (zh) * | 2009-12-07 | 2010-06-02 | 天津大学 | 以dna为模板组装氧化锌纳米链的方法 |
| AU2011203450B2 (en) * | 2010-01-04 | 2016-01-07 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Methods, compositions, and kits for recovery of nucleic acids or proteins from fixed tissue samples |
| US20110229879A1 (en) * | 2010-03-19 | 2011-09-22 | University Of Rochester | Methods and compositions for nuclear staining |
| EP2576820A1 (de) * | 2010-06-02 | 2013-04-10 | Qiagen GmbH | Stabilisierung von nukleinsäuren in zellmaterial-haltigen biologischen proben |
| US9023600B2 (en) * | 2011-02-16 | 2015-05-05 | The University Of Akron | Highly selective pyrophosphate sensor |
| CN102318597B (zh) * | 2011-08-19 | 2013-04-03 | 张雪云 | 一种液基细胞保存液组合物及其制备方法 |
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| WO2013123030A2 (en) * | 2012-02-13 | 2013-08-22 | Streck, Inc. | Blood collection device for improved nucleic acid regulation |
| WO2014029791A1 (en) * | 2012-08-21 | 2014-02-27 | Qiagen Gmbh | Method for isolating nucleic acids from a formaldehyde releaser stabilized sample |
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