JP2020535789A - 無細胞核酸及び細胞を安定化するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
- 試料と組成物とを、好ましくは最大20%、好ましくは5〜15%、とりわけ8〜12%の、好ましくは水溶液である組成物対試料の容量比において接触させて、試料と組成物とからの混合物を製造する工程と、
- 任意選択で、試料と組成物とからの混合物を、0℃以上で、例えば0〜37℃で、例えば0〜30℃で、より好ましくは5〜20℃又は22.5℃で、例えば1時間〜14日間、好ましくは5時間〜5日間又は3日間まで又は2日間までにわたり貯蔵する工程と、
- 任意選択で、引き続き混合物を細胞含有分画と無細胞分画とに分離する工程と、
- 好ましくは、混合物の分離後に、生じた無細胞分画へプロテイナーゼ、例えばプロテイナーゼKを添加する工程と、
- 混合物の核酸をその無細胞分画から分析する工程、及び/又は細胞を細胞含有分画から分析する工程と、
を有する。
水中の0.5Mのクエン酸(一水和物)及び水中の0.5Mのクエン酸三ナトリウム(二水和物)をpH4.2に達するまで混合し、引き続き18質量/容量%のウロトロピンを添加及び溶解させることによって、組成物を製造した。
実施例1に相応して、組成物と全血とからの混合物を製造し、22.5℃で貯蔵した。第2の全血試料は、凝固を防ぐために本発明による組成物の代わりに生理食塩溶液及びEDTA(1.6mg/ml血液)を含有した。両方の種類の全血試料のうち、0日目、1日目、3日目及び5日目に各5.0mlを赤血球溶解に供し、循環内皮細胞(cEC)を、Miltenyi Biotech社のcEC Enrichment and Enumeration Kitによって濃縮して分析した。健康な人の場合に、循環内皮細胞の数は、約1〜20細胞/mlである。異なる疾患の場合に、cECの数は部分的に大幅に増加する。安定化調製物は、貯蔵された血液試料中のcECの数が安定であることを保証せねばならない。キットについて記載された分析の後に、検出されたcECの数が、本発明により安定化された試料においてのみ貯蔵時間にわたって一定に留まることが分かった。
水中の0.5Mのクエン酸(一水和物)及び水中の0.5Mのクエン酸三ナトリウム(二水和物)をpH4.2に達するまで混合し、引き続き15質量/容量%のウロトロピンを添加及び溶解させることによって、組成物を製造した。
実施例3に相応して、尿に前立腺癌細胞(LnCap)を加え、組成物による安定化又は生理食塩溶液との比較のために混合して貯蔵した。
Claims (23)
- 生体試料中に含まれる無細胞核酸のための安定剤としての組成物の使用であって、組成物が、水溶液において、7以下のpH値に緩衝する少なくとも1種の緩衝物質と、好ましくはキレート形成剤である少なくとも1種の凝固防止剤と、ウロトロピンと、任意選択でPEGとを有することを特徴とする、使用。
- 組成物が、水溶液において、少なくとも1種の緩衝物質と、キレート形成剤である少なくとも1種の凝固防止剤と、ウロトロピンと、任意選択でPEGとからなることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
- 生体試料中に含まれる無細胞核酸のための安定剤としての組成物の使用であって、組成物が、乾燥混合物として、生体試料を7以下のpH値に緩衝するように適合されている少なくとも1種の緩衝物質と、好ましくはキレート形成剤である少なくとも1種の凝固防止剤と、ウロトロピンと、任意選択でPEGとを有することを特徴とする、使用。
- 組成物が、遊離した又は溶解したホルムアルデヒドのためのスカベンジャー化合物を含有しないことを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
- 少なくとも1種の緩衝物質が、水溶液を3.5〜7の範囲のpH値に緩衝し、0.3〜1Mのクエン酸塩の濃度に相当する緩衝能を有し、前記溶液中に1〜30質量/容量%のウロトロピンが溶解していることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
- 少なくとも1種の緩衝物質及びキレート形成剤である少なくとも1種の凝固防止剤が、クエン酸緩衝剤によって形成されていることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用。
- 少なくとも1種の緩衝物質が、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、MES(2-N-モルホリノエタノールスルホン酸)、PIPES(ピペラジン-N,N'-ビス-2-エタノスルホン酸)、MOPS(3-N-モルホリノプロパンスルホン酸)、リン酸緩衝剤及びこれらの少なくとも2種の混合物から選択され、少なくとも1種の凝固防止剤が、クエン酸塩及びEDTA並びにこれらの混合物から選択されるキレート形成剤であることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用。
- 無細胞核酸のための安定剤としての使用、引き続いての無細胞分画の単離及び無細胞分画中に含まれる核酸の分析を特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用。
- 生体試料中に含まれる細胞のための安定剤としての使用、引き続いての細胞含有分画の単離及びその中に含まれる細胞の分析を特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用。
- 細胞含有分画の細胞の分析が、細胞中に含まれる核酸の分析及び/又は細胞表面に結合したタンパク質の免疫学的分析を含むことを特徴とする、請求項9に記載の使用。
- 生体試料が全血であり、組成物が、採血管を対応させた取り込まれるべき最大の試料容量の20%までの容量割合で、採血管中に含まれることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用。
- 生体試料が尿であることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用。
- 生体試料が、組成物との混合物において0〜37℃で1時間〜14日間にわたり安定であることを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の使用。
- 生体試料のための安定剤として使用するための組成物であって、組成物が、7以下のpH値に緩衝する少なくとも1種の緩衝物質と、好ましくはカルシウムイオンのためのキレート形成剤である少なくとも1種の凝固防止剤と、ウロトロピンと、任意選択でPEGと、任意選択で水とからなることを特徴とする、組成物。
- 組成物が、任意選択で水溶液において、緩衝物質としてのクエン酸緩衝剤と凝固防止剤としてのキレート形成剤とウロトロピンとからなり、クエン酸緩衝剤が、3.5〜7の範囲のpH値に緩衝することを特徴とする、請求項14に記載の組成物。
- 組成物が、水溶液において、緩衝物質兼キレート形成剤としてのクエン酸緩衝剤とウロトロピンとからなり、クエン酸緩衝剤が、3.5〜7の範囲のpH値に緩衝し、溶液中に1〜30質量/容量%のウロトロピンが溶解していることを特徴とする、請求項15に記載の組成物。
- 採血管が、請求項1から11又は13のいずれか一項に記載の生体試料中に含まれる無細胞核酸のための安定剤として使用する組成物を、採血管中に取り込まれる最大の試料容量の20%までの容量割合で含むことを特徴とする、採血管。
- 生体試料の無細胞核酸を安定化し、分析するための方法であって、
- 試料を請求項1から14のいずれか一項に記載の使用のための組成物と接触させて、試料と組成物との混合物を製造する工程と、
- 試料と組成物との混合物を0〜37℃で1時間〜14日間にわたり貯蔵する工程と
を含む、方法。 - 組成物を、試料の容量の最大20%の容量比で試料と接触させることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- - 貯蔵に引き続いて混合物を細胞含有分画及び無細胞分画へ分離する工程と、
- 無細胞分画及び/若しくは細胞含有分画の核酸を分析する工程、並びに/又は細胞含有分画中の細胞表面に結合されたタンパク質を分析する工程と
を特徴とする、請求項18又は19に記載の方法。 - 混合物の分離後に無細胞分画へプロテイナーゼを添加し、引き続きその混合物をインキュベートすることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
- 無細胞分画から核酸を単離し、引き続き分析することを特徴とする、請求項20又は21に記載の方法。
- 生体試料が、全血又は尿であることを特徴とする、請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。
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