JPWO2013168767A1 - 赤血球除去方法および採血用遠沈管 - Google Patents
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Abstract
本発明は、血液に含まれる細胞を展開し観察する場合において、採血した時点から、数日間保管されるなどして、赤血球が分離されるまでに長時間が経過した血液由来検体であっても、希少細胞をほとんどロスすることがなく、血液に含まれる希少細胞の検出精度を向上することができる赤血球除去方法および採血用遠沈管を提供することを目的とする。血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に含まれる赤血球を予め除去する方法であって、(Ａ)：血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程；および、(Ｂ)：上記工程(Ａ)で得られた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程を含むことを特徴とする赤血球除去方法。
Description
本発明は、血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に多量に含まれる赤血球を予め除去する方法および細胞固定剤と抗凝固剤と密度勾配遠心用分離液とが充填されている採血用遠沈管に関する。
循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、各種幹細胞等（本明細書において、まとめて「希少細胞」という。）は、病態に応じて抹消血中に極めて稀に存在する細胞である。これら希少細胞の検出は臨床的に有用であることは自明であるが、全血サンプルからすべての希少細胞を検出することは未だに困難である場合がほとんどである。
近年、様々な細胞分離手法を応用して希少細胞の検出が試みられ、製品化されているが、いずれにおいても対象の希少性およびヘテロ性が故に、検出結果の有効性やその保証手段が重要であると考えられている。例えば、細胞分離工程のいくつかを経るうちに希少細胞をロスしたり、多種多様な不要細胞の混入により希少細胞を識別するのが困難であったりするので、希少細胞をどの程度ロスしたかの評価や希少細胞をロスしないための手段を講じることが重要である。
例えば、特許文献1には、癌患者から採血した血液をＣｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)安定化剤に回収し、通常の遠心分離を行って血漿を除去した後、ＣＴＣ表面抗原に特異的な抗体が固定化された磁性粒子を使用し、ＣＴＣを磁気的に分離する方法が開示されている。
しかしながら、一概にＣＴＣとは言え、転移性の乳癌や前立腺癌、大腸癌などに由来するものであるから、ＣＴＣすべてが同じ性質を有するとは限らず（例えば、同一組織の大腸癌に由来するＣＴＣであっても、その細胞表面に発現している分子（表面抗原）の種類・数が一様であるとは言い切れない。）、特許文献1の磁気的に分離する工程において、ある種のＣＴＣを取りこぼしている可能性がある。
また、特許文献2には、血液中の希少細胞を検出する方法であって、血液から赤血球を除き、白血球および希少細胞が含有される細胞懸濁液を得る前処理工程と、該細胞懸濁液を複数の穴が設けられた観察領域に展開する細胞展開工程と、該観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する撮影工程と、撮影で得られた画像から希少細胞を検出する検出工程とを含む方法が開示されている。前処理工程において、密度勾配遠心法によって赤血球を分離してもよいこと（段落[0038]）、またホルマリン法等で細胞固定する場合は遠心分離の後で（細胞観察部材への展開の際に、または細胞観察をする際に染色処理とともに）行うこと（段落[0042]〜[0043]）が記載されている。
しかしながら、特許文献2の検出方法では、採血から該検出方法を実施するまでに長時間を要するため、血液中の細胞が劣化しやすいと考えられ、特に前処理工程において密度勾配遠心法を行った場合、希少細胞の回収率が低下したり、単核球層に赤血球が多く混入したりしてしまい、前処理工程後の工程が阻害され、正確な検出結果が得られないことがあった。
本発明は、血液に含まれる細胞を展開し観察する場合において、採血した時点から、数日間保管されるなどして、赤血球が分離されるまでに長時間が経過した血液由来検体であっても、希少細胞をほとんどロスすることがなく、血液に含まれる希少細胞の検出精度を向上することができる赤血球除去方法および採血用遠沈管を提供することを目的とする。
通常、ホルムアルデヒド等を用いて細胞固定を行うと、細胞が有するタンパク質等の分子が、その分子内または分子間で架橋される。細胞固定された細胞は、その比重が細胞固定前とほとんど変わらないものもあるかもしれないが、細胞の種類に関係なく大なり小なり変動することも十分考えられる。しかしながら、細胞固定前後の細胞の比重の変化についてこれまで詳細に調べられていないため、どの種類の細胞がどの程度比重が変動するか、まったくわかっていない。
このような状況で、そのような細胞固定処理を、比重による厳密な分離を行う密度勾配遠心分離の前に行うという発想は、これまでまったくなかった。
しかしながら、本発明者らは、血液由来検体に含有される細胞に対して細胞固定処理を行った後に密度勾配遠心分離をしたところ、細胞固定された希少細胞が、赤血球以外の細胞が多く含まれる層にほぼ確実に含まれるようになり、希少細胞の回収率の向上、赤血球混入比の低下を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
しかしながら、本発明者らは、血液由来検体に含有される細胞に対して細胞固定処理を行った後に密度勾配遠心分離をしたところ、細胞固定された希少細胞が、赤血球以外の細胞が多く含まれる層にほぼ確実に含まれるようになり、希少細胞の回収率の向上、赤血球混入比の低下を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、上述した目的のうち少なくとも１つを実現するために、本発明の１つの側面を反映した赤血球除去方法は、血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に含まれる赤血球を予め除去する方法であって、(Ａ) 血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程；および、(Ｂ) 上記工程(Ａ)で得られた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程を含む。
また、本発明のもう１つの側面を反映した採血用遠沈管は、細胞固定剤、抗凝固剤および密度勾配遠心用分離液が予め充填されている。
本発明の赤血球除去方法または採血用遠沈管を用いて赤血球を除去すると、採血した時点から、数日間保管されるなどして、赤血球が分離されるまでに長時間が経過した血液由来検体であっても、希少細胞をほとんどロスすることがなく、細胞が収縮または膨張する等の劣化を抑えることができる。
また、本発明の赤血球除去方法または採血用遠沈管を用いて血液由来検体から赤血球を除去した後、赤血球が除去された血液由来検体を展開し観察することによって、該血液由来検体に含有される（含有される可能性のある）ＣＴＣ等の希少細胞を検出する場合、該血液由来検体に希少細胞が存在するか否かの判断結果の信頼性が向上し、さらに該血液由来検体から希少細胞を検出する精度が高くなる。
以下、本発明に係る赤血球除去方法および採血用遠沈管を詳細に説明する。
＜赤血球除去方法＞
本発明の赤血球除去方法は、血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に多量に含まれる赤血球を予め除去する方法であって、下記の工程(Ａ)および(Ｂ)を含むことを特徴とする。
＜赤血球除去方法＞
本発明の赤血球除去方法は、血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に多量に含まれる赤血球を予め除去する方法であって、下記の工程(Ａ)および(Ｂ)を含むことを特徴とする。
細胞固定処理工程(Ａ)：血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程。
密度勾配遠心工程(Ｂ)：細胞が固定された血液由来検体を、密度勾配遠心法により、「赤血球が多く含まれる層」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」との少なくとも二層に分離する工程。
密度勾配遠心工程(Ｂ)：細胞が固定された血液由来検体を、密度勾配遠心法により、「赤血球が多く含まれる層」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」との少なくとも二層に分離する工程。
本発明における「血液由来検体」とは、採血した後なんら処理を施していない血液や、適切な希釈剤を用いて希釈された血液、後述するように「抗凝固剤」を用いて血液凝固が阻害された血液、または、希釈剤や抗凝固剤等を併用して適切な処理を施した血液などをいう。
細胞固定処理工程(Ａ)において、細胞固定するとともに血液凝固を阻害することが好ましく、採血直後に血液と抗凝固剤とを反応させることによって血液凝固を阻害しつつ、さらに「細胞固定剤」を添加することによって血液細胞を固定する態様が好ましい。
また、密度勾配遠心工程(Ｂ)の一態様として、図1に示されるように、密度勾配遠心用の分離液(3)が予め充填された遠沈管(1)に、工程(Ａ)で得られた、細胞固定された血液由来検体(2)を該分離液(3)の上に重層する工程；および、この遠沈管(1)を密度勾配遠心法により遠心分離することによって、「赤血球が多く含まれる層」(7)と「分離液の層」(6)と「単核球が多く含まれる層」(5)と「血小板が多くまれる血漿からなる層」(4)とに分離する工程、に分けられる。
密度勾配遠心工程(Ｂ)を実施した後、「赤血球が多く含まれる層」(7)以外の層である「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」に相当する、図1の層(4)〜(6)をすべて採取することが好ましい。
本発明の赤血球除去方法を用いて、血液由来検体から赤血球を除去すると、その後、細胞展開し、目的とする希少細胞を検出する際、血液由来検体中に目的の細胞が存在するか否かの判断結果の信頼性を向上させ、また目的の細胞が存在する場合は、その検出精度を向上させることができる。
〔希少細胞〕
本発明で用いる血液由来検体に含まれている可能性のある「希少細胞」とは、体内に極微量に存在する細胞の総称であり、例えば循環腫瘍細胞（血液循環癌細胞ともいう。）〔ＣＴＣ〕、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、各種幹細胞等が挙げられる。本発明の赤血球除去方法を実施した後に得られた血液由来検体から検出するための目的の細胞でもあり得る。
本発明で用いる血液由来検体に含まれている可能性のある「希少細胞」とは、体内に極微量に存在する細胞の総称であり、例えば循環腫瘍細胞（血液循環癌細胞ともいう。）〔ＣＴＣ〕、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、各種幹細胞等が挙げられる。本発明の赤血球除去方法を実施した後に得られた血液由来検体から検出するための目的の細胞でもあり得る。
特にＣＴＣは、癌の予後や転移の診断や治療効果のモニタリングの指標となり得ることから、本発明では希少細胞としてＣＴＣが好適である。
〔抗凝固剤〕
抗凝固剤は、採血した血液がゲル状になる「血液凝固」を防止するための薬剤である。血液由来検体の用途によって抗凝固剤が必要な場合と不要な場合とがあるが、本発明のように希少細胞を回収する場合は通常は抗凝固剤が必要となる。
〔抗凝固剤〕
抗凝固剤は、採血した血液がゲル状になる「血液凝固」を防止するための薬剤である。血液由来検体の用途によって抗凝固剤が必要な場合と不要な場合とがあるが、本発明のように希少細胞を回収する場合は通常は抗凝固剤が必要となる。
一般的な「抗凝固剤」としては、エチレンジアミン四酢酸〔ＥＤＴＡ〕、ジエチレントリアミン五酢酸〔ＤＴＰＡ〕、1,2-ジアミノシクロヘキサン四酢酸〔ＤＣＴＡ〕、エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)四酢酸〔ＥＧＴＡ〕；ヘパリン、ヘパリン硫酸、低分子ヘパリン等のヘパリン種；クエン酸、シュウ酸等が挙げられる。例えば、白血球の数やリンパ球の百分率を出す場合は、抗凝固剤としてＥＤＴＡを使用する。ＣＤ4数などリンパ球のサブセットを調べる場合は、ヘパリンであってもＥＤＴＡであってもよい。輸血用の血液を採血する場合は、クエン酸ナトリウムを含む液（例えばＡＣＤ〔acid citrate dextrose〕、ＣＰＤ〔citrate phosphate dextrose〕など）を使用する。
本発明で用いることができる「抗凝固剤」としては、これら従来公知の抗凝固剤をいずれも選択でき、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔細胞固定剤〕
工程(Ａ)、すなわち、血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程では、細胞固定剤を使用して細胞を固定する。「固定」または「細胞固定」とは、一般的には、細胞または組織の自己分解や腐敗を遅延させるとともに、その形態および抗原性を保持する目的で行われる処理をいう。本発明では、このような処理が希少細胞の回収率の向上、赤血球混入比の低下などの効果をもたらす。
〔細胞固定剤〕
工程(Ａ)、すなわち、血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程では、細胞固定剤を使用して細胞を固定する。「固定」または「細胞固定」とは、一般的には、細胞または組織の自己分解や腐敗を遅延させるとともに、その形態および抗原性を保持する目的で行われる処理をいう。本発明では、このような処理が希少細胞の回収率の向上、赤血球混入比の低下などの効果をもたらす。
細胞固定剤として一般的な物質としては、例えば、アルデヒド類、アルコール類、重金属元素などが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。また、細胞固定剤として直接作用するものではないが、それ自体が加水分解等を受けることによって例えばホルムアルデヒド等の細胞固定剤を遊離するような、例えばホルムアルデヒド供与体（「ホルムアルデヒドドナー」または「ＦＡドナー」ともいう。）なども、本発明で用いる細胞固定剤に包含される。ホルムアルデヒド供与体は、長期間保存（ただし、加水分解を受けないような条件下で）した後であっても、血液由来検体や血液に触れた直後から加水分解によってホルムアルデヒドを遊離できることから、特に好ましい。
アルデヒド類は、タンパク質の既存の結合様式（例えば、ジスルフィド結合や水素結合など）を解離させ、新たな結合を形成する。その結合は、リジン、アルギニン等のアミノ基末端やトリプトファン、チロキシン等の芳香族活性炭素との共有結合であったり、別のアミノ酸末端残基と連結して形成されるメチレン架橋であったりする。これらの新たな結合によってタンパク質の高次構造を変化させたり、このような結合や架橋に関与しない遊離分子もポリペプチド鎖をホールドすることによってさらなる変性を防いだりすることができ、タンパク質構造を安定化するとともに、細胞原形質をゲル化して酵素活性を抑えることができる細胞固定剤である。このようなアルデヒド類としては、ホルムアルデヒド〔ＦＡ〕が代表的であり、グルタルアルデヒドやグリオキサールなども含まれる。
エタノールやメタノールに代表されるアルコール類は、タンパク質を変性させて沈殿させることができる細胞固定剤である。
重金属元素としては、例えば、クロム〔Ｃｒ〕、マンガン〔Ｍｎ〕、亜鉛〔Ｚｎ〕などが挙げられる。
重金属元素としては、例えば、クロム〔Ｃｒ〕、マンガン〔Ｍｎ〕、亜鉛〔Ｚｎ〕などが挙げられる。
また、ホルムアルデヒド供与体としては、例えば、アミンやアミドのメチロール、ヒドロキシメチル誘導体、ジアゾリジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、メテンアミン、パラホルムアルデヒドなどが挙げられる。
本発明においては、これらを一種単独で用いても二種以上併用してもよいが、これらに限定されるものではない。
工程(Ａ)において用いる細胞固定剤の量は、その種類に応じて適宜調整することができるが、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、細胞固定剤の濃度は0.01〜50.0ｖｏｌ％の範囲で調整される。
工程(Ａ)において用いる細胞固定剤の量は、その種類に応じて適宜調整することができるが、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、細胞固定剤の濃度は0.01〜50.0ｖｏｌ％の範囲で調整される。
例えば、ＦＡドナーを細胞固定剤として用いる場合、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対してＦＡドナーの濃度が好ましくは0.1〜10.0ｖｏｌ％となるように含ませる。ＦＡドナーの濃度が上記範囲内であると、ＦＡがゆっくり遊離され、下記の好ましいＦＡの濃度範囲を数日にわたって維持することができるので好適である。というのも、採血したときから検査するまでに、通常、数日を要するからである。
例えば、ＦＡを細胞固定剤として用いる場合、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、ＦＡの濃度が好ましくは0.01〜1.0ｖｏｌ％、より好ましくは0.02〜0.2ｖｏｌ％となるように含ませ、一方、アルコール類を用いる場合は、該細胞固定剤の濃度が好ましくは1.0〜50.0ｖｏｌ％となるように含ませる。
細胞固定剤を上記範囲内で用いると、工程(Ｂ)で実施する密度勾配遠心法において、固定された希少細胞が赤血球を多く含む層にほぼ混入しないようにすることができる。細胞固定剤の量が多すぎても少なすぎても、充分な白血球回収率および赤血球混入比を達成できない場合がある。
また、血液由来検体と細胞固定剤とを接触させる処理時間は適宜調整することができるが、両者を混合してから反応が進行し、本発明の作用効果が充分に奏されるようになるまで、一定の時間を確保することが望ましい。ここで、本発明者は、本発明の作用効果が充分に発揮されるためには、固定化剤濃度と処理時間との両方のバランスに依存する傾向があり、固定化剤の濃度に応じて処理時間が決まると考えている。例えば、後述する本実施例に示すようにＣｙｔｏ−Ｃｈｅｘ（登録商標）ＢＣＴを用いた場合等典型的な場合における処理時間は、サンプルとして用いる血液自体の劣化の程度も考慮に入れて、好ましくは10分間以上7日間以下である。
〔密度勾配遠心法〕
工程(Ｂ)で実施される「密度勾配遠心法」とは、主に分子生物学実験で用いられる手法であり、所望の「分離液」を用いることによって遠沈管内の溶液に対して通常は底部から上部に向かって密度（比重）を低下させ、その状態で試料を遠心分離すると、目的とする物質や細胞がその密度（比重）に従って一定の密度溶液の層をそれぞれ形成するが、そのような性質を利用して目的物を分取する方法である。
工程(Ｂ)で実施される「密度勾配遠心法」とは、主に分子生物学実験で用いられる手法であり、所望の「分離液」を用いることによって遠沈管内の溶液に対して通常は底部から上部に向かって密度（比重）を低下させ、その状態で試料を遠心分離すると、目的とする物質や細胞がその密度（比重）に従って一定の密度溶液の層をそれぞれ形成するが、そのような性質を利用して目的物を分取する方法である。
すなわち、密度勾配遠心法は、その密度（比重）が予めわかっている目的物を、該目的物以外の物から分離するための手法であるから、当業者は、通常、比重が不明な目的物を分離するために密度勾配遠心法は用いることはしない。
密度勾配遠心法に用いられる「分離液」としては、特定の比重を有し、細胞を破壊することのない浸透圧およびｐＨに調節できるものであれば特に限定されないが、例えば、市販のフィコール(登録商標)やパーコール(登録商標)、ショ糖溶液などを用いることができる。
この分離液の比重を、赤血球の比重よりも小さく、且つ、白血球の比重よりも大きく設定して密度勾配遠心法を実施すると、血液由来検体を、「赤血球が多く含まれる層」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」との少なくとも二層に分離することができ、この「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」を全部取り出すことによって、血液由来検体から赤血球をほぼ取り除くことができる。
用いる分離液の比重を、好ましくは1.113以下、より好ましくは1.085以下とすると、取り出した全部の「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」に含まれる赤血球の混入率を2〜6％またはそれ以下に抑えられるため好適である。
分離液として、比重の異なる二種以上（例えば比重1.077と1.119）を併用してもよく、この場合、赤血球以外の細胞（例えば好酸球、好中球、好塩基球、リンパ球、単核球など）をさらに分離することができ、検出対象である希少細胞以外のこれらの細胞をさらに排除することができる。
なお、血液由来検体に含まれている主な細胞成分の比重は、一般的に、血漿＜血小板＜白血球＜赤血球という大小関係を有している。ＣＴＣの比重は、その種類・性質にもよるが、血小板や白血球と同程度、あるいは、血小板や白血球よりもさらに小さいことが知られている。
＜採血用遠沈管＞
本発明の採血用遠沈管は、上記「細胞固定剤」、上記「抗凝固剤」および密度勾配遠心用の上記「分離液」が予め充填されていることを特徴とし、充填の態様として、分離液と細胞固定剤および抗凝固剤とが「多孔質バリア」および/または「チキソトロープゲル」によって物理的に分断されているのが好ましく、その際、細胞固定剤および抗凝固剤が固体状（例えば粉末や顆粒など）であるのが好ましく、特に細胞固定剤がホルムアルデヒド供与体であるとより好ましい。
本発明の採血用遠沈管は、上記「細胞固定剤」、上記「抗凝固剤」および密度勾配遠心用の上記「分離液」が予め充填されていることを特徴とし、充填の態様として、分離液と細胞固定剤および抗凝固剤とが「多孔質バリア」および/または「チキソトロープゲル」によって物理的に分断されているのが好ましく、その際、細胞固定剤および抗凝固剤が固体状（例えば粉末や顆粒など）であるのが好ましく、特に細胞固定剤がホルムアルデヒド供与体であるとより好ましい。
この「多孔質バリア」とは、好適にはエラストマー製であり、赤血球が一個通過できる程度の大きさ（孔径5〜8μｍ）以上かつ孔径150μｍ以下程度の貫通孔を有するフィルター状のものが好ましく、その厚さは密度勾配遠心法による機械的な力を受けても損傷しない程度の強度を有する厚さであればよく、例えば2〜15ｍｍ程度である。多孔質バリアのみを用いて分離液と細胞固定剤および抗凝固剤とを分断する場合、細胞固定化剤および抗凝固剤が、多孔質バリアの孔径より大きい直径を有する顆粒であることが好ましい。さらには、分離液と接しないように、細胞固定化剤および抗凝固剤をフィルムコート状の形態で、遠沈管の上部に固定しておくことが好ましい。
また、「チキソトロープゲル」とは、好適には、ケイ酸、ベントナイト、ヘクトライト、カオリン、アルギン酸塩および/またはこれらの混合物からなる群から選択されるチキソトロープ物質からなるゲル状のものであり、密度勾配遠心法による機械的な力が作用することによって流動化するが、このような力が作用しないと硬化する性質を有する。
なお、本発明の採血用遠沈管に好適な多孔質バリアおよびチキソトロープゲルとして、特表2008-529541号公報に記載のものを好適に使用することができる。
以下、本発明について実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
［実施例１］ホルムアルデヒド処理血液の白血球回収率および赤血球混入比
採血管として、テルモ(株)製のベノジェクト(登録商標)II真空採血管「VP-DK053K」を用いた。この採血管には予めエチレンジアミン四酢酸二カリウム〔ＥＤＴＡ-2Ｋ〕の顆粒が所定量充填されており、この量は採血量に対してＥＤＴＡ濃度が1.5ｍｇ/ｍＬ程度になる量と思われる。なお、この採血管の容積は５ｍＬである。
［実施例１］ホルムアルデヒド処理血液の白血球回収率および赤血球混入比
採血管として、テルモ(株)製のベノジェクト(登録商標)II真空採血管「VP-DK053K」を用いた。この採血管には予めエチレンジアミン四酢酸二カリウム〔ＥＤＴＡ-2Ｋ〕の顆粒が所定量充填されており、この量は採血量に対してＥＤＴＡ濃度が1.5ｍｇ/ｍＬ程度になる量と思われる。なお、この採血管の容積は５ｍＬである。
採血した血液３ｍＬに、20％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業(株)製）の希釈液0.3ｍＬを添加して細胞固定を行った。そして、10回転倒して混和させた。
この「20％中性緩衝ホルマリン液」は、ホルマリン原液（37％ホルムアルデヒド溶液）をリン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕で約7.4％に調整されたものであり、血液３ｍＬに対して、ホルムアルデヒド〔ＦＡ〕の最終濃度がそれぞれ0.01ｖｏｌ％、0.02ｖｏｌ％、0.04ｖｏｌ％、0.08ｖｏｌ％および0.1ｖｏｌ％になるようにして採血管に添加した。
この「20％中性緩衝ホルマリン液」は、ホルマリン原液（37％ホルムアルデヒド溶液）をリン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕で約7.4％に調整されたものであり、血液３ｍＬに対して、ホルムアルデヒド〔ＦＡ〕の最終濃度がそれぞれ0.01ｖｏｌ％、0.02ｖｏｌ％、0.04ｖｏｌ％、0.08ｖｏｌ％および0.1ｖｏｌ％になるようにして採血管に添加した。
各採血管を室温で３日間静置し、その３日目に再度採血管を転倒させて、血漿成分と血球成分とを混和させた後、各採血管の内容物に対して、ウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を0.5重量％含むＰＢＳ溶液で２倍希釈した。そのうち４ｍＬを、密度勾配遠心用分離液（Ｆｉｃｏｌｌ、比重1.077）３ｍＬが予め充填された遠沈管の該分離液の上から重層し、室温で400×ｇで40分間遠心分離を行った。
遠心後、赤血球が多く含まれる層以外の層をすべて採取し、フィコエリスリン〔ＰＥ〕標識抗ＣＤ45抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ33342により細胞染色を行った。そのうち20μＬを血球計算盤にて顕微鏡下で観察し、明視野にて全細胞数をカウント、また蛍光励起にて観察されるＰＥおよびＨｏｅｃｈｓｔ33342のシグナルを白血球としてカウントした。
また、別途、密度勾配遠心前の血液も一部採取しておき、同様に細胞染色を行い、適宜ＰＢＳ溶液で希釈して、遠心前の白血球数をカウントした。
実際にカウントしたサンプルの希釈倍率や全体のサンプル量から補正を行い、２ｍＬ血液および遠心後サンプルに存在する全白血球数を算出し、遠心分離前の白血球数に対する遠心分離後の白血球数の比を算出して、白血球回収率（％）を求めた。また、遠心後サンプルの全細胞数に対し、白血球数を除いた値を赤血球数とし、赤血球数と白血球数の比を算出し、赤血球混入比を求めた。その結果を表１に示す。
実際にカウントしたサンプルの希釈倍率や全体のサンプル量から補正を行い、２ｍＬ血液および遠心後サンプルに存在する全白血球数を算出し、遠心分離前の白血球数に対する遠心分離後の白血球数の比を算出して、白血球回収率（％）を求めた。また、遠心後サンプルの全細胞数に対し、白血球数を除いた値を赤血球数とし、赤血球数と白血球数の比を算出し、赤血球混入比を求めた。その結果を表１に示す。
［比較例1］
実施例１において、「２０％中性緩衝ホルマリン液」の代わりにＰＢＳを用いた以外は実施例１と同様にして白血球回収率と赤血球混入比を求めた。その結果を表１に示す。
実施例１において、「２０％中性緩衝ホルマリン液」の代わりにＰＢＳを用いた以外は実施例１と同様にして白血球回収率と赤血球混入比を求めた。その結果を表１に示す。
まず、抗凝固剤と細胞固定剤とが予め充填された採血管として市販されているＣｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ（Streck Innovations社製）一本当たりに、採血した血液3ｍＬを入れた。
この「Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」に充填されている細胞固定剤は、本発明者らが分析した結果、ジアゾリジニル尿素やイミダゾリジニル尿素などのホルムアルデヒド供与体であると予想され、血液混和後にホルムアルデヒドを徐放して細胞固定作用を発揮するものと考えられる。また、「Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」に充填されている抗凝固剤は、ＥＤＴＡ溶液であると考えられる。Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴを採血管として用いると、白血球の表面抗原が長時間保護されるという効果が期待されている。
次に、採血管を10回転倒し、混和した。
Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)に血液3ｍＬが入っているこのような採血管は３本用意し、10分間静置後、密度勾配遠心法を実施した群と；室温で２日間静置後に一度転倒混和（血漿成分と血球成分とが混和されるように）し、密度勾配遠心法を実施した群と；室温で３日間静置後に一度転倒混和し、密度勾配遠心法を実施した群とにそれぞれ用いた。
Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)に血液3ｍＬが入っているこのような採血管は３本用意し、10分間静置後、密度勾配遠心法を実施した群と；室温で２日間静置後に一度転倒混和（血漿成分と血球成分とが混和されるように）し、密度勾配遠心法を実施した群と；室温で３日間静置後に一度転倒混和し、密度勾配遠心法を実施した群とにそれぞれ用いた。
各採血管の内容物に対して、ＢＳＡを0.5重量％含むＰＢＳ溶液で２倍希釈した。そのうち４ｍＬを、密度勾配遠心用分離液（Ｆｉｃｏｌｌ〔フィコール〕(登録商標)、比重1.077）３ｍＬが予め充填された遠沈管の該分離液に重層し、室温で400×ｇで40分間遠心分離を行った。
密度勾配遠心後、赤血球層以外の層をすべて採取し、ＰＥ標識抗ＣＤ45抗体およびＨｏｅｃｈｓｔにて細胞染色を行った。そのうち20μＬを血球計算盤にて顕微鏡下で観察し、蛍光励起にて観察されるＰＥおよびＨｏｅｃｈｓｔ33342のシグナルを白血球としてカウントした。また、別途、密度勾配遠心前の血液由来検体（Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)で処理後）も一部採取しておき、同様に細胞染色を行い、適宜ＰＢＳ溶液で希釈して、密度勾配遠心前の白血球数をカウントした。実際にカウントしたサンプルの希釈倍率や全体のサンプル量から補正を行い、２ｍＬ血液および遠心分離後サンプルに存在する全白血球数を算出し、遠心分離前の白血球数に対する遠心分離後の白血球数の比を算出して、白血球回収率（％）を求めた。この結果を表２および図２に示す。
［比較例２］
実施例２において、「Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」の代わりに「ベノジェクト(登録商標)II真空採血管」（実施例１で用いたものと同じ、所定量のＥＤＴＡ-2Ｋが予め充填されている採血管）を用いた以外は、実施例２と同様にして白血球回収率を求めた。この結果を表２および図２に示す。
実施例２において、「Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」の代わりに「ベノジェクト(登録商標)II真空採血管」（実施例１で用いたものと同じ、所定量のＥＤＴＡ-2Ｋが予め充填されている採血管）を用いた以外は、実施例２と同様にして白血球回収率を求めた。この結果を表２および図２に示す。
［実施例３］ホルムアルデヒド処理血液とＣｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)処理血液の比較
ホルムアルデヒド〔ＦＡ〕による処理群として、実施例１において、血液３ｍＬに対するホルムアルデヒド〔ＦＡ〕の最終濃度が0.08ｖｏｌ％になるよう添加した採血管と、実施例１と同様にして、血液３ｍＬに対するホルムアルデヒド〔ＦＡ〕の最終濃度が0.16ｖｏｌ％になるよう添加して準備した採血管それぞれに対し、実施例１において、「室温で３日間静置した」ことに代えて、室温で１日間静置し、実施例１と同様にして白血球回収率を求めた。
また、Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴによる処理群（以下、「Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)処理」）として、実施例２において、静置及び混和を、１日間静置後に一度転倒混和することによって行ったこと以外は実施例２と同様にして白血球回収率を求めた。
これらの結果を表３に示す。
十分なホルムアルデヒド〔ＦＡ〕の最終濃度で処理すれば、静置１日後であっても、Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)処理の場合と同等の白血球回収率（％）を得られることがわかる。
ホルムアルデヒド〔ＦＡ〕による処理群として、実施例１において、血液３ｍＬに対するホルムアルデヒド〔ＦＡ〕の最終濃度が0.08ｖｏｌ％になるよう添加した採血管と、実施例１と同様にして、血液３ｍＬに対するホルムアルデヒド〔ＦＡ〕の最終濃度が0.16ｖｏｌ％になるよう添加して準備した採血管それぞれに対し、実施例１において、「室温で３日間静置した」ことに代えて、室温で１日間静置し、実施例１と同様にして白血球回収率を求めた。
また、Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴによる処理群（以下、「Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)処理」）として、実施例２において、静置及び混和を、１日間静置後に一度転倒混和することによって行ったこと以外は実施例２と同様にして白血球回収率を求めた。
これらの結果を表３に示す。
［実施例４］静置温度による白血球回収率および赤血球混入比
実施例２の３日間静置において、静置時の温度を振って白血球回収率と赤血球混入比を求めた。すなわち、「Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」による細胞固定化を行う際に、３日間静置を行う温度を、４℃，２０℃，２９℃，３７℃という４段階の温度に振ったことを除いては、実施例２と同様の操作を行い、それぞれのサンプルについて、白血球回収率及び赤血球混入比の算出を行った。
その結果を表４に示す。
室温（２０℃）が特に白血球回収率および赤血球混入比において適していることがわかる。
実施例２の３日間静置において、静置時の温度を振って白血球回収率と赤血球混入比を求めた。すなわち、「Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」による細胞固定化を行う際に、３日間静置を行う温度を、４℃，２０℃，２９℃，３７℃という４段階の温度に振ったことを除いては、実施例２と同様の操作を行い、それぞれのサンプルについて、白血球回収率及び赤血球混入比の算出を行った。
その結果を表４に示す。
［実施例５］4℃および20℃における白血球回収率および赤血球混入比の経時変化
実施例４において、長時間の保管に適していると推測された4℃および20℃において、白血球回収率および赤血球混入比についての、採血日から５日間の経時変化を実施例２と同様な方法で追跡した。すなわち、「Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」による細胞固定化を行う際に、静置を行う温度を４℃，２０℃という２段階の温度に振るとともに、静置を行う時間についても10分間（０日），３日間（３日），５日間（５日）という３段階の時間に振ったことを除いては、実施例２と同様の操作を行い、それぞれのサンプルについて、白血球回収率及び赤血球混入比の算出を行った。
ここで、比較例２と同様に細胞固定化を行わなかったサンプルについての、20℃における白血球回収率および赤血球混入比の経時変化についても同様に追跡を行った。
結果を図３に示す。
実施例４において、長時間の保管に適していると推測された4℃および20℃において、白血球回収率および赤血球混入比についての、採血日から５日間の経時変化を実施例２と同様な方法で追跡した。すなわち、「Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」による細胞固定化を行う際に、静置を行う温度を４℃，２０℃という２段階の温度に振るとともに、静置を行う時間についても10分間（０日），３日間（３日），５日間（５日）という３段階の時間に振ったことを除いては、実施例２と同様の操作を行い、それぞれのサンプルについて、白血球回収率及び赤血球混入比の算出を行った。
ここで、比較例２と同様に細胞固定化を行わなかったサンプルについての、20℃における白血球回収率および赤血球混入比の経時変化についても同様に追跡を行った。
結果を図３に示す。
1・・・遠沈管
2・・・細胞固定された血液由来検体
3・・・分離液
4・・・血小板が多く含まれる血漿からなる層
5・・・単核球が多く含まれる層
6・・・分離液の層
7・・・赤血球が多く含まれる層
2・・・細胞固定された血液由来検体
3・・・分離液
4・・・血小板が多く含まれる血漿からなる層
5・・・単核球が多く含まれる層
6・・・分離液の層
7・・・赤血球が多く含まれる層
Claims (11)
- 血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に含まれる赤血球を予め除去する方法であって、
(Ａ)：血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程；および
(Ｂ)：上記工程(Ａ)で得られた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程
を含む赤血球除去方法。 - 上記工程(Ａ)において、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、細胞固定剤を、その濃度が0.01ｖｏｌ％以上50.0ｖｏｌ％以下となるように含ませる、請求項1に記載の赤血球除去方法。
- 上記工程(Ａ)において、ホルムアルデヒド供与体を細胞固定剤として用いて細胞を固定する場合、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、ホルムアルデヒド供与体の濃度が0.1ｖｏｌ％以上10.0ｖｏｌ％以下となるように含ませる、請求項1に記載の赤血球除去方法。
- 上記工程(Ａ)において、ホルムアルデヒドを細胞固定剤として用いて細胞を固定する場合、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、ホルムアルデヒドの濃度が0.01ｖｏｌ％以上1.0ｖｏｌ％以下となるように含ませる、請求項1に記載の赤血球除去方法。
- 上記工程(Ａ)において、アルコール類を用いて細胞を固定する場合、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、該細胞固定剤の濃度が1.0ｖｏｌ％以上50.0ｖｏｌ％以下となるように含ませる、請求項1に記載の赤血球除去方法。
- 上記工程(Ａ)において、細胞固定する時間が10分間以上7日間以下である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の赤血球除去方法。
- 上記工程(Ａ)において、細胞固定するとともに血液凝固を阻害する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の赤血球除去方法。
- 上記工程(Ｂ)において、密度勾配遠心法に用いる分離液の比重が、1.113以下である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の赤血球除去方法。
- 上記工程(Ｂ)において、密度勾配遠心法に用いる分離液の比重が、1.085以下である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の赤血球除去方法。
- 上記工程(Ｂ)を実施した後、赤血球が多く含まれる層以外の層を全部採取する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の赤血球除去方法。
- 細胞固定剤、抗凝固剤および密度勾配遠心用分離液が予め充填されている採血用遠沈管。
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