KR20190109738A - 단핵구 분리 장치 및 단핵구 분리 방법 - Google Patents

단핵구 분리 장치 및 단핵구 분리 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20190109738A
KR20190109738A KR1020197023385A KR20197023385A KR20190109738A KR 20190109738 A KR20190109738 A KR 20190109738A KR 1020197023385 A KR1020197023385 A KR 1020197023385A KR 20197023385 A KR20197023385 A KR 20197023385A KR 20190109738 A KR20190109738 A KR 20190109738A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
monocyte
layer
centrifugation
clots
container
Prior art date
Application number
KR1020197023385A
Other languages
English (en)
Inventor
아키히코 타구치
유키코 니노
타카시 츠무라
켄이치 모리타
Original Assignee
고에키 자이단 호징 고베 이료 산교 도시 스이신 기코
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고에키 자이단 호징 고베 이료 산교 도시 스이신 기코 filed Critical 고에키 자이단 호징 고베 이료 산교 도시 스이신 기코
Publication of KR20190109738A publication Critical patent/KR20190109738A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/02—Blood transfusion apparatus
    • A61M1/0281—Apparatus for treatment of blood or blood constituents prior to transfusion, e.g. washing, filtering or thawing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/491—Blood by separating the blood components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/56—Labware specially adapted for transferring fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/02—Blood transfusion apparatus
    • A61M1/0272—Apparatus for treatment of blood or blood constituents prior to or for conservation, e.g. freezing, drying or centrifuging
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/02—Blood transfusion apparatus
    • A61M1/029—Separating blood components present in distinct layers in a container, not otherwise provided for
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/021—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5021—Test tubes specially adapted for centrifugation purposes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B04—CENTRIFUGAL APPARATUS OR MACHINES FOR CARRYING-OUT PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES
    • B04B—CENTRIFUGES
    • B04B11/00—Feeding, charging, or discharging bowls
    • B04B11/04—Periodical feeding or discharging; Control arrangements therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B04—CENTRIFUGAL APPARATUS OR MACHINES FOR CARRYING-OUT PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES
    • B04B—CENTRIFUGES
    • B04B13/00—Control arrangements specially designed for centrifuges; Programme control of centrifuges
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B04—CENTRIFUGAL APPARATUS OR MACHINES FOR CARRYING-OUT PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES
    • B04B—CENTRIFUGES
    • B04B5/00—Other centrifuges
    • B04B5/04—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers
    • B04B5/0442—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers with means for adding or withdrawing liquid substances during the centrifugation, e.g. continuous centrifugation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
    • G01N1/14—Suction devices, e.g. pumps; Ejector devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5002—Partitioning blood components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M2202/00—Special media to be introduced, removed or treated
    • A61M2202/04—Liquids
    • A61M2202/0413—Blood
    • A61M2202/0439—White blood cells; Leucocytes
    • A61M2202/0443—Macrophages, e.g. monocytes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0663—Whole sensors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B04—CENTRIFUGAL APPARATUS OR MACHINES FOR CARRYING-OUT PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES
    • B04B—CENTRIFUGES
    • B04B13/00—Control arrangements specially designed for centrifuges; Programme control of centrifuges
    • B04B2013/006—Interface detection or monitoring of separated components

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)

Abstract

본 발명의 단핵구 분리 장치는, 혈액 시료가 저장된 용기(100)의 저면으로부터 원심분리 매체를 주입하는 주입 수단(210); 원심분리 매체와 혈액 시료가 저면측으로부터 이 순서로 적층되어 있는 용기(100)에 의해 수행될 원심 분리를 유발하는 원심 분리 수단(300); 원심분리 후에 단핵구 층에 존재하는 응혈괴를 검출하는 검출 수단(400); 검출된 응혈괴를 제거하는 제거 수단(220); 및 단핵구를 채취하는 채취 수단(230)을 포함한다. 또한, 본 발명에 따르는 단핵구 분리 방법은, 본 발명의 단핵구 분리 장치의 각 구성 요소에 대응하는, 주입 단계, 원심분리 단계, 검출 단계, 제거 단계 및 채취 단계를 포함한다.

Description

단핵구 분리 장치 및 단핵구 분리 방법
본 발명은 단핵구 분리 장치 및 단핵구 분리 방법에 관한 것이다.
최근, 허혈성 질환 환자의 골수액을 채취하고, 비중 원심분리법으로 골수액 중에 존재하는 단핵구를 분리하고, 분리한 단핵구를 허혈의 국소 또는 혈관에 이식하여 혈관의 재생을 촉진하는 세포 치료가 개시되고 있다. 골수액으로부터 비중 원심분리법을 이용하여 단핵구를 분리하는 목적은 골수액에 포함된 과립구와 적혈구를 제거하는 것이며, 이러한 세포를 제거하여 세포 치료의 치료 효과가 향상될 것으로 생각되고 있다.
한편, 골수액은 매우 응고되기 쉬우므로, 환자의 골수액 채취 동안, 항응고제를 충분히 사용하여도, 응혈괴(clot)의 형성을 완전히 방지하는 것은 매우 곤란하다. 응혈괴는 피브린이 모여 망목 구조를 만들고, 거기에 적혈구가 얽혀 생긴 것이며, 응혈괴의 주성분은 피브린, 혈소판 및 적혈구이다. 골수 세포를 이용한 치료에서, 응혈괴는 치료에 방해가 되는 경우가 많기 때문에, 예를 들면, 백혈병 환자에 대한 타가 골수 세포 이식시에는 500ml 이상의 골수액을 채취하고, 먼저 기공 크기가 다른 3 종류의 골수 이식용 필터를 통해, 응혈괴를 제거한 후에, 비중 원심분리법으로 골수액 중에 존재하는 단핵구를 분리한다. 사지 허혈 환자에 대한 자가 골수액을 이용한 재생 치료는 혈관 재생을 촉진하는 것으로 나타나고 있지만(비특허 문헌 1), 백혈병 환자에 대한 타가 골수 세포 이식과 마찬가지로, 500ml 이상의 골수액을 채취하고, 기공 크기가 다른 3 종류의 골수 이식용 필터를 통해, 응혈괴를 제거한 후에, 세포 분리 장치를 사용하고 비중 원심분리법으로 골수액 중에 존재하는 단핵구를 분리하고, 환자에 이식하고 있다. 또한, 뇌경색 환자에 대한 자가 골수액을 이용한 재생 치료는 신경 기능 회복을 촉진할 것을 시사하고 있지만(비특허 문헌 2), 백혈병 환자와 사지 허혈 환자와 비교하면 소량인 25ml 또는 50ml의 골수액을 채취하고, 셀 프로세싱 센터 내에서 수작업으로 단핵구의 분리를 실시하고, 단핵구를 포함하는 층에 혼입된 응혈괴는, 수작업으로 제거한 후, 환자에게 이식하고 있다. 또한, 사지 허혈 환자에 비해, 뇌경색 환자에서 비교적 소량의 골수액을 이용하는 이유는 소량으로도 충분한 효과를 기대할 수 있고(비특허 문헌 3), 대량의 골수 채취에 의한 혈압 저하가 뇌경색 증상의 악화를 일으킬 수 있기 때문이다. 또한, 비교적 소량의 골수액의 분리 정제시에 필터를 사용하여 응혈괴를 제거하면, 필터 부분에서 볼륨 손실이 많고 골수액 양이 현저하게 감소하기 때문에, 필터를 사용하는 것은 곤란하다. 마찬가지로, 수작업으로 골수 단핵구를 분리하고 심근 경색 환자에게 투여한 시험에서는, 세포 이식의 효과가 나타나고 있지만(비특허 문헌 4), 응혈괴의 제거 기능이 없는 세포 분리 장치에 의해 분리된 세포를 이용한 임상 시험에서는 효과가 나타나지 않았다(비특허 문헌 5)는 것이 보고되고 있다. 단, 셀 프로세싱 센터에서 수작업으로 단핵구의 분리는, 번잡한 작업 외에도, 셀 프로세싱 센터의 구축 및 유지에 많은 비용이 든다. 따라서, 기존의 장비 이외에도 특허문헌 1과 같이 셀 프로세싱 센터가 불필요한 골수 단핵구의 분리 장치가 고안되어 있지만, 그 장치는 응혈괴의 제거 기능은 갖고 있지 않다.
선행 기술 문헌
특허 문헌
특허 문헌 1: WO 2011/001936
비특허 문헌
비특허 문헌 1: Taguchi et al. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2003 Mar; 25 (3): 276-8
비특허 문헌 2: Taguchi et al. Stem Cells Dev. 2015 Oct 1; 24 (19): 2207-18
비특허 문헌 3: Uemura et al. Curr Vasc Pharmacol. 2012 May; 10 (3): 285-8.
비특허 문헌 4: Schachinger V N Engl J Med. 2006 Sep 21; 355 (12): 1210-21
비특허 문헌 5: Traverse JH, JAMA. 2012 Dec 12; 308 (22): 2380-9.
본 발명은 이러한 문제점을 감안하여 이루어진 것으로서, 채취할 단핵구 성분으로 적혈구 등을 포함하는 응혈괴 유래 세포의 혼입이 발생하기 어려운 단핵구 분리 장치 및 단핵구 분리 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 단핵구 분리 장치는, 혈액 시료를 저장한 용기의 저면으로부터 원심분리 매체(medium)를 주입하는 주입 수단, 원심분리 매체와 혈액 시료가 저면측에서 이 순서로 적층되어있는 용기를 원심분리하는 원심분리 수단, 원심분리 후에 골수 단핵구 층에 존재하는 응혈괴를 검출하는 검출 수단, 검출된 응혈괴를 제거하는 제거 수단 및 골수 단핵구를 채취하는 채취 수단을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 단핵구 분리 방법은, 혈액 시료가 저장된 용기의 저면에 원심분리 매체를 주입하는 주입 단계, 원심분리 매체와 혈액 시료가 저면측에서 이 순서로 적층되어 있는 용기를 원심분리하는 원심분리 단계, 원심분리 후에 단핵구 층에 존재하는 응혈괴를 검출하는 검출 단계, 검출된 응혈괴를 제거하는 제거 단계, 및 단핵구를 채취하는 채취 단계를 포함한다.
본 발명에 의하면, 분리 채취된 단핵구 성분으로 적혈구 등을 포함하는 응혈괴 유래 세포의 혼입이 발생하기 어렵다.
[도 1] 도 1은 본 실시형태에 따른 단핵구 분리 장치의 외관도이다.
[도 2] 도 2는 응혈괴의 촬영(imaging) 수단을 설명하는 개념도이며, 그 중 (A)는 측부 촬영 수단을 설명하는 도면이며, (B)는 상부 촬영 수단을 설명하는 도면이다.
[도 3] 도 3은 용기에 혈액 시료를 저장한 후, 노즐 개방 단부를 용기 저부에 이동시킬 때까지의 공정 설명도이다.
[도 4] 도 4는 용기 저부에 원심분리 매체의 주입 개시부터 원심분리 완료까지의 공정 설명도이다.
[도 5] 도 5는 혈장의 흡입 개시부터 흡입 완료까지의 공정 설명도이다.
[도 6] 도 6은 단핵구 층의 상부에 존재하는 응혈괴의 제거 개시부터 응혈괴 제거 완료까지의 공정 설명도이다.
[도 7] 도 7은 단핵구 층의 채취 개시부터 채취 완료까지의 공정 설명도이다.
[도 8] 도 8은 위축 지수(Atrophy index)의 측정 방법의 설명도이다.
[도 9] 도 9는 본 실시예에 따르는 방법에 의해 분리한 골수 단핵구의 허혈 장애 억제 효과를 나타내는 도면이다.
[도 10] 도 10은 본 실시예에 따르는 방법에 의해 분리한 골수 단핵구 투여의 대뇌 피질 기능 회복 촉진 효과를 나타내는 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시형태에 대해 구체적으로 설명하지만, 본 실시형태는 본 발명의 원리의 이해를 용이하게 하기 위한 것이며, 본 발명의 범위는 하기의 실시형태에 한정되는 것이 아니라, 당업자가 이하의 실시형태의 구성을 적절하게 치환한 다른 실시형태도 본 발명의 범위에 포함된다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 실시형태에 따른 단핵구 분리 장치(900)는 혈액 시료가 저장된 용기(100)의 저면으로부터 원심분리 매체를 주입하는 주입 수단(210), 원심분리 매체와 혈액 시료가 저면측으로부터 이 순서로 적층되어있는 용기(100)를 원심분리시키는 원심분리 수단(300), 원심분리 후에 단핵구 층에 존재하는 응혈괴를 검출하는 검출 수단(400), 검출된 응혈괴를 제거하는 제거 수단(220), 및 단핵구를 채취하는 채취 수단(230)을 포함한다.
용기(100)는, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱 원심관이다. 혈액 시료는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 골수액이다. 골수액은, 예를 들면, 척추 동물(인간을 포함)을 마취시키고(국소 또는 전신 마취), 골에 바늘을 꽂아 주사기로 흡인하여 채취하는 것이 가능하다. 골로서는, 예를 들면, 대퇴골, 흉골, 골반을 형성하고 있는 장골 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
원심분리 매체를 주입하는 주입 수단(210)은, 원심분리 매체 공급 장치(도시되지 않음)에 접속되고 용기(100) 내에 원심분리 매체를 주입할 수 있는 노즐과, 이 노즐의 개방 단부를 혈액 시료가 저장된 용기(100)의 저면으로 이동시키는 이동 기구(도시되지 않음)를 구비한다. 원심분리 매체 공급 기구는 공지된 액체 공급 기구를 사용할 수 있으며, 예를 들면, 원심분리 매체를 수용하는 탱크, 송액 주사기, 유로, 전자 밸브(electromagnetic valve) 등으로 구성된다. 원심분리 매체는 특별히 한정되는 것이 아니라, 예를 들면, 퍼콜(Percoll)(등록 상표), 림포프렙(Lymphoprep)(등록 상표) 등의 밀도 구배 형성용으로 시판되고 있는 매체가 사용될 수 있으며, 피콜-파크(Ficoll-Paque)(등록 상표)와 나이코프렙(Nycoprep)(등록 상표) 등도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 피콜-파크 프레미엄(Ficoll-Paque PREMIUM)(Ficoll은 등록 상표)이다.
주입 수단(210)에서 원심분리 매체의 주입은, 급격하게 하면 원심분리 매체와 혈액 시료의 혼합 때문에 원심분리 매체와 혈액 시료와의 계면이 손상될 우려가 있으므로, 소정 속도 이하로 주입하는 것이 바람직하며, 구체적으로는, 용기(100)가 50mL의 원심관의 경우, 0.05mL/초 내지 1.0mL/초에서 원심분리 매체를 주입하는 것이 가능하다.
원심분리 수단(300)은 공지된 원심분리 장치를 사용할 수 있고, 원심분리 매체와 혈액 시료가 저면측에서 이 순서로 적층되어있는 용기(100)를 원심분리시킨다. 원심분리 수단(300)은 모터에 의해 회전하는 회전축에 설치된, 예를 들면, 4개의 버킷을 갖고, 이 버킷에 용기(100)가 수용되도록 되어 있다.
원심분리할 때, 혈액 샘플을 저장한 용기(100)에 대향하는 위치에 수용하는 카운터 웨이트는, 상기 주입 수단(210)에서 다른 용기(100)에 PBS 또는 혈액 시료 및 원심분리 매체를 주입시켜 제조할 수 있다.
원심분리 후는, 용기(100) 내에서 용기 저부로부터 순서로, 적혈구 층, 원심분리 매체 층, 단핵구 층, 혈장 층일 수 있지만, 검출 수단(400)은 원심분리 후에 단핵구 층에 존재하고, 제거 대상으로 되는 응혈괴를 검출한다. 여기에서 단핵구 층에 존재하고, 제거 대상으로 되는 응혈괴는 단핵구 층에 존재하는 응혈괴와 단핵구 층 위에 존재하는 응혈괴를 포함한다.
검출 수단(400)은 용기(100) 내의 단핵구 층을 수직 상향 방향에서 촬영하는 상부 촬영 수단(410), 용기(100) 내의 단핵구 층을 수평 방향에서 촬영하는 측부 촬영 수단(420), 상부 촬영 수단에 의해 촬영하여 수득된 이미지 및 측부 촬영 수단에 의해 촬영하여 수득된 이미지에서 수득되는 색채 정보에 기초하여 단핵구 층에 존재하는 응혈괴의 위치 정보를 검출하는 위치 정보 검출 수단(도시되지 않음)을 포함한다. 상부 촬영 수단(410) 및 측부 촬영 수단(420)은, 예를 들면, CCD 카메라이며, 이 CCD 카메라에 의해 촬영된 이미지는 컬러 이미지로서 모니터에서 표시된다(도시되지 않음).
도 2(A)에 도시된 바와 같이, 원심분리 후에는 적혈구 층(40)은 최하층에, 단핵구 층(20)은 혈장 층(10)과 원심분리 매체(30)의 중간에 백색의 띠모양 층으로 관찰된다. 응혈괴(90)(도 2에서, 응혈괴(90)는, 예를 들면, 90a, 90b, 90c, 90d로 이루어지는 것으로 한다.)는 주로 적혈구에서 구성되기 때문에 적색의 이물질로 관찰된다.
도 2(B)에 도시된 바와 같이, 상부 촬영 수단(410)에 의해 단핵구 층(20)(백색)을 배경으로 하는 응혈괴(90a 및 90d)와 단핵구 층(20)의 하부에 위치하는 응혈괴(90b 및 90c) 및, 단핵구 층 내의 응혈괴(도시되지 않음)가 촬영된다. 그리고, 위치 정보 검출 수단은 상부 촬영 수단(410)의 촬영한 이미지에 대해 공간 필터 등을 적용하여 휘도가 변화하는 부분을 강조하고, 이 강조한 부분을, 예를 들면, 이진화하여 단핵구 층(20)(백색)을 배경으로 하는 응혈괴(90a 및 90d)와 단핵구 층(20)의 하부에 위치하는 응혈괴(90b 및 90c) 및 단핵구 층 내의 응혈괴의 평면시에서 위치 정보를 검출한다.
그러나, 상단 촬영 수단(410)에 의해 촬영된 이미지만으로는 단핵구 층(20)의 상부에 위치하는 응혈괴(90a, 90d)와 단핵구 층(20)의 하부에 위치하는 응혈괴(90b, 90c) 및 단핵구 층 내의 응혈괴의 구별이 곤란하다.
그래서, 본 실시형태에 따른 발명에서는 도 2(A)에 도시된 바와 같이, 측부 촬영 수단(420)에 의해 수평 방향으로도 응혈괴(90)를 촬영하고, 위치 정보 검출 수단은 측부 촬영 수단(420)의 촬영 이미지에 기초하여 단핵구 층(20)의 상부에 위치하는 응혈괴(90a, 90d)와 단핵구 층(20)의 하부에 위치하는 응혈괴(90b, 90c) 및 단핵구 층 내의 응혈괴의 구별을 수행한다. 이에 따라, 위치 정보 검출 수단은 단핵구 층(20)에 존재하는 제거 대상으로 되는 응혈괴(도 2에서, 단핵구 층(20)의 상부에 존재하는 응혈괴(90a, 90d))를 검출할 수 있다.
또한, 작업 효율의 관점에서, 단핵구 층(20)의 상부에 존재하는 응혈괴 전체를 검출하여 제거하는 것이 아니라, 단핵구 층(20)의 상부에 존재하는 응혈괴 중 소정 크기의 응혈괴만을 검출하여 제거할 수 있다. 예를 들면, 검출 수단(400)은, 응혈괴를 회전 타원체와 유사한 형태로 파악하는 경우, 적도 반경 또는 극반경의 어느 하나가 5mm 이상인 경우에 제거 대상으로 되는 응혈괴로서 검출할 수 있다. 또한, 예를 들면, 검출 수단(400)은 단핵구 층(20) 위에 존재하는 응혈괴 중 상부 촬영 수단(410)에 의해 촬영된 응혈괴의 평면시에서의 면적을 계산하고, 소정 면적 이상의 것을 제거 대상으로 되는 응혈괴로 검출할 수 있다.
제거 수단(220)은 위치 정보 검출 수단에 의해 검출된, 단핵구 층(20)에 존재하고, 제거 대상으로 되는 응혈괴(도 2에서는 단핵구 층(20)의 상부에 존재하는 응혈괴(90a, 90d))를 제거한다. 제거 수단(220)은 응혈괴 흡입 기구(도시되지 않음)에 접속되고 응혈괴를 흡입할 수 있는 노즐과, 이 노즐의 개방 단부를 단핵구 층(20)에 존재하는 응혈괴로 이동시키는 이동 기구(도시되지 않음)를 구비한다.
검출된 응혈괴를 제거하기 쉽게 하기 위해, 응혈괴를 제거하기 전에 혈장 층(10)을 제거하는 혈장 층 제거 수단을 마련하는 것이 가능하다. 혈장 층 제거 수단은 공지의 액체 흡입 기구를 사용할 수 있으며, 예를 들면, 흡입 노즐, 흡입한 혈장 층을 수용하는 탱크, 흡입 펌프, 유로 등으로 구성된다. 혈장 층(10)은 후술한 이유로 소량의 혈장 층(10)을 잔존시키면서 흡입을 완료하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 용기(100) 내의 혈장 층(10)의 액체 양의 10% 내지 20%를 잔존시켜 흡입을 완료하는 것이 바람직하다. 본 발명은 또한, 혈장 층을 제거한 후에 응혈괴를 제거하는 구성으로 한정되지 않고, 혈장 층의 흡입 제거와 동시에 응혈괴를 제거할 수 있으며, 또한 혈장 층(10)을 제거하지 않고서 응혈괴를 제거할 수 있다.
채취 수단(230)은 단핵구 채취 백(도시되지 않음)에 접속되고 단핵구를 채취할 수 있는 노즐과, 이 노즐의 개방 단부를 단핵구 층(20)으로 이동시키는 이동 기구를 구비한다. 채취한 단핵구는 그대로 사용하는 것도 가능하고, 또한 사용하기 전에, 예를 들면, 생리식염수를 첨가하여 원심분리기에 의해 복수회 세척을 수행할 수도 있다. 소량의 혈장 층(10)을 잔존시켜 혈장 층의 흡입을 완료한 경우에는 단핵구 층을 채취할 때에 잔존 혈장 층도 흡입할 수 있지만, 사용 전에 단핵구의 세척을 수행함으로써 잔존 혈장 층의 혼입을 배제할 수 있다.
이어서, 상술한 구성을 갖는 본 실시형태에 따른 단핵구 분리 장치(900)의 사용 양태의 한 가지 구체예에 대해 설명한다.
도 3 좌측에 나타낸 바와 같이, 피험자로부터 채취한 혈액 시료(50)를 용기(100)에 저장한다. 이어서, 도 3 중앙에 나타낸 바와 같이, 원심분리 매체를 주입가능한 노즐의 개방 단부가, 혈액 시료를 저장한 용기(100)에 투입된다. 이어서, 도 3 우측에 나타낸 바와 같이, 노즐의 개방 단부는 혈액 시료를 저장한 용기(100)의 저면으로 이동하게 된다.
도 4 좌측에 나타낸 바와 같이, 주입 수단(210)에 의해 원심분리 매체(30)의 주입이 개시되고, 도 4 중앙에 나타낸 바와 같이, 원심분리 매체(30)가 용기(100)의 저면측에 저장된다. 그 후, 도 4 우측에 나타낸 바와 같이, 원심분리 후는, 용기(100) 내에서 용기 저부로부터 순차로 적혈구 층(40), 원심 분리 매체(30), 단핵구 층(20), 혈장 층(10)일 수 있고, 추가로 이물질인 응혈괴(90a, 90b, 90c, 90d)도 존재할 수 있다.
도 5 좌측에 나타낸 바와 같이, 노즐에 의해 혈장 층(10)의 흡입이 개시된다. 여기에서 노즐은 혈장 층(10)의 상부에 위치한다. 즉, 노즐은 혈장 층(10) 및 단핵구 층(20)의 경계 부분으로부터 격리된 위치에서 혈장 층(10)의 제거를 개시한다. 노즐의 앞인 노즐 개방 단부가 해당 경계 부분에 가까우면, 혈장 층(10)을 흡입 제거할 때에 생기는 유동으로 골수 단핵구가 권입되어, 수율이 저하될 우려가 있기 때문이다.
그리고, 도 5 중앙에 나타낸 바와 같이, 잔존 양이 소량일 때까지 혈장 층(10)의 흡입이 계속되고, 그 후 도 5 우측에 나타낸 바와 같이, 소량의 혈장 층(10)을 잔존시켜 혈장 층의 흡입이 완료된다. 혈장 층(10)을 모두 제거할 수 있지만, 혈장 층(10)을 제거할 때에 단핵구 층(20) 내에 존재하는 단핵구도 흡입하여 제거할 우려가 있기 때문에, 소량의 혈장 층(10)을 잔존시켜 혈장 층의 흡입을 완료하는 것이 바람직하다.
도 6 좌측에 나타낸 바와 같이, 본 실시형태에서는 단핵구 층(20)의 상부에 존재하는 응혈괴(90a, 90d)의 제거가 개시된다. 그리고, 도 6 중앙에 나타낸 바와 같이, 제거 수단(220)에 의해 우선 응혈괴(90d)가 제거되고, 그 후 도 6 우측에 나타낸 바와 같이, 응혈괴(90a)가 제거된다.
도 7 좌측에 나타낸 바와 같이, 단핵구를 채취가능한 노즐의 개방 단부가 단핵구 층(20) 내에 도입되고, 이어서 도 7 중앙에 나타낸 바와 같이, 노즐에 의해 단핵구 층(20)의 흡입이 개시되고, 그 후 도 7 우측에 나타낸 바와 같이, 모든 단핵구 층(20)의 채취가 완료된다.
실시예
(실시예 1) 골수 단핵구의 허혈 장애 억제 효과
응혈괴의 혼입을 억제한 본 실시예에 따르는 단핵구 분리 방법에 의해 분리한 골수 단핵구에 의한 허혈 장애 억제 효과를 검증하기 위해, 본 발명자들이 개발한 재현성이 높은 허혈 모델 마우스[참조: Taguchi et al. J Exp Stroke Transl Med. 2010; 3: 28-33]을 이용한 실험을 실시했다. 뇌경색 48시간 후에, 꼬리 정맥으로부터 1x105개의 분리된 골수 단핵구를 투여하고, 세포 투여 30일 후의 허혈 장애 억제 효과에 대한 평가 방법으로서, 매크로 표본에 의한 뇌 위축 점수[참조: Taguchi et al . Eur J Neurosci. 2007; 26 (1): 126-133.]을 사용했다. 비치료 대조군에서는 세포 투여 그룹과 동량(100μl)의 생리식염수를 꼬리 정맥으로부터 투여했다. 실험에는 각 그룹 6마리의 허혈 마우스를 사용했다.
골수 세포 투여의 미세 혈관에 미치는 영향을 검증하는 허혈 모델은 하기의 방법으로 제조했다.
8주령의 SCID 마우스(severe combined immunodeficiency mouse: 중증 복합 면역 결핍 마우스)를 하로센 마취에 의해 전신 마취하고, 좌측 광대뼈 부분보다 접근하여 좌중앙 대뇌 동맥에 직달할 수 있도록 두개골에 1.5mm 정도의 천공을 수행했다. 후각로를 통과한 직후(후각 교차점 원위측)의 좌중앙 대뇌 동맥을, 바이폴라 전기 메스를 사용하여 응고시키고, 응고 후 절단하여 좌중앙 대뇌 동맥을 영구적으로 폐쇄하고, 좌중앙 대뇌 동맥 영역의 피질에 국한하는 허혈 부위 및 허혈 강도의 재현성이 우수한 허혈 모델을 제조했다.
이어서, 인간 골수액을 구입하고, 골수 세포가 들어있는 튜브(용기)의 저면으로부터 피콜-파크 프레미움(Ficoll-Paque PREMIUM)(피콜은 등록 상표) 용액을 주입한 후, 튜브를 400G에서 40분간 원심분리했다. 단핵구 층의 상부에 혼재하는 장경 5mm 이상의 응혈괴를 제거한 후, 단핵구 층 성분을 흡입하여 채취하고, 새로운 튜브로 옮겼다. 세포는 투여 전에, 알부민 함유 생리식염수(최종 알부민 농도 2%)로 원심분리기를 이용하여 세정을 2회 수행했다.
매크로 표본에 의한 허혈 장애 점수의 상세는 하기와 같다. 본 연구에서 사용한 뇌허혈 모델은 허혈이 좌중앙 대뇌 동맥을 관류하는 대뇌 피질에 국한된 것이지만, 허혈 후는 염증 세포의 침윤 등에 의해, 반대측(뇌허혈이 없는 측면)과 비교하여, 허혈 측면에서는 명백한 조직의 위축이 발생한다. 위축 정도의 정량적 평가에 위축 지수(Atrophy index)가 유용하다는 것을 나타냈다[참조: Taguchi et al. Eur J Neurosci. 2007; 26 (1): 126-133]. 위축 지수의 측정 방법을 도 8에 나타낸다. 또한, 위축 지수는 X/Y×100(%)로 표시된다.
허혈 장애 경감에 대한 치료 효과를 도 9에 나타낸다. 위축 지수는 뇌 위축을 나타내는 지표이다. 대조군은 생리식염수를 투여한 그룹이다. 실시예는 골수 단핵구를 투여한 그룹이다. 1×105개의 골수 단핵구의 투여에 의해 생리식염수 투여 그룹과 비교하여 통계학적으로도 유의하게 허혈 장애 경감 효과가 있는 것으로 나타났다. * 표시는 대조군 그룹과 골수 단핵구 그룹 사이에 통계학적 유의차가 있음을 나타낸다.
이상의 결과로부터, 본 실시예에 따르는 방법에 의해 분리한 골수 단핵구의 우수한 허혈 장애 억제 효과가 밝혀졌다.
(실시예 2) 골수 단핵구에 의한 허혈 장애로부터의 기능 회복 촉진 효과
응혈괴의 혼입을 억제한 본 실시예에 따르는 단핵구 분리 방법에 의해 분리한 골수 단핵구에 의한 허혈 장애로부터의 기능 회복 촉진 효과를 검증하기 위해, 본 발명자들이 개발한 재현성이 높은 허혈 모델 마우스를 이용했다[참조: Taguchi et al. J Exp Stroke Transl Med. 2010; 3: 28-33]. 뇌경색 작성 48시간 후에, 꼬리 정맥으로부터 1×105개의 분리된 골수 단핵구를 투여하고, 세포 투여 30일 후에 허혈 장애로부터의 기능 회복 촉진 효과에 관한 평가 방법으로서, 오픈 필드 테스트에 의한 명암 조건에 대한 반응성[참조: Taguchi et al. J Clin Invest. 2004; 114: 330-338]을 사용했다. 실험에는 각 그룹 6마리의 허혈 마우스를 사용했다. 골수 세포 투여의 기능 회복 촉진 효과를 검증하는 허혈 모델은 실시예 1과 동일한 방법을 사용했다. 투여할 세포의 처리는 실시예 1과 동일한 방법을 사용했다.
기능 회복 촉진 효과에 관한 평가 방법으로서, 오픈 필드 테스트를 실시했다. 그의 측정 원리 및 측정 방법은 하기와 같다. 마우스는 야행성이기 때문에, 정상의 마우스에서는, 명 조건에서는 행동량이 감소하고, 환경을 어둡게 하는 것에 의해 행동량이 증가하는 것으로 알려져 있다. 명 조건하에서 행동 억제에 있어서는 대뇌 피질 기능이 중요하며, 또한 세포 치료에 의해 대뇌 피질 기능이 회복하고, 명 조건하에서 행동 억제 기능이 회복되는 것으로 밝혀져있다[참조: Taguchi et al. J Clin Invest 2004; 114: 330-338]. 본 연구에서는 마우스를 오픈 필드 측정 장치(고우이켄(KOUIKEN)사 제조, 자유 이동 공간 40cm×40cm)에서 명 조건하에서 30분간 직립(standing-up)행동(뒷발로 서기(rearing))의 회수를 자동 계산하고, 그 후 암 조건하에서 30분간 직립반응의 회수를 계산했다. 명 조건으로부터 암 조건으로 변화했을 때의 운동량의 증가를 기능 회복의 지표로 사용했다.
골수 단핵구 투여에 의한 허혈 장애로부터의 기능 회복 촉진 효과의 결과를 도 10에 나타낸다. 대조군은 생리식염수를 투여한 그룹이다. 실시예는 골수 단핵구를 투여한 그룹이다. 도 10은 생리식염수가 투여된 경우 및 골수 단핵구가 투여된 경우의 각각에 대해서 마우스의 직립 회수를 표시하고, 백색은 명 조건하에서 직립 회수, 흑색은 암 조건하에서 직립 회수를 나타낸다. 생리식염수가 투여된 그룹에서는 암 조건으로의 변화에 의해 유의한 운동량의 증가가 확인되지 않았지만, 골수 단핵구의 투여에 의해 통계적으로 유의한 암 조건에 대한 행동량의 증가가 관찰되었다. * 표시는 골수 단핵구 그룹에서, 명 조건으로부터 암 조건으로의 변화로 직립 회수의 통계학적으로 유의한 증가가 확인된 것을 나타낸다. 즉, 골수 단핵구의 투여로 뇌신경 기능 회복 촉진 효과가 있는 것으로 나타났다.
이상의 결과로부터, 본 실시예에 따르는 방법에 의해 분리한 골수 단핵구 투여의 우수한 대뇌 피질 기능 회복 촉진 효과가 밝혀졌다.
본 발명은 골수 단핵구의 분리에 이용할 수 있다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 제2017-012742호(출원일: 2017년 1월 27일)을 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함된다.
10 혈장 층
20 단핵구 층
30 원심분리 매체
40 적혈구 층
50 혈액 시료
90 응혈괴
100 용기
210 주입 수단
220 제거 수단
230 채취 수단
300 원심분리 수단
400 검출 수단
410 상부 촬영 수단
420 측부 촬영 수단
900 단핵구 분리 장치

Claims (9)

  1. 혈액 시료를 저장한 용기(100)의 저면으로부터 원심분리 매체(medium)를 주입하는 주입 수단(210),
    원심분리 매체와 혈액 시료가 저면측으로부터 이 순서로 적층되어 있는 용기(100)를 원심분리시키는 원심 분리 수단(300),
    원심분리 후에 단핵구 층에 존재하는 응혈괴(clot)를 검출하는 검출 수단(400),
    검출된 응혈괴를 제거하는 제거 수단(220), 및
    단핵구를 채취(harvesting)하는 채취 수단(230)을 포함하는, 단핵구 분리 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 검출 수단(400)은, 용기(100) 내의 단핵구 층을 수직 상향 방향에서 촬영(imaging)하는 상부 촬영 수단(410)과, 용기(100) 내의 단핵구 층을 수평 방향에서 촬영하는 측부 촬영 수단(420)을 포함하는, 단핵구 분리 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 검출 수단(400)은, 상기 응혈괴를 회전 타원체에 유사한 형상에서 적도 반경 또는 극반경 중의 어느 하나가 5mm 이상인 경우에 제거 대상으로 되는 응혈괴를 검출하는, 단핵구 분리 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제거 수단(220)에서 응혈괴를 제거하기 전에, 원심분리 후에 단핵구 층의 상부에 있는 혈장 층을 제거하는 혈장 층 제거 수단을 포함하는, 단핵구 분리 장치.
  5. 제4항에 있어서, 상기 혈장 층 제거 수단은 상기 혈장 층의 상부로부터 상기 혈장 층을 흡입 제거하는, 단핵구 분리 장치.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 혈장 층 제거 수단은, 상기 혈장 층의 액체 양의 10 내지 20%를 잔존시키면서 상기 혈장 층을 흡입 제거하는, 단핵구 분리 장치.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서,　상기 주입 수단(210)은 0.05 내지 1.0mL/초로 원심분리 매체를 주입하는, 단핵구 분리 장치.
  8. 혈액 시료를 저장한 용기의 저면에 원심분리 매체를 주입하는 주입 단계,
    원심분리 매체와 혈액 시료가 저면측으로부터 이 순서로 적층되어 있는 용기를 원심분리시키는 원심 분리 단계,
    원심분리 후에 단핵구 층에 존재하는 응혈괴를 검출하는 검출 단계,
    검출된 응혈괴를 제거하는 제거 단계, 및
    단핵구를 채취하는 채취 단계를 포함하는, 단핵구 분리 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제거 단계는, 단핵구 층의 상부에 존재하는 응혈괴를 제거하는, 단핵구 분리 방법.
KR1020197023385A 2017-01-27 2018-01-26 단핵구 분리 장치 및 단핵구 분리 방법 KR20190109738A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2017-012742 2017-01-27
JP2017012742 2017-01-27
PCT/JP2018/002497 WO2018139583A1 (ja) 2017-01-27 2018-01-26 単核球分離装置及び単核球分離方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190109738A true KR20190109738A (ko) 2019-09-26

Family

ID=62979445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197023385A KR20190109738A (ko) 2017-01-27 2018-01-26 단핵구 분리 장치 및 단핵구 분리 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20190388896A1 (ko)
EP (1) EP3575788A4 (ko)
JP (1) JPWO2018139583A1 (ko)
KR (1) KR20190109738A (ko)
CN (1) CN110268262A (ko)
WO (1) WO2018139583A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200124194A (ko) * 2019-04-09 2020-11-02 이준석 스크린 교환 장치, 이를 포함하는 생체조직 미세화 시스템, 이를 이용하는 생체조직 미세화 방법 및 이와 관련된 생체조직으로부터 타겟 물질을 분리하는 방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2021140773A1 (ko) * 2020-01-08 2021-07-15
CN113893958B (zh) * 2021-12-10 2022-03-25 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 离心管取放方法、设备和计算机可读存储介质
CN113980894B (zh) * 2021-12-27 2022-03-15 深圳博雅感知医疗科技有限公司 制备骨髓浓缩细胞的方法及其用于治疗卵巢早衰的用途

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4190535A (en) * 1978-02-27 1980-02-26 Corning Glass Works Means for separating lymphocytes and monocytes from anticoagulated blood
JPS5863852A (ja) * 1981-10-14 1983-04-15 Hitachi Ltd リンパ球分取装置
US4954264A (en) * 1989-02-02 1990-09-04 Becton-Dickinson And Company Apparatus for separating mononuclear cells from blood and method of manufacturing and using the same
JP2005249738A (ja) * 2004-03-08 2005-09-15 Asahi Kasei Medical Co Ltd 血液の体外処理時に凝固しやすい血液の判別方法
GB0422358D0 (en) * 2004-10-08 2004-11-10 Rts Thurnall Plc Determination of the boundaries between fractions and extraction of selected fractions in a fractional sample
US8110393B2 (en) * 2007-03-23 2012-02-07 Beckman Coulter, Inc. Method and apparatus for separating and harvesting cells from a whole blood sample
JP5465850B2 (ja) * 2008-08-01 2014-04-09 シスメックス株式会社 試料分析システム
WO2011001936A1 (ja) 2009-06-30 2011-01-06 株式会社カネカ 血液成分の分離システム、分離材
CN101659939A (zh) * 2009-09-28 2010-03-03 成都瑞琦科技实业有限责任公司 单核细胞分离方法
JP5771917B2 (ja) * 2010-08-04 2015-09-02 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 単核球分離管及び単核球分離システム
KR101387302B1 (ko) * 2011-01-26 2014-04-21 경희대학교 산학협력단 골수 지방조직을 활용하는 신규한 단핵구 세포 집합물 분리 방법, 이로써 분리된 골수 유래 단핵구 세포 집합물 및 그의 용도
EP2704841B1 (en) * 2011-05-05 2017-02-01 Stemcell Technologies Inc. Method and insert for density gradient separation
JP5748648B2 (ja) * 2011-12-26 2015-07-15 国立研究開発法人国立循環器病研究センター 細胞分離装置及び遠心分離方法
EP2848935A4 (en) * 2012-05-10 2015-12-09 Konica Minolta Inc PROCESS FOR REMOVING RED BLOOD BODIES AND CENTRIFUGAL TUBES FOR BLOOD TREATMENT
WO2013175797A1 (ja) * 2012-05-23 2013-11-28 独立行政法人国立循環器病研究センター 細胞分離バック、細胞分離方法及び細胞分離システム
EP2770318B1 (en) * 2013-02-21 2018-03-21 Roche Diagniostics GmbH Method and apparatus for detecting clots in a liquid and laboratory automation system
US20170003367A1 (en) 2015-06-30 2017-01-05 General Electric Company Magnetic resonance imaging system and method

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200124194A (ko) * 2019-04-09 2020-11-02 이준석 스크린 교환 장치, 이를 포함하는 생체조직 미세화 시스템, 이를 이용하는 생체조직 미세화 방법 및 이와 관련된 생체조직으로부터 타겟 물질을 분리하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20190388896A1 (en) 2019-12-26
EP3575788A4 (en) 2020-10-14
CN110268262A (zh) 2019-09-20
JPWO2018139583A1 (ja) 2019-12-19
WO2018139583A1 (ja) 2018-08-02
EP3575788A1 (en) 2019-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20190109738A (ko) 단핵구 분리 장치 및 단핵구 분리 방법
KR101319135B1 (ko) 재생 의약에서 성체 줄기 세포를 비롯한 세포 부분집합의 수집, 처리, 이식을 위한 통합된 기계 장치
US9976115B2 (en) Bone marrow adipose portion isolation device and methods
EP3316780B1 (en) Methods for preparation of enriched biological fluids
JP5771917B2 (ja) 単核球分離管及び単核球分離システム
KR101157134B1 (ko) 다혈소판 혈장의 분리방법
KR102278713B1 (ko) 혈액암 치료용 마이크로웨이브 치료 장치
Karczewski et al. The efficiency of an autotransfusion system for tumor cell removal from blood salvaged during cancer surgery
JPWO2012141032A1 (ja) 単核球調製材、及び前記調製材を利用した単核球調製方法
KR20100054019A (ko) 다혈소판 혈장의 제조방법
KR20070060148A (ko) 세포배양용 인간 혈청
KR102100665B1 (ko) 원심분리를 위한 장치 및 그 방법
JP2888590B2 (ja) 血漿および濃厚赤血球採取用器具
EP1531870A1 (en) Selected cell delivery for heart failure
Catalfamo et al. [4] Isolation of platelets from laboratory animals
KR101008583B1 (ko) 자가 혈소판 농축물질 분리용 용기
CN112481205A (zh) 一种骨髓采集与有核细胞分离的技术
JP5592450B2 (ja) 自走細胞捕捉具
RU2789518C1 (ru) Способ получения плазмы, обогащенной тромбоцитами, из малых объёмов крови
EP4061444A1 (en) Process for preparing blood components and biomedical device
CN108619496A (zh) Adamts13在制备促进脑卒中后血管重塑药物中的用途
JP4333936B2 (ja) 生体骨組織再生用細胞を得る方法
KR20130091515A (ko) 골수 줄기세포 농축액 수집방법
JPH05337165A (ja) 冷凍保存血液の洗浄方法およびその装置
CN110402890A (zh) 一种nmosd动物模型构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application