JP5748648B2 - 細胞分離装置及び遠心分離方法 - Google Patents
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Description
(1) 第1液体収容部を有する第1容器と、第2液体収容部を有し前記第1容器の下方に設けられる第2容器と、を備え、溶液を遠心分離するために遠心分離器に装着される細胞分離装置であって、
前記第1容器と前記第2容器とは、相対回転可能に取り付けられており、
前記第1容器と前記第2容器とを相対回転させることにより、前記第1液体収容部と前記第2液体収容部とを連通させる連通状態と、前記第1液体収容部と前記第2液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な切替機構を備えることを特徴とする細胞分離装置。
(2) 前記第1容器には、第1導入孔と開閉制御可能なフィルター付ベントが設けられており、
前記第2容器には、第2導入孔が設けられており、
前記第1及び第2導入孔は、それぞれシリンジの挿入により開口するニードルレスポートであることを特徴とする上記(1)に記載の細胞分離装置。
(3) 前記第1容器の底面には、少なくとも2以上の貫通孔が形成されており、
前記貫通孔は、それぞれ前記貫通孔に向かって下方に傾斜するテーパ面に囲繞されていることを特徴とする上記(1)または(2)に記載の細胞分離装置。
(4) 前記テーパ面は、水平面に対する傾斜角度が30°以上であることを特徴とする上記(3)に記載の細胞分離装置。
(5) 第3液体収容部を有し、前記第1容器の上方に設けられる第3容器が前記第1容器に相対回転可能に取り付けられており、
前記第1容器と前記第3容器とを相対回転させることにより、前記第1液体収容部と前記第3液体収容部とを連通させる連通状態と、前記第1液体収容部と前記第3液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な他の切替機構を備えることを特徴とする上記(1)〜(4)のいずれかに記載の細胞分離装置。
(6) 前記第3容器には、導出孔が設けられており、
前記導出孔は、シリンジの挿入により開口するニードルレスポートであることを特徴とする上記(5)に記載の細胞分離装置。
(7) 前記第1容器の天面には、少なくとも2以上の貫通孔が形成されており、
前記貫通孔は、それぞれ前記貫通孔に向かって上方に傾斜するテーパ面に囲繞されていることを特徴とする上記(5)または(6)に記載の細胞分離装置。
(8) 前記テーパ面は、水平面に対する傾斜角度が30°以上であることを特徴とする上記(7)に記載の細胞分離装置。
(9) 前記第3容器は、エアベントが設けられており、
前記第3液体収容部は、天面が弾性材で形成されており、容積が可変であることを特徴とする上記(5)〜(8)のいずれかに記載の細胞分離装置。
(10) 第1液体収容部を有する第1容器と、第2液体収容部を有し前記第1容器の下方に設けられる第2容器と、前記第1液体収容部と前記第2液体収容部とを連通させる連通状態と前記第1液体収容部と前記第2液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な切替機構と、を備えた細胞分離装置を用いた遠心分離方法であって、
前記切替機構を遮断状態として、前記第1液体収容部に溶液を注入し、前記第2液体収容部に分離液を注入する第1工程と、
前記第1工程後、前記切替機構を遮断状態から連通状態に切り替える第2工程と、
前記第2工程後、前記切替機構を連通状態としたまま遠心分離を行う第3工程と、を備えることを特徴とする遠心分離方法。
(11) 前記第3工程後、前記切替機構を連通状態から遮断状態に切り替える第4工程と、を備えることを特徴とする(10)に記載の遠心分離方法。
(12) 前記細胞分離装置には、第3液体収容部を有し、前記第1容器の上方に設けられる第3容器が前記第1容器に相対回転可能に取り付けられており、
前記細胞分離装置は、前記第1液体収容部と前記第3液体収容部とを連通させる連通状態と前記第1液体収容部と前記第3液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な他の切替機構をさらに備え、
前記第4工程後、前記他の切替機構を連通状態とし、且つ、前記細胞分離装置を前記第3容器が下側となる状態で、2回目の遠心分離を行う第5工程と、を備えることを特徴とする(11)に記載の遠心分離方法。
(13) 前記第1容器と前記第2容器とを相対回転させることにより、前記切替機構の連通状態と遮断状態とを切り替えることを特徴とする(10)〜(12)のいずれか1項に記載の遠心分離方法。
(14)第1液体収容部を有する第1容器と、第2液体収容部を有し前記第1容器の下方に設けられる第2容器と、を備え、溶液を遠心分離するために遠心分離器に装着される細胞分離装置であって、
前記第1液体収容部と前記第2液体収容部とを連通させる連通状態と前記第1液体収容部と前記第2液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な切替機構を備え、
前記切替機構は、前記第1容器と前記第2容器の少なくとも一方に対してスライド可能なスライド部材を含むことを特徴とする細胞分離装置。
(15)第3液体収容部を有し、前記第1容器の上方に設けられる第3容器が前記第1容器に相対回転可能に取り付けられており、
前記第1液体収容部と前記第3液体収容部とを連通させる連通状態と前記第1液体収容部と前記第3液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な他の切替機構を備えることを特徴とする(14)に記載の細胞分離装置。
(第1実施形態)
<細胞分離装置>
図1は本発明に係る第1実施形態の細胞分離装置の全体外観図、図2は分解斜視図である。図1及び図2に示すように、細胞分離装置10は、第1容器11と、第2容器12と、第3容器13と、を備える。
図3も参照して、第1容器11は、中央容器14と、下部収縮リング15Aと、上部収縮リング15Bと、から構成される。中央容器14は、上下方向に貫通する略円筒状に形成された部材であり、その上端縁及び下端縁には、それぞれ上部収縮リング15B、下部収縮リング15Aに嵌合し、熱溶着、超音波溶着、または接着によって液密に接合する環状突起17、18が形成されている(18は図9参照)。中央容器14の上部には、ヘパリン溶液及び骨髄液などの溶液の導入孔であるニードルレスポート19と、外部と通気可能なフィルター付きベント20とが、周方向の異なる位置に設けられている。
図4は第2容器の分解斜視図であり、第2容器12は、下部容器25、キャップ26、及び下部切替リング27Aと、から構成される。下部容器25は、上下方向に貫通する略円筒状に形成された部材であり、その上端縁には、下部切替リング27Aと嵌合して液密に接合する環状溝28が形成されている。また、下部容器25の下端縁には、雄ねじ29が形成されており、キャップ26の雌ねじ30と螺合してキャップ26が下部容器25の下部に液密に取り付けられる。
図5に示すように、第3容器13は、上部容器41と、隔壁フィルム42と、上部切替リング27Bと、から構成される。上部容器41は、半球状凹部が形成された略椀状の部材であり、下端縁の外周には、上部切替リング27Bと液密に嵌合するための溝43が設けられている。また、上部容器41の頭頂部には、エアベントである貫通孔44が形成されており、後述する上部切替リング27Bのニードルレスポート36からの溶液の出し入れに伴って半球状凹部内の空気を貫通孔44から排出または吸入する。上部容器41を形成する素材は、比較的剛性のある一般的な素材であればよく、PP、PE、ポリカーボネイト等が例示できる。
図1に示すように、下部収縮リング15Aと下部切替リング27Aとにより第1切替機構55が形成され、上部収縮リング15Bと上部切替リング27Bとにより他の切替機構である第2切替機構56が形成される。第1切替機構55と第2切替機構56とは、上下方向が逆であるだけで同一部材であるので、以後の説明においては、図7及び図8に示す第2切替機構56について説明する。従って、第1切替機構55としての説明は、第2切替機構56を第1切替機構55に、上部切替リング27Bを下部切替リング27Aに、上部収縮リング15Bを下部収縮リング15Aに、第3液体収容部53を第2液体収容部52に読み替えるものとする。
次に、収縮リングのテーパ面の傾斜角度について説明する。細胞分離装置10による細胞の分離効率は、収縮リング15のテーパ面21aの傾斜角度によって異なる。図10はテーパ面21aの最適な傾斜角度を求めるために行ったラットの末梢血から単核球層を分離する実験の概略工程を示している。
上記のように構成された細胞分離装置10を用いた溶液の遠心分離は、図1及び図9を参照して概略下記の手順で行われる。
(a)第1容器11のフィルター付きベント20を開く。
(b)第1容器11と第2容器12とを相対回転させて第1切替機構55を開き、第1液体収容部51と第2液体収容部52とが連通する連通状態とする。
(c)第2容器12のニードルレスポート36からシリンジで分離液を第2液体収容部52内に注入する。分離液の注入により上昇する第2液体収容部52内の圧力は、開かれているフィルター付きベント20から逃がされるので、容易に注入することができる。
(d)第2液体収容部52を分離液で満たしたのち、第1容器11と第2容器12とを相対回転させて第1切替機構55を閉じ、第1液体収容部51と第2液体収容部52とが遮断された遮断状態とする。分離液は、第2容器の上面すなわち天面板31と等しい液位まで、ないし、天面板31を超えた液位まで充填することが好ましい。
(e)第1容器11と第3容器13とを相対回転させて第2切替機構56が遮断状態であることを確認する。
(f)骨髄液(赤血球等の細胞及び血液凝固阻止目的のヘパリン溶液等を含む)をシリンジに採取する。
(g)第1容器11のニードルレスポート19から採取した骨髄液を第1液体収容部51に注入する。骨髄液を注入後、生理食塩水、リンゲル液等の低比重等張液(以下、これらを総称して希釈液とも呼ぶ。)を注入して2倍以上に適宜希釈する。骨髄液及び希釈液の注入により上昇する第1液体収容部51内の圧力は、開かれているフィルター付きベント20から逃がされるので、容易に注入することができる。希釈液の注入は、骨髄液の粘性を下げる効果がある。
(h)第1容器11のフィルター付きベント20を閉じる。
(i)細胞分離装置10を転倒させたり、左右に振って骨髄液及び希釈液を十分に混和する。溶液の混和時、及び連続して行われる遠心分離時には、フィルター付きベント20が閉じているので、エアフィルターの濡れを防止することができる。図12(a)は、1回目の遠心分離前の状態を示す図である。第1液体収容部51内には混和した骨髄液及び希釈液が収容されており、第2液体収容部52内には分離液が収容されている。
(j)第1容器11と第2容器12とを相対回転させて第1切替機構55を開き、第1液体収容部51と第2液体収容部52とが連通する連通状態とする。
(k)所定の条件で遠心分離操作を行う。図12(b)は、1回目の遠心分離後の状態を示す図である。第1液体収容部51と第2液体収容部52には、上から血清、単核球、分離液、及び赤血球、血小板等の血球成分が、この順に分離して成層される。
(m)続いて2回目の遠心分離を実施すべく、第1容器11内にある溶液を目視して、単核球の細胞のバンドがあることを確認した後、再び第1容器11のフィルター付きベント20を開けた状態で第1容器11のニードルレスポート19から生理食塩水又はリンゲル液等の希釈液を注入し、フィルター付きベント20を閉じて細胞分離装置10を転倒させたり、左右に振って内溶液を十分に混和する。一度分離された血清及び単核球を濃縮する際に希釈液を加えることで、血清及び分離液の密度をより小さくし、2回目の遠心分離後に細胞である単核球を確実に沈めることができる。
(n)第1容器11と第3容器13とを相対回転させて第2切替機構56を開き、第1液体収容部51と第3液体収容部53とが連通する連通状態とする。
(o)第3液体収容部53を下側(上下逆)にして、所定の条件で遠心分離操作を行う。図12(c)は、2回目の遠心分離後の状態を示す図である。第1液体収容部51と第3液体収容部53には、下部(隔壁フィルム42上)に単核球が堆積し、その上に混和した血清、分離液、及び希釈液が成層される。
(p)遠心分離操作終了後、第1容器11と第3容器13とを相対回転させて第2切替機構56を閉じ、第1液体収容部51と第3液体収容部53とを遮断状態とする。
(q)第3容器13のニードルレスポート36から第3液体収容部53内の溶液をシリンジで採取する。必要によりピペッティングを行い、細胞を均一に分散させる。
(r)必要により、輸液バッグ等に採取した細胞を懸濁させる。
次に、本発明に係る第2実施形態の細胞分離装置について説明する。図13は第2実施形態の細胞分離装置の全体斜視図であり、図14は第3容器の分解斜視図であり、図15は第1及び第2容器間に配置された切替機構、及び第1及び第3容器間に配置された他の切替機構が、共に連通状態とされた第2実施形態の細胞分離装置の断面図である。
図13〜図15に示すように、細胞分離装置10Aの第3容器13Aは、上部容器41Aと、上部切替リング27Cと、から構成される。上部容器41Aは、図中下面側に半球状凹部が形成された略椀状の部材であり、下端縁の外周には、上部切替リング27Cと液密に嵌合するための溝43が設けられている。また、上部容器41Aの上部には、半球状凹部に連通するニードルレスポート19が設けられている。上部容器41Aを形成する素材は、比較的剛性のある一般的な素材であればよく、PP、PE、ポリカーボネイト等が例示できる。
上記のように構成された細胞分離装置10Aを用いた溶液の遠心分離は、第1実施形態の細胞分離装置10における手順と基本的に同様に行われ、(a)〜(q)で二回目の遠心分離操作を行った後、以下の手順で行われる。
(q)′第3容器13のフィルター付きベント65を開いた後、第3容器13Aのニードルレスポート19から第3液体収容部53内の溶液をシリンジで採取する。必要によりピペッティングを行い、細胞を均一に分散させる。
(r)必要により、輸液バッグ等に採取した細胞を懸濁させる。
次に、本発明に係る第3実施形態の細胞分離装置について説明する。図16は本発明に係る第3実施形態の細胞分離装置の全体斜視図であり、図17は第1及び第2容器間に配置された切替機構が、連通状態とされた第3実施形態の細胞分離装置の断面図である。
上記のように構成された細胞分離装置10Bを用いた溶液の遠心分離は、図16及び図17を参照して概略下記の手順で行われる。
(a)第1容器11のフィルター付きベント20を開く。
(b)第1容器11と第2容器12とを相対回転させて第1切替機構55を開き、第1液体収容部51と第2液体収容部52とが連通する連通状態とする。
(c)第2容器12のニードルレスポート36からシリンジで分離液を第2液体収容部52内に注入する。分離液の注入により上昇する第2液体収容部52内の圧力は、開かれているフィルター付きベント20から逃がされるので、容易に注入することができる。
(d)第2液体収容部52を分離液で満たしたのち、第1容器11と第2容器12とを相対回転させて第1切替機構55を閉じ、第1液体収容部51と第2液体収容部52とが遮断された遮断状態とする。分離液は、第2容器の上面すなわち天面板31と等しい液位まで、ないし、天面板31を超えた液位まで充填することが好ましい。
(f)骨髄液(赤血球等の細胞及び血液凝固阻止目的のヘパリン溶液等を含む)をシリンジに採取する。
(g)第1容器11のニードルレスポート19から採取した骨髄液を第1液体収容部51に注入する。骨髄液を注入後、生理食塩水、リンゲル液等の低比重等張液(以下、これらを総称して希釈液とも呼ぶ。)を注入して2倍以上に適宜希釈する。骨髄液及び希釈液の注入により上昇する第1液体収容部51内の圧力は、開かれているフィルター付きベント20から逃がされるので、容易に注入することができる。希釈液の注入は、骨髄液の粘性を下げる効果がある。
(h)第1容器11のフィルター付きベント20を閉じる。
(i)細胞分離装置10Bを転倒させたり、左右に振って骨髄液及び希釈液を十分に混和する。溶液の混和時、及び連続して行われる遠心分離時には、フィルター付きベント20が閉じているので、エアフィルターの濡れを防止することができる。
(j)第1容器11と第2容器12とを相対回転させて第1切替機構55を開き、第1液体収容部51と第2液体収容部52とが連通する連通状態とする。
(k)所定の条件で遠心分離操作を行う。
(l)′遠心分離操作終了後、第1容器11と第2容器12とを相対回転させて第1切替機構55を閉じ、第1液体収容部51と第2液体収容部52とが遮断された遮断状態とする。第2容器12のニードルレスポート36から第2液体収容部52内の溶液をシリンジで採取する。必要によりピペッティングを行い、細胞を均一に分散させる。
(r)必要により、輸液バッグ等に採取した細胞を懸濁させる。
次に、本発明に係る第4実施形態の細胞分離装置について説明する。図18及び図19は本発明に係る第4実施形態の細胞分離装置の断面図である。
細胞分離装置10Cの第1切替機構55Aは、下部収縮リング15Cと下部切替リング27Dとスライド部材60とにより構成され、下部切替リング27Dの突部37が下部収縮リング15Cの内溝24に係合し、相対回転不能(下部切替リング27Dを下部収縮リング15Cに対して回転することが不可能であることの意)に組み付けられている。
11 第1容器
12 第2容器
13、13A 第3容器
15 収縮リング
15A、15C 下部収縮リング
15B 上部収縮リング
19 ニードルレスポート(第1導入孔)
21 隔壁(第1容器の底面、第1容器の天面)
21a テーパ面
22 貫通孔
27 切替リング
27A、27D 下部切替リング
27B、27C 上部切替リング
36 ニードルレスポート(第2導入孔、導出孔)
42 隔壁フィルム(弾性材)
51 第1液体収容部
52 第2液体収容部
53 第3液体収容部
55、55A 第1切替機構(切替機構)
56 第2切替機構(他の切替機構)
60 スライド部材
Claims (15)
- 第1液体収容部を有する第1容器と、第2液体収容部を有し前記第1容器の下方に設けられる第2容器と、を備え、溶液を遠心分離するために遠心分離器に装着される細胞分離装置であって、
前記第1容器と前記第2容器とは、相対回転可能に取り付けられており、
前記第1容器と前記第2容器とを相対回転させることにより、前記第1液体収容部と前記第2液体収容部とを連通させる連通状態と前記第1液体収容部と前記第2液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な切替機構を備えることを特徴とする細胞分離装置。 - 前記第1容器には、第1導入孔と開閉制御可能なフィルター付ベントが設けられており、
前記第2容器には、第2導入孔が設けられており、
前記第1及び第2導入孔は、それぞれシリンジの挿入により開口するニードルレスポートであることを特徴とする請求項1に記載の細胞分離装置。 - 前記第1容器の底面には、少なくとも2以上の貫通孔が形成されており、
前記貫通孔は、それぞれ前記貫通孔に向かって下方に傾斜するテーパ面に囲繞されていることを特徴とする請求項1または2に記載の細胞分離装置。 - 前記テーパ面は、水平面に対する傾斜角度が30°以上であることを特徴とする請求項3に記載の細胞分離装置。
- 第3液体収容部を有し、前記第1容器の上方に設けられる第3容器が前記第1容器に相対回転可能に取り付けられており、
前記第1容器と前記第3容器とを相対回転させることにより、前記第1液体収容部と前記第3液体収容部とを連通させる連通状態と前記第1液体収容部と前記第3液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な他の切替機構を備えることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞分離装置。 - 前記第3容器には、導出孔が設けられており、
前記導出孔は、シリンジの挿入により開口するニードルレスポートであることを特徴とする請求項5に記載の細胞分離装置。 - 前記第1容器の天面には、少なくとも2以上の貫通孔が形成されており、
前記貫通孔は、それぞれ前記貫通孔に向かって上方に傾斜するテーパ面に囲繞されていることを特徴とする請求項5または6に記載の細胞分離装置。 - 前記テーパ面は、水平面に対する傾斜角度が30°以上であることを特徴とする請求項7に記載の細胞分離装置。
- 前記第3容器は、エアベントが設けられており、
前記第3液体収容部は、天面が弾性材で形成されており、容積が可変であることを特徴とする請求項5〜8のいずれか1項に記載の細胞分離装置。 - 第1液体収容部を有する第1容器と、第2液体収容部を有し前記第1容器の下方に設けられる第2容器と、前記第1液体収容部と前記第2液体収容部とを連通させる連通状態と前記第1液体収容部と前記第2液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な切替機構と、を備えた細胞分離装置を用いた遠心分離方法であって、
前記切替機構を遮断状態として、前記第1液体収容部に溶液を注入し、前記第2液体収容部に分離液を注入する第1工程と、
前記第1工程後、前記切替機構を遮断状態から連通状態に切り替える第2工程と、
前記第2工程後、前記切替機構を連通状態としたまま遠心分離を行う第3工程と、を備えることを特徴とする遠心分離方法。 - 前記第3工程後、前記切替機構を連通状態から遮断状態に切り替える第4工程と、を備えることを特徴とする請求項10に記載の遠心分離方法。
- 前記細胞分離装置には、第3液体収容部を有し、前記第1容器の上方に設けられる第3容器が前記第1容器に相対回転可能に取り付けられており、
前記細胞分離装置は、前記第1液体収容部と前記第3液体収容部とを連通させる連通状態と前記第1液体収容部と前記第3液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な他の切替機構をさらに備え、
前記第4工程後、前記他の切替機構を連通状態とし、且つ、前記細胞分離装置を前記第3容器が下側となる状態で、2回目の遠心分離を行う第5工程と、を備えることを特徴とする請求項11に記載の遠心分離方法。 - 前記第1容器と前記第2容器とを相対回転させることにより、前記切替機構の連通状態と遮断状態とを切り替えることを特徴とする請求項10〜12のいずれか1項に記載の遠心分離方法。
- 第1液体収容部を有する第1容器と、第2液体収容部を有し前記第1容器の下方に設けられる第2容器と、を備え、溶液を遠心分離するために遠心分離器に装着される細胞分離装置であって、
前記第1液体収容部と前記第2液体収容部とを連通させる連通状態と前記第1液体収容部と前記第2液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な切替機構を備え、
前記切替機構は、前記第1容器と前記第2容器の少なくとも一方に対してスライド可能なスライド部材を含むことを特徴とする細胞分離装置。 - 第3液体収容部を有し、前記第1容器の上方に設けられる第3容器が前記第1容器に相対回転可能に取り付けられており、
前記第1液体収容部と前記第3液体収容部とを連通させる連通状態と前記第1液体収容部と前記第3液体収容部との連通を遮断する遮断状態とを切替可能な他の切替機構を備えることを特徴とする請求項14に記載の細胞分離装置。
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