CN110268262A - 单核细胞分离装置及单核细胞分离方法 - Google Patents

单核细胞分离装置及单核细胞分离方法 Download PDF

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田口明彦
新纳由纪子
津村尚史
森田健一
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Abstract

本发明的单核细胞分离装置具有：从存储有血液试样的容器(100)的底面注入离心分离介质的注入装置(210)、使从底面侧起依次层叠有离心分离介质和血液试样的容器(100)离心分离的离心分离装置(300)、检测离心分离后存在于单核细胞层的凝血块的检测装置(400)、除去检测出的凝血块的除去装置(220)、采集单核细胞的采集装置(230)。此外，本发明的单核细胞分离方法具有与本发明的单核细胞分离装置的各部件构成要素相对应的注入工序、离心分离工序、检测工序、除去工序、采集工序。

Description

单核细胞分离装置及单核细胞分离方法
技术领域
本发明涉及单核细胞分离装置及单核细胞分离方法。
背景技术
近年来，开始了一种细胞治疗，是通过采集缺血性疾病患者的骨髄液，用比重离心法分离存在于骨髄液中的单核细胞，将分离出的单核细胞移植到缺血的部分或血管内，由此促进血管再生。使用比重离心法从骨髄液中分离出单核细胞的目的，是要除去骨髄液中含有的粒细胞及红细胞，认为通过除去这些细胞可以提升细胞治疗的治疗效果。
另一方面，由于骨髄液极其容易凝固，因此从患者身上采集骨髄液时，即使充分使用了抗凝血药，也很难完全防止凝血块的形成。凝血块指的是，纤维蛋白聚集形成网状结构，红细胞在此汇集而产生的物质，凝血块的主成分是纤维蛋白、血小板及红细胞。使用骨髄细胞进行治疗时，凝血块大多会妨碍治疗，因此，例如在对白血病患者进行非亲缘骨髄细胞移植时，会采集500ml以上的骨髄液，首先通过孔径不同的3种骨髄移植用滤网，除去凝血块，然后通过比重离心法分离出存在于骨髄液中的单核细胞。有文献提出，对于四肢缺血患者，使用自身骨髄液进行再生治疗会促进血管再生(非专利文献1)，但与白血病患者的非亲缘骨髄细胞移植同样地采集500ml以上的骨髄液，通过孔径不同的3种骨髄移植滤网除去凝血块，然后使用细胞分离机器，通过比重离心法分离出存在于骨髄液中的单核细胞，移植给患者。此外，有文献提出，对于脑梗塞患者，使用自身骨髄液进行再生治疗会促进神经功能恢复(非专利文献2)，但较之于白血病患者和四肢缺血患者，采集的骨髓液较少，为25ml或50ml，在细胞培养处理中心内手工分离单核细胞，并且手工除去混入含有单核细胞的层中的凝血块后，移植给患者。另外，较之于四肢缺血患者，脑梗塞患者使用较少量骨髄液的理由，是因为即使少量也可期待充分的效果(非专利文献3)、以及大量采集骨髄造成的血压下降可能会引起脑梗塞症状恶化。此外，若在进行较少量的骨髄液的分离提纯时使用滤网除去凝血块，则滤网部分的容量损失较多，骨髄液量会显著减少，因此难以使用滤网。与我们相同，在手工分离骨髄单核细胞并给予心肌梗塞患者的试验中，显示出了细胞移植的有效性(非专利文献4)，但是也有文献报告，使用了没有凝血块除去功能的细胞分离机器所分离出的细胞的临床试验中，没有确认到其有效性(非专利文献5)。但是，在细胞培养处理中心内手工分离单核细胞，不仅其操作繁琐，而且细胞培养处理中心的建立及维持需要耗费很大的费用。因此，除了现有的机器以外，也有如专利文献1地设计出无需细胞培养处理中心的骨髄单核细胞的分离装置，但是没有除去凝血块的功能。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际专利公开WO2011/001936
非专利文献
非专利文献1：Taguchi et al.Eur J Vasc Endovasc Surg.2003Mar；25(3):276-8
非专利文献2：Taguchi et al.Stem Cells Dev.2015Oct 1；24(19):2207-18
非专利文献3：Uemura et al.Curr Vasc Pharmacol.2012May；10(3):285-8.
非专利文献4：Schachinger V N Engl J Med.2006Sep 21；355(12):1210-21
非专利文献5：Traverse JH,JAMA.2012Dec 12；308(22):2380-9.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明鉴于所涉及的问题点而作，目的在于提供一种源自含有红细胞等的凝血块的细胞难以混入到所获取的单核细胞成分中的单核细胞分离装置及单核细胞分离方法。
用以解决课题的方法
本发明涉及的单核细胞分离装置，具有：从存储有血液试样的容器的底面注入离心分离介质的注入装置、使从底面侧起依次层叠有离心分离介质和血液试样的容器离心分离的离心分离装置、检测离心分离后存在于骨髄单核细胞层的凝血块的检测装置、除去检测出的凝血块的除去装置、和采集骨髄单核细胞的采集装置。
此外，本发明涉及的单核细胞分离方法，具有：从存储有血液试样的容器的底面注入离心分离介质的注入工序、使从底面侧起依次层叠有离心分离介质和血液试样的容器离心分离的离心分离工序、检测离心分离后存在于单核细胞层的凝血块的检测工序、除去检测出的凝血块的除去工序、采集单核细胞的采集工序。
发明的效果
根据本发明，源自含有红细胞等的凝血块的细胞难以混入到分离获取到的单核细胞成分中。
附图说明
[图1]图1是本实施方式涉及的单核细胞分离装置的外观图。
[图2]图2是说明凝血块拍摄装置的概念图，其中，(A)是说明侧部拍摄装置的图，(B)是说明上部拍摄装置的图。
[图3]图3是从将血液试样存储于容器后至管嘴开口端移动到容器底部为止的工序的说明图。
[图4]图4是从向容器底部注入离心分离介质开始至离心分离结束为止的工序的说明图。
[图5]图5是从开始吸取血浆至吸取结束为止的工序的说明图。
[图6]图6是从开始除去存在于单核细胞层的上部的凝血块至凝血块的除去结束为止的工序的说明图。
[图7]图7是从开始采集单核细胞层至采集结束为止的工序的说明图。
[图8]图8是Atrophy index(萎缩指数)的测定方法的说明图。
[图9]图9是显示通过本实施例涉及的方法分离出的骨髄单核细胞的缺血障碍抑制效果的图。
[图10]图10是显示给予通过本实施例涉及的方法分离出的骨髄单核细胞的大脑皮质功能恢复促进效果的图。
符号说明
10 血浆层
20 单核细胞层
30 离心分离介质
40 红细胞层
50 血液试样
90 凝血块
100 容器
210 注入装置
220 除去装置
230 采集装置
300 离心分离装置
400 检测装置
410 上部拍摄装置
420 侧部拍摄装置
900 单核细胞分离装置
具体实施方式
以下参照附图具体说明本发明的实施方式，但该实施方式是为了使本发明的原理容易理解，本发明的范围不限定于下述的实施方式，本领域技术人员将以下实施方式的构成进行适当置换后的其他实施方式也包含于本发明的范围内。
如图1所示，本实施方式涉及的单核细胞分离装置900具有：从存储有血液试样的容器100的底面注入离心分离介质的注入装置210、使从底面侧起依次层叠有离心分离介质和血液试样的容器100进行离心分离的离心分离装置300、检测离心分离后存在于单核细胞层的凝血块的检测装置400、除去检测出的凝血块的除去装置220、和采集单核细胞的采集装置230。
容器100例如是玻璃或塑料制的离心管。血液试样并无特别限定，例如为骨髄液。骨髄液例如可以通过将脊椎动物(包括人)麻醉(局部麻醉或全身麻醉)，用针刺骨，用注射器吸取而进行采集。骨可举出例如大腿骨、胸骨、形成骨盆的髋骨等，但不限定于这些。
注入离心分离介质的注入装置210具备：与未图示的离心分离介质供给装置连接、可以向容器100内注入离心分离介质的管嘴；使该管嘴的开口端向存储有血液试样的容器100的底面移动的未图示的移动装置。离心分离介质供给装置可以采用公知的液体供给装置，例如由收纳离心分离介质的槽、送液注射器、流路、电磁阀等构成。离心分离介质并无特别限定，可以使用例如Percoll(注册商标)、Lymphoprep(注册商标)等作为密度梯度形成用而市售的介质，此外，也可以使用Ficoll-Paque(注册商标)和Nycoprep(注册商标)等，但优选Ficoll-Paque PREMIUM(Ficoll是注册商标)。
从注入装置210注入离心分离介质时，若急剧进行，则离心分离介质与血液试样之间的界面可能会变乱，因此希望以规定速度以下进行注入，具体地，当容器100为50mL的离心管时，可以以0.05mL/秒～1.0mL/秒注入离心分离介质。
离心分离装置300可以使用公知的离心分离装置，使从底面侧起依次层叠有离心分离介质和血液试样的容器100离心分离。离心分离装置300具备设置于通过马达而旋转的旋转轴上的例如4个存储空间(bucket)，形成为容器100被该存储空间收纳。
进行离心分离时，收纳在与收纳有血液试样的容器100相对的位置上的平衡物，可在上述注入装置210向别的容器100注入PBS或者血液试样及离心分离介质而制作。
离心分离后，在容器100内，从容器底部开始依次形成红细胞层、离心分离介质层、单核细胞层、血浆层，检测装置400检测出离心分离后存在于单核细胞层的凝血块除去对象。在这里，所谓存在于单核细胞层的凝血块除去对象，包括了存在于单核细胞层中的凝血块、以及存在于单核细胞层上的凝血块。
检测装置400具备：从铅直上方方向拍摄容器100内的单核细胞层的上部拍摄装置410；从水平方向拍摄容器100内的单核细胞层的侧部拍摄装置420；根据由上部拍摄装置拍摄到的图像及侧部拍摄装置拍摄到的图像所得到的色彩信息，检测存在于单核细胞层的凝血块的位置信息的未图示的位置信息检测装置。上部拍摄装置410及侧部拍摄装置420例如是CCD摄像机，通过这些CCD摄像机拍摄的图像，作为彩色图像而被显示于未图示的监视器。
如图2(A)所示，离心分离后，可观察到红细胞层40在最下层，单核细胞层20在血浆层10与离心分离介质30的中间大致为白色的带状层，由于凝血块90(图2中，凝血块90例如由90a、90b、90c、90d构成)主要由红细胞构成，因此观察到的是大致为红色的异物。
如图2(B)所示，通过上部拍摄装置410拍摄到以单核细胞层20(白色)为背景的凝血块90a和90d、位于单核细胞层20的下部的凝血块90b和90c、以及未图示的单核细胞层内的凝血块。然后，位置信息检测装置通过对上部拍摄装置410所拍摄的图像适用空间过滤器等而亮度发生变化的部分进行强调，并对该强调部分进行例如二值化，由此检测以单核细胞层20(白色)为背景的凝血块90a和90d、位于单核细胞层20的下部的凝血块90b和90c、以及单核细胞层内的凝血块的俯视图中的位置信息。
但是，仅以上部拍摄装置410拍摄的图像，难以区分位于单核细胞层20的上部的凝血块90a、90d、位于单核细胞层20的下部的凝血块90b、90c以及单核细胞层内的凝血块。
因此，本实施方式涉及的发明中，如图2(A)所示，通过侧部拍摄装置420从水平方向也拍摄凝血块90，位置信息检测装置会根据侧部拍摄装置420所拍摄的图像，区别出位于单核细胞层20的上部的凝血块90a、90d、位于单核细胞层20的下部的凝血块90b、90c以及单核细胞层内的凝血块。由此，位置信息检测装置可以检测出存在于单核细胞层20的凝血块除去对象(图2中存在于单核细胞层20的上部的凝血块90a、90d)。
此外，基于操作效率的观点，也可以只检测并除去存在于单核细胞层20的上部的凝血块中的规定大小的凝血块，而不是检测并除去所有的存在于单核细胞层20的上部的凝血块。例如，当将凝血块视为近似于旋转椭球体的形状、其赤道半径或极半径中的任意一个在5mm以上时，检测装置400可以将其作为凝血块除去对象检测出。此外，例如，检测装置400检测可以计算出存在于单核细胞层20上的凝血块中被上部拍摄装置410拍摄到的凝血块在俯视图中的面积，将规定面积以上的作为凝血块除去对象而检测出。
除去装置220将位置信息检测装置所检测到的存在于单核细胞层20的凝血块除去对象(图2中为存在于单核细胞层20的上部的凝血块90a、90d)除去。除去装置220具备：与未图示的凝血块吸取装置相连接的可以吸取凝血块的管嘴、使该管嘴的开口端向存在于单核细胞层20的凝血块移动的未图示的移动装置。
为了易于除去检测出的凝血块，可以设置在除去凝血块之前除去血浆层10的血浆层除去装置。血浆层除去装置可以采用公知的液体吸取装置，例如由吸取管嘴、收纳吸取到的血浆层的槽、吸引泵、流路等构成。基于后述的原因，关于血浆层10，优选残留少量的血浆层10时结束吸取，具体地，优选残留容器100内的血浆层10的液量的10％～20％时结束吸取。另外，不限定于在除去血浆层之后除去凝血块，也可以在吸取除去血浆层的同时除去凝血块，此外，也可以不除去血浆层10即除去凝血块。
采集装置230具备：与未图示的单核细胞采集袋相连接、可采集单核细胞的管嘴；和使该管嘴的开口端向单核细胞层20移动的移动装置。采集到的单核细胞可以直接使用，也可以在使用前加入例如生理盐水并用离心分离机进行多次清洗。当残留少量血浆层10而结束血浆层的吸取时，存在采集单核细胞层时连残存血浆层也吸取到的可能性，但通过在使用前进行清洗，可以排除残存血浆层的混入。
接下来说明具备有上述构成的本实施方式涉及的单核细胞分离装置900的使用方式的一个具体例子。
如图3左侧所示，采集自被试者的血液试样50存储于容器100。然后，如图3中央所示，可注入离心分离介质的管嘴的开口端被投入至存储有血液试样的容器100内。然后如图3右侧所示，管嘴的开口端被移动至存储有血液试样的容器100的底面。
如图4左侧所示，通过注入装置210，开始注入离心分离介质30，然后，如图4中央所示，离心分离介质30被存储至容器100的底面侧。之后，如图4右侧所示，离心分离后，在容器100内，自容器底部起依次形成红细胞层40、离心分离介质30、单核细胞层20、血浆层10，有还存在异物即凝血块90a、90b、90c、90d的情况。
如图5左侧所示，通过管嘴，开始吸取血浆层10。在这里，管嘴位于血浆层10的上部。即，管嘴在自远离血浆层10与单核细胞层20的边界部分的位置开始除去血浆层10。这是因为，若管嘴的前端即管嘴开口端靠近其边界部分，则吸取除去血浆层10时，存在骨髄单核细胞会被卷入而造成得率下降之虞。
然后如图5中央所示，继续吸取血浆层10至仅残留少量，然后如图5右侧所示，残留少量血浆层10而结束血浆层的吸取。虽然也可以除去所有的血浆层10，但也有在除去血浆层10时存在于单核细胞层20内的单核细胞也被吸取而除去之虞，因此优选残留少量血浆层10而结束血浆层的吸取。
如图6左侧所示，本实施方式中，开始除去存在于单核细胞层20的上部的凝血块90a、90d。然后如图6中央所示，通过除去装置220，首先除去凝血块90d，之后如图6右侧所示，除去凝血块90a。
如图7左侧所示，可采集单核细胞的管嘴的开口端被导入单核细胞层20内，然后如图7中央所示，通过管嘴，开始吸取单核细胞层20，之后如图7右侧所示，所有的单核细胞层20的采集结束。
实施例
(实施例1)骨髄单核细胞的缺血障碍抑制效果
为了验证抑制了凝血块的混入的本实施例涉及的单核细胞分离方法所分离出的骨髄单核细胞带来的缺血障碍抑制效果，使用发明人开发出的高再现性缺血模型小鼠(Taguchiet al.J Exp Stroke Transl Med.2010；3:28-33)进行了实验。制造脑梗塞48小时后，从尾静脈给予1×105个分离出的骨髄单核细胞，作为细胞给予30天后的缺血障碍抑制效果的评价方法，使用基于宏观标本的脑萎缩评分(Taguchi et al.Eur J Neurosci.2007；26(1):126-133.)。非治疗对照组中，从尾静脈给予与细胞给予组相同量(100μl)的生理盐水。实验中各组使用6只缺血小鼠。
以下述方法制造出验证骨髄细胞给予后对微小血管所起作用的缺血模型。
将8周龄的SCID小鼠(severe combined immunodeficiency mouse：严重联合免疫缺陷小鼠)通过氟烷麻醉进行全身麻醉，在头盖底进行1.5mm左右的穿孔，以从左颊骨部进入而能直达至左侧大脑中动脉。将刚刚通过嗅束后(嗅束交叉部的远位侧)的左侧大脑中动脉，用双极射频手术刀使之凝固，凝固后切断，由此永久闭塞左侧大脑中动脉，制造出局限于左侧大脑中动脉区域皮质的缺血部位以及缺血强度再现性良好的缺血模型。
然后购入人骨髄液，从装有骨髄细胞的试管(容器)的底面注入Ficoll-PaquePREMIUM(Ficoll是注册商标)液后，400G下进行40分钟离心。除去混入单核细胞层上部的长径5mm以上的凝血块后，吸取单核细胞层成分，移入新管。细胞在给予前使用含有白蛋白的生理盐水(最终白蛋白浓度2％)，用离心分离机清洗2次。
基于宏观标本的缺血障碍评分的详情如下所述。本研究中使用的脑缺血模型，局限在左侧大脑中动脉所灌流的大脑皮质，缺血后，由于炎症细胞的浸润等，较之相对侧(未制造脑缺血的一侧)，在缺血侧产生了明显的组织萎缩。本发明人曾揭示了：对于其萎缩程度的定量评价，Atrophy index是有用的(Taguchi et al.Eur J Neurosci.2007；26(1):126-133.)。Atrophy index的测定方法如图8所示。另外，Atrophy index以X/Y×100(％)表示。
关于减轻缺血障碍的治疗效果如图9所示。Atrophy index是表示脑萎缩的指标。所谓对照(Control)是被给予了生理盐水的组。所谓实施例是被给予了骨髄单核细胞的组。通过给予1x105个骨髄单核细胞，较之于给予生理盐水的组，统计学上也显示出明显的缺血障碍减轻效果。＊号表示，对照组与骨髄单核细胞组之间存在统计学上的显著差异。
以上结果明确显示，根据本实施例涉及的方法所分离出的骨髄单核细胞的优异的缺血障碍抑制效果。
(实施例2)骨髄单核细胞的缺血障碍功能恢复促进效果
为了验证抑制了凝血块混入的本实施例涉及的单核细胞分离方法所分离出的骨髄单核细胞带来的缺血障碍功能恢复促进效果，使用发明人开发出的高再现性缺血模型小鼠(Taguchi et al.J Exp Stroke Transl Med.2010；3:28-33)。制造脑梗塞48小时后，从尾静脈给予1×105个分离出的骨髄单核细胞，作为有关细胞给予30天后的缺血障碍功能恢复促进效果的评价方法，使用基于旷场实验的对明暗条件的反应性(Taguchi et al.J ClinInvest.2004；114:330-338)。实验中各组使用6只缺血小鼠。验证给予骨髄细胞所带来的功能恢复促进效果的缺血模型，使用与实施例1相同的方法。给予细胞的处理，使用与实施例1相同的方法。
作为有关功能恢复促进效果的评价方法，实施旷场实验。其测定原理及测定方法如下所述。已知：由于小鼠的夜行性，因此正常小鼠在明亮条件下活动量会下降，将环境变暗后活动量会增加。有文献显示，在明亮条件下的行动抑制中，大脑皮质功能很重要，此外，通过细胞治疗，大脑皮质功能恢复，明亮条件下的行动抑制功能会恢复(Taguchi et al.JClin Invest.2004；114:330-338)。本研究中，自动计数小鼠在旷场测定装置((株)行医研制，自由移动空间40cm×40cm)中在明亮条件下30分钟的后腿直立反应(rearing)次数，然后计数在黑暗条件下30分钟的后腿直立反应次数。将从明亮条件变化为黑暗条件时增加的运动量，用作功能恢复的指标。
给予骨髄单核细胞所带来的缺血障碍功能恢复促进效果的结果如图10所示。所谓对照是被给予了生理盐水的组。所谓实施例是被给予了骨髄单核细胞的组。图10中，显示出给予生理盐水的情况、以及给予骨髄单核细胞的情况下各自的rearing(后腿直立)次数，白色是明亮条件下的后腿直立次数，黑色是黑暗条件下的后腿直立次数。被给予生理盐水的组中，没有发现变化为黑暗条件后有显著的运动量增加，但是观察到了通过给予骨髄单核细胞，统计学上显著的对于暗反应的活动量增加。＊号表示，确认到骨髄单核细胞组中，从明亮条件变化为黑暗条件时，可看到后腿直立次数在统计学上的显著的增加。即，显示出通过给予骨髄单核细胞，具有脑神经功能恢复促进效果。
以上结果明确显示，给予通过本实施例涉及的方法所分离出的骨髄单核细胞，具有优异的大脑皮质功能恢复促进效果。
产业上的可利用性
本发明可利用于骨髄单核细胞的分离。
本申请以在日本提出的专利申请特愿2017-012742(申请日：2017年1月27日)为基础，其内容全部包含于本说明书中。

Claims (9)

1.一种单核细胞分离装置，具有：
从存储有血液试样的容器(100)的底面注入离心分离介质的注入装置(210)，
使从底面侧起依次层叠有离心分离介质和血液试样的容器(100)离心分离的离心分离装置(300)，
检测离心分离后存在于单核细胞层的凝血块的检测装置(400)，
除去检测出的凝血块的除去装置(220)，
采集单核细胞的采集装置(230)。
2.根据权利要求1所述的单核细胞分离装置，其特征在于，所述检测装置(400)具有：从铅直上方方向拍摄容器(100)内的单核细胞层的上部拍摄装置(410)，以及从水平方向拍摄容器(100)内的单核细胞层的侧部拍摄装置(420)。
3.根据权利要求1或2所述的单核细胞分离装置，其特征在于，将所述凝血块近似为旋转椭球体的形状时的赤道半径或极半径中的任意一个在5mm以上时，所述检测装置(400)将其检测出为凝血块除去对象。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的单核细胞分离装置，其特征在于，具有在所述除去装置(220)除去凝血块之前，除去离心分离后位于单核细胞层上部的血浆层的血浆层除去装置。
5.根据权利要求4所述的单核细胞分离装置，其特征在于，所述血浆层除去装置从所述血浆层的上部吸取除去该血浆层。
6.根据权利要求4或5所述的单核细胞分离装置，其特征在于，所述血浆层除去装置吸取除去该血浆层时，残留所述血浆层液量的10～20％。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的单核细胞分离装置，其特征在于，所述注入装置(210)以0.05～1.0mL/秒注入离心分离介质。
8.一种单核细胞分离方法，具有：
从存储有血液试样的容器的底面注入离心分离介质的注入工序，
使从底面侧起依次层叠有离心分离介质和血液试样的容器离心分离的离心分离工序，
检测离心分离后存在于单核细胞层的凝血块的检测工序，
除去检测出的凝血块的除去工序，
采集单核细胞的采集工序。
9.根据权利要求8所述的单核细胞分离方法，其特征在于，所述除去工序中，除去存在于单核细胞层上部的凝血块。
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