CN113029710B - 一种用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法，属于烟气毒性分析技术领域。本发明的提取方法包括以下步骤：1)抽吸加热卷烟时采用滤片捕集烟气总粒相物，采用DPBS缓冲液吸收穿过滤片的烟气气相物；每个滤片对应的抽吸口数为35‑45口且对应采用的缓冲液体积为V1，V1为2‑3.75mL；2)采用DMSO对捕集的烟气总粒相物进行萃取，将萃取液与吸收后的缓冲溶液混合；每个滤片对应采用的DMSO体积为V2，V2为2‑3.0mL且V2≤V1。该方法能够充分获取加热卷烟烟气提取物，并获得较高浓度的全烟气提取物母液，用于体外毒性测试时可以获得较大细胞毒性响应范围，从而较好的评估加热卷烟的体外毒性情况。

Description

一种用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法
技术领域
本发明涉及一种用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法，属于烟气毒性分析技术领域。
背景技术
加热卷烟(又被称为加热不燃烧卷烟、电加热卷烟或加热烟草制品)是一类为降低烟气健康风险研发的新型烟草制品。该类产品主要通过控制温度使烟叶在非燃烧状态下释放烟气供消费者使用。由于其具有低危害和类似于可燃卷烟的口感、尼古丁输送等特性，日渐受到消费者青睐。研究发现，加热卷烟的“低危害”可能是由于其加热温度(不超过350℃)比传统卷烟燃烧温度低，释放出比燃烧卷烟较低的有害和潜在有害成分引起的。
卷烟烟气由粒相成分和气相成分组成。卷烟体外毒性测试全烟气提取方法：滤片收集的烟气总粒相物(TPM)用一定体积的二甲基亚砜(DMSO)萃取并定容至10mg/mL浓度的TPM的DMSO溶液，用等DMSO体积的缓冲液收集烟气气相物(GVP)，然后将TPM和GVP溶液等体积混合用于后续细胞毒性测试。在确定毒性测试剂量范围时，由于DMSO超过一定体积分数后对细胞有毒性损伤，因此，允许的最大染毒剂量通常控制在DMSO体积分数为2％以下，例如：根据这一方式，参比卷烟3R4F最大允许的染毒剂量约为388.2μg/mL，实际上，在染毒剂量约为80μg/mL下，Beas-2b细胞存活率即可达到30％左右，因此，在这种提取方法下，很容易观察到最大的Beas-2b细胞毒性响应范围，并且做到50％细胞存活率的响应浓度。
当前用于加热卷烟体外毒性测试的全烟气提取方法主要延用传统卷烟的全烟气提取方法，但是由于加热卷烟烟气有害成分较少，毒性小，在传统卷烟的全烟气提取方案下，容易造成提取母液中全烟气提取物浓度低而DMSO浓度较高，从而，无法观察到较低细胞存活率的细胞毒性响应范围，从而无法客观地评估加热卷烟的体外毒性情况。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法，可以获得较大的细胞毒性响应范围。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法，包括以下步骤：
1)在抽吸加热卷烟的过程中，采用滤片捕集烟气总粒相物，采用DPBS缓冲液吸收穿过滤片的烟气气相物；每1个滤片对应的抽吸口数为35-45口，且每使用1个滤片对应采用的DPBS缓冲液的体积为V1，V1为2-3.75mL；所述滤片为购自Borgwaldt KC GmbH的规格为直径44mm的剑桥滤片；
2)捕集结束后，采用二甲基亚砜对滤片上捕集的烟气总粒相物进行萃取，萃取有烟气总粒相物的二甲基亚砜与步骤1)中吸收烟气气相物后的DPBS缓冲溶液进行混合；进行所述萃取时，每1个滤片对应采用的二甲基亚砜的体积为V2，V2为2-3.0mL且V2≤V1。
本发明的用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法，能够充分获取加热卷烟烟气提取物，并有助于获得较高浓度的全烟气提取物母液(即全烟气提取物在母液中的浓度尽量高、DMSO的体积分数尽量低)，用于体外毒性测试时，可以获得较大细胞毒性响应范围，从而较好的评估加热卷烟的体外毒性情况。
优选的，步骤1)中，每1个滤片对应的抽吸口数为40口，且每使用1个滤片对应采用的DPBS缓冲溶液的体积为3.75mL；步骤2)中，每1个滤片对应采用的二甲基亚砜的体积为2mL。
进一步的，DPBS缓冲溶液为无钙镁PBS缓冲溶液，具体为氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的混合水溶液，pH值为7.2-7.4。DPBS缓冲溶液中，氯化钠的浓度为8.0g/L，氯化钾的浓度为0.2g/L，磷酸氢二钠的浓度为1.15g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.2g/L。
所述抽吸采用的设备为吸烟机。优选的，步骤1)中，所述抽吸采用ISO抽吸模式或Health Canada Intense(简称HCI)抽吸模式，ISO和HCI抽吸模式的具体抽吸方法见表1。
表1 ISO和HCI两种抽吸模式
优选的，步骤1)中，采用的滤片的数量为4个。采用多个滤片时，当每个滤片抽吸口数达到设定口数时需要更换滤片。每支加热卷烟的抽吸口数可以根据具体的抽吸模式进行调整。每支加热卷烟的抽吸口数优选为4口。每支加热卷烟抽吸4口普适于多种加热烟具类型的ISO和HCI的抽吸模式。
二甲基亚砜呈中性且极性较高，采用二甲基亚砜对滤片进行萃取时，二甲基亚砜不会和烟气粒相物的化学成分发生反应，并且对烟气中的化学成分具有较好的萃取效果。
优选的，步骤1)中，所述DPBS缓冲溶液的温度为0-4℃。通过使通过滤片的烟气冷却降温，可以尽可能的充分捕集烟气气相物。DPBS缓冲溶液的温度可以通过冰浴控制。
优选的，V2＜V1时，所述混合是将萃取有烟气总粒相物的二甲基亚砜、补加液与吸收烟气气相物后的DPBS缓冲溶液进行混合；所述萃取有烟气总粒相物的二甲基亚砜和补加液的总体积与吸收烟气气相物后的DPBS缓冲溶液体积相等；所述补加液为DPBS缓冲溶液或细胞培养基。萃取有烟气总粒相物的二甲基亚砜、补加液与吸收烟气气相物后的DPBS缓冲溶液进行混合所得的混合液即为加热卷烟全烟气提取物母液。
V2＝V1时，所述混合是将萃取有烟气总粒相物的二甲基亚砜与吸收烟气气相物后的DPBS缓冲溶液进行混合。
实验测试证明，采用购自Borgwaldt KC GmbH的规格为直径44mm的剑桥滤片捕集不超过45口烟气时，滤片背面未看到黄色，提示主流烟气经滤片捕集并未透过滤片；每个滤片捕集加热卷烟烟气不超过45口时，2mL二甲基亚砜可以将单个滤片完全浸没并将单个滤片捕集的总粒相物萃取出来，3-3.75mL体积的DPBS缓冲液可以吸收通过以上单个滤片对应口数的烟气气相物。而44mm的Whatman滤片则需要更多的体积二甲基亚砜才能完全浸没。
附图说明
图1为本发明的实施例1的提取方法采用的提取装置的示意图，其中，1-烟气捕集器，2-第一吸收瓶，3-第二吸收瓶，4-抽气泵；
图2为本发明的实验例中不同DMSO体积分数(％)下Beas-2b细胞的存活率图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例以及对比例中采用的DPBS缓冲溶液为氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的混合水溶液，pH值为7.2-7.4，DPBS缓冲溶液中氯化钠的浓度为8.0g/L，氯化钾的浓度为0.2g/L，磷酸氢二钠的浓度为1.15g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.2g/L。
实施例1
本实施例的用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法采用的装置如图1所示，包括烟气捕集器1、第一吸收瓶2、第二吸收瓶3和抽气泵4，烟气捕集器1与第一吸收瓶2的进气端连接，第一吸收瓶2的出气端与第二吸收瓶3的进气端连接，第二吸收瓶3的出气端与抽气泵4连接。
本实施例的用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法，包括以下步骤：
1)将滤片按照正反面要求装于烟气捕集器上，并将烟气捕集器置于吸烟机上；记录装上滤片的烟气捕集器的质量；所采用滤片为购自Borgwaldt KC GmbH的规格为直径44mm的剑桥滤片(货号80202852)；
将15mL的DPBS缓冲溶液加入洁净干燥的第一吸收瓶中，将15mL的去离子水加入洁净干燥的第二吸收瓶中，且将加入液体的吸收瓶分别置于装有冰的保温杯中，使吸收瓶中液体处于冰浴环境(约0-4℃)；
2)吸烟机采用HCI抽吸模式抽吸加热卷烟，每支加热卷烟抽吸4口，共抽吸10支，40口后更换滤片，共抽吸4个滤片；抽吸过程中，烟气捕集器中的滤片捕集烟气总粒相物(TPM)，第一吸收瓶中15mL的DPBS同步吸收160口烟气的烟气气相物(GVP)；
更换滤片前，记录捕集过烟气的带有滤片的捕集器的质量；捕集烟气后与捕集烟气前装上滤片的烟气捕集器的质量之差即滤片捕集的烟气TPM质量；
将滤片从捕集器中取出时，打开捕集器，将滤片对折，然后再次对折擦拭捕集器上液珠后置于洁净自封袋中封好后，置于-20℃冰箱中等待萃取。
3)抽吸结束后，将吸收烟气气相物的DPBS缓冲溶液从第一吸收瓶中移出，并于超净台中用0.22μm无菌滤器配合无菌注射器过滤于无菌离心管中，得到无菌GVP萃取母液，并将装有无菌GVP萃取母液离心管封口后置于4℃冰箱中待用。
4)将捕集TPM的四个滤片从冰箱取出后，剪成小碎片，避免剪刀污染烟气捕集面，然后将小碎片置于50mL离心管中，然后加入8mL DMSO浸没碎片，并置于超声仪中超声30min进行萃取。
5)萃取完成后，将装有滤片离心管置于超净台中，然后将超声好离心管中滤片倒于装有0.22μm无菌滤器的50mL无菌注射器针筒内，利用注射器活塞挤压的方式将滤片中的TPM DMSO溶液过滤挤出至无菌离心管中，得到无菌TPM萃取母液。
6)在超净台中，将无菌GVP萃取母液、无菌TPM萃取母液和无菌DPBS缓冲溶液按照体积比为15:8:7的比例混合，混合后的液体即为加热卷烟全烟气母液。
实施例2
本实施例的用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法，与实施例1的提取方法的区别仅在于：本实施例1的步骤1)中是将安装滤片的烟气捕集器置于ISO抽吸模式吸烟机上；本实施例的步骤2)中采用ISO抽吸模式进行对加热卷烟进行抽吸；本实施例的步骤6)是将无菌GPV萃取母液、无菌TPM萃取母液和细胞培养基按照体积比为15:8:7的比例混合。
对比例
本对比例的用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法，包括以下步骤：
1)将滤片(直径44mm，WhatmanTM)按照正反面要求装于烟气捕集器上，并将烟气捕集器置于HCI抽吸模式吸烟机上；记录装上滤片的烟气捕集器的质量；
将15mL的DMSO溶液加入洁净干燥的与烟气捕集器连接的三角瓶中；
2)吸烟机采用HCI抽吸模式抽吸加热卷烟，每支加热卷烟抽吸10口，共抽吸4支，40口后更换滤片，共抽吸5个滤片；抽吸过程中，烟气捕集器中的滤片捕集烟气总粒相物(TPM)，三角瓶中15mL的DMSO同步吸收200口烟气的烟气气相物(GVP)；
更换滤片前，记录捕集过烟气的带有滤片的捕集器的质量；捕集烟气后与捕集烟气前装上滤片的烟气捕集器的质量之差即滤片捕集的烟气TPM质量；
将滤片从捕集器中取出时，打开捕集器，将滤片对折，然后再次对折擦拭捕集器上液珠后置于洁净自封袋中封好后，置于-20℃冰箱中等待萃取。
3)抽吸结束后，将捕集TPM的5个滤片从冰箱取出后，剪成小碎片，转移至装有吸收烟气气相物的DMSO溶液的三角瓶中，然后再加入10mL DMSO溶液制备25mL DMSO混合液，常温摇床震荡40min后，吸取萃取后的样品。
4)将样品置于超净台中用0.22μm无菌滤器配合无菌注射器过滤于无菌离心管中，得到无菌全烟气混合母液，原液浓度为20支烟/25mLDMSO，即0.8支烟/mL。
实验例1
本实验例为采用实施例1和对比例的用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法得到的加热卷烟全烟气母液的Beas-2b细胞毒性测试。
不同体积分数DMSO下的Beas-2b细胞存活率如图2所示，由图2可知，2％体积分数的DMSO细胞存活率为87％，3％体积分数的DMSO细胞存活率为67％，因此将DMSO体积分数控制在2％内对加热卷烟全烟气母液进行稀释。
按照实施例1的用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法，得到加热卷烟1+加热烟具1、加热卷烟2+加热烟具2在HCI抽吸模式下的全烟气母液。经计算，两种加热卷烟全烟气母液中，配置DMSO体积分数为2％时，为两种加热卷烟全烟气最高染毒剂量，对应TPM的浓度分别为2.25mg/mL和1.56mg/mL。
按照实施例2的用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法，得到加热卷烟1+加热烟具1、加热卷烟2+加热烟具2在ISO抽吸模式下的全烟气母液。经计算，两种加热卷烟全烟气母液中，配置DMSO体积分数为2％时，为两种加热卷烟全烟气最高染毒剂量，对应TPM的浓度分别为1.87mg/mL和1.23mg/mL。
同时按照对比例的用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法，得到加热卷烟1+加热烟具1在HCI抽吸模式下的全烟气母液。经计算，所得加热卷烟全烟气母液中，配置DMSO体积分数为2％时，为该加热卷烟全烟气母液时的最高染毒剂量，对应TPM浓度为0.298mg/mL。在该全烟气母液最高染毒剂量下进行加热卷烟样品的细胞毒性试验，试验结果见表2。
表2两种加热卷烟样品细胞毒性
由表2可知，在最高染毒体积分数(DMSO 2％)下，采用对比例的提取方法所得母液在加热卷烟1+加热烟具1下最高染毒浓度为298μg/mL、细胞存活率为72.25±2.63％，而采用实施例1的提取方法所得母液在加热卷烟1+加热烟具1和加热卷烟2+加热烟具2下的细胞染毒浓度分别为2.25mg/mL TPM和1.56mg/mL TPM，细胞存活率分别为13.92±3.56和39.43±3.28，且二者细胞存活率均低于50％，相比于对比例的染毒浓度扩大了7.55倍、细胞存活率降低了58.33％。采用实施例2的提取方法所得母液在加热卷烟1+加热烟具1和加热卷烟2+加热烟具2下的细胞染毒浓度分别为1.87mg/mL TPM和1.23mg/mL TPM，细胞存活率分别为35.27±2.59和45.89±2.58，且二者细胞存活率均低于50％。
可见，本发明的用于体外毒性测试的加热卷烟全烟气的提取方法能够较好的观察较大的细胞毒性响应范围，并能够较好的帮助评估加热卷烟的体外毒性情况。

Claims (6)

1.一种加热卷烟全烟气的体外细胞毒性的测试方法，其特征在于，对加热卷烟全烟气进行提取，提取物稀释到DMSO体积分数为2％时，为加热卷烟全烟气最高染毒剂量，所述提取方法包括以下步骤：
1）在抽吸加热卷烟的过程中，采用滤片捕集烟气总粒相物，采用DPBS缓冲液吸收穿过滤片的烟气气相物；每1个滤片对应的抽吸口数为35-45口，且每使用1个滤片对应采用的DPBS缓冲液的体积为V1，V1为2-3.75 mL；所述滤片为购自Borgwaldt KC GmbH的规格为直径44 mm的剑桥滤片；
2）捕集结束后，采用二甲基亚砜对滤片上捕集的烟气总粒相物进行萃取，萃取有烟气总粒相物的二甲基亚砜与步骤1）中吸收烟气气相物后的DPBS缓冲溶液进行混合；进行所述萃取时，每1个滤片对应采用的二甲基亚砜的体积为V2，V2为2-3.0 mL且V2≤V1；
步骤1）中，所述DPBS缓冲溶液的温度为0-4℃。
2.根据权利要求1所述的加热卷烟全烟气的体外细胞毒性的测试方法，其特征在于：步骤1）中，每1个滤片对应的抽吸口数为40口，且每使用1个滤片对应采用的DPBS缓冲溶液的体积为3.75 mL；步骤2）中，每1个滤片对应采用的二甲基亚砜的体积为2 mL。
3.根据权利要求1所述的加热卷烟全烟气的体外细胞毒性的测试方法，其特征在于：步骤1）中，所述抽吸采用ISO抽吸模式或HCI抽吸模式。
4.根据权利要求1或2或3所述的加热卷烟全烟气的体外细胞毒性的测试方法，其特征在于：步骤1）中，采用的滤片的数量为4个。
5.根据权利要求1或2或3所述的加热卷烟全烟气的体外细胞毒性的测试方法，其特征在于：每支加热卷烟的抽吸口数为4口。
6.根据权利要求1或2或3所述的加热卷烟全烟气的体外细胞毒性的测试方法，其特征在于：V2＜V1时，所述混合是将萃取有烟气总粒相物的二甲基亚砜、补加液与吸收烟气气相物后的DPBS缓冲溶液进行混合；所述萃取有烟气总粒相物的二甲基亚砜和补加液的总体积与吸收烟气气相物后的DPBS缓冲溶液体积相等；所述补加液为DPBS缓冲溶液或细胞培养基。
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