CN108619496A

CN108619496A - Adamts13在制备促进脑卒中后血管重塑药物中的用途

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Publication number: CN108619496A
Application number: CN201710163310.9A
Authority: CN
Inventors: 范文英; 赵冰樵; 徐昊辰; 曹永亮; 杨醒
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2017-03-19
Filing date: 2017-03-19
Publication date: 2018-10-09

Abstract

本发明属生物制药领域，涉及ADAMTS13在制备血管重塑药物中的用途，尤其是ADAMTS13在制备促进脑卒中后血管重塑药物中的用途。本发明经实验结果证实，ADAMTS13的缺失会导致血管再生的减少，血管完整度的下降并且加剧脑缺血小鼠损伤周边皮层的血管损伤；外源的重组ADAMTS13能够显著地增加血管再生，促进血管功能的修复，并且明显的改善脑缺血小鼠的行为功能；ADAMTS13在脑缺血恢复期调节血管再生过程中起重要作用，ADAMTS13缺失抑制血管新生和血管成熟可能与血管通透性的开放有关ADAMTS13促进脑缺血后的血管重塑通过VWF—Ang‑2/Gal‑3—pVEGFR‑2通路完成。

Description

ADAMTS13在制备促进脑卒中后血管重塑药物中的用途

技术领域

本发明属生物制药领域，涉及ADAMTS13在制备血管重塑药物中的用途，尤其是ADAMTS13在制备促进脑卒中后血管重塑药物中的用途。

背景技术

研究表明，脑中风是世界范围内主要的长期致残疾病，然而，目前对促进脑中风后的脑功能恢复尚无有效的医疗手段。研究报道，脑中风后会引起持续的神经再生，这些新生的神经前体细胞会以向缺血损伤周边迁移的方式促进脑功能的重塑。尽管大量报道证明干细胞移植疗法可以促进中风后的脑回路修复和脑功能恢复，但是干细胞的低存活率和成瘤问题均制约着其临床使用。有研究表明，脑中风后，在脑缺血损伤的周边会出现血管新生和血管网络重塑，新生的血管分泌神经营养因子和趋化因子，它们会在受损的脑区制造出良好的微环境支持新生的神经元的存活。对中风病人而言，脑损伤周边的新生血管形成对所述患者的生命至关重要，因此，脑中风后的血管再生应答对神经功能的恢复至关重要，因此，；探究并阐明血管再生以及血管修复背后的分子机制意义非凡，它将为脑中风和神经退行性疾病提供新的临床治疗手段。

血友病因子(VWF)是一种大分子多聚体糖蛋白，它在凝血、血栓形成和炎症细胞聚集等功能中起着重要的作用。正常条件下，VWF由内皮细胞和巨核细胞合成，并储存于内皮细胞的韦伯小体和血小板的阿尔法颗粒中，血管损伤后，VWF以超大多聚体形式存在，并被ADAMTS13快速的切割成活性较低的小分子片段；ADAMTS13的缺失会导致血栓性血小板减少性紫癜(TTP，一种自发形成微血栓而严重威胁生命的疾病)；ADAMTS13也可以通过切割VWF减少血栓、降低炎症反应。

最近有研究表明，VWF参与多种多样的血管活动，其中，VWF在血管形成的过程中扮演重要角色，它会影响血管发育过程中平滑肌细胞的覆盖，由于ADAMTS13能够切割VWF，或许会在血管再生的过程中起作用；还有研究表明，ADAMTS13可以在体外促进人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移。然而，迄今尚未见有关ADAMTS13对在体的血管再生作用的报道。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟通过探究ADAMTS13在脑中风恢复期对新生血管形成和血管网络重塑的作用，提供ADAMTS13在制备血管重塑药物中的用途，尤其是ADAMTS13在制备促进脑卒中后血管重塑药物中的用途。

与本发明相关的现有技术有：

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发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供ADAMTS13在制备血管重塑药物中的用途，尤其是ADAMTS13在制备促进脑卒中后血管重塑药物中的用途。

本发明中采用ADAMTS13敲除小鼠和ADAMTS13、VWF共敲除小鼠进行了脑缺血后VWF切割酶ADAMTS13促进血管新生和血脑屏障完整的分子机制研究实验，结果显示，存在有一条ADAMTS13调控的全新血管再生分子通路，该通路包括：Ang-2，Gal-3和磷酸化的VEGFR-2，结果同时显示在脑缺血恢复期给予重组ADAMTS13可以促进脑缺血后血管修复和血管损伤后的再生。

本发明通过动物实验表明ADAMTS13在脑中风恢复期对新生血管形成和血管网络重塑的作用，所述实验中包括：

实验小鼠被施以远端大脑中动脉阻塞手术模型，在手术建模的10-14天分别对小鼠脑血管长度，新生血管数量，灌注血管长度，血脑屏障的渗漏情况，血管外血浆免疫球蛋白(IgG)的沉聚和外源注射Dextran的渗漏面积，周细胞和平滑肌细胞在血管的覆盖率，脑微血管的紧密连接蛋白和基底膜蛋白含量以及脑功能进行了检测；

结果显示，在脑缺血后第14天，ADAMTS13敲除小鼠的脑缺血周边，新生血管、灌注血管、血管周细胞平滑肌细胞覆盖率，紧密连接蛋白和基底膜蛋白明显减少，血脑屏障的破坏加剧，血管外血浆蛋白的渗漏和沉聚增多；ADAMTS13敲除小鼠共敲除VWF或给予VWF抑制剂可以增加的微血管和灌注血管长度，并逆转周细胞的缺失和血脑屏障的开放；VWF在内皮细胞的底物血管生成素2(Ang-2)和半乳糖凝集素3(Gal-3)在ADAMTS13敲除小鼠的微血管中显著的减少；基于上述结果，使用腺病毒过表达Ang-2或者给予外源重组Gal-3，均可逆转由ADAMTS13缺失所引起的微血管减少、周细胞缺失以及血脑屏障的破坏；给予VEGFR-2(血管内皮生长因子受体2)抑制剂SU1948可以减少过表达Ang-2或外源给予Gal-3对血管的影响；尤其是，在脑缺血造模后第7天给予野生型小鼠重组ADAMTS13可以显著的促进新生血管的形成、血管修复和脑功能的回复；

本发明经实验，结果证明：ADAMTS13是调控脑缺血后血管重塑的关键因子，重组ADAMTS13可以作为一种治疗药物为促进脑中风后脑功能恢复开辟新的途径。

附图说明

图1.ADAMTS13敲除的小鼠在卒中恢复期新生血管减少，

其中，A.缺血14天小鼠脑冠状切面HE染色。蓝色虚线中的区域是共聚焦或多光子显微镜分析位置，B.缺血14天假手术组，野生型和ADAMTS13敲除小鼠CD31标记的血管组化染色，比例尺＝50μm。C.CD31标记的血管统计定量，n＝6；D-F.缺血14天野生型和ADAMTS13敲除小鼠的IB4组化染色，Brdu与CD31共染色，比例尺＝20μm，30μm，n＝6；G,H.给予荧光标记的Dextran后的缺血14天假手术组，野生型和ADAMTS13敲除小鼠的皮层血管多光子成像及灌注血管长度定量，比例尺＝100μm，n＝6。I,J.缺血14天后假手术组，野生型和ADAMTS13敲除小鼠通过Lectin标记的血管图像及血管长度、血管面积定量，比例尺＝100μm，n＝6。

图2：ADAMTS13敲除的小鼠血脑屏障破坏程度增加，血管完整性降低，

其中，A,B.荧光标记的40KDa dextran在假手术，野生型，ADAMTS13敲除小鼠皮层的双光子成像，PS为dextran的渗透率，比例尺＝50μm，n＝6；C,D.纤维蛋白酶原与CD31阳性细胞在假手术，野生型，ADAMTS13敲除小鼠脑切片中的共染色，比例尺＝20μm，n＝6；

E,F.PDGFR-β,α-SMA与CD31阳性细胞在假手术，野生型，ADAMTS13敲除小鼠脑切片中的共染色，比例尺＝50μm，20μm，n＝6；G.western blot检测野生型，ADAMTS13敲除小鼠皮层微血管中的ZO-1，occludin和cludin 5的表达水平；H.collagen IV与CD31阳性细胞在假手术，野生型，ADAMTS13敲除小鼠脑切片中的共染色，比例尺＝20μm，n＝6；I.actin stressfiber在假手术，野生型，ADAMTS13敲除小鼠脑切片中的统计定量，n＝6。

图3.抑制ADAMTS13敲除小鼠中的VWF水平可以促进血管再生并降低血管损伤，

其中，A-D.CD31,FITC-dextran,IgG,CD13,在WT,Adamts13^-/-,Adamts13^-/-Vwf^-/-,Adamts13^-/-给予VWF抗体4组小鼠中的组化染色，比例尺＝50μm，比例尺＝50μm(A-C)，比例尺＝10μm(D)；E-H,血管面积，灌注血管长度，CD13阳性周细胞，IgG渗出的统计定量，n＝6，*P<0.05。

图4.ADAMTS13通过Ang-2/Gal-3-pVEGFR-2信号通路调节新生血管形成和血管损伤，

其中，A.WT和Adamts13^-/-小鼠微血管中的VWF配体分子的PCR定量；B-E.分别对Adamts13^-/-+control(Ad-Con)，Adamts13^-/-+Ang-2adenoviruses(Ad-Ang-2),Ad-Ang-2+DMSO和Adamts13^-/-+VEGF-R2inhibitor Su1498的血管面积，血管长度，周细胞CD13共标率和FITC-dextran渗透率的统计定量；F-I.分别对Adamts13^-/-+ saline，Adamts13^-/-+galectin-3(rGal-3),rGal-3+DMSO和Adamts13^-/-+VEGF-R2inhibitor Su1498的血管面积，血管长度，周细胞CD13共标率和FITC-dextran渗透率的统计定量；J.western blot检测WTmice,Adamts13^-/-mice,Adamts13^-/-mice treated with Ad-Con or Ad-Ang-2,andAdamts13^-/-mice treated with saline or rGal-3组的VEGFR-2磷酸化水平；K.westernblot结果的统计定量，n＝5，*P<0.05。

图5.rADAMTS13在中风恢复期促进新生血管形成

其中，A.Vehicle组和给予rADAMTS13组小鼠脑缺血造模14天后Brdu/CD31的统计定量；B,C.Vehicle组和给予rADAMTS13组小鼠脑缺血造模14天后IB4标记的血管的组化染色和统计定量，比例尺＝25μm；D,E.对血管分支，血管长，血管面积的统计定量；F.CD31标记的血管染色，比例尺＝100μm；G,H.Vehicle组和给予rADAMTS13组小鼠脑缺血造模14天后tomato-lectin标记的灌注血管组化染色和统计定量，比例尺＝200μm；以上各组数据n＝6，*P<0.05。

图6.给予rADAMTS13治疗的小鼠血管损伤降低并对预后有积极影响。

其中，A.对照组和给予rADAMTS13组小鼠脑缺血造模14天后IgG与CD31、FITC-dextran与CD31组化共染色，比例尺＝20μm。B.对照组和给予rADAMTS13组小鼠Fibrin渗出的统计定量。C.对照组和给予rADAMTS13组小鼠IgG渗出的统计定量。D.对照组和给予rADAMTS13组小鼠脑缺血造模14天后CD13与CD31组化共染色，比例尺＝50μm。E.对照组和给予rADAMTS13组小鼠脑缺血造模14天后CD13和CD31的统计定量。F.对照组和给予rADAMTS13组小鼠CD13与pdgfr-β的统计定量。G,H.对照组和给予rADAMTS13组小鼠脑缺血造模14天后collagen IV与CD31组化共染色及统计定量。I,J.对照组和给予rADAMTS13组小鼠在缺血7天时前肢(I)和后肢(J)的错步率统计。K.对照组和给予rADAMTS13组小鼠adhesive taperemoval test统计。行为学数据n＝8，*P<0.05。

图7.脑卒中恢复期ADAMTS13的缺失导致新生血管形成减少，

其中，A-C.假手术组，野生型组和ADAMTS13敲除组的小鼠脑缺血造模14天后CD31标记的血管分支，IB4标记的tip cell和Brdu/CD31共标记的统计定量，n＝8，*P<0.05。

图8.ADAMTS13敲除的小鼠血脑屏障破坏程度增加，血管完整性降低，

其中，A,B.假手术组、野生型组和ADAMTS13敲除组小鼠IgG与CD31组化共染色及IgG渗出统计定量。比例尺＝15μm。C.假手术组、野生型组和ADAMTS13敲除组小鼠周细胞pdgfr-β的定量。D,E.假手术组、野生型组和ADAMTS13敲除组小鼠CD13与CD31组化共染色及CD13血管覆盖率统计定量。比例尺＝50μm。F-H.western blot检测野生型、ADAMTS13敲除小鼠皮层微血管中的ZO-1，occludin和cludin 5的表达水平和统计定量，n＝5。*P<0.05。

图9.ADAMTS13通过Ang-2/Gal-3-pVEGFR-2信号通路调节新生血管形成和血管损伤，

其中，A.CD31,200KDa FITC-dextran,40KDa FITC-dextran,CD13在Adamts13^-/-+control(Ad-Con)，Adamts13^-/-+Ang-2adenoviruses(Ad-Ang-2),Ad-Ang-2+DMSO和Adamts13^-/-+VEGF-R2inhibitor Su1498 4组小鼠中的组化染色；B.CD31,200KDa FITC-dextran,40KDa FITC-dextran,CD13在Adamts13^-/-+saline，Adamts13^-/-+galectin-3(rGal-3),rGal-3+DMSO和Adamts13^-/-+VEGF-R2inhibitor Su1498 4组小鼠中的组化染色。

图10.给予rADAMTS13治疗的小鼠脑微血管周细胞和平滑肌细胞的覆盖率上升，

其中，A,B.缺血后14天小鼠分别给予12.5,25或 50ng rADAMTS13治疗，Brdu标记的新生细胞组化染色及统计，n＝4，*P<0.05.比例尺＝50μm；C,D.Vehicle组和给予rADAMTS13组小鼠周细胞NG2与CD31组化共染色及NG2血管覆盖率的统计定量，比例尺＝30μm；E.Vehicle组和给予rADAMTS13组小鼠平滑肌细胞α-SMA与CD31组化共染色及α-SMA血管覆盖率的统计定量，比例尺＝10μm。

具体实施方式

实施例1动物实验

1)实验动物

ADAMTS13敲除小鼠(购自Jackson Laboratory)，VWF敲除小鼠(购自JacksonLaboratory)ADAMTS13和VWF双敲除小鼠(ADAMTS13敲除小鼠与VWF敲除小鼠杂交后得到F1代ADAMTS13和VWF双杂合小鼠，F1代小鼠雌雄配对，筛选出F2代ADAMTS13和VWF双基因敲除纯合小鼠)均是C57BL/6背景，对照小鼠选用鼠龄匹配的野生型C57BL/6小鼠(由上海斯莱克实验动物有限公司提供)；实验所用的所有小鼠均是8-10周的雄性小鼠；所有的动物实验均遵守复旦大学脑科学协同创新中心动物关爱使用委员会的规定；

2)远端大脑中动脉缺血模型

根据文献，本皮层缺血模型主要通过电凝远端的右侧大脑中动脉实现，简言之，小鼠首先被30％和70％混合气(包含1-1.5％的异氟烷)麻醉，使用小鼠体温检测控制系统将手术小鼠体温控制在37±0.5摄氏度，将小鼠的头骨和硬脑膜小心剥离，分离出大脑中动脉的末梢至嗅球束并将该段血管电凝，血管梗阻后，立即用微脉管夹将颈总动脉夹闭15分钟，假手术组的小鼠仅仅暴露出大脑中动脉和颈总动脉，不做其他处理；

3)给药方法

在小鼠脑缺血造模前第10天，将小鼠麻醉并将26G无菌钢针套管按照如下坐标插入侧脑室：前囟后0.2mm，旁开0.9mm,深1mm，重组ADAMTS13(25ngrADAMTS13溶解于2μl PBS中，购自美国R&D公司)或PBS每日通过侧脑室注射，共注射一周；预实验中，使用了三个不同浓度的rADAMTS13(12.5ng、25ng、50ng)，分别检测它们对脑缺血后损伤周围区域细胞增殖(BrdU阳性细胞)的影响，结果显示25ng的剂量效果最好(图10A和图10B)，VEGFR-2的抑制剂Su1498(250ng溶解于2μl含有1％DMSO的PBS中，购自美国Abcam公司)或对照(含有1％DMSO的PBS)每日侧脑室注射两次，共注射一周，重组人Galcetin-3(每只小鼠每次5μg，购自美国Peprotech公司)或生理盐水每日静脉注射一次，共注射一周，兔抗VWF抗体(给药剂量为每克体重6μg，购自美国Dako Carpenteria公司)或对照兔免疫糖蛋白(购自美国DAKO公司)每日静脉折射一次，共注射一周，1μl腺病毒包裹的标记红色荧光蛋白且编码血管生成素2(Adeno-Ang-2)或仅被红色荧光蛋白标记的对照病毒通过立体定位仪，被注射在右侧纹状体(腺病毒的滴度为1.2x10¹³viral genomes/ml)，所有的药物干预在脑缺血造模第7天时开始给予，为了标记新生的细胞，在小鼠脑缺血造模后的第8-13天每天两次腹腔给予BrdU(给药剂量为每千克体重50mg，购自美国Sigma公司)，所有的小鼠均于脑缺血造模的第14天处死；

4)活体多光子显微成像分析

小鼠用异氟烷(30％O₂，70％N₂)麻醉后，将金属固定棒置于暴露枕骨上，用牙科骨粘合剂辅助固定，使用颅骨钻在缺血周边颅骨表面钻出2×2mm正方形区域，用镊子45°角揭去，小心剥离硬脑膜，用缓冲液(NaCl,KCl,HEPES PH7.4)冲洗，在裸露的脑组织表面滴加50μl 1％琼脂，在琼脂上覆盖5mm圆形玻片(WPI502040)，将玻片调整与颅骨表面水平，用牙科骨粘合剂固定，整个实验过程中，小鼠的体温控制在37±0.5摄氏度；

5)灌注血管长度测定

将小鼠置于多光子显微镜下，在小鼠脑缺血对侧眼眶静脉注射100μl FITC-Dextran(2000KD，50mg/mL，Sigma，FD2000s)，注射后以900NM波长进行扫描，扫描视野为500×500μm，每只小鼠扫描皮层表面下200-500μm的区域，每层扫描间隔5μm，最终每只小鼠会得到由40张照片重组的立体图像，使用FV 10-ASW软件，对该图像进行z轴重组，并分解成500x500x5μm大小的图片，使用NIH Image J软件的Analyze Skeleton插件对重组的图片进行处理，计算每一张图内直径小于6μm的血管总长度，最后平均所有图片每mm³的平均总长度；

6)血脑屏障测定

将小鼠置于多光子显微镜下，在小鼠脑缺血对侧眼眶静脉注射100μl FITC-Dextran(40KD，50mg/mL，Sigma，FD40)，注射后立即以900NM波长进行扫描，每次扫描持续180s，一共扫描大约20分钟，记录注射FITC-Dextran后的动态录像，用ImageJ软件对扫描后的图像进行处理，选取一个20×20μm 的视野计算血脑屏障渗透率PS值，每只小鼠共选择20个视野进行统计，最后得到PS值的平均值；

血脑屏障渗透率PS值(permeability surface-area product)按照以下公式计算，其中，Hct是血细胞比容(45％)，Iv是初始荧光强度，V是血管容积(1g脑的血管容积为50cm³)^[21]。PS＝(1-Hct)1/Iv x V x dIt/dt(其中：由于从组织中回流入血管的荧光染料极少，所以该公式忽略了回流的荧光染料)；

7)行为学

对小鼠的运动功能和感觉功能进行检测，在小鼠脑缺血造模前一天和造模后的第1、7、14天进行平衡杆实验和贴纸移除实验，实验均采用双盲测试，在小鼠行走平衡木实验中，小鼠被置于木质的平衡木杆(木杆直径12mm，长1.2m，高45cm)上，记录前脚和后脚的错步次数，计算10分钟内小鼠错步次数与总步数的百分率，小鼠的前爪或后爪从平衡木上滑落就计一次错步，在小鼠贴纸移除实验中，直径6mm的圆形单面贴纸被贴在小鼠两只前爪的跖面来影响小鼠的触觉刺激，小鼠每天每只前爪共进行3次贴纸移除测试，每次移除贴纸的时间被记录；

8)静脉注射F I TC-Dextran

在双光子之外的实验中，FITC-Dextran被用来检测血脑屏障的渗漏，简言之，在小鼠处死前2分钟通过静脉注射FITC-Dextran(分子量＝40，000Da，购自Sigma，每只小鼠注射50ul，浓度100mg/ml)，经过体循环后，取小鼠脑组织，浸泡于4％的多聚甲醛中24小时，之后再浸泡于30％的蔗糖溶液中4℃过夜48小时，脱水后切成50μm的冰冻切片，之后孵育大鼠抗CD31抗体(购自美国BD公司)4℃过夜，之后孵育荧光标记的二抗Alexa Fluor 594-conjugated驴抗rat IgG(购自美国Invitrogen公司)，使用ImageJ软件计算血管外的FITC-Dextran面积百分比；

9)Tomato-Lect i n标记的灌注血管分析

Tomato-lectin仅与有血流的内皮细胞结合，因此Tomato-lectin被广泛应用于标记灌注血管，Biotinylated lycopersicon esculentum(tomato)lectin(1.25mg/kg，购自美国Vector laboratory公司)在小鼠脑缺血造模后第14天处死前5分钟通过心室注射，体循环后，深度麻醉的小鼠被冰冷的PBS和PFA 灌流，之后脑组织被切成20μm厚的冰冻切片，然后赋予fluorescence-streptavidin(购自Vector Laboratory公司)，拍摄损伤周边的区域图片，灌注血管的长度通过Image J的插件“Analyze Skeleton”进行统计和计算；

10)检测血管外的I gG和F i br i n的沉聚

脑组织冰冻切片被5％驴血清和1％BSA封闭1小时，之后孵育大鼠抗CD31抗体和Alexa Fluor 488-conjugated驴抗mouse immunoglobulin G(购自Invitrogen)或大鼠抗CD31抗体和兔抗Fibrinogen(购自美国Acris Antibodies Inc公司)，4℃过夜，之后孵育对应的荧光二抗Alexa Fluor 594驴抗rat IgG和Alexa Fluor 488驴抗rabbit IgG，通过NIHImageJ软件处理图像，计算IgG和Fibrin的积分荧光强度；

11)免疫荧光化学

使用恒冷箱切片(购自美国Leica公司)机将小鼠脑组织切成20μm厚的冰冻切片，免疫荧光化学实验的步骤如之前所述，本实验中使用如下的一抗：大鼠抗CD31、山羊抗CD31(购自美国R&D Systems公司)大鼠抗BrdU(ab6326，Abcam)，FITC-标记的isolectin B4(IB4；L2895，Sigma-Aldrich)，Cy3标记抗α-smooth muscle(α-SMA；clone 1A4，C6198，Sigma-Aldrich)，山羊抗PDGFR-β(AF385，R&D Systems)，兔抗collagen IV(ab19808，Abcam)，荧光488标记鬼笔环肽(PHDG1；Cytoskeleton，Inc，Denver，Co，美国)，FITC标记抗aminopeptidase N(CD13；558744，BD)，兔抗神经胶质细胞2型(NG2，AB5320，Millipore，MA，美国)，在Brdu染色中，所有的组织切片在2N HCl中处理30分钟来裂解DNA^[17]。二抗的使用如下：Alexa Fluor 594-conjugated驴抗兔IgG,Alexa Fluor594-conjugated驴抗山羊IgG,Alexa Fluor 594-conjugated驴抗小鼠IgG,Alexa Fluor 594-conjugated驴抗大鼠IgG,Alexa Fluor 488-conjugated驴抗大鼠IgG,Alexa Fluor 488-conjugated驴抗山羊IgG,Alexa Fluor 488-conjugated驴抗小鼠IgG,Alexa Fluor 488-conjugated驴抗兔IgG(均购自Invitrogen)；所有的图片均使用奥林巴斯FV 1000共聚焦激光显微镜扫描，每一张图片均采用ImageJ软件分析处理，缺血周边皮层的CD31阳性的血管长度使用Image J插件“Analyze Skeleton”进行长度分析，周细胞的覆盖率统计的是缺血周边皮层0.42mm²范围内CD13、PDGFR-β、NG2细胞在CD31血管上的覆盖率，所有在CD31血管上的Brdu细胞被计数，所有IB4阳性的顶端细胞被计数；

12)微血管分离

实验采用右旋糖酐(购自Sigma公司)梯度离心及细胞过滤器连续筛选的方法提取小鼠脑微血管，以下所有步骤均在4℃条件或冰上操作，用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS；0.01M，pH 7.4)灌流小鼠，取小鼠大脑半球，去除脑膜，用解剖刀片将脑组织切成片状(1～2mm)，并置于杜恩斯匀浆器，加4ml含2％胎牛血清(FBS；Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的PBS进行匀浆，向匀浆液中加入右旋糖酐(分子量70kDa，Sigma)，使右旋糖酐终浓度达到16％，充分混匀，6000g离心15min，去除微血管的脑组织留于右旋糖酐梯度上层，富含微血管的组分沉积于离心管底部，保留沉淀，用含2％FBS的PBS重悬，经100μm及45μm细胞过滤器(购自美国BD Falcon公司)过滤去除较大血管，组织碎片及血红细胞(4-8μm)，小鼠脑微血管留于45μm细胞过滤器上，用PBS冲洗并收集备用；

13)免疫印迹实验

用冰冷的PBS洗之前收集的脑微血管后用RIPA裂解缓冲液重选，RIPA中包含蛋白酶抑制剂cocktails(购自德国Roche Diagnostics公司)，等量的蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶中，电泳后电转到PVDF膜上，用5％的脱脂奶粉封闭，孵育一抗4℃过夜后孵育辣根过氧化物酶标记的二抗，使用Bio-Image分析系统(购自美国Bio-Rad公司)成像；

14)实时定量PCR

使用TRIzol试剂(购自Invitrogen公司)提取之前收集的微血管RNA，使用ABI7300PCR仪(购自美国Applied Biosystems公司)检测等量的样品中的cDNA含量，实验中所使用的基因引物如下：Ang-2上游引物5′-CCTCGACTACGACGACTCAGT-3′,下游引物5′-TCTGCACCACATTCTGTTGGA-3′,connective tissue growth factor11(CTGF)上游引物5′-GGGCCTCTTCTGCGATTTC-3′,下游引物5′-ATCCAGGCAAGTGCATTGGTA-3′,Gal-1上游引物5′-AACCTGGGGAATGTCTCAAAGT-3′,下游引物5′-GGTGATGCACACCTCTGTGA-3′,Gal-3上游引物5′-GGAGAGGGAATGATGTTGCCT-3′,下游引物5′-TCCTGCTTCGTGTTACACACA-3′,insulin-likegrowth factor binding protein-7(IGFBP-7)上游引物5′-AAGAGGCGGAAGGGTAAAGC-3′,下游引物5′-TGGGGTAGGTGATGCCGTT-3′,integrinαv上游引物5′-CCGTGGACTTCTTCGAGCC-3′,下游引物5′-CTGTTGAATCAAACTCAATGGGC-3′,integrinβ3上游引物,5′-CCACACGAGGCGTGAACTC-3′,下游引物5′-CTTCAGGTTACATCGGGGTGA-3′,interleukin-8(IL-8)上游引物5′-CAAGGCTGGTCCATGCTCC-3′,下游引物5′-TGCTATCACTTCCTTTCTGTTGC-3′,osteoprotegerin上游引物5′-ACCCAGAAACTGGTCATCAGC-3′,下游引物5′-CTGCAATACACACACTCATCACT-3′,p-selectin上游引物,5′-GTCTGTCCCGTCACTGGATAC-3′,下游引物5′-TCCTCTCTTACCGGGTTACCA-3′,GAPDH上游引物5′-AATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′,下游引物5′-GATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′；

15)统计学

数据都是以平均值±标准差的方式呈现，所有的统计学分析使用的是Boneferroni多重比较检验的单向方差分析。所有的显著性差异的P值小于0.05。多组检验时使用单边analysis of variance(ANOVA)检验.两组比较时,使用非配对双边T检验；

实验结果显示：

ADAMTS13的缺失减少脑缺血恢复期的血管再生：

本发明使用ADAMTS13基因敲除小鼠探究ADAMTS13在脑缺血恢复期对新生血管形成的作用，对小鼠进行远端大脑中动脉梗阻模型后，对缺血灶周边区域的皮层进行了研究和分析(如图1A所示)，在脑缺血造模后第14天，与野生型小鼠相比，Adamts13基因敲除小鼠的微血管长度和密度有显著的减少，分别减少了30％和47％(如图1B和1C所示)，同时，Adamts13基因敲除小鼠的血管分支数量和IB4阳性内皮顶端细胞也显著地减少了44％和59％(如图1D和图1E，图7A和图7B所示)，通过注射外源BrdU标记新生细胞，BrdU和CD31双阳性信号代表新生的内皮细胞；与野生型相比Adamts13基因敲除小鼠的新生内皮细胞数量显著减少47％(如图1F和图7C所述)，实验数据说明，ADAMTS13在内皮细胞增殖和血管出芽引导的新血管的生成过程中扮演重要角色；

基于免疫组织化学检测到的血管数据，进一步使用FITC-Dextran(分子量＝2000，000Da)和多光子显微镜对灌注血管进行活体的检测，较之于野生型的小鼠，Adamts13基因敲除小鼠的皮层灌注血管长度显著地减少63％(如图1G和图1H所示)，使用番茄素Lectin研究皮层的血管功能性，较之于野生型小鼠，Adamts13敲除的小鼠番茄素Lectin灌注的皮层区域面积减少37％(如图1I和图1J所示)，因此，ADAMTS13的缺失显著的减少脑缺血后新血管的形成和脑血管的灌注。

ADAMTS13的缺失破坏血管的完整性并加剧血脑屏障的破坏:

通过静脉注射荧光的血管造影剂——FITC-Dextran(分子量40，000Da)使用活体的激光多光子成像技术进行ADAMTS13在脑血管渗透性的作用研究,实验的结果说明，野生型假手术组的皮层血管没有大分子量的FITC-Dextran渗出(如图2A和图2B所示)，在脑缺血造模第14天，FITC-Dextran有明显的渗漏(如图2A所示)，表明包含新生血管的脑损伤周边皮层的血管壁(如图1B-图1F所示)有严重的破损,提示新生的血管并未成熟完整还具有通透性，与野生型小鼠相比，ADAMTS13敲除的小鼠的血脑屏障通透性破坏加剧了82％；ADAMTS13敲除的小鼠显著地增加了静脉注射的Dextran的渗漏(如图8A所示)，说明ADAMTS13的缺失加剧血脑屏障的开放，当血脑屏障破坏后，血液循环中的内源性大分子物质会沉聚在脑实质中；进一步测定血液中大分子物质的渗漏情况，通过免疫荧光标记CD31和Fibrin，较之于野生型小鼠，ADAMTS13小鼠的Fibrin沉聚增加了2.2倍(如图2C和图2D所示)，类似于Fibrin，ADAMTS13敲除的小鼠比野生型小鼠的IgG渗漏增多2.3倍(如图8A，图8B所示)；

基于周细胞是维持血脑屏障稳定的重要组份，本实验使用周细胞的标记物PDGFR-β和CD13，实验结果表明，与野生型小鼠相比较，ADAMTS13敲除的小鼠PDGFR-β阳性周细胞和CD13阳性周细胞在血管上的覆盖率分别减少52％和53％(如图2E,图8C-图8E所示)，血管表面的平滑肌细胞α-SMA的覆盖率在ADAMTS13小鼠中明显减少(如图2F所示)，进一步观察血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin 5在Adamts13敲除小鼠中的变化，结果显示发现微血管的紧密连接蛋白均有显著地减少(如图2G、图8F-图8H所示)，较之于野生型小鼠，ADAMTS13小鼠的基底膜Collagen IV阳性细胞覆盖率显著减少54％(如图2H所示)，肌动蛋白应力纤维的形成与血管紧密连接蛋白功能的紊乱以及血管通透性的增加密切相关，较之于野生型小鼠，ADAMTS13敲除的小鼠血管中的肌动蛋白应力纤维显著增加2.2倍，与之前的实验结果对应(如图2I所示)。

ADAMTS13通过VWF的配体血管生成素2(Ang-2)/半乳糖凝集素3(Gal-3)依赖的VEGFR-2激活途径来调控血管新生和血脑屏障的渗透性：

血友病分子VWF是目前已知的ADAMTS13的唯一作用底物，之前的研究表明，VWF的缺失会增加基底胶实验中微血管的形成并且增加小鼠的耳部血管密度，本实验结果显示，与ADAMTS13敲除小鼠相比，ADAMTS13/VWF共同敲除的小鼠损伤周边的微血管密度显著地增加(如图3A和图3E所示)，活体多光子成像表明，双基因敲除的小鼠较之单独敲除ADAMTS13的小鼠，脑损伤周围皮层的灌注血管长度增加了3.5倍(如图3B和图3F所示)，与野生型小鼠相比增加了46％；双基因敲除的小鼠较之单独敲除ADAMTS13的小鼠，CD13阳性周细胞的覆盖率显著增加(如图3C和图3G所示)，测定IgG的渗漏以考察血脑屏障的破坏，结果显示较之单独敲除ADAMTS13的小鼠，双基因敲除的小鼠IgG的渗漏显著地减少了62％(如图3D和图3H所示)，结果表明，在敲除ADAMTS13小鼠同时给予VWF抑制剂A0082时，共同给药组较之单独敲除ADAMTS13基因组新生血管的密度、灌注血管长度、CD13阳性周细胞覆盖率显著增加，IgG渗漏减少(如图3A-图3H所示)；

进一步选取VWF在内皮细胞上的配体进行后续研究，使用实时荧光定量PCR技术，检测脑缺血后第10天小鼠的损伤周围皮层微血管中的VWF配体mRNA水平，共有10个VWF底物的mRNA被定量，其中，ADAMTS13敲除小鼠的Ang-2和Gal-3的mRNA水平较之野生型小鼠的变化最大，均超过了5.5倍的改变(如图4A所示)；Ang-2是血管受体酪氨酸激酶Tie2的拮抗剂，并且对血管再生以及血管完整性具有重要的作用，Gal-3是促血管新生因子，本实验中假设ADAMTS13是通过调节Ang-2及Gal-3通路来起到调控脑缺血后的血管重塑进程，为了证明这个假设，本实验在ADAMTS13敲除小鼠上使用腺病毒过表达Ang-2或者外源注射重组Gal-3蛋白，与给予对照病毒的ADAMTS13敲除小鼠相比，给予Ang-2病毒的ADAMTS13敲除小鼠，在血管面积、灌注血管长度、周细胞覆盖率上均有显著地提高，分别提高了72％、123％、64％(如图4B-图4D，图9A所示，使用多光子活体成像技术，发现在ADAMTS13敲除小鼠上给予Ang-2过表达腺病毒可以逆转基因缺失导致的血脑屏障破坏(如图4E，图9A所示)；与过表达Ang-2类似，当给予ADAMTS13敲除小鼠重组人Gal-3时，r-Gal3可以显著地逆转由于ADAMTS13缺失所导致的血管密度、灌注血管长度、周细胞覆盖面积和血脑屏障开放等结果(如图4F-图4I，图9B所示)；

本实验结果还显示，通过腺病毒过表达Ang-2或者通过静脉注射重组Gal-3都可以逆转ADAMTS13基因缺失所导致的VEGFR-2磷酸化降低(如图4J和4K所示)，给予VEGFR-2的抑制剂SU1498可以显著地逆转由腺病毒过表达Ang-2或重组Gal-3所带来的对血管密度、灌注血管长度、周细胞覆盖率和血脑屏障开放性的影响(如图4B-4E，图4F-图4I，图9A和图9B所示)，实验结果表明，VEGFR-2是一Ang-2和Gal-3信号通路的下游分子。

在脑缺血恢复期，给予重组ADAMTS13可以促进血管再生现象，促进血管功能恢复，改善小鼠的行为学指标：

上述的实验结果证明，在脑缺血后ADAMTS13的缺失会减少血管再生并且加剧血管的恶化；因此，本实验进一步探究外源给予野生型的小鼠重组ADAMTS13，能否增强脑缺血后的血管重塑，与对照组小鼠相比，给予重组ADAMTS13的给药组小鼠在新生的内皮细胞数量、内皮顶端细胞数量和血管的分支数量均有显著地增加，分别增加了2倍、1.9倍和1.5倍(如图5A-图5D所示)，与PBS对照组相比，ADAMTS13给药组的血管长度、血管面积显著地增加了43％和59％(如图5E-图5G所示)；测定Tomato-Lectin标记的灌注血管密度结果显示，ADAMTS13给药组比对照组显著地增加了76％(如图5H-图5I所示)，给药组相比于对照组，血管外IgG和Fibrin的沉积显著地减少了(如图6A-图6C所示)，CD13周细胞和PDGFR-β周细胞的覆盖率在给药组有显著地增加，分别增加了44％和64％(如图6D-图6F所示)，NG2阳性的周细胞覆盖率在ADAMTS13给药组中表现出类似的变化(如图10A和图10B所示)；相较于对照组，给药组的基底膜覆盖率和平滑肌细胞的附着都有显著的提高(如图6G和图6H,图10C所示)；进一步的小鼠平衡木实验和贴纸移除实验结果显示，在缺血后的第1-7天，给药组与对照组在两个行为学测试上未见有显著地差异，在脑缺血后的第14天，给药组的前后肢错步率与对照组相比均有显著的下降，同时给药组小鼠移除贴纸的时间也明显的减少(如图6I-图6K所示)。

本发明的实验结果证实，ADAMTS13的缺失会导致血管再生的减少，血管完整度的下降并且加剧脑缺血小鼠损伤周边皮层的血管损伤；外源的重组ADAMTS13能够显著地增加血管再生，促进血管功能的修复，并且明显的改善脑缺血小鼠的行为功能；ADAMTS13在脑缺血恢复期调节血管再生过程中起重要作用，ADAMTS13缺失抑制血管新生和血管成熟可能与血管通透性的开放有关ADAMTS13促进脑缺血后的血管重塑通过VWF—Ang-2/Gal-3—pVEGFR-2通路完成。

Claims

1.ADAMTS13在制备促进脑卒中后血管重塑药物中的用途。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ADAMTS13为重组ADAMTS13。

3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的外源的重组ADAMTS13能增加血管再生，促进血管功能的修复。

4.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的外源的重组ADAMTS13能改善脑缺血小鼠的行为功能。

5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ADAMTS13通过VWF—Ang-2/Gal-3—pVEGFR-2通路完成促进脑缺血后的血管重塑。