BR112020001091A2 - processo e composição para a estabilização de ácidos nucleicos livres de células - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a uma composição para uso como agente de estabilização e a um processo para a estabilização de amostras biológicas, em particular, de sangue total, em particular, para a estabilização do teor e da integridade de ácidos nucleicos livres de células. A composição apresenta, em solução aquosa, pelo menos uma substância tampão, que tampona para um valor de pH de 7 ou abaixo, preferivelmente 3,5 a 7,0, pelo menos um formador de quelato para cátions bivalentes e urotropina, opcionalmente PEG ou consiste nos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRO- CESSO E COMPOSIÇÃO PARA A ESTABILIZAÇÃO DE ÁCIDOS NU- CLEICOS LIVRES DE CÉLULAS".
[0001] A presente invenção refere-se a um processo e a uma com- posição para a estabilização de ácidos nucleicos livres de células, em particular, de DNA e/ou RNA livre de células, assim como, alternativa- mente ou adicionalmente, para a estabilização de células de amostras biológicas, em particular, sangue total ou plasma ou urina, assim como ao uso da composição como agente de estabilização para ácidos nu- cleicos livres de células e/ou células em uma amostra biológica. A com- posição pode ser misturada a uma amostra livre de células ou a uma amostra contendo células, por exemplo, através de um tubo de coleta de sangue, no qual o sangue foi coletado imediatamente e no qual a composição é previamente introduzida, por exemplo, são coletados 20% do volume máximo de sangue, para cuja finalidade é configurado o tubo de coleta de sangue. Para urina como amostra biológica, a com- posição pode ser previamente introduzida em um recipiente de amostra ou ser misturada à amostra enchida no mesmo, sendo respectivamente preferível introduzir previamente ou misturar a composição em uma pro- porção volumétrica predeterminada à amostra.
[0002] O processo e a composição têm a vantagem, de estabilizar ácidos nucleicos livres de células contidos na amostra biológica, em par- ticular, para a análise posterior, por exemplo, por meio de hibridização, sequenciação ou amplificação, opcionalmente com prévio isolamento, por exemplo, por meio de adsorção em um agente de adsorção para ácidos nucleicos e subsequente eluição. A estabilização de ácidos nu- cleicos livres de células é, em particular, a manutenção da quantidade e estrutura dos ácidos nucleicos livres de células, o que também pode ser designado como sua integridade.
[0003] A composição e o processo têm preferivelmente também o efeito de estabilizar as células contidas na amostra, por exemplo, contra uma lise espontânea, de modo que, por um lado, na amostra coletada, os ácidos nucleicos contidos nas células não são ou são liberados ape- nas em grau reduzido e não se misturam com ácidos nucleicos livres de células da amostra e, por outro lado, da amostra podem ser separadas células, a fim de poder analisar as células essencialmente sem prejuízo através de lise e, por exemplo, livres de ácidos nucleicos livres de célu- las. Neste caso, as células podem ser aquelas do doador da amostra, portanto, células próprias do corpo, por exemplo, células epiteliais e/ou células tumorais e as células podem ser células estranhas ao corpo, por exemplo, bactérias, fungos ou leveduras ou vírus.
[0004] A análise de células, que são separadas a partir de uma mis- tura da composição com uma amostra biológica, pode compreender a análise de proteínas intracelulares e/ou de proteínas ligadas à superfí- cie, por exemplo, através de análises imunológicas. A composição leva preferivelmente a uma estabilização de proteínas ligadas à superfície em células. Estado da Técnica
[0005] O documento WO 2013/123030 A2 descreve, para a estabi- lização de sangue total para a análise posterior de DNA livre de células, a mistura de um composto que libera formaldeído, em particular, de diazolidinil ureia ou imidazolidinil ureia em combinação com um captu- rador para remover o formaldeído livre, por exemplo, de aminoácidos, em particular, glicina, alquilaminas, poliaminas, respectivamente em combinação com EDTA como anticoagulante.
[0006] Umetani et a/, Clinical Chemistry 52:6, 1062-1069 (2006) descreve, para a análise da estabilidade de DNA livre de células no soro através de amplificação quantitativa de PCR, de duas seções de se- quências de repetição ALU, das quais uma seção de 115 bp (ALU 115) está localizada dentro da outra seção de 247 bp (ALU 247). A proporção das quantidades dos amplificados forma uma medida para a qualidade do DNA.
[0007] Um quociente de amplificados de PCR de ALU 247 / ALU 115 de 1, portanto, quantidades iguais de ALU 247 e ALU 115, é conside- rado como sendo característico para gDNA, visto que uma tal amostra, além dos pequenos modelos, contém também os modelos mais longos. Para (cf) DNA livres de células, Hao, T. B., Shi, W., Shen, X. J., Qi, J., Wu, X. H., Wu, Y., Tang, Y. Y., Ju, S. Q. “Circulating cell-free DNA in Serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colo- rectal cancer”, British Journal of Cancer 111, 1482 — 1489 (2014) indi- cam um quociente ALU 247 / ALU 115 de cerca de 0,3.
[0008] O documento WO 2013/045458 descreve, para a estabiliza- ção de sangue total, uma mistura de di-hidroxiacetona como adição hi- pertônica, N,N-dimetilformamida, N N-dietilformamida, N,N-dimetilace- tamida ou N N-dietilacetamida como agente de estabilização para áci- dos nucleicos extracelulares, preferivelmente de um formador de que- lato como anticoagulante e um inibidor da apoptose, que é, em particu- lar, um inibidor de caspase.
[0009] O documento WO 2007/073397 A1 descreve uma composi- ção farmacêutica para o tratamento de doenças da bexiga com um po- lissacarídeo aniônico e um anestésico em tampão, que pode conter me- tenamina (corresponde à urotropina) como agente antibacteriano. Tarefa da Invenção
[0010] A tarefa da invenção está no fornecimento de uma composi- ção alternativa e em um processo alternativo para a estabilização de ácidos nucleicos livres de células, por exemplo, DNA ou de células em amostras biológicas, em particular, no sangue total ou na urina, para a posterior análise, sendo que a composição é preferivelmente estável ao armazenamento e mais preferivelmente, apresenta um menor número de várias substâncias constitutivas como agentes conhecidos.
Descrição da Invenção
[0011] A invenção soluciona a tarefa com as características das rei- vindicações e, em particular, com uma composição para uso como agente de estabilização e um processo para a estabilização de amostras biológicas, em particular, sangue total ou urina, em particular, para a estabilização do teor e da integridade de ácidos nucleicos livres de cé- lulas e/ou para a estabilização do teor e da integridade de células. À composição apresenta, em solução aquosa, pelo menos uma substân- cia tampão, que tampona para um valor de pH de 7 ou abaixo, preferi- velmente 3,5 a 7,0 e, em particular, é dotada para tamponar a mistura da composição e da amostra biológica para esse valor de pH, apresenta pelo menos um inibidor de coagulação e/ou pelo menos um formador de quelato, em particular, pelo menos um formador de quelato para cá- tions bivalentes, preferivelmente para íons de cálcio e urotropina, opci- onalmente PEG ou consiste nesses, em particular, para uso como agente de estabilização para sangue total. Visto que os formadores de quelato, em particular, EDTA, também são inibidores de coagulação, para essa finalidade da invenção os inibidores de coagulação podem ser formados por formadores de quelato. Para uso como agentes de estabilização para urina como amostra biológica, a composição pode apresentar a substância tampão e a urotropina como mistura seca, por exemplo, em forma de pó ou preferivelmente em solução aquosa, opci- onalmente com pelo menos um inibidor de coagulação e/ou formador de quelato ou consistir nesses. Em geral, uma amostra biológica é pre- ferivelmente uma amostra de um tecido ou de um líquido corporal de um animal ou de um ser humano.
[0012] A pelo menos uma substância tampão pode ser selecionada dentre o tampão citrato, tampão acetato, MES (ácido 2-N-morfolinoeta- nolsulfônico), PIPES (ácido piperazin-N,N'-bis-2-etanossulfônico), MOPS (ácido 3-N-morfolinopropanossulfônico), tampão fosfato e misturas de pelo menos dois desses ou consistir nesses. O pelo menos um inibidor de coagulação pode ser, por exemplo, hirudina, opcionalmente em mis- tura com um formador de quelato. Preferivelmente, o inibidor de coagu- lação é um formador de quelato, que pode ser selecionado, por exem- plo, dentre citrato e EDTA e misturas desses ou consistir nesses.
[0013] A composição, sem um composto acrescentado, pode ser um capturador para formaldeído livre ou dissolvido em água, em parti- cular, sem glicina e/ou sem formador de quelato adicional, em particular, sem EDTA (tetra-acetato de etilenodiamina), por exemplo, quando a composição contém citrato. De modo particularmente preferido, a com- posição consiste em uma solução de tampão citrato e urotropina em água. Para uso como agente de estabilização para ácidos nucleicos |li- vres de células e/ou para células na urina ou em um processo para a estabilização de ácidos nucleicos livres de células e/ou de células na urina, a composição pode consistir em tampão citrato e urotropina, op- cionalmente com um inibidor de coagulação e/ou formador de quelato, em mistura seca, na qual o tampão citrato está ajustado, para tamponar na amostra para um valor de pH de 7 ou abaixo, preferivelmente 3,5 a 7,0, em particular, para um volume de amostra predeterminado.
[0014] A substância tampão apresenta preferivelmente uma capaci- dade de tamponamento de uma solução de tampão citrato, que apre- senta uma concentração na faixa de 0,3 a 1 M, mais preferivelmente 0,4 a 0,7 M, por exemplo, 0,5 M e um valor de pH na faixa de 3,5 a 7, pre- ferivelmente de 4 a 6,5, para sangue total como amostra, por exemplo, PH de 4 a 4,5, em geral, mais preferivelmente, um valor de pH de 4,5 ou 4,2 e é dotada, por exemplo, para tamponar a mistura da amostra bio- lógica e da composição para esse valor de pH. O teor de urotropina (hexametilenotetramina) está preferivelmente na faixa de 1 a 30% em peso/% em volume, preferivelmente 2 ou 5 a 25% em peso/% em vo- lume ou até 20% em peso/% em volume, por exemplo, 5 a 19 ou até 8%
em peso/% em volume, na solução tampão. Preferivelmente, a substân- cia tampão é o tampão quelato em uma concentração na faixa de 0,3 a 1 M, mais preferivelmente 0,4 a 0,7 M, por exemplo, 0,5 M e apresenta um valor de pH na faixa de 3,5 a 7, preferivelmente pH 4 a 6,0, para sangue total como amostra, por exemplo, pH de 4 a 4,5, em geral, mais preferivelmente, um valor de pH de 4,5 ou 4,2 e é preferivelmente do- tada para tamponar a mistura da amostra biológica e da composição para esse valor de pH.
[0015] Foi verificado, que o tampão citrato inibe a coagulação de sangue total de forma satisfatória, também sem conter o EDTA. Por con- seguinte, a pelo menos uma substância tampão e o pelo menos um for- mador de quelato pode ser formado a partir de tampão citrato.
[0016] Preferivelmente, em particular, para sangue total como amostra biológica, a composição de acordo com a invenção é produzida preparando o tampão, que é preferivelmente tampão citrato, em água, ajuste do valor do pH e subsequente acréscimo e dissolução da urotro- pina. Preferivelmente, o tampão é produzido misturando uma solução da substância tampão, que é, por exemplo, ácido cítrico ou ácido acé- tico, em água com uma solução de um sal da substância tampão, por exemplo, citrato trissódico ou acetato de sódio, em água, na concentra- ção respectivamente desejada do tampão, por exemplo, tampão citrato ou tampão acetato. Alternativamente, o ácido e o sal do ácido são mis- turados a seco em uma proporção, de modo que na adição do líquido, ajusta-se o valor de pH desejado.
[0017] A composição de acordo com a invenção, é adequada para uso como agente de estabilização para amostras biológicas, em parti- cular, sangue total ou urina, em particular, para ácido nucleico livre de células contendo uma amostra biológica, DNA e/ou RNA, com o subse- quente isolamento de uma fração livre de células, por exemplo, de plasma livre de células ou de células. A partir da fração livre de células podem ser analisados, em particular, ácidos nucleicos livres de células. Neste caso, foi verificado, que a composição é adequada para, em amostras biológicas, em particular, em sangue total, estabilizar a quan- tidade e a estrutura de ácidos nucleicos livres de células, em particular, de DNA livre de células ou de RNA livre de células e prevenir essenci- almente alterações da quantidade ou estrutura desses ácidos nucleicos, de modo que, através da composição, não sejam causadas essencial- mente quaisquer alterações da quantidade ou estrutura desses ácidos nucleicos, que perturbariam a análise posterior dos ácidos nucleicos. Uma análise posterior dos ácidos nucleicos pode ocorrer, por exemplo, através de hibridização, sequenciação ou amplificação, por exemplo, PCR.
[0018] O teor ideal de PEG, por exemplo, de uma ou uma mistura de PEG 6000 até PEG 20000, reage a uma hemólise. A composição, em particular, no uso para a análise posterior de ácido nucleico livre de células, preferivelmente com isolamento de ácidos nucleicos através de adsorção em um agente de adsorção para ácidos nucleicos, não contém qualquer PEG.
[0019] As células de uma amostra biológica, que foi misturada com a composição de acordo com a invenção, caracterizam-se pelo fato de que seu teor de ácidos nucleicos, em particular, DNA e RNA, permanece essencialmente inalterado e não influencia o teor de ácidos nucleicos da fração livre de células.
[0020] A composição de acordo com a invenção tem a vantagem de ser estável ao armazenamento, por exemplo, por pelo menos um mês, mais preferivelmente pelo menos dois meses, por exemplo, durante até oito meses ou até seis meses a O até 30ºC, mais preferivelmente a 5 até 20ºC, a fim de obter o efeito de estabilização. Além do mais, a compo- sição é também estável ao armazenamento, quando essa está contida em um tubo de coleta de sangue e é previamente introduzida nesse para
O Sangue a ser coletado ou está contida em um recipiente de amostra de urina e é previamente introduzida nesse para a urina a ser preen- chida. De modo correspondente, a invenção se refere também a um tubo de coleta de sangue e seu uso para a estabilização de ácidos nu- cleicos livres de células e/ou das células de uma amostra biológica, que é uma amostra de sangue total, sendo que a composição está contida no tubo de coleta de sangue. De modo correspondente, a invenção se refere também a um recipiente de amostra de urina e seu uso para a estabilização de ácidos nucleicos livres de células e/ou das células da amostra biológica, que é uma amostra de urina, sendo que a composi- ção está contida no um recipiente de amostra de urina.
[0021] Foi verificado, que a composição sem um teor de um com- posto captador para formaldeído livre ou dissolvido em água e sem um teor adicional de um anticoagulante, tal como, por exemplo, EDTA, é adequada para a estabilização de ácidos nucleicos e/ou de células. Atu- almente, a estabilidade ao armazenamento da composição e seu efeito de estabilização sobre amostras biológicas é atribuído ao fato, de que a urotropia na composição e na mistura com a amostra está presente em equilíbrio com o formaldeído livre, cuja concentração é suficiente para a estabilização ou inativação de proteínas.
[0022] Preferivelmente, a composição está contida em um tubo de coleta de sangue, por exemplo, em uma proporção volumétrica de no máximo 20%, pelo menos 2%, preferivelmente 5 a 15%, em particular, 8 a12%, por exemplo, de 10% do volume de sangue total, que pode ser aspirado para o tubo de coleta de sangue ou para o qual o tubo de coleta de sangue configurado ao máximo. Preferivelmente, a composição está contida em um recipiente de amostra de urina, por exemplo, em uma proporção volumétrica de no máximo 20%, pelo menos 2%, preferivel- mente 5 a 15%, em particular, 8 a 12%, por exemplo, de 10% do volume de urina, que pode ser preenchido no recipiente de amostra de urina ou para o qual o recipiente de amostra de urina é configurado ao máximo.
[0023] O processo para a estabilização de uma amostra biológica, que é, em particular, sangue total, apresenta as etapas do - contato da amostra com a composição para preparar uma mistura a partir da amostra e da composição, preferivelmente para uma proporção volumétrica de no máximo 20%, preferivelmente 5 a 15%, em particular, 8 a 12% da composição, que está preferivel- mente em solução aquosa, à amostra, - opcional armazenamento da mistura a partir da amostra e compo- sição acima de 0ºC, por exemplo, a O até 37ºC, por exemplo, a O até 30ºC, mais preferivelmente a 5 até 20ºC ou a 22,5ºC, por exemplo, durante 1 hora a 14 dias, preferivelmente 5 horas até 5 dias ou até 3 dias ou até 2 dias, - opcionalmente com subsequente separação da mistura em uma fração contendo células e em uma fração livre de células, - preferivelmente o acréscimo de proteinase, por exemplo, protei- nase K, depois da separação da mistura, à fração livre de células produzida e - a análise dos ácidos nucleicos da mistura a partir da fração livre de células e/ou a análise das células a partir da fração contendo células.
[0024] O processo para a estabilização e análise de ácidos nuclei- COS livres de células de uma amostra biológica apresenta, por exemplo, as etapas do contato da amostra com a composição para uso como agente de estabilização para o ácido nucleico livre de células contido na amostra para a preparação de uma mistura da amostra e da composição e do armazenamento da mistura da amostra e da composição a O até 30ºC durante pelo menos 1 hora até 14 dias, preferivelmente com sub- sequente separação da mistura em uma fração contendo células e em uma fração livre de células, preferivelmente o acréscimo de proteinase,
por exemplo, proteinase K, depois da separação da mistura para a fra- ção livre de células produzida e a análise dos ácidos nucleicos da mis- tura a partir de sua fração livre de células e/ou a análise das células a partir da fração contendo células ou o processo consiste nessas etapas.
[0025] A análise da mistura compreende opcionalmente o isola- mento de ácidos nucleicos, preferivelmente através do contato com um agente de adsorção para ácidos nucleicos e subsequente lavagem do agente de adsorção e eluição dos ácidos nucleicos ligados do agente de adsorção. Agentes de adsorção correspondentes, por exemplo, ma- teriais de troca de íons estão contidos, por exemplo, em kits de isola- mento de DNA de Macherey-Nagel (NucleoSnap DNA Plasma) ou Qia- gen (QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit).
[0026] A separação da mistura em uma fração contendo células e em uma livre de células pode ocorrer, em geral, por exemplo, através de filtração ou centrifugação e/ou através de adsorção.
[0027] Em geral, em particular, para urina como amostra, o pro- cesso, em particular, para a fração livre de células, pode compreender pelo menos uma etapa de enriquecimento para ácidos nucleicos livres, por exemplo, a precipitação de ácidos nucleicos e/ou a adsorção de áci- dos nucleicos em um adsorvente, por exemplo, em partículas paramag- néticas, que são revestidas com um agente de adsorção.
[0028] Opcionalmente, uma fração contendo células, da qual a fra- ção livre de células é separada de uma mistura da amostra biológica com a composição, pode ser suspensa e desintegrada em uma compo- sição aquosa, tal como é descrita presentemente como agente de esta- bilização.
[0029] A invenção é descrita, agora, em mais detalhes com base em um exemplo com relação às Figuras, que na - Figura 1 mostra o resultado de uma amplificação de PCR de DNA livre de células a partir de uma amostra depois de vários períodos de armazenamento e na - Figura 2, mostra o resultado de amplificações de PCR de duas se- ções de DNA como quociente das concentrações dos amplificados depois de vários períodos de armazenamento. Exemplo 1: Isolamento e análise de DNA livres de células a partir de sangue total
[0030] A composição foi preparada misturando 0,5 M de ácido cí- trico (mono-hidrato) em água e 0,5 M de citrato trissódico (di-hidrato) em água até obter o pH de 4,2 e subsequente acréscimo e dissolução de 18% em peso/% em volume, de urotropina.
[0031] Como exemplo para uma amostra biológica, o sangue total de 4,9 ml foi coletado de 3 doadores em respectivamente 4 tubos de coleta de sangue idênticos, que continham 0,49 ml da composição (10% em volume, do sangue total). Desses tubos de coleta de sangue, que continham essa mistura de sangue total e a composição e que foram armazenados a 22,5ºC, foi processada respectivamente uma no dia O (TO), dia 3 (T3), dia 7 (T7) e dia 14 (T14) e dessa foi isolado DNA livre de células e analisado. Para isso, a partir de cada tubo de coleta de sangue foi produzida uma fração livre de células através de um pro- cesso de centrifugação de duas etapas (10 minutos, 2.000 x g; 15 mi- nutos, 15.00 x g).
[0032] A partir do plasma livre de células assim produzido, que con- tinha a composição para a estabilização, isolou-se o DNA livre de célu- las com o kit NucleoSnap DNA Plasma (à venda pela Macherey-Nagel). Ao contrário da instrução do kit, foram usados 1,7 ml do plasma livre de células em vez de 3,0 ml e o tampão de lise VL, assim como o etanol foram reduzidos, do mesmo modo, de 3 ml para 1,7 ml. Além do mais, o tempo de incubação para o plasma livre de células com proteinase K à temperatura ambiente e a 56ºC foi respectivamente prolongado de 5 minutos para 15 minutos.
[0033] A análise do DNA livre de células ocorreu através de amplifi- cação da seção de 115 bp de ALU115 e da seção de 247 bp de ALU247 por meio de PCR quantitativo, tal como descrito por Umetani et a/ (2006).
[0034] A Figura 1 mostra o valor médio dos quocientes da concen- tração de ALU115 para o tempo indicado no dia 0 (TO), dia 3 (T3 = Tx), dia 7 (T7 = Tx) e dia 14 (T14 = Tx) da alíquota e da concentração de ALU 115 no dia O (TO). Neste caso, um quociente (Tx/TO) de 1, indica que a concentração do DNA livre de células permanece inalterado ou estável na mistura e também que o DNA livre de células da mistura pode ser amplificado de forma inalterada pelo PCR. Esse resultado mostra, que o DNA livre de células na mistura de sangue total e da composição é estabilizado durante um período de armazenamento de pelo menos 14 dias a 22,5ºC em concentração e estrutura para uma subsequente análise.
[0035] A Figura 2 mostra os quocientes das quantidades absolutas de DNA livre de células (cfDNA) no exemplo de ALU 247 e ALU 115 nos tempos indicados do armazenamento a 25ºC (dia O (O), dia 3 (3), dia 7 (7), dia 10 (10) e dia 14 (14) para a composição de acordo com a inven- ção (cfDNA exato) e para amostras de EDTA (EDTA) no dia 0 (0) e dia 7 (7)). O resultado mostra a estabilização com base no quociente cons- tante durante o tempo de incubação através da composição de acordo com a invenção (exato). Em amostras não estabilizadas, anticoaguladas com EDTA, o quociente ALU 247 / ALU 115 aumenta com o aumento do tempo de armazenamento. Uma estabilização insuficiente de amos- tras de sangue / amostras biológicas leva à lise de células e, com isso, à liberação do DNA genômico (gDNA). Um quociente ALU 247 / ALU 115 de 1, portanto, quantidades iguais de ALU 247 e ALU 115 é carac- terístico para gODNA.
[0036] Esses resultados mostram também, que a composição é adequada para o isolamento posterior de ácidos nucleicos livres de cé- lulas a partir de uma mistura livre de células da composição com plasma com a adsorção dos ácidos nucleicos em um agente de adsorção ou esse isolamento não é prejudicado. Exemplo 2: Isolamento e análise de células de sanque total
[0037] De acordo com o exemplo 1, preparou-se uma mistura da composição e sangue total e armazenou-se a 22,5ºC. Uma segunda amostra de sangue total continua, em vez da composição de acordo com a invenção, solução fisiológica de cloreto de sódio e EDTA (1,6 mg / ml de sangue) para prevenir a coagulação. Dos dois tipos de amostras de sangue submeteram-se no dia O, dia 1, dia 3 e dia 5, 5,0 ml cada a uma lise de eritrócitos e as células endoteliais circulantes (CEC) foram enriquecidas e analisadas com auxílio do Kit CEC Enrichment and Enu- meration da empresa Miltenyi Biotech. Em indivíduos sadios o número de células endoteliais circulantes situa-se em cerca de 1 — 20 células/ml. Em diferentes doenças, o número dos cECs é, em parte, consideravel- mente aumentado. Preparações de estabilização devem assegurar, que o número de cEC é estável em amostras de sangue armazenadas. De- pois da análise descrita para o kit, foi verificado, que o número das CEC detectadas permaneceu constante apenas nas amostras estabilizadas durante o tempo de armazenamento. Exemplo 3: Isolamento e análise de DNA livre de células a partir de urina
[0038] A composição foi preparada misturando 0,5 M de ácido cí- trico (mono-hidrato) em água e 0,5 M de citrato trissódico (di-hidrato) em água até obter o pH de 4,2 e o subsequente acréscimo e dissolução de 15% em peso/volume de urotropina.
[0039] Como exemplo para uma amostra biológica, 90 ml de urina foram misturados imediatamente após a coleta da amostra com 1/10 de volume da composição. Dessa mistura, que foi armazenada a 22,5ºC, processou-se respectivamente uma alíquota no dia 0, dia 3, dia 7 e dia
14 e dessa, isolou-se e analisou-se o DNA livre de células. Para isso, a partir de uma alíquota foi produzida respectivamente uma fração livre de células através de uma centrifugação a 15000 x g durante 15 minutos e separação da fração livre de células. A partir da fração livre de células assim produzida, que continua a composição para a estabilização, o DNA livre de células foi isolado com o kit NucleoSnapDNA Plasma (à venda pela Macherey-Nagel).
[0040] Em comparação com amostras de urina, que foram armaze- nadas não tratadas ou misturadas com adição de um volume igual de solução fisiológica de cloreto de sódio ou apenas com a substância tam- pão dissolvida e foram armazenadas de forma idêntica, mostra, que o DNA livre de células foi estabilizado através da composição. Exemplo 4: Análise de células estabilizadas na urina
[0041] De acordo com o exemplo 3, a urina foi misturada com célu- las de carcinoma de próstata (LnCap) e para a estabilização com a com- posição ou para comparar com essa foi misturada com solução fisioló- gica de cloreto de sódio e armazenada.
[0042] A análise ocorreu depois do tempo de armazenamento idên- tico das amostras comparativas em células sedimentadas por centrifu- gação. Foi verificado, que apenas a composição de acordo com a in- venção permitiu a detecção citométrica de fluxo das células acrescen- tadas.
[0043] Em comparação com amostras de urina, que foram mistura- das não tratadas ou com adição de um volume igual de solução fisioló- gica de cloreto de sódio ou apenas com a substância tampão e armaze- nadas de forma idêntica, mostra que a composição estabilizou os mar- cadores superficiais das células durante o armazenamento.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Uso de uma composição como agente de estabilização para os ácidos nucleicos livre de células contidos em uma amostra bio- lógica, caracterizado pelo fato de que a composição apresenta pelo me- nos uma substância tampão, que tampona para um valor de pH de 7 ou abaixo, pelo menos um inibidor de coagulação, que é preferivelmente um formador de quelato e urotropina, opcionalmente PEG, em solução aquosa.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição consiste na pelo menos uma substância tam- pão, no pelo menos um inibidor de coagulação, que é um formador de quelato e urotropina, opcionalmente PEG, em solução aquosa.
3. Uso de uma composição como agente de estabilização para os ácidos nucleicos livre de células contidos em uma amostra bio- lógica, caracterizado pelo fato de que a composição apresenta pelo me- nos uma substância tampão, que é configurada para tamponar a amos- tra biológica para um valor de pH de 7 ou abaixo, pelo menos um inibidor de coagulação, que é preferivelmente um formador de quelato e urotro- pina, opcionalmente PEG, como mistura seca.
4, Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre- cedentes, caracterizado pelo fato de que a composição não contém qualquer composto capturador para formaldeído livre ou dissolvido.
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre- cedentes, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma substância tampão tampona a solução aquosa para um valor de pH na faixa de 3,5 a 7 e apresenta uma capacidade tampão, que corresponde a uma con- centração de 0,3 a 1 M de citrato e está dissolvida na solução em 1 a 30% em peso/volume, de urotropina.
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre- cedentes, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma substância tampão e o pelo menos um inibidor de coagulação, que é um formador de quelato, são formados pelo tampão citrato.
7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre- cedentes, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma substância tampão é selecionada dentre o tampão citrato, tampão acetato, MES (ácido 2-N-morfolinoetanolIsulfônico), PIPES (ácido piperazin-N,N'-bis- 2-etanossulfônico) MOPS (ácido 3-N-morfolinopropanossulfônico), tampão fosfato e misturas de pelo menos dois desses e que o pelo me- nos um inibidor de coagulação, que é um formador de quelato, é seleci- onado dentre o citrato e EDTA e misturas desses.
8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre- cedentes, caracterizado pelo uso como agente de estabilização para ácidos nucleicos livres de células, o subsequente isolamento de uma fração livre de células e a análise dos ácidos nucleicos contendo a fra- ção livre de células.
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre- cedentes, caracterizado pelo uso como agente de estabilização para as células contidas na amostra biológica, o subsequente isolamento de uma fração contendo células e a análise das células contidas nessa.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a análise das células da fração contendo células compre- ende a análise dos ácidos nucleicos contidos em células e/ou a análise imunológica de proteínas ligadas à superfície de células.
11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é san- gue total e a composição está contida em uma proporção volumétrica de até 20% do volume máximo de amostra a ser coletada, para o que é configurado um tubo de coleta de sangue.
12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é urina.
13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é está- vel em mistura com a composição a O até 37ºC durante 1 hora até 14 dias.
14. Composição para uso como agente de estabilização para uma amostra biológica, caracterizada pelo fato de que a composição consiste em pelo menos uma substância tampão, que tampona para um valor de pH de 7 ou abaixo, pelo menos um inibidor de coagulação, que é preferivelmente um formador de quelato para íons de cálcio e urotro- pina, opcionalmente PEG, opcionalmente água.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracte- rizada pelo fato de que a composição consiste em tampão citrato como substância tampão e como formador de quelato como inibidor de coa- gulação e urotropina, opcionalmente em solução aquosa e o tampão citrato tampona para um valor de pH na faixa de 3,5 a 7.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracte- rizada pelo fato de que a composição consiste em tampão citrato como substância tampão e como formador de quelato e urotropina em solução aquosa e o tampão citrato tampona para um valor de pH na faixa de 3,5 a 7 e na solução são dissolvidos 1 a 30% em peso/volume, de urotro- pina.
17. Tubo de coleta de sangue, caracterizado pelo fato de que contém uma composição para uso como agente de estabilização para os ácidos nucleicos livres de células contidos em uma amostra bioló- gica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou 13, em uma proporção volumétrica de até 20% do volume da amostra a ser coletada no tubo de coleta de sangue.
18. Processo para a estabilização e análise de ácidos nuclei- cos livres de células de uma amostra biológica com as etapas de - contatar a amostra com uma composição para uso, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma mistura a partir da amos- tra e da composição e - armazenar a mistura a partir da amostra e da composição a O até 37ºC durante 1 hora a 14 dias.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracteri- zado pelo fato de que a composição é contatada com a amostra em uma proporção volumétrica de no máximo 20% do volume da amostra.
20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 18 a 19, caracterizado pelo fato de que possui as etapas de - separar a mistura subsequente ao armazenamento em uma fração contendo células e em uma fração livre de células e - analisar os ácidos nucleicos da fração livre de células e/ou na fra- ção contendo células e/ou da análise de proteínas ligadas à super- fície da célula na fração contendo células.
21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracteri- zado pelo fato de que depois da separação da mistura na fração livre de células, é acrescentada proteinase e, em seguida, a mistura é incubada.
22. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 20 a 21, caracterizado pelo fato de que a partir da fração livre de células os ácidos nucleicos são isolados e, em seguida, analisados.
23. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 20 a 22, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é san- gue total ou urina.
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