JPS5819063B2 - 白血球、特に好塩基性細胞を計算するための試薬および該試薬を使用する計算方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、白血球、特にヒト又は動物におけるデ血液好
塩基性細胞のような好塩基性細胞を計算することにより
アナフィラキシ−敏感度、特にアレルギー反応に対する
敏感度を判定する方法およびそれに使用するための試薬
に関する。

そして、本発明は、また、過敏症の障害、詳しくは、ア
レルギーの原因を上述した手段を採用してガラス器具内
で診断するための方法に関する。

一般的に、テストされるべき種々のアレルゲンを多数注
入することからなるアレルギーを診断する方法が知られ
ており、この方法は今日まで非常にしばしば採用されて
いる。

この方法を行なうことによって存在する不快さに加うる
に、この方法は、患者に対して時には著しく急険であり
、かつ説明するのに困難な不特定な反応をしばしば生ず
る。

何年かの間、血清中に明白な過敏症の抗体を製造するた
めの方法が存在していた。

しかし、一方、この方法は非常に高価である。

何故ならばこの方法は、放射性沃素でマークしたり不溶
性基体上に固定したりするために非常に複雑な精製技術
を用いたり、精製されたアレルゲンおよび動物に免疫性
を与えることによって得られる抗体を用い、ついで精製
するからである。

一方、この方法は特殊な装置（遠心分離際、そして放射
性成分を計算するための装置）を必要とする。

この装置は、この方法を非常に高価となし、かつ、開発
国の大都市の中心部以外では不適当である。

加うるに、血清抗体の存在はアレルギーを発現させるの
に不十分であるということが知られていない。

実際、血液中の好塩基性細胞がアレルギーの症状の発現
に重要な役割を演することは知られている。

特に、アレルギー現象がアレルゲン剤の存在下に循環血
液中において好塩基性細胞の顆粒減少に大いに役立ちう
ろことが観察されている。

この顆粒減少は就中、これらの好塩基性細胞を含有する
毒物、特にヒスタミンの大量を開放することによって伴
われる。

また、アレルギー反応がガラス容器中において再現され
ることは判っている。

このガラス容器中において、好塩基性細胞は、種々の形
態学上の変形又は細胞状の変形をうける抗原の効果の下
に顆粒減少を受は易い。

なお、この抗原は、制御試料中の好塩基性細胞中には観
察されるものでなく、またはこれらの試料について疑い
もなく不活性であるアレルゲン剤と前板って接触される
。

このことは、患者に起因する血液試料の好塩基性細胞が
抗原又はアレルゲンの存在下に受は易いという細胞状の
変形についてのガラス容器中における研究に基くアレル
ギーの診断のための方法がすでにある著者によって提案
されていることによる。

抗原又はアレルゲンについて、過敏症反応をこの患者の
中で誘発する可能性が研究されている。

これらの診断法は、現在までに、非常に犬さな困難性に
遭遇している。

この困難性の第１の原因の一つは、血液のその他の成分
に関する好塩基性細胞が非常に、かつ、むしろまれであ
ることにあるのであり、このためにすでに述べた技術は
、一般的に二つの段階、すなわち好塩基性細胞中の血液
試料の比較濃度という第１段階であり、ついで該細胞の
いわゆる着色段階である。

標準的な技術は、５ＨＥＬＬＥＹ Ｗ、Ｂぶよびり。

ＪＵＨＬＩＮによって記載されている（血液、１９：２
０９（１９６２））。

最初の段階の達成は、好塩基性細胞を包含する白血球の
固定および赤血球の破壊を確保するための媒体と研究さ
れるべき血液試料とを接触させるいくつかの操作を包含
する。

この媒体は、エチルアルコール６０部、氷酢酸２０部お
よび〃ロワホルム２０部から成り、完全な固定を達成す
るために翌日までこの混合物を４℃に保持し、上澄液を
除去してデカントされた細胞を同じ媒体中の懸濁体へ戻
し、濾紙上に懸濁体を濾過して該濾紙自体の上に白血球
によって形成される固体残渣物を得るのである。

次に、第２の段階は、例えば、１００ηのトルイジンブ
ルーを３０ｍ１の蒸留水中に溶解させることによって得
られるトルイジンブルー溶液中に３０秒間、これらの細
胞を有するフィルターを浸漬することから成る。

赤色に着色された好塩基性細胞の試料をついで顕微鏡下
に゛判読″する。

必須部分のみを上述したように思いおこさせるこの技術
は、しかしながら、採用するのに極端に臨界的である。

そして、著者自身が知っているように、実験者の一部に
ついて強い熱意が、顆粒減少好塩基性細胞と粒状比奴塩
基性細胞との間の最も頻発な相違の程度にまで予想され
る。

この相違は、この顆粒減少をうけるこれらの好塩基性細
胞中に確立されうる形態学上の変形の評価に存する。

ある患者は、５ＨＥＬＬＥＹの方法について簡単な意見
を提案した。

例えば、ＫＬＯＰＳＴＯＣＫおよびＡｓ５ｏｃｉａｔｅ
ｓ（イスラエル医薬ジャーナル、９月−１０月、１９６
２．２１巻）は、ガラス容器中においてアレルギーを診
断するための方法を確立するために、試作抗原の効果の
下に血液試料中の好塩基性細胞の形態学上の変形を研究
するための新しい技術を提案した。

これらの技術の一つは、研究されるべき抗原の存在下に
前以って゛ヘパリン処理された″血液試料を２０分間培
養し、ついでこの試料の分別部分と対照物の分別部分を
希釈することから成る。

この対照物は、０．２５％のトルイジンブルーと 。

２．５係の酢酸から形成される着色混合物の５倍容量で
正常塩溶液の存在下に培養されたものである。

得られる媒体の５分間の培養ののちに、顕微鏡下におけ
る比較研究を顆粒減少好塩基性細胞と各試料において粒
状化をうけた好塩基性細胞との割合。

について行う。

なお、粒状化の評価は、粒状化の影響の下に細胞中に誘
発される形態学上の変化に常に基いている。

もしも着色技術がより簡単であるならば、顆粒減少好塩
基性細胞と粒状比奴塩基性細胞との間の形態学上の相違
についての評価は、未だに困難である。

媒体の強い酸性だけがこれらの困難性に付加されるので
あろう。

ＫＬＯＰＳＴＯＣＫおよびＡｓ５ｏｃｉａｔｅｓによっ
て提案された第２の方法は、研究されるべき抗原の存在
下に前以って培養された血液試料を特に差動シ遠心分離
することによって好塩基性細胞を濃縮する段階を包含す
る。

得られる濃縮液中の好塩基性細胞の研究は（この濃縮液
中には白血球および好塩基性細胞が含有されている）、
５０％のエチルアルコールを含有する水／アルコール中
のトルイジンブルーに基く着色剤で着色したのちに顕微
鏡下で行なわれる。

しかしながら、この方法においては、好塩基性細胞の可
能な粒状化についての評価は、なお困難であるので、観
察者が好塩基性細胞を観察し、かつ、赤血球のシートに
全体が包まＪれる他のすべての白血球が現われるまでに
はなされない。

これらの種々の方法または技術にはある程度の効果があ
るが、しかしながら、これらは実際上用いられていない
。

何故ならば、試薬が調整されな・ければならないこと、
試験の時間が長いこと、退屈であることおよび非常に訓
練されたスタッフが必要であることなどの些細なことの
ためである。

一般的に言えば、好塩基性細胞を簡単に計算し得るよう
にする可視化方法は若干あるにすぎない。

これらの計算に固有な困難性は、なる程、Ｊａｍｅｓ
Ｅ、ＭＯＯＲＥおよびＡｓ５ｏｃｉａｔｅｓ（Ｐ。

Ｓ、Ｅ、Ｂ、Ｍ、１９５３，８２巻、６０１〜６０３頁
）によって説明されている。

これらの著者は、好塩基性細胞の水溶性粒体が同時に溶
解されることなしに赤血球の溶血が前以って行なわれる
であろう血液試料中の他の白血球について好塩基性細胞
の区別をすでに説明した。

また、有機酸の中で酢酸が、赤血球のための溶血剤とし
て効果的ではあるが、それらを含有する試薬中の好塩基
性細胞の粒体の溶解性のために適当でないことを特に指
摘している。

簡単に言えば、アルコールの１５係〜３０％溶液が、粒
体を固定するのに効果的ではあるが、溶血剤としては効
果的でないことをこれらの著者は確立している。

これらの明らかに克服できない困難性をやわらげるため
に、好塩基性細胞をメタクロメート着色するための全く
異なった方法が結果として提案されている。

この方法は、研究されるべき血液試料を、等浸透圧塩溶
液に溶解したトルイジンブルー溶液の４０容量部、エチ
ルアルコールの１１容量部およびサポニンの５０係エチ
ルアルコール溶液の１１容量部から形成される混合物に
接触させることから成る。

しかしながら、推薦される方法は、適用に際して、特に
それが好塩基性細胞の相互（粒状化されているか否かに
よるが）の区別に適用される場合に困難性が残る。

この問題は、本発明が解決するものである。

そのほか、血液中の他の白血球から好塩基性細胞を区別
するために用いる場合においてさえ、この方法の再現性
は完全ではない。

メタクロメート着色は顕著でない。

サポニンは媒体中に沈殿する傾向がある。

上述したような全ての困難性は、一般の血液学研究所が
本発明が完成されるに至るまで、過敏症的感性、詳しく
はアレルギーの診断を達成するためにガラス容器中で研
究する方法を要求していなかったことを意味する。

本発明の目的は、特に好塩基性細胞、さらに詳しくは粒
状化をうけたものを除外した顆粒減少好塩基性細胞と、
多分、白血球をもまたガラス容器内で可視化して計算す
るための方法を提供するものである。

この方法は、単一段階で血液試料に適用できるものであ
り、これらの試料の成る成分に必要な前板って濃縮する
ことは伴わない。

そして、この方法は使用が非常に容易であって、再現性
があり、特に訓練されていない人がだれでも行なえｊる
範囲内にある。

本発明の目的はまた、試１験されるべき血液の試料と接
触させたのちに、計算装置によって、特に標準血液計算
器によって、すばやくて脚半の計算を行なえる試薬を提
供することである。

また、本発明の目的は、期間中非常に安定ノであって、
このために各試験について適当な試薬を一時的に調製す
ることがもはや必要でないような試薬を製造することで
ある。

最後に、本発明は、患者が影響される過敏症的感性、詳
しくはアレルギーをガラス器具内で診断するための方法
を完成。

することを目的とする。

好塩基性細胞および、必要に応じて、生物学的媒体、特
に血液試料中に含有される他の白血球を可視化する本発
明による方法は、メタクロメート剤を含有する低浸透圧
的水性試薬、白血球および３好塩基性細胞のための固定
液および試料中に含有される水によって少なくとも一部
が惹起される、血液試料中の赤血球の破壊に寄与するに
適当な酸とこの試料との好ましくは単一段階における直
接混合物によって特徴づけられる。

なお、この酸は、試料／試薬混合物の最終ｐＨが約３お
よび約５の間にあるというような割合で試薬中に存在す
る。

さらに詳しくは、血液の試料などに含有される好塩基性
細胞をメタクロメート剤を用いて可視化する本発明によ
る方法は、好塩基性細１包が前板つ、て固定化されてい
ない試料を試料／試薬混合物のｐＨが３および４の間に
あるような割合で低浸透圧的水性試薬と直接接触される
ことによって特徴づけられる。

なお、この試薬は、メタクロメート剤、好塩基性細胞を
固定させるに適するアルコールお。

よび赤血球について溶菌素生成の性質を有する酸を共に
含有する。

この試薬のメタクロメート剤濃度は、顆粒減少好塩基性
細胞の着色速度を適当に区別するには、一方、前板って
粒状化をうけた好塩基性細胞のゆっくりとした着色速度
を適当に区別するには、十分でない。

一方、試薬中のアルコール濃度は、着色をうける時間を
有する顆粒減少好塩基性細胞にとっては十分に低く、な
お、着色時間前の固定されるべき顆粒減少好塩基性細胞
にとっては十分に高い。

このような形成される試薬の水および酸の含有量は、顆
粒減少好塩基性細胞、すなわち着色される好塩基性細胞
のすべてのうちでただ一つをさらに直接的に観察するの
に十分な程度まで赤血球の溶菌素生成を保証するに足る
。

ｐＨ条件は、非常に重要である。

３より低いｐＨにおいては観察される着色が不安定であ
り、５より高いｐＨにおいては好塩基性細胞と血液の他
の成分とを区別するのが困難となる。

そして、このことは、すべて、赤血球が、最良の場合で
も、もはや部分的に溶菌素生成されないということであ
る。

本発明は、指示されるｐＨブラケットにおいて、一方の
元のままの好塩基性細胞と他方の顆粒減少好塩基性細胞
との着色速度および、もし適用可能ならば、他の白血球
の好塩基性細胞の固定速度の間の競争を、メタクロメー
ト剤によって実施する。

使用される各々の固定剤およびメタクロメート剤の濃度
によって、固定剤により固定される前に元のままの好塩
基性細鴨だけが着色されるべき時間を有するが、一方、
顆粒減少好塩基性細胞は、後で肉眼で見える着色物とな
る時間の前に固着される。

顆粒減少でない好塩基性細胞が観察者に見えるまでその
全量が着色されることに着目するのは興味深い。

このことは、多分、これらの好塩基性細胞中に浸透する
溶媒中に溶解し始める好塩基性細胞の粒子に帰する。

この細胞は、溶解物質が外部へ拡散するのを防止する効
果を有する。

部分的に顆粒減少された場合でさえ好塩基性細胞中に目
で見える着色がないことは、粒子中に誘発され、かつ、
これらの好塩基性細胞の中心のみに存するとしてもその
高い希釈性のために観察が不可能となるこれらの好塩基
性細胞中になお存在すると思われる弱い着色性と同様に
解釈される。

本発明の利益が、好塩基性細胞の粒子の水溶性に対する
酢酸の効果に関する限り以前に不利益であると考えられ
ていたこと（詳しくは、以前に損害が大きいと考えられ
ていた）から、明らかに由来するものであると思わせる
ことにほかならない仮説の問題が存在するにすぎないこ
とは、当然のことながら、いうまでもない。

本発明はまた、試薬自体に関するものであり、この試薬
は、メタクロメート剤（特にトルイジンブルー）を含有
する低浸透圧性水性溶液、白血球および好塩基性細胞の
ための固定剤、および血液試料中の赤血球の破壊に寄与
するに適する酸から形成されることを特徴とする。

なお、この酸は、試薬の最終的ｐＨが約３および約５の
間にあるような割合で試薬中に存在する。

本発明による方法に関して指示される条件に試薬が多少
とも応することは注目的である。

一般的にいえば、血液試料を多数の試薬（容量）で希釈
しなければならないとすれば、試薬成分の各割合および
ｐＨ条件が研究されるべき試薬／血液混合物にまで凡そ
およぶか、またはその反応であろうと思われる。

本発明による試薬においては、水と相溶性であって白血
球の固定および好塩基性細胞の安定化を達成するのに適
するアルコールによって固定剤が構成されるのが好まし
い。

水は、アルコールに対する希釈剤として作用し、かつ、
赤血球に対する溶菌素手成剤として作用する。

酸は、白血球、詳しくは好塩基性細胞と相溶性を有する
ものの中から選択される。

好ましくは、試薬は、等浸圧水性溶液をつくるのに寄与
する塩化すＩ−ＩＪウムのような形態の無機塩のどんな
ものとも無関係である。

その好ましい形態においては、本発明による試薬は、１
００ＴｒＬｌ容量の液として、約２０乃至約５０ｍ１の
アルコール、約８０乃至約５０ｍ１の水（蒸留水が好ま
しく、実際には再蒸留水である）、１ｍｌよりも少ない
酸および必要量のメタクロメート剤を含有する。

好ましいメタクロメート剤はトルイジンブルーによって
構成される。

その他のメタクロメート着色剤として、勿論、例えば、
” Ｍａｓｔ −ｃｅｌ ｌ５ａｎｄ ｂａｓｏｐｈｉ
ｌｓ”）Ａｒ＋ｒ＋ａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮｅｗＹｏ
ｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ）第１
０３巻、１９６３に記載されるものを用いることができ
る。

好ましい酸およびアルコールは、各々、エタノールおよ
び酢酸によって構成される。

本発明による試薬を用いれば、血液試料中の赤血球の破
壊、白血球の固定および好塩基性細胞（ｂａｓｏｐｈｉ
ｌｓ ）の安定化を同時に単一段階で達成することが可
能であり、そして、顆粒減少でない好塩基性細胞の選択
的な赤着色を用いるメタクロメート着色剤がトルイジン
ブルーによって構成される場合に、最終的に、かつ、特
に達成することが可能である。

この着色は、実際」二速やかである。そして、混合物が
白球計算器の室へ移行した場合に、血液試料の一単位容
量に含有されていて顆粒減少をうけていない好塩基性細
胞の数を、この技術分野において周知の方法によって、
すばやく計算することが可能である。

混合物のｐＨが４．５である場合には、単−好塩基性細
胞の細胞質の着色が観察される。

他の占血球の核の非常に僅かな青着色もまた見られるが
、好塩基性細胞よりも他の細胞の細胞質は決して着色、
されていないので、全量のうちで赤色に着色されている
と思われる細胞のみが好塩基性細胞である。

実際、好塩基性細胞の細胞質中に含有されていて上記メ
タクロメート着色剤によって着色された粒子が特別な好
塩基性細胞である。

この理由のために、他の多核細胞の細胞質および白血球
の細胞質はまた、一方において好塩基性細胞的多核細胞
を計算する可能性を生じ、他方において他の多核細胞お
よびリンパ球を計算する可能性を生ずることによっては
、着色されない。

選択されるｐＨは、試薬と血液との直接混合物から生じ
、所望のｐＨ値によって調整される。

多分、混合物のｐＨは、そのｐＨ値を減少させるかまた
は反対に増加させるかのいずれかを望むことによって、
例えば、酢酸もしくは塩酸又はソーダのような構成塩基
を用いて、混合前に試薬のｐＨを変化させることにより
調整することもできる。

勿論、混合物における最終的に所望のｐＨによって、前
以って試薬の酸含有量を整えることは特に簡単である。

方法は極めて簡単な操作である。

これは全ての血液に適用可能であり、その構成分の成る
ものを前以って分離することは全く必要としない。

この方法は、天然の血液に適用可能であり、または等浸
透圧緩衝液で、例えば、”Ｔｙｒｏｄｅ ｂｕｆｆｅｒ
”という用語で知られるもので前以って洗った血液に適
用可能である。

この方法は、新鮮な血液に直接用いることが可能であり
、またはしばらくの間保管した血液の場合におけるヘパ
リンのような凝固防止剤を含有する面突にも直接用いる
ことができる。

混合される血液と試薬との割合は、就中、試薬の最初の
ｐＨにより、かつ、混合物における所望のｐＨによる。

゛最適″な試薬を用いる好ましい場合には、■容量の血
液と９容量の試薬との混合物は、４．５のｐＨとなる。

このことは、実際、顆粒減少をうけていない単一の好塩
基性細胞の選択的着色をもたらす。

硝子板（赤色灯塩基性細胞が処理試料の光線背景におい
て容易に目だつ）の優れた゛判続し易ざ′によって補充
される方法の筒部さは、それを取扱う人が未訓練であっ
てもその人の処理範囲内に迅速に置かれるということで
ある。

結局、本試薬はその構成分の性質を考慮すると４そんな
に高価なものでない。

最終的に、試薬の構成分の割合の賢明な選択は、４℃の
温度でこのような試薬を保持することは興味があるがア
ルコールの蒸発の危険を減少させるために室温で保持す
ると、数ケ月間その安定性が持続するという完全に安定
な混合物をもたらす。

この点に関し、好ましい試薬は、１００ｍ１の液につい
て好ましい構成分を下記のような割合（容量、メタクロ
メート剤に関する限り重量）で含有するものである＝２
０乃至５０属のエタノール１．。

８０乃至５０ｍ１の水、最終混合物のｐＨが約３および
約５の間にあるような１５０および６００ミクロリツト
ルの間の量の氷酢酸、および３０乃至２５０ｒｖのトル
イジンブルー。

この混合物の構成分の相溶性、混合物の犬きな。

安定性および指示された条件下の好塩基性細胞のメタク
ロレート着色における効力は、改良されている。

本発明による試薬におけるさらに好ましい種々の構成分
の割合は下記のとおりである＝２５乃至１４０ｍ１のエ
タノール、７５乃至６０ｒｕｌの水、最終混合物のｐＨ
が約３および約５の間にあるような１５０および６００
ミクロリツトルの間の氷酢酸および３０乃至１００Ｔｎ
９のトルイジンブルーであり、これは１００ｍ１の試薬
の全容量についてであ。

る。

最良の結果は、上記構成分を一ヒ記割合で含有するｐＨ
３，４〜３．６の試薬で得られる：例えば、約３０１ｒ
Ｌｌの無水アルコール、約７０ｍ１の蒸留水、約７０１
ｒ１９のトルイジンブルー、および約４００ミクロリツ
トルの氷酢酸。

本発明はまた、ヒト又は動物における血液好塩基性細胞
のような白血球（特に好塩基性細胞）を計算することに
基き、過敏症感性、詳しくはアレルギーをガラス器具内
で診断する方法に関する。

この方法によれば、顆粒減少活性を証明するのが望まし
い抗原および考慮下に病人の好塩基性細胞に関して不活
性に保持された対照抗原の各々の存在下に与えられた血
液試料を培養する。

そして、試験される血液試料が後者の抗原に感性である
限り、試験されるべき抗原の存在下において好塩基性細
胞の少なくとも部分的な顆粒減少を達成するに必要な時
間ののちに、上記指示された条件下に種々のクラクショ
ンを上述した試薬と混合する。

ついで、各フラクションにおいて目にみえる好塩基性細
胞の計算を標準血球計算器によって行ない、得られる数
を比較する。

試験される試料について得られる結果と対照試料につい
て得られる結果とを比較することによって、病人が試験
される抗原に感性であるか否かが、試験される試料につ
いて行なわれる計算が対照フラクションで得られる数と
有意的に相違するか否かによって、直ちに決定される。

本発明は、好塩基性細胞の顆粒減少を惹起し易い如何な
る抗原又・は化学的薬剤（多くの場合、これらの薬剤又
は抗原はアレルゲンによって構成されているとしても）
に対する患者の感性を診断するのに適用する。

本発明による診断方法についての大きな利益は、その筒
部さにある。

この方法は、顆粒減少をうけた好塩基性細胞が対象物を
形成するという形態学上の変形に包含される必要なしに
、計算技術に単に基く。

この方法はまた、特に装備された研究所において採用さ
れ、かつ、訓練された技術者によって採用されるだけの
濃縮操作にたよることを避ける。

計算は、培養操作の直後において試験されるべきアレル
ゲンの存在下に血液試料について行われるのが好ましい
。

この計算はまた、あとまわしにすることもできる。

しかしながら、反応を妨げて、例えば、エチレンジアミ
ンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ、）の塩のような凝集防止剤を
添加することによって細胞のおそい凝集を避けると餌料
である。

上記手順による方法の感性は、この抗原の存在下に培養
される対照試料について行なわれる計算に関して同様な
条件下における血液試料について行なわれる計算におい
て有意的な減少が観察されるとすぐに、多くの場合、試
験される抗原に関して病人の感性のために明らかになさ
れる結論を可能とする。

しかし、本発明による方法の筒部さおよび感性によって
、特に計算が全部の血液試料について行なわれる場合に
おける好塩基性細胞の顆粒減少がないものとして説明さ
れるものと研究される抗原に関する患者のさらに明白な
感性との間の明らかな相違の存在が成る患者において、
確立される。

さらに、本発明による方法のおかげで、これらの相違の
根源である現象の性質を明らかにすることが可能となり
、かつ、研究される抗原に関して血液中に含有される成
る因子の行為について附加的な情報を得ることが可能と
なる。

特に本発明の他の一つの構成は、血漿が、成る場合には
、アレルゲン／好塩基性細胞の反応に矛盾する成る因子
（以下、゛ブロッキング因子゛′と称する）を含有する
という記述に起因する。

。研究されるべき種々の血液試料の培養が上記条件下に
夫々の抗原に接触して常に行なわれるのであって、かつ
、相当する抗原の存在下に好塩基性：細胞について少な
くとも部分的顆粒減少を一つの試料又は他の試料におい
てたまたま得ることが必要な期間ののちに顆粒減少をう
けていない好塩基性細胞についての計算が好ましくは本
発明の試薬によってなされるというこの構成は、上述し
た操−作が行なわれる筈の血液試料の各々を一方におい
て全血液試料に分割し、他方において血漿が前以って除
去された試料（以下、゛°洗浄血液の試料″と称する）
に分割することによって特徴づけられるのであり、また
、これらの血液試料の各々のた。

めに全血液試料および洗浄血液の試料の両方について上
述した培養および計算を行なうことによって特徴づけら
れる。

これによって、研究される相当抗原に関する患者の過敏
症的感性と好塩基性細吃に関する抗原の顆粒減少作用に
矛盾する因子の。

血漿中の存在との両方を表わす各血液試料のために得ら
れる数の間の夫々の意味が明らかになる。

実際、二つの形態の試料が血漿の存在又は不存在によっ
て相互に区別されるときには、結果における相違の観察
は、単に血漿からのものであり、・さらに正確には、含
有されていて好塩基性細胞（さらに詳しくは、その表面
に固定されていて上述した抗原による攻撃に対抗するク
ラスＩｇＥの免疫グロブリン）を保護する構成分又は因
子からのものである。

これらの因子が全血液試料の血漿中に存在する場合には
、これらの試料中の抗原の破壊が抑制され、観察される
顆粒減少数が抗原の実際的顆粒減少作用についてもはや
指示的ではない。

これに対し、洗浄血液の試料中に観察される顆粒減少数
は、全て、好塩基性細胞に関して試験される抗原の実際
的有毒性をさらに表わしており、この作用は、この形態
の血液試料中の血漿中に存在する因子によってもはや反
駁されない。

これに対し、同じ試料からの洗浄血液の試料および全血
液試料について得られる数が何らの有意な相違をも示さ
ない場合には、研究される抗原に関するブロッキング因
子が血液試料からの患者の血漿中に存在しないことは、
同じ血液試料からのものであって、これらの同じ抗原の
不存在下に培養された（または後述するように、これら
の抗原の存在下ではあるがカルシウムの不存在下に培養
された）対照試料と上記試料とについて計算数の比較が
さらに観察される限り、勿論、合理的に推理される。

本発明の上記構成の第一の重要な利益は、試験されるべ
き抗原の効果と研究される血液試料が採取される患者に
関する対照抗原（特に非−アレルゲン）の効果との間に
前以って必要であると考えられる比較を実際上撤廃する
ことができるという事実にある。

これによって、試験される抗原に関する患者における過
敏症的反応の存在が決定される。

一般的にいえば、洗浄血液の試料は、事実、細胞構成分
に見合う等浸透圧的緩衝液の懸濁体中の細胞構成分（特
に赤血球および白血球）の顕濁体によって構成される。

換言すれば、この等浸透圧的緩衝液は、洗浄血液の試料
中において、全血液□試料中の血漿に置換される。

有利なことには、さらに、この等浸透圧的緩衝液は、そ
れにほぼ等しい媒体（この媒体中には全面液の細胞構成
分が浸漬される）中の血液の細胞構成分を洗浄試料中に
維持するように、炭水化物（特にブドウ糖）およ・び蛋
白質のような構成分を含有する。

有利なことには、この緩衝液は、７．４乃至７．６のｐ
Ｈを有しており（トリーヒドロキシメチル）アミノメタ
ンに基いている。

この緩衝液はまた、ヘパリンおよびＥＤＴＡのような凝
固剤を少量含有していてもよい。

ＥＤＴＡは、就中、反応を安定にする効果、血液を非凝
固性にする効果、ならびに細胞の凝集および管壁への細
胞の沈積を防止する効果を有する。

ヘパリンは、また、これらの機能に寄与し、ＥＤＴ、Ｉ
ＶＹ添加ｆされるカルシウムによってキレート化するこ
とがらＥＤＴＡを保護する。

勿論、これらの構成分は、同じ機能を行なうに適する他
のものと置き換えることができる。

有利なことには、そして全血液試料と洗浄血液１の試料
の細胞構成分が前以ってうける物理的処理における相違
から生ずるようなパラメーターの影響をさらに減少する
ためには（すなわち、後者の細胞構成分とこれらが前以
って浸漬される血漿の細胞構成分とがうける物理的分離
操作のために）、研究されるべき血液試料に由来する最
初の試料における細胞構成分と血漿とを分離することに
よって得られる還元全血液の試料によって実際構成され
る全血液の試料に対して、洗浄血液の試料の調製のため
に用いるものと同一の条件下に試験されＳる。

このようにして分離された細胞構成分は、ついで、血漿
に再度結合させる。

洗浄血液の試料を構成するのに用いる緩衝液の容量は、
血漿と共に形成される細胞構成分から前以って分離され
た血漿の容量に等しい。

細胞構成分と血漿を適用フラクションに分離するには、
勿論、公知の方法、特に遠心分離が適用可能であり、異
種の試料の細胞構成分は、必要に応じ、同一の緩衝液で
洗浄する。

ついで、最終的に得られる、血漿を含有しない細胞構成
分を、全ご血液試料の場合にはそれから細胞構成分を分
離した血漿の量と合せ、焼津血液試料の場合には予め分
離した血漿の量に等しい量の低浸透圧性緩衝液と合せる
。

本発明の追加的構成によると、一定な抗原の影Ｊ響下で
、好塩基性細胞の顆粒減少がカルシウムの存在下でのみ
作用するという事実が利点となる。

上述した培養をカルシウムの存在下で実施するものであ
る、本発明の方法による改良は、特に、検査の目的のた
めに、全血液と洗浄血液のそれぞ。

れの試料の培養をさらに過剰のカルシウム存在下、研究
する抗原の非存在下で実施することによって特徴づけら
れる。

得られた結果を比較すると、研究する抗原に対するアナ
フィラキシ−敏感性を好塩性細胞の他の形態の敏感性と
区別することが可能となる。

特に、カルシウムのみの存在下で培養した試料中で観察
される顆粒減少は、試験すべき抗原以外の因子に対する
好塩基性細胞の敏感性を意味する。

本発明による改良された診断法の追加的好ましい特徴に
よると、対照の目的のためには、全血液と洗浄血液の上
記試料の培養は、試料のカルシウム成分を予め特にキレ
ート化によってマスクしたものについて、試験すべき抗
原の存在下、カルシウムの非存在下で実施される。

抗原のみの存在下での試験試料における顆粒減少の非存
在は、同一抗原の存在下でしかもカルシウムの存在下で
の好塩基性細胞の顆粒減少の観察ｉと共に、血漿試料の
出所である患者のアナフイラサシー敏感性を該抗原に対
して確認される。

これに反し、カルシウムを存在させないで抗原のみを存
在させた場合の好塩基性細胞の顆粒減少は、１ｇＥアナ
フィラキシー系を作用させない好塩基性細胞に対して抗
原が毒性を有することを示している。

この毒性は多くの因子によるものであり、それは媒質中
に汚染物又は減成生成物が存在しているかどうかの問題
である。

上述した観点から、本発明による改良方法によって達成
される利益、すなわち、試験が一層敏感に実施され、か
つ診断が安全であるということの重要性が判る。

本発明は、結局、アレルギー又は類似反応の診断に必要
な試薬を組合せた、一式型のキットを提供することに関
する。

その好ましい形態の一つは、本発明による液体試薬と、
アナフィラキシ−敏感性、特にアレルギータイプの診断
を実施するのに必要な塩基性アレルゲンとを別々に蓄臓
器にセットとしたものである。

また、上記液体試薬の本質的構成分は、なるべく、試薬
に必要な配合割合に応じた量で別な蓄臓器内に収容され
るので、これを扱う人は、これらの構成分を混合するだ
けで長期間保存可能な試薬を構成できる。

何故ならば、この試薬は安定性；であるからである。

試１験すべき血液試料と一緒にされる抗原は溶液の形態
であってもよい。

しかし、塩基性アレルゲンについて、小さな管又は硝子
板（スライド）、ミクロ硝子板又は凹みを有する同効物
に依存する場合の好ましい形態では、乾燥状態の種々の
アレルゲンの一定量をこれらの管又は凹み物に包含させ
る。

これらの量は、弁部又は凹部へ導入された血液試料中に
おける望ましい希釈に採用される。

これらの管又は凹部中にアレルゲンを沈積させるにはそ
れ自体公知の方法で実施す。

るとよく、例えば、アレルゲンの懸濁液又は溶液を予め
管又は凹部に収容し、溶剤を凍結乾燥又は蒸発させると
よい。

上記蒸発法を用いると、アレルギーの診断を非常に迅速
に行なうことができる。

実際には、一定量の血液を、例えはミクロ硝子板。

トを用いて、上記管又は凹部の各々に導入し、該血液を
アレルゲンと接触させて、血液の好塩基性細胞の顆粒減
少を行なうのに適当な温度および期間培養を行ない、そ
の際相当する抗原の存在下で上述した反応を行わせ、つ
いて上記管又は凹部の各々に本発明による試薬の一定量
を添加し、上述した条件下で該凹部における好塩基性細
胞の計算を行なえば十分である。

全血液と洗浄血液との間における前述した計算比較を行
なうには、本発明による液体試薬又はそ。

れを調整するのに必要な構成分と、硝子板又はミクロ硝
子板における弁部又は凹部に包含される抗原を組合せて
含有している試薬キットを用いるとよく、この薬剤用具
は、その中の抗原が、上記弁部又は凹部に導入した血液
試料中の好塩基性細胞。

の少なくとも一部盆がその培養中（この培養は上記抗原
の顆粒減少を保持するのに適した条件下で行なわれる）
において顆粒減少するのに必要な量のカルシウム塩と合
体されていることが特徴である。

有利なことには、抗原を伴った硝子板又はミ。クロ硝子
板において、同一抗原の漸増的用量をそれぞれ含有する
一系列の弁部又は凹部が提供され、これによって希釈度
が増減される。

したがって、成る抗原に対する患者の敏患件の存在のみ
ならず、該抗原に対する患者の好塩基性細胞の敏感度を
も決定することが可能となる。

本発明による上述したような試薬キットを作成する一態
様によると、上述したミクロ硝子板は、さらに、カルシ
ウムが存在しない抗原単独をそれぞれ含有している弁部
又は凹部と、抗原が存在しないカルシウム塩単独を含有
している弁部又は凹部を含有している。

また、上記試薬キットを作成する他の態様では、上述し
たミクロ硝子板は２個のミクロ硝子板に再分化されてお
り、その一方はカルシウムのみを含有している一系列の
弁部又は凹部と、カルシウムと抗原の両者を含有してい
る複数系列の弁部又は凹部を上述した条件下で包含して
おり、他方のものは同一抗原の相当する漸増的（又は漸
減的）用量をそれぞれ含有しているが、カルシウムが存
在していない、相当する複数系列の弁部又は凹部を組入
れている。

主成分としてカルシウムのみを含有している第１番目の
ミクロ硝子板における弁部又は凹部の系列は、勿論、第
２番目のミクロ硝子板から得られる。

次に、実施例を例示するが、本発明の範囲はこれらの実
施例に制限されるものでなく、種々の変形が可能である
。

下記実施例に示されている試験に用いた血液は純粋なヘ
パリン（シリコン処理したプラスチック管内の血液１ｍ
ｌ当り１０単位のヘパリン）について収集したものであ
る。

また、試験を実施までの間、血液は白血球の非特異性凝
集を避けるために、水中又は撹拌下に保存する。

実施例 １ 本発明による着色試薬の調製： ９５ｆｂ工タノール３０ｍ１を蒸留水７０ｍ１と混合し
、ついでこれにトルイジンブルー（米国ニューヨークに
＆に、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｌａｂ、の販売製品）７５
′ｍｇを添加する。

この混合物を全体が溶解するまで撹拌する。

この撹拌をつづけながら、得られる溶液に凍結した酢酸
４００ミクロリツトルを加えてそのｐＨを３．４〜３６
にする。

この溶液を４８時間後に濾過する。

得られる濾液は雰囲気温度下で数ケ月間保存する。

しかし、この際エタノールの蒸発を低減するために４℃
で保存することが好ましい。

また、約２ケ月毎に溶液を濾過することが望ましい。

実施例 ２ 血液の好塩基性細胞のメタクロメート着色と計算： 血液（ヒト又は兎）０．５０−１ｍ１を、ｒｎｌ当り１
０□単位のヘパリン又は０．２モルのＥｌ）ＴＡソーダ
の２５ミクロリツトル（ｐＨ７，４）を含有する管へ注
入する。

この血液試料を実施例１における着色試薬（ｐＨを４．
５に調整）の９倍容量で希釈する。

混合物を緩かに撹拌し、４〜５分後に血球計算器盤中で
公知の方法により好塩基性細胞の計算を行う。

同様な方法で、例えば１０μｌの血液（ヒトの指から採
取）についてより少ない容量で作業することも可能であ
る。

リーサス型（ｒｈｅｓｕｓ −ｔｙｐｅ） ：のミクロ
管の底部に含まれている試薬９０μへ血液１０μｌを加
え、上記と同様にして好塩基性細胞のメタクロメート着
色から得られる赤い斑点を計する。

健康なヒトならびに兎から採取した血液につい１て得ら
れた結果は次のとおりであった。

ヒトにおいて： 血液（１２サンプル）−当り２３〜７０の好塩基性細胞
。

これは標準偏差４４±８（平均上）に相当する。

１健康な兎に
ついて： 血液（３８サンプル）−当り２９８±２３の好塩基性細
胞。

上述した手法は、もつと高いｐＨで操作するときには他
の白血球を計算するのに同様に適用できる。

シ特にｐＨが漸増的に増加するときには、連続して微小
なリンパ球の核、ついで大きなリンパ球、単核細胞、遂
には多核性の白血球が次第に青色に色付けされることが
確認される。

より少量の酢酸を含有する試薬を用いて操作す２るか、
又は該試薬を試験すべき血液試料と混合する前にソーダ
を試薬に添加することによって最高のｐＨが得られる。

実施例 ３ アレルゲン作用の研究： ３一定量
の血液（２５０〜５００ミクロリツトノのを２系列の管
へ導入する。

試験すべき抗原の増加量を第１系列の管と、患者が感じ
ない対照抗原へ添加する。

緩やかに撹拌したのち、管の内容物を３７℃で１０分間
培養する。

ついで多量のＥＤＴＡこソーダを加えて２ Ｘ １０”
−’モルの目的希釈を得る。

このＥＩ）Ｔ Ａは反応を阻止し、反応により起る細胞
の凝集を避ける。

着色法は次の６時間において、例えば１０ミクロリツト
ルの血液の各管から試料を採取し、これらの各試料を９
０ミクロリツトルベの着色試薬と混合することによって
実施される。

ついで上述したようにして好塩基性細胞の計算を行う。

例示のために、下記表に、２人の患者ＡとＢの血液から
得られる好塩基性細胞について一方は花粉（ｐｏｌ ｆ
ｅｎ ）の存在下で他方はペニシリンの存在下で培養し
たのちの平均計算値を示す。

花粉の存在下での計算値は上記表の第１番目の横欄に、
ペニシリンの存在下での計算は第２番目の横欄に示され
ている。

これらの結果から、患者Ａは花粉に対してアレルギーを
示し、患者Ｂはペニシリンに対してアレルギーを示す事
実が確認される。

表 Ｂ 花 粉 ７ ５０ ペニシリン ５０ １２ 実施例 ４ アレルゲンの作用の研究における顕微鏡用載せ硝子板の
使用： 試験すべき抗原を、蛋白質例えば０．０１〜０．１係の
ヒトの血清アルブミンを加えた蒸留水に希釈させてＴｅ
ｒｅｓａｋｉ型の上記硝子板の陥凹部に収容する。

液状溶剤が蒸発すると、これらの硝子板は使用可能の状
態となる。

上記硝子板の陥凹部の各々；へ１０ミクロリツトルの血
液を加え、全体を撹拌し、ついで得られる硝子板を給温
培養器中で３γＣで１０分間放置する。

ついでこの血液を乾燥したＥＤＴＡを含む毛細管へ導入
し、迅速に上記陥凹部へ戻す。

ついで９０ミクロリツトルの着色試薬を上記陥凹部の各
々へ添加し、上述のようにして好塩基性細胞を計算する
。

計算に際しての読みは” Ｆｕｃｈｓ Ｒｏｓｅｎｔｈ
ａｌ ｃｅｌｌｓ”という用語で知られている微小室盤
中で行うことができる。

上記方法においてはアレルゲンの代りに顆粒減少剤（ｄ
ｅｇｒａｎｕｌａｎｔ ａｇｅｎｔ ）を試験してもよ
く、このようにして抗ＩｇＥ抗血清の存在下における好
塩基性細胞の顆粒減少を評価することが可能であり、こ
れは、さらに、患者のアレルギー反応性のパラメーター
を提供する。

反応全体は全血液又は成る種のＴｙ ｒ ｏｄ ｅ緩衝
液又は他の等浸透圧緩衝液で２回洗浄した血液について
実施される。

全血液ならびに洗浄血液中に顆粒減少を生じさせるのに
必要なアレルゲンを加入することによって、血漿中にお
ける゛ブロッキン・グ” （ｂｌｏｃｋｉｎｇ ）因子
の存在を現出させることが可能である。

すなわち、該因子は抗原を消耗させるものであり、アレ
ルギー病理学において非常に重要なものである。

実施例 ５ 添附図面には、本発明を実施する特殊な方法による顕微
鏡用載せ硝子板が図式的に示されている。

図示されている上記硝子板は８列に配置され、符号Ａ−
Ｈによってそれぞれ示されている多数の陥凹部と、番号
１〜１２によりそれぞれ示されてい。

る１２個のカラムから成っている。

例示では、符号ＡとＨで示されている水平列の井はｗ’
ｅ ｌ Ｉ 、抗原を含まない１回分の用量のカルシウ
ム塩を含有していて、前記記載の主題であった対照培養
溶液の製造を可能にするものである。

。残りの６列Ｂ−Ｇの井には低減させた用量の抗原を含
有させて、抗原の濃度も同様に低減するように希釈させ
ることが可能である。

例えば、列Ｂの井は１０−５ｇの抗原を含有する希釈液
が得られる用量を含有しており、列Ｃの井は１０−５ｇ
の。

抗原を含有する得られる用量を含有しており、列り、Ｅ
、Ｆ、およびＧは１０．１０．１０ 、および１０−１
〜の抗原をそれぞれ含有する希釈液が得られる用量を含
有している。

これらの用量は勿論例示にすぎないものであつシて、抗
原によって変化できることはいうまでもないことである
。

カラム１〜１２の陥凹部は全て同一の抗原を含有してい
る（ただし、列ＡとＨの部分を形成する陥凹部を除く）
。

したがって、このような硝子板孟又は顕微鏡用載せ硝子
板は、洗浄血液の試料およびこれらの各試料からの全血
液をそれぞれ、例えば上述したような抗原の漸減的希釈
液の存在下で培養後、６個の異なった試料から得られる
顆粒減少していない好塩基性細胞の計算の比較を可能に
Ｊする。

例えば、カラム１．３．５．７．９および井は、６個の
別々な試料と陥凹部２．４．６．８．１０および１２か
らの全血液の一定な容量と、同じ試料から得られる洗浄
血液の同じ容量を受入れるであろう。

第２の硝子板又は顕微鏡用載せ硝子板は、全ての場合に
、対応する陥凹部中に、カルシウムの不存在で同じ抗原
の調整品を含有している。

全ての硝子板で３７℃で、例えば１０分間培養したのち
、陥凹部の内容物の一定量を顕微鏡用載７せ硝子板（ミ
クロ硝子板）の井の各々から採取し、それらの各々につ
いて特に前述した条件下で計算を実施する。

上記記載の方法で操作することにより、すなわち、種々
の用量の抗原（井においては１−２：３−４ ： ５−
６ ： ７−８ ： ９−１０および１１−１２がそれ
ぞれ一対になっている）を用いることにより、ミクロ硝
子板のカラムの１つの幾つかの井から採取した試料にお
ける顆粒減少を、抗原の存在下でそれが活性であるまで
、確認することが可能となるのみならず、それが研究試
料に誘導可能な顆粒減少の強度をも測定することが可能
となる。

これらの強度は、顆粒減少を受けた好塩基性細胞の割合
に対する抗原の用量の相関関係の値によって表わされる
。

勿論、上記例示したミクロ硝子板よりはるかに多数の井
を有するミクロ硝子板を使用可能なことはいうまでもな
いことである。

ここに記載した具体化法において゛キット″（ｋｉｔ）
は抗原を伴った硝子板又はミクロ硝子板から成っており
、これらの硝子板の各々は種々の試料からの血液試料に
おける好塩基性細胞の計算を可能にする。

なお、本発明が当業者によって容易に推考できる全ての
変形を包含していることはいうまでもない。

例えば、硝子板又はミクロ硝子板を混合したもの、すな
わち、これらの硝子板の各々が種々の抗原の用量を漸増
させたものから成っているパキット″を調整することも
全く可能である。

例えば、例示したような硝子板は、１−２ ： ３−４
： ５−６ ： ７−８ ： ９−１０および１１−
１２のようにそれぞれ一対となったカラムを占有してい
る６種の異った抗原から成ってもよい。

したがって、このような硝子板又はミクロ硝子板は、試
験すべき６種の抗原の存在下で同じ試料から試料（全血
液ならびに洗浄血液のそれぞれの試料）中の顆粒減少し
ていない好塩基性細胞の計算の比較を可能とする０例え
ばカラム１．３．５．７．９および１１は全血液の一定
容量を受入れるだろうし、陥凹部２．４．６．８．１０
および１２は同じ試料からの洗浄血液の同容量を受入れ
るであろう。

実施例 ６ 実施例５によるミクロ硝子板の調製： 溶液１： Ｃ２Ｃｌ２ ・６Ｈ２０２００即 ＭｇＣｌ２ ・６Ｈ２０２００ダ ヒトの血液アルブミン １００ダ 蒸留水 １００ｍ１ 溶液２： カルシウム塩とマグネシウム塩を除く以外は溶液１と同
じ。

カルシウムの存在下で試験すべき抗原の各々を受入れし
ようとする硝子板又はミクロ硝子板の調製に関しては、
上記溶液１の１０ミクロリツトルを列ＡとＨの容共へ撹
拌せずに導入する。

ついで、試験すべき抗原の用量を列Ｂ１Ｃ１Ｄ。

Ｅ、ＦおよびＧの陥凹部へ導入し、溶液１の１０゜ミク
ロリットルに希釈して試験すべき血液試料中の抗原の希
釈液を得るのに適したものとなし、かつ例えば１０．１
０．１０．１０．１０ 、および１０ とそれぞれ等し
い希釈液を適当な容量で上記陥凹部へ導入する。

抗原を受入れようとする相応する硝子板又はミクロ硝子
板を、カルシウムを用いない以外は上記と同じ方法で、
溶液１の代りに溶液２を用いて最初の硝子板におけると
同じ操作を実施して調製する。

上記溶液を３７℃に一夜放置すると、本発明に当するミ
クロ硝子板が得られる。

これらの硝子板は、使用に際して除去できる接着性プラ
スチック物質のフィルムで被覆してもよい。

本発明による゛°キット” （ｋｉｔ）型の様式は、シ
研究すべき血液試料を受入れるのに適した、予め調製さ
れた管をさらに包含していることが有利である。

これらの管は、詳しくは、多量の抗凝固剤、すなわち、
使用時にそれに導入される試料の凝固を防止するのに十
分なヘパリンおよびＥＤＴＡで被。

覆されているものである。

本発明による好しい応用例においては、上記管は、エチ
レンジアミンテトう酢酸および／又はヘパリン塩基を加
えた溶液を用い、この溶液を管中で３７℃で蒸発させる
ことによって調製してもよ。

い。

例えば、蒸留水１００罰中にＥＤＴＡ−２ナトリウム３
．７ｇ、ＥＤＴＡ−４ナトリウム４．３ｇおよびヘパリ
ン０．４ｇを含有する゛°キット″型の完全な様式は、
上述した付着物から成っているミクロ硝子板二できれば
抗凝固剤を被覆した管：洗浄用。

緩衝液（これは親液性状態又は例えば１０倍の濃縮状態
で、蒸留水で割れるアンプル形体もしくは類似形態で提
供することが有利である）：蒸留水および本発明による
試薬から構成されたものである。

洗浄用緩衝液は、例えば次のような組成を有する。

（ヒドロキシメチル）アミンメタン、３．０３ｇ緩衝液
トリス（ＴＲＩＳ） ＮａＣ１７，００ｇ ＫＣｌ ０．３７０
ｇグルコース（Ｄ−グリコース＋ 無水グリコース） １°ｏｏ、ｐ 純粋ヘパリン ０．４０ｇＥＤＴ
Ａ−２ナトリウム ０．４．６ｇＥＤＴＡ
−４ナトリウム ０．５４，９ヒトの血清
アルブミン ２．５０ ｊ；１蒸留水
１００（７実施例 ７ 患者におけるアナフィラキシイー反応、詳しくはアレル
ギー反応を実施例５によるミクロ硝子板によって発見す
る例を示す。

ａ）血液試料の採取 患者から５ＴＬｌの血液を採取し、上述したような管の
一つに導入する。

この管を撹拌器を備えた装置に収容し、試験を行うまで
緩やかに撹拌する。

ｂ）全血液と洗浄血液のフラクションの調製１ 、ｍｌ
の２個の血液試料を上記管に採取する。

全体を室温で１０分間８００ｇにおいて遠心分離し、遠
心分離後血漿の上方レベル部分を管上にマークする。

上記管の内容物を完全に調合し、４ｍｌの洗浄用緩衝液
の全量で洗浄する。

洗浄用緩衝液は遠心分離によって分離する。

この洗浄は繰返して行うことが好ましく、最後に分離し
たのち、遠心分離した一方の管の沈殿物を、緩やかに撹
拌しながら、最初のレベルに達するまで分離した血漿中
に懸濁させて全血液のフラクションを再び構成する。

一方、他方の管の遠心分離した沈殿物は、相当する血漿
の最初のレベルに達するまで洗浄用緩衝液に懸濁させて
洗浄血液のフラクションを形成する。

ｃ）ミクロ硝子板上での培養方法 上述した全血液試料および洗浄血液試料からの１０ミク
ロリツトルの各試料を、該試料について作用を研究しよ
うとする抗原を含有する各ミクロ硝子板の井へ導入する
。

すなわち、洗浄血液の試料を垂直列２．４．６．８．１
０．１２の井へ導入し、全血液の試料を井１．３．５．
７．９．１１へ導入する。

容共へ導入された血液の容量はミクロピヘットによって
静かに吸引、吸出して良く混合し、１ついで被覆されて
いない硝子板を給温培養器中に収容し３７°Ｃに１０分
間保持する。

ｄ）着色方法 研究の終期において、着色試薬９０ミクロリツトルを容
共に収容し、着色液と血液をミクロノビペットを用いて
吸引および吸出させて撹拌し良く混合する。

ｅ）読み（判定） 容共からの混合物を取り出し、例えば ”Ｆｕｃｈｓ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ｃｅｌビ′とい
う名称で知ｊられている血液計算器の室へ収容する。

そのままにして顕微鏡で読みとる。

結論は、さきに述べたように１種以上の抗原の存在下で
観察される顆粒減少の数を比較して得られる。

すなわち、一方顆粒減少を生じない抗原の存在下で確認
さこれる結果に基いており、他方は対照に関するもので
あって、カルシウムのみについていうと陥凹部ＡとＨに
おいて、および抗原を用いてカルシウムの非存在下で調
製したミクロ硝子板の列Ｂ−Ｇの陥凹部において記載し
た例においてみられる結果に基くものである。

また、相違する列Ｂ−Ｇにおける抗原の割合を増加させ
ることによって、同じ方法で、上述した顆粒減少を生ず
る抗原の存在下で観察される結果から、希釈の作用とし
て観察される顆粒減少の数における変化の凹型的曲線を
確立することも可能である。

したがって、同様に、試験した抗原の毒性レベルについ
ての情報又はこれらの抗原に関して試料を採取した患者
の好塩基性細胞の感受性の度合についての情報を得るこ
とも可能である。

カルシウムの存在下で顆粒減少の最低レベルを生ずる希
釈物が一度確立されると、カルシウムの非存在下で、抗
原の同一希釈物を含有している他のミクロ硝子板の陥凹
部における好塩基性細胞の挙動を観察しうるように上述
した種類の対照を限定することが可能であろう。

【図面の簡単な説明】

添附図面は、本発明を実施するための特定な方法を用い
る顕微鏡用載せ硝子板を図式的に示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血液試料の好塩基性細胞を可視性にするための試薬
   であって、メタクロメート剤、血液試料中の好塩基性細
   胞の固定剤、および血液試料中の赤血球の崩壊に寄与し
   得る能力を有する酸を含有する低浸透圧性の水性溶液か
   ら成り、かつ上記酸が試薬の最終ｐＨを約３乃至約５の
   範囲にするような割合で含有されている上記試薬。 ２ 試薬が、液体１００ｍ１当り約２０乃至約５０ｍ１
   のアルコール、約８０乃至約５０ｒｒＬｌの水、好しく
   は蒸留水、１ｍｌより少ない量の酸および必要量のメタ
   クロメート剤を含有している特許請求の範囲第１項記載
   の試薬。 ３ 予め固定されていない好塩基性細胞を含有する、生
   物学的媒質である血液の試料を、メタクロメート剤、上
   記試料中の好塩基性細胞の固定剤、および上記試料中の
   赤血球の少くとも一部を崩壊し得る能力を有する酸を含
   有する低浸透圧性の水性試薬と混合して該混合物のｐＨ
   を約３乃至約５の範囲に調整することにより上記試料中
   の好塩基性細胞を可視し得るようになし、ついでアナフ
   ィラキシ−敏感度、特にアレルギー反応に対する敏感１
   度を判定するために該可視し得る好塩基性細胞を計算す
   る方法。 ４ 血液試料に含有される好塩基性細胞が予め固定され
   ていないものであり、水性試薬が、メタクロメート剤、
   好塩基性細胞を固定可能なアルコ−、ル、および赤血球
   に対して溶菌素中成性を有する酸を含有するものであっ
   て、該試薬中のメタクロメート剤の濃度が、顆粒減少し
   ていない好塩基性細胞の着色度と、予め顆粒減少を受け
   ている好塩基性細胞の比較的弱い着色度との適切な識別
   を可；能とするのに十分に低いものであり、該試薬中の
   アルコールの濃度が、顆粒減少していない好塩基性細胞
   が着色を受ける時間を保有するのに十分に低いものであ
   るが、該好塩基性細胞をそれが順次着色する時間を保有
   する前に固定化するのに十分に１高いものであり、かつ
   上記試薬中の水分と酸の含量が、顆粒減少していない好
   塩基性細胞を直接観察可能にするのに必要な程度まで赤
   血球を崩壊させるのに十分な量である特許請求の範囲第
   ３項記載の方法。 ）５ メタクロメート剤がトルイジンブルーであり、ア
   ルコールがエタノールであり、かつ酸が酢酸である特許
   請求の範囲第４項記載の方法。