JP2019519228A - 水溶液からの洗浄剤の除去のための組成物、システムおよび方法 - Google Patents
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- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
- C02F1/40—Devices for separating or removing fatty or oily substances or similar floating material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C303/00—Preparation of esters or amides of sulfuric acids; Preparation of sulfonic acids or of their esters, halides, anhydrides or amides
- C07C303/42—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
- C07C303/44—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
Description
本出願は、2016年5月31日に出願された米国特許出願第62/343,293号に対する優先権を主張する。本出願の全文は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、水溶液から洗浄剤を除去するための組成物、システム、方法およびキットに関する。本出願の組成物、システム、方法およびキットはまた、水溶液から洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子を除去するためにも使用し得る。
R1−OH I
(式中、R1は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式C4−C12アルキルである)の水不混和性アルコール;および(c)水不混和性ハロカーボンを含む洗浄剤除去システムが提供され、ハロカーボンはアルコールと混和性である。場合により、塩は、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、システムは、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子を除去するためにも使用し得る。
R1−OH I
(式中、R1は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式C4−C12アルキルである)の水不混和性のアルコール;および水不混和性のハロカーボン(ハロカーボンは、アルコールと混和性である)と混合して2相混合物を形成するステップを含み、ほぼ全ての洗浄剤が非水相中に存在する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、方法はまた、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子の除去にも使用し得る。
R1−OH I
(式中、R1は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式C4−C12アルキルである)の水不混和性のアルコール;および水不混和性のハロカーボンを、洗浄剤を含む水溶液と混合することにより形成される2相組成物が提供され、ほぼ全ての洗浄剤が非水相中に存在する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、2相組成物の非水相は、洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子を含み得る。
R1−OH I
(式中、R1は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式C4−C12アルキルである)の水不混和性のアルコール;水不混和性のハロカーボン;少なくとも1種の試薬容器;および場合により、使用説明書(単一または複数)を含み、前記ハロカーボンは前記式Iのアルコールと混和性である。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、キットはまた、洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子を、それらが存在する可能性がある水溶液から除去するために使用し得る。
上述のように、本明細書に記載の洗浄剤除去組成物およびシステムは、少なくとも3種の成分:塩;水不混和性アルコール;およびハロカーボンを含む。これらの成分は、水溶液からの洗浄剤(および存在する場合、洗浄剤関連分子/洗浄剤結合分子)の除去に使用する前に、それらが洗浄剤除去のために水溶液と混合されるまで、別々に保持でき、またはそれらを混合して、全3種の成分の混合物、もしくは3種の成分の内のいずれか2種の混合物として貯蔵できる。従って、本洗浄剤除去システムは、使用前に、塩;水不混和性アルコール;およびハロカーボン成分を貯蔵する1つまたは複数の容器をさらに含み得る。
本システム、組成物および方法に有用な塩は、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である。本システム、組成物および方法で使用可能な塩の具体例には、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−n−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−n−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−n−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、1−ブチルアミンの酸性塩、1−ペンチルアミンの酸性塩、1−ヘキシルアミンの酸性塩、1−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本システムおよび方法は、洗浄剤を含む水溶液が本洗浄剤除去組成物と混合される場合、陰イオン洗浄剤などの洗浄剤の溶解度特性の変化を利用する。2相混合物の形成を容易にするために、アルコール成分は、水に不混和性であるか、またはわずかに混和性であるのみでなければならない。水不混和性アルコールは、式I:
R1−OH I
(式中、R1は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式C4−C12アルキルである)の構造を有する。
ハロカーボン成分の機能の1つは、有機相が下相で、水相が上相となるように、水溶液と本洗浄剤除去組成物との混合物を形成する2相混合物中の有機相の密度を高めることである。さらに、2相の良好な分離を確実にするために、ハロカーボンは水に不混和性であるか、またはわずかに混和性であるのみでなければならず、また、アルコール成分と混和性でなければならない。
本システムおよび組成物は、例えば、除去される洗浄剤を含む水溶液の性質に応じて、または洗浄剤除去(および、存在する場合、洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子の除去)後の水溶液の最終的な用途に応じて、任意に追加の成分を含むことができる。
本出願は、水溶液から洗浄剤を除去する方法を提供する。特定の実施形態では、洗浄剤は陰イオン洗浄剤である。特定の実施形態では、陰イオン洗浄剤はSDSまたはサルコシルである。方法はまた、水溶液中に存在する可能性がある洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子の除去にも使用し得る。したがって、本方法は、理想的に使用され、水溶液から阻害物質、すなわち、限定されないが、PCR(RT−PCRを含む)、ライブラリー調製、およびヌクレオチドシーケンシングを含む下流の用途などの反応を阻害する阻害物質を除去し得る。阻害物質には、例えば、その後の用途などにおける酵素阻害物質、例えば、酵素依存性反応の阻害物質が挙げられる。
試料中のSDSの極めて小さい(<0.01重量/体積%)量を定量するために、高感度アッセイシステムを開発した。このアッセイで、SDSの定量化は、ステインズオールとしても知られる、3,3′−ジエチル−9−メチル−4,5,4′,5′−ジベンゾチアカルボシアニン染料を基準にしている。これは、SDSの存在下で黄色に変わるフクシア染料である。このアッセイは、試料中の0.003%程度の少ないSDSの正確な検出および定量化を可能とする。
・Tecan Infinite 200プレートリーダー
・Grenier96ウエル平底透明ポリスチロールプレート
・ステインズオール[Sigma−Aldrich、カタログ番号E9379−1G]
・イソプロパノール[EMD、カタログ番号PX1834−6]
・DMSO[BDH、カタログ番号B10323]
・10%SDS(w/v)[EMD、カタログ番号DX2490−2]
アッセイの実行前にH2O中の1%に希釈
・50%(v/v)イソプロパノール中の1mg/mLからなるステインズオールストック溶液(1.8mM)。このストック溶液は、暗所、4℃で1ヶ月間安定である。
・ステインズオール中間体溶液(90μM):
中間体溶液は、1mLのステインズオールストック溶液(1.8mM)と、1mLのDMSO、および18mLのH2Oを混合することにより調製した。このステインズオール中間体溶液は、暗所、室温で貯蔵した場合、3日間安定である。
a.0.05%SDS=5μlの1%SDS+95μlのH2O
b.0.025%SDS=50μl(A)+50μlのH2O
c.0.0125%SDS=50μl(B)+50μlのH2O
d.0.0625%SDS=50μl(C)+50μlのH2O
e.0.003125%SDS=50μl(D)+50μlのH2O
f.0.0015625%SDS=50μl(E)+50μlのH2O
g.0.00078125%SDS=50μl(F)+50μlのH2O
h.0%SDS=H2O
1.5μlのSDS標準溶液または試料を96ウェルプレートのウエルに移す。
2.吸光度を読み取る直前に、195μlのステインズオール中間体溶液をそれぞれの試料に加える(注意:ステインズオールは感光性である)。
3.標準的プレートリーダーを用いて、420nm〜480nmから吸光度を読み取る。
4.吸光度の「曲線下面積」(AUC)(420〜480nm)を、GraphPad Prism5ソフトウェアで計算する。
本発明の種々の洗浄剤除去組成物を用いて、既知の量のSDSを含む水溶液からSDSを除去した。異なる濃度のSDSを含む100マイクロリットルの分割量の水性組成物を調製した。塩および20μlの1:1(vol/vol)の高級アルコールとハロカーボンの混合物を下記のように加えることにより、SDS除去を実施した。チューブを強く2分間ボルテックスし、13,000rpmで2分間遠心分離した。上段の(水性)相を取り出し、水相中の残留SDSを、実施例1に記載の改良ステインズオールアッセイを用いて定量した。結果を、図1〜3に示す。暗色バーは、SDS標準溶液を表し、白色バーは、試験した洗浄剤除去組成物による結果を表す。
生物試料を含む水性組成物における本発明の有効性を示すために、新しいヒト唾液試料を15mlのコニカルチューブに収集した。1ミリリットルの唾液を、4%SDSおよび250mMのLiClを含む同体積のリシスバッファーで処理し、プロテイナーゼK(「PK」)を用いて60℃で15分間消化した。PKは、90℃で15分間加熱することにより不活化し、93.75μlの分割量のリシスバッファー中で処理した唾液を、6.25μlの2M 塩化アンモニウム溶液と混合した。
複雑な生物試料を含む水性組成物における本発明の有効性を示すために、ヒト静脈血をEDTAチューブに収集した。1ミリリットルの血液を3倍量のSDSおよび塩化アンモニウム含有リシスバッファーに70℃で15分間溶解した。溶解した血液試料中のSDSおよび塩化アンモニウムの最終濃度は、それぞれ2.5%および175mMであった。
下記のマスターミックスを用いて、複数のqPCR反応を実施した:2.5μlの1mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、2.5μlの10xPCR緩衝液、1.5μlの50mM MgCl2、0.5μlの10mM dNTP、0.5μlの10pMol順方向プライマー、0.5μlの10pMol逆方向プライマー(ヒト18S−165順方向5’gtggagcgatttgtctggttおよびヒト18S−165逆方向5’ggacatctaagggcatcacag)、0.5μlの0.5μM Syto9、0.2μlの5U/μl Taqポリメラーゼ、12.3μlの水。
唾液由来試料
実施例3に記載のように、洗浄剤除去組成物で処理後、溶解した唾液試料の水相を得た。12μlの分割量の水相を1%アガロースゲル中で、1kb+DNAラダーの横に並べて電気泳動した。その後、ゲルをSybrGold(登録商標)(Invitrogen、カタログ番号S11494)で染色した。結果を図7に示すが、高分子量DNA(>23kb)を認めることができ、したがって、本発明の組成物による処理は、DNAを無傷のまま水溶液中に残すことを示す。
実施例4に記載のように、この実施例用として、溶解した血液試料から洗浄剤除去後に、水相を得た。洗浄剤除去後に8μlの分割量の水相を0.8%アガロースゲル中で、1kb+DNAラダーの横に並べて電気泳動した。その後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。結果を図9に示すが、高分子量DNA(>23kb)を認めることができ、したがって、本発明の組成物による処理は、DNAを無傷のまま水溶液中に残すことを示す。
唾液
2mLの新しい唾液試料を15mlのコニカルチューブに収集し、等体積のリシスバッファー(4%SDS、250mMのLiCl)と混合した。
溶解した唾液の200μlの分割量をPKと混合し、60℃で15分間、インキュベートした。PKを90℃で15分間加熱することにより不活化した。10μlの2Mの塩化アンモニウムおよび40μlの1−ペンタノールと(ポリ)クロロトリフルオロエチレンの1:0.8(vol/vol)混合物を加えた。チューブを強く2分間ボルテックスし、13,000rpmで2分間遠心分離した。上段(水性)相を取り出し、1%アガロースゲルで電気泳動した。ゲルをSybrGoldで処理して、核酸を染色した(図11)。細菌16Sおよび23SリボソームRNAバンドは、本明細書に記載の洗浄剤除去組成物が、無傷のRNAを水相中に残すことを示すことが認められる。ヒト28Sおよび18SリボソームRNAは、認められなかった。理由は、それらは、非常に少ない量で唾液中に存在し、少なすぎてSybrGoldによる染色により検出できないためである。しかし、ヒトリボソームRNAは、次のセクションで示すように、RT−PCRにより検出できる。
ヒト静脈血を標準的EDTAチューブに収集した。1倍量の血液を9倍量のリシスバッファー(4%SDS、250mMのLiCl)と混合した。溶解した血液をPKにより60℃で15分間消化した。次に、90℃で15分間、PKを不活化した。100μlの分割量の溶解した血液からのSDSの除去を、5μlの2Mの塩化アンモニウムおよび20μlの1−ペンタノールと(ポリ)クロロトリフルオロエチレンの1:0.8(vol/vol)混合物を混合することにより実施した。チューブを強く2分間ボルテックスし、13,000rpmで2分間遠心分離した。上段(水性)相を取り出し、分割量を1%アガロースゲルで泳動させた(図14)。核酸をSybrGoldで染色した。ヒト18Sおよび28SリボソームRNAに対応するバンドを認めることができる。1μlの血液水相を、20μlのRT反応混合物(4μlの5X First Strand Buffer(Invitrogen)、2μlの100mM DTT、2μlの10mM dNTP、2μlの50mM MgCl2、1μlのRNAse阻害物質(10U/μl)、1μlのランダムプライマー(125ng/μl、Invitrogen)、1.5μlのM−MLV逆転写酵素(Invitrogen)、残りは水)に添加した。その後、1μlのRT生成物を、24μlのqPCR反応に加え、上記実施例5に記載のように処理した。逆転写酵素不含のネガティブコントロールチューブを−RTとして標識した。図15に示す結果は、SDSが、SDSに結合した可能性のある追加の阻害物質と共に、洗浄剤除去組成物により除去されると、ヒト18SリボソームRNAは、RT−PCRにより検出され得ることを明確に示した。
いくつかの代表的アルコールを、洗浄剤除去組成物中でのそれらの実行能力を調査した。一級アルコール、二級アルコール、環状アルコール、ジオールおよび固体および液体アルコールの両方を(室温で)試験した。アルコールを、未処理の生物試料に対して、および/または簡単な水とSDS(4重量/体積%)混合物が使用される「モデルシステム」で試験した。効率的に相分離をさせるために、アルコールは、水中でほとんど不混和性であるが、ハロカーボンとは可溶性でなければならない。結果を下記の通りまとめている:
R1−OH I
(式中、R1は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式C4−C12アルキルである)の構造を有するいずれかのアルコールであり得る。
ヒト静脈血を標準的EDTAチューブに収集した。1倍量の血液を、3倍量の4%SDSおよび30mMのDTTを含むリシスバッファーと完全に混合した。洗浄剤およびタンパク質除去を以下のように実施した。NH4Clを最終濃度の100mMまで、溶解した血液試料の100μlの分割量に加えた。それぞれの溶解した血液の分割量に、種々の量の1−ペンタノールおよびBDCMを含む20μlの洗浄剤除去組成物を加えた(詳細は下記参照)。チューブを強く2分間ボルテックスし、13,000rpmで2分間遠心分離した。初期の溶解した血液試料(すなわち、洗浄剤除去前)、ならびに洗浄剤除去後の水相をSDS−PAGEにより分析した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルーで染色し、タンパク質バンドを示した。結果を図16に示す。レーン1は、タンパク質分子量マーカーを含む。レーン2は空である。レーン3は0.5μlの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含む。レーン4は空である。レーン5は1μlの洗浄剤除去前の溶解した血液試料を含む。レーン6は空である。レーン7はBDCMのみで溶解した血液試料の処理後の7.5μlの水相を含む。レーン8は空である。レーン9は3:7(vol/vol)の1−ペンタノール:BDCM混合物で溶解した血液試料の処理後の7.5μlの水相を含む。レーン10は1:1(vol/vol)の1−ペンタノール:BDCM混合物で溶解した血液試料の処理後の7.5μlの水相を含む。レーン11は7:3(vol/vol)の1−ペンタノール:BDCM混合物で溶解した血液試料の処理後の7.5μlの水相を含む。レーン12は1−ペンタノールのみで溶解した血液試料の処理後の7.5μlの水相を含む。
生物試料を含む水性組成物中の洗浄剤除去のための、本方法および組成物の有効性を示すために、新しいヒト唾液試料を15mlのコニカルチューブに収集した。1ミリリットルの唾液を、4%サルコシルを含む同体積のリシスバッファーで処理し、プロテイナーゼK(「PK」)を用いて60℃で15分間消化した。PKは、90℃で15分間加熱することにより不活化し、90μlの分割量のリシスバッファー中で処理した唾液を、10.00μlの2M 塩化アンモニウム溶液と混合した。
次世代シーケンシング(NGS)の主要素は、高品質ライブラリー調製である。ほとんどの高スループットNGSライブラリー構築ワークフローは、共通の一連のステップに依存し、そのいくつかは、酵素的に−DNAフラグメンテーション、末端修復、Aテイリング、アダプターリゲーション、およびPCR増幅−により達成される。入力DNA品質はまた、ライブラリー構築の成功のための重要な決定因子である。洗浄剤などの酵素阻害物質は、生物試料の精製中持ち越され、最終収率の低下、ライブラリープレップの失敗、または生物情報学的に分析される場合に低く、不均一なカバー率をもたらし得る。理想的には、抽出プロトコルまたはシステムは、阻害物質不含核酸に純化するように最適化されるべきである。
Claims (138)
- 水溶液から洗浄剤を除去するための洗浄剤除去システムであって、
a.塩;
b.式I:
R1−OH I
(式中、R1は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式C4−C12アルキルである)の水不混和性アルコール;および
c.水不混和性のハロカーボン
を含み、前記ハロカーボンが、前記式Iのアルコールと混和性である、システム。 - 前記洗浄剤が陰イオン洗浄剤である、請求項1に記載のシステム。
- 洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子を前記水溶液からさらに除去する、請求項1または2に記載のシステム。
- 前記洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項3に記載のシステム。
- 前記洗浄剤および/または前記洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が酵素阻害物質である、請求項3または4に記載のシステム。
- 前記塩が、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−n−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−n−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−n−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、1−ブチルアミンの酸性塩、1−ペンチルアミンの酸性塩、1−ヘキシルアミンの酸性塩、1−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項6に記載のシステム。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ブタノール、3−メチル−1−ブタノール、2−ブタノール、1−ヘプタノール、1,2−ヘキサンジオール、1−ヘキサノール、2−ノナノール、1−ペンタノール、4−メチル−2−ペンタノール、シクロペンタノール、1−プロパノール、1−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項1〜7のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記塩が塩化アンモニウムである、請求項7に記載のシステム。
- 前記ハロカーボンが、1−ブロモ−3−クロロプロパン、1−ブロモ−6−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン(BDCM)、クロロジブロモメタン、クロロホルム、2−ヨードプロパン、ポリ(クロロトリフルオロエチレン)、またはこれらの組み合わせである、請求項1〜9のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ブタノール、1−ペンタノール、シクロペンタノール、1−ヘキサノール、1−ヘプタノール、2−ノナノールまたは1−ウンデカノールである、請求項1〜10のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項11に記載のシステム。
- 前記ハロカーボンが、BDCMまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項1〜12のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート(SDS)またはサルコシルである、請求項1〜13のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記洗浄剤がSDSである、請求項14に記載のシステム。
- 前記水溶液が生物試料である、請求項1〜15のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項16に記載のシステム。
- 前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部/鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブまたは擦過物、口腔洗浄試料、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液/精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液/分泌物/スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支、気管または肺洗浄液または吸引液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、産業廃水、などを含む、請求項16または17に記載のシステム。
- 前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および/または原生生物を含む、請求項18に記載のシステム。
- 塩化アンモニウム、1−ペンタノールおよびブロモジクロロメタンまたはポリクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記塩、前記水不混和性アルコールおよび前記水不混和性のハロカーボンが、別々の容器で提供される、請求項1に記載のシステム。
- 前記塩、前記水不混和性アルコールおよび前記水不混和性のハロカーボンが、単一の容器で提供される、請求項1に記載のシステム。
- 前記水不混和性アルコールおよび前記水不混和性のハロカーボンが、第一の容器で単一の組成物として提供され、前記塩が、別々の第二の容器で提供される、請求項1に記載のシステム。
- 試料収集容器を追加で含み、前記試料収集容器が必要に応じ、洗浄剤含有溶液を含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記水性混合物の処理時に、水相および非水相を含む2相混合物が形成され、前記非水相が、ほぼ全ての洗浄剤および存在する何らかの洗浄剤関連タンパク質または洗浄剤結合タンパク質を含み、前記水相が下流の用途での直接使用に好適する、請求項1〜24のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項25に記載のシステム。
- 前記PCRがRT−PCRである、請求項26に記載のシステム。
- 前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項5に記載のシステム。
- 前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項28に記載のシステム。
- 前記PCRがRT−PCRである、請求項28に記載のシステム。
- 還元剤をさらに含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記還元剤が、ジチオトレイトール(DTT)、メルカプトヘキサノール、メルカプトウンデカノール、ジメルカプトプロパノールまたはメルカプトブタノールである、請求項31に記載のシステム。
- キレート化剤および/または緩衝液をさらに含む、請求項1〜32のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸(EGTA)、(2−ヒドロキシエチル)エチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、エチレンジアミン三酢酸(EDTA)、シクロヘキサンジアミン四酢酸(CDTA)、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項33に記載のシステム。
- 親油性染色剤をさらに含む、請求項1〜34のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記親油性染色剤が、ナイルレッド、9−アントリルジアゾメタン、Fluorol Yellow088、N,N,N−トリメチル−4−(6−フェニル−1,3,5−ヘキサトリエン−1−イル)フェニルアンモニウム p−トルエンスルホネート(TMA−DPH)、3,3’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルコロレート、1,6−ジフェニル−1,3,5−ヘキサトリエン、Sudan III、Sudan Orange G、Nile BlueクロリドまたはSolvent Blue 37である、請求項35に記載のシステム。
- 前記洗浄剤を含む水溶液から洗浄剤を除去する方法であって、前記水溶液を、
a.塩;
b.式I:
R1−OH I
(式中、R1は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式C4−C12アルキルである)の水不混和性アルコール;および
c.水不混和性のハロカーボンであって、前記式Iのアルコールと混和性であるハロカーボン、
と混合して、2相混合物を形成するステップを含み、ほぼ全ての前記洗浄剤が非水相中に存在する、方法。 - 前記洗浄剤が、陰イオン洗浄剤である、請求項37に記載の方法。
- 洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子を前記水溶液からさらに除去する、請求項37または38に記載の方法。
- 前記洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項39に記載の方法。
- 前記洗浄剤および/または洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が、酵素阻害物質である、請求項39または40に記載の方法。
- 前記アルコールおよび前記ハロカーボンが、前記水溶液と混合される前に、混ぜ合わされる、請求項37〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水相を前記2相混合物から分離するステップをさらに含む、請求項37〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記混合物を遠心処理して前記2相の分離を容易にするステップをさらに含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2相混合物の水相中の塩の濃度が、約30mM〜約0.5Mである、請求項37〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ハロカーボンが、前記有機相の密度を前記水相の密度より高めるのに十分な濃度で存在する、請求項37〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アルコール中のハロカーボンの濃度が、最大約80%(v/v)、例えば、約50%(v/v)である、請求項46に記載の方法。
- 前記塩+前記アルコール+前記ハロカーボンの合計体積の、前記洗浄剤を含む水溶液の体積に対する比率が、約1:9〜約2:1である、請求項37〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記塩+前記アルコール+前記ハロカーボンの合計体積の、前記洗浄剤を含む水溶液の体積に対する比率が、約1:5である、請求項48に記載の方法。
- 前記洗浄剤、および何らかの洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子を含む水溶液が、生物試料である、請求項37〜49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項50に記載の方法。
- 前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部/鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブ、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液/精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液/分泌物/スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、産業廃水、などを含む、請求項50または51に記載の方法。
- 前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および/または原生生物を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記塩が、アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項37〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−n−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−n−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−n−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、1−ブチルアミンの酸性塩、1−ペンチルアミンの酸性塩、1−ヘキシルアミンの酸性塩、1−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項54に記載の方法。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ブタノール、3−メチル−1−ブタノール、2−ブタノール、1−ヘプタノール、1,2−ヘキサンジオール、1−ヘキサノール、2−ノナノール、1−ペンタノール、4−メチル−2−ペンタノール、シクロペンタノール、1−プロパノール、1−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項37〜55のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ハロカーボンが、1−ブロモ−3−クロロプロパン、1−ブロモ−6−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン(BDCM)、クロロジブロモメタン、クロロホルム、2−ヨードプロパン、ポリクロロトリフルオロエチレン、またはこれらの組み合わせである、請求項37〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 前記塩が塩化アンモニウムである、請求項57に記載の方法。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ブタノール、1−ペンタノール、シクロペンタノール、1−ヘキサノール、1−ヘプタノール、2−ノナノールまたは1−ウンデカノールである、請求項37〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項59に記載の方法。
- 前記ハロカーボンが、BDCMまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項37〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート(SDS)またはサルコシルである、請求項37〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記洗浄剤がSDSである、請求項62に記載の方法。
- 前記塩が塩化アンモニウムであり、前記アルコールが1−ペンタノールであり、前記ハロカーボンがブロモジクロロメタンである、請求項37に記載の方法。
- 前記塩が塩化アンモニウムであり、前記アルコールが1−ペンタノールであり、前記ハロカーボンがポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項37に記載の方法。
- 前記2相混合物由来の水相の一部を、下流の用途のために直接使用するステップをさらに含む、請求項37〜65のいずれか1項に記載の方法。
- 前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項66に記載の方法。
- 前記PCRがRT−PCRである、請求項67に記載の方法。
- 前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項41に記載の方法。
- 前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項69に記載の方法。
- 前記PCRがRT−PCRである、請求項70に記載の方法。
- 2相組成物であって、
a.塩;
b.式I:
R1−OH I
(式中、R1は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式C4−C12アルキルである)の水不混和性アルコール;および
c.水不混和性のハロカーボンであって、式Iのアルコールと混和性であるハロカーボン;を、
d.洗浄剤を含む水溶液;と混合して、
水相および非水相を含む2相混合物が形成され、それにより、ほぼ全ての前記洗浄剤が非水相中に存在する、2相組成物。 - 前記洗浄剤が陰イオン洗浄剤である、請求項72に記載の2相組成物。
- 前記水溶液が、洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子をさらに含み、前記2相混合物中で、前記洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子が非水相中に存在する、請求項72または73に記載の2相組成物。
- 前記洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項74に記載の2相組成物。
- 前記洗浄剤および/または洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が、酵素阻害物質である、請求項74または75に記載の2相組成物。
- 前記塩が、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項72〜76のいずれか1項に記載の2相組成物。
- 前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−n−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−n−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−n−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、1−ブチルアミンの酸性塩、1−ペンチルアミンの酸性塩、1−ヘキシルアミンの酸性塩、1−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項77に記載の2相組成物。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ブタノール、3−メチル−1−ブタノール、2−ブタノール、1−ヘプタノール、1,2−ヘキサンジオール、1−ヘキサノール、2−ノナノール、1−ペンタノール、4−メチル−2−ペンタノール、シクロペンタノール、1−プロパノール、1−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項72〜78のいずれか1項に記載の2相組成物。
- 前記ハロカーボンが、1−ブロモ−3−クロロプロパン、1−ブロモ−6−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン(BDCM)、クロロジブロモメタン、クロロホルム、2−ヨードプロパン、ポリクロロトリフルオロエチレン、またはこれらの組み合わせである、請求項72〜79いずれか1項に記載の2相組成物。
- 前記塩が塩化アンモニウムである、請求項78に記載の2相組成物。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ブタノール、1−ペンタノール、シクロペンタノール、1−ヘキサノール、1−ヘプタノール、2−ノナノールまたは1−ウンデカノールである、請求項72〜81のいずれか1項に記載の2相組成物。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項82に記載の2相組成物。
- 前記ハロカーボンが、BDCMまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項72〜83のいずれか1項に記載の2相組成物。
- 前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート(SDS)またはサルコシルである、請求項72〜84のいずれか1項に記載の2相組成物。
- 前記洗浄剤がSDSである、請求項85に記載の2相組成物。
- 前記洗浄剤および/または洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子を含む水溶液が、生物試料である、請求項72〜86のいずれか1項に記載の2相組成物。
- 前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項87に記載の2相組成物。
- 前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部/鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブ、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液/精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液/分泌物/スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、産業廃水、などを含む、請求項87または88に記載の2相組成物。
- 前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および/または原生生物を含む、請求項89に記載の2相組成物。
- 塩化アンモニウム、1−ペンタノールおよびブロモジクロロメタンを含む、請求項72に記載の2相組成物。
- 塩化アンモニウム、1−ペンタノールおよびポリクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項72に記載の2相組成物。
- 前記水相が、下流の用途での直接使用に好適する、請求項72〜92のいずれか1項に記載の2相組成物。
- 前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項93に記載の2相組成物。
- 前記PCRがRT−PCRである、請求項94に記載の2相組成物。
- 前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項76に記載の2相組成物。
- 前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項96に記載の2相組成物。
- 前記PCRがRT−PCRである、請求項97に記載の2相組成物。
- 還元剤をさらに含む、請求項72〜98のいずれか1項に記載の2相組成物。
- 前記還元剤が、ジチオトレイトール(DTT)、メルカプトヘキサノール、メルカプトウンデカノール、ジメルカプトプロパノールまたはメルカプトブタノールである、請求項99に記載の2相組成物。
- キレート化剤および/または緩衝液をさらに含む、請求項72〜100のいずれか1項に記載の2相組成物。
- 前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸(EGTA)、(2−ヒドロキシエチル)エチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、エチレンジアミン三酢酸(EDTA)、シクロヘキサンジアミン四酢酸(CDTA)、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項101に記載の2相組成物。
- 親油性染色剤をさらに含む、請求項72〜102のいずれか1項に記載の2相組成物。
- 前記親油性染色剤が、ナイルレッド、9−アントリルジアゾメタン、Fluorol Yellow088、N,N,N−トリメチル−4−(6−フェニル−1,3,5−ヘキサトリエン−1−イル)フェニルアンモニウム p−トルエンスルホネート(TMA−DPH)、3,3’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルコロレート、1,6−ジフェニル−1,3,5−ヘキサトリエン、Sudan III、Sudan Orange G、Nile BlueクロリドまたはSolvent Blue 37である、請求項103に記載の2相組成物。
- 前記洗浄剤を含む水溶液から洗浄剤を除去するためのキットであって、
a.塩;
b.式I:
R1−OH I
(式中、R1は、任意に置換されてもよい直鎖、分枝、または環式C4−C12アルキルである)の水不混和性アルコール;
c.水不混和性のハロカーボンであって、前記式Iのアルコールと混和性であるハロカーボン、
d.少なくとも1種の試薬容器;および場合により、
e.使用説明書、
を含むキット。 - 前記洗浄剤が、陰イオン洗浄剤である、請求項105に記載のキット。
- さらに、洗浄剤関連分子および/または洗浄剤結合分子を前記水溶液から除去するためである、請求項105または106に記載のキット。
- 前記洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子がタンパク質である、請求項107に記載のキット。
- 前記洗浄剤および/または洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子が酵素阻害物質である、請求項107または108に記載のキット。
- 前記塩が、四級アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項105〜109のいずれか1項に記載のキット。
- 前記塩が、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ベタイン塩、塩化コリン、ジエチルアミン塩酸塩、ジメチルエタノールアミン、エタノールアミン、エチルアンモニウムクロリド、メチルアンモニウムクロリド、テトラ−n−ブチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムクロリド一水和物、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラ−n−プロピルアンモニウムクロリド、メチルトリ−n−ブチルアンモニウムクロリド、トリエチルアミン塩酸塩、トリエチルメチルアンモニウムクロリド、トリメチルアミン塩酸塩、1−ブチルアミンの酸性塩、1−ペンチルアミンの酸性塩、1−ヘキシルアミンの酸性塩、1−ドデシルアミンの酸性塩、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせである、請求項110に記載のキット。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ブタノール、3−メチル−1−ブタノール、2−ブタノール、1−ヘプタノール、1,2−ヘキサンジオール、1−ヘキサノール、2−ノナノール、1−ペンタノール、4−メチル−2−ペンタノール、シクロペンタノール、1−プロパノール、1−ウンデカノールまたはこれらの組み合わせである、請求項105〜111のいずれか1項に記載のキット。
- 前記ハロカーボンが、1−ブロモ−3−クロロプロパン、1−ブロモ−6−クロロヘキサン、ブロモジクロロメタン(BDCM)、クロロジブロモメタン、クロロホルム、2−ヨードプロパン、ポリクロロトリフルオロエチレン、またはこれらの組み合わせである、請求項105〜112のいずれか1項に記載のキット。
- 前記塩が塩化アンモニウムである、請求項111に記載のキット。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ブタノール、1−ペンタノール、シクロペンタノール、1−ヘキサノール、1−ヘプタノール、2−ノナノールまたは1−ウンデカノールである、請求項105〜114のいずれか1項に記載のキット。
- 前記水不混和性アルコールが、1−ペンタノールまたはシクロペンタノールである、請求項115に記載のキット。
- 前記ハロカーボンが、BDCMまたはポリクロロトリフルオロエチレンである、請求項105〜116のいずれか1項に記載のキット。
- 前記洗浄剤が、ナトリウムドデシルスルフェート(SDS)またはサルコシルである、請求項105〜117のいずれか1項に記載のキット。
- 前記洗浄剤が、SDSである、請求項118に記載のキット。
- 前記洗浄剤および/または洗浄剤関連分子または洗浄剤結合分子を含む水溶液が生物試料である、請求項105〜119のいずれか1項に記載のキット。
- 前記生物試料が、試料貯蔵、溶解または抽出組成物を含む変性生物試料である、請求項120に記載のキット。
- 前記生物試料が、唾液、喀痰、頬側スワブ、血清、血漿、血液、咽頭、鼻部/鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブ、尿、粘液、糞便、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、精液/精子、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液/分泌物/スワブまたは擦過物、骨髄吸引液、胸水、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液、細胞培養液、細胞懸濁液、結合組織、上皮、粘膜、筋組織、胎盤組織、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、爪、植物、植物抽出物、藻類、微生物、土壌試料、下水、廃水、食糧、産業廃水、などを含む、請求項120または121に記載のキット。
- 前記微生物が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、古細菌、および/または原生生物を含む、請求項122に記載のキット。
- 塩化アンモニウム、1−ペンタノールおよびブロモジクロロメタンを含む、請求項105に記載のキット。
- 塩化アンモニウム、1−ペンタノールおよびポリクロロトリフルオロエチレンを含む、請求項105に記載のキット。
- 試料収集容器をさらに含む、請求項105〜125のいずれか1項に記載のキット。
- 下流の用途で直接使用するための、請求項105〜126のいずれか1項に記載のキット。
- 前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項127に記載のキット。
- 前記PCRがRT−PCRである、請求項128に記載のキット。
- 前記酵素阻害物質が、下流の用途の阻害物質である、請求項109に記載のキット。
- 前記下流の用途が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ライブラリー調製、またはヌクレオチドシーケンシングである、請求項130に記載のキット。
- 前記PCRがRT−PCRである、請求項131に記載のキット。
- 還元剤をさらに含む、請求項105〜132のいずれか1項に記載のキット。
- 前記還元剤が、ジチオトレイトール(DTT)、メルカプトヘキサノール、メルカプトウンデカノール、ジメルカプトプロパノールまたはメルカプトブタノールである、請求項133に記載のキット。
- キレート化剤および/または緩衝液をさらに含む、請求項105〜134のいずれか1項に記載のキット。
- 前記キレート化剤が、エチレングリコール四酢酸(EGTA)、(2−ヒドロキシエチル)エチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、エチレンジアミン三酢酸(EDTA)、シクロヘキサンジアミン四酢酸(CDTA)、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸リチウム、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項135に記載のキット。
- 親油性染色剤をさらに含む、請求項105〜136のいずれか1項に記載のキット。
- 前記親油性染色剤が、ナイルレッド、9−アントリルジアゾメタン、Fluorol Yellow088、N,N,N−トリメチル−4−(6−フェニル−1,3,5−ヘキサトリエン−1−イル)フェニルアンモニウム p−トルエンスルホネート(TMA−DPH)、3,3’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルコロレート、1,6−ジフェニル−1,3,5−ヘキサトリエン、Sudan III、Sudan Orange G、Nile BlueクロリドまたはSolvent Blue 37である、請求項137に記載のキット。
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