CN113957066A - Ffpe样本dna快速提取的方法 - Google Patents

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吴开乐
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沈杲
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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Abstract

本发明公开了FFPE样本DNA快速提取的方法，包括以下几个步骤，将石蜡组织样本切片；对FFPE组织样本进行裂解；水浴孵育；磁珠吸附；磁珠清洗等。避免使用传统的二甲苯，其一种有毒的有机试剂，不仅容易造成核酸片段化，核酸得率低，而且对操作者的人身安全有一定的威胁性，本发明将其替换为二甲基硅油，二甲基硅油具有无毒无味、耐高温、化学稳定性高的特点，且能够有效溶解石蜡，起到脱蜡的作用，减小对操作者人身安全，提高了核酸的提取产率。

Description

FFPE样本DNA快速提取的方法
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，特别是涉及FFPE样本DNA快速提取的方法。
背景技术
FFPE(Formalin-fixed paraffin-embedding)，通常指人的或者动植物组织样本利用福尔马林固定、石蜡包埋形成的石蜡切片或者石蜡块样本，是医学领域常见的生物材料。这一保存方法是目前用于长期保存病理样本的标准化方法，可以保存临床上大量的患病组织。此类样本已经被广泛应用于高通量测序、原位杂交、免疫组织化学等研究领域。
如果要对FFPE组织进行分子生物学研究，首先就是要进行DNA的提取。但是固定剂的交联作用对核酸结构有损，福尔马林组织固定与石蜡包埋作用会妨碍核酸的提取，抑制DNA聚合酶的活性从而影响PCR扩增。除此之外，石蜡阻碍消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶K和组织内蛋白的接触，影响组织消化和DNA释放。所以为了消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，必须在保证不增加外源性PCR抑制因子，并尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底脱蜡。
现在有很多科研工作者使用二甲苯进行脱蜡，但二甲苯脱蜡方法仍然存在较多问题：首先，二甲苯是一种有毒的有机试剂，不仅容易造成核酸片段化，核酸得率低，而且对操作者的人身安全有一定的威胁性。另外，如果组织切片比较厚，超过10μm，二甲苯难以渗透，脱蜡效果不彻底，影响后续酶的消化效率。
本试剂盒将脱蜡液由普通试剂盒中有毒的二甲苯替换为无毒的二甲基硅油，试剂盒使用简便，可以实现快速高效的FFPE样本核酸提取，简化了脱蜡步骤，提高了试剂盒的性价比，同时，设计相应试剂包装盒，有效避免试剂瓶晃动和倾倒，结构更稳定。
发明内容
本发明的目的在于提供FFPE样本DNA快速提取的方法，将脱蜡液由普通试剂盒中有毒的二甲苯替换为无毒的二甲基硅油，可以实现快速高效的FFPE样本核酸提取，简化了脱蜡步骤，提高了试剂盒的性价比。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
FFPE样本DNA快速提取的方法，包括以下几个步骤，
(1)将石蜡组织样本(FFPE组织样本)放入切片机切取5-10张切片，厚度为10μm，放入1.5mL离心管中，做好标记；
(2)在装有FFPE组织样本的1.5mL的离心管中加入裂解液buffer200ul、蛋白酶K20ul和脱蜡液二甲基硅油50ul，涡旋震荡2min，4000r/min离心2min；蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂。
传统使用的二甲苯是一种有毒的有机试剂，不仅容易造成核酸片段化，核酸得率低，而且对操作者的人身安全有一定的威胁性。鉴于此，本试剂盒将其替换为二甲基硅油，二甲基硅油具有无毒无味、耐高温、化学稳定性高的特点，且能够有效溶解石蜡，起到脱蜡的作用。
(3)水浴锅预热至56℃，将离心过的有FFPE组织样本在56℃条件下孵育1小时，然后水浴锅升温至90℃，继续孵育1小时，可观察到管中分层，上层为油相层，下层为水相层，孵育结束后，取出离心管冷却至室温，用移液器小心将下方水相溶液完全取出转移至另外一支1.5mL离心管中；水浴加热提供高温,溶解石蜡。石蜡溶解后，出现油水分层，油相层包含溶解二甲基硅油和石蜡，剩余成分裂解液等分到水相层。
(4)在放有水相层的离心管中加入异丙醇200μL和磁珠20μL，混合均匀，室温反应5min；异丙醇比较疏水,能很好地沉淀核酸，磁珠的作用是吸附核酸。
(5)放磁力架上吸附去上清；去上清意思是：磁珠吸附了核酸后，剩余液体即上清，可以丢弃了。
(6)加入400ul清洗液A，上下颠倒混匀30秒使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，待磁珠完全吸附时，用移液器小心去除液体；废液为清洗液A。
然后加入400ul清洗液B，上下颠倒混匀30秒使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，待磁珠完全吸附时，用移液器小心去除液体；废液为清洗液B。
(7)晾干磁珠约2min；
(8)加入50μL洗脱液进入离心管中，室温孵育2min；洗脱液为无核酸酶水。
(9)放磁力架上吸附取上清，上清即为最终核酸产物。
进一步地，在步骤(3)和步骤(4)之间如果需要去除体系中的RNA，可在取出的水相溶液中加入2μl RNase A，室温放置5min即可。
进一步地，所述裂解液Buffer含有:10mM EDTA、30mM Tris-HCl、3M异硫氰酸胍、Tween 20。M即为mol/L，物质的量浓度单位，Tween 20即吐温20。Tween 20作为亲水性溶解液，用于配置裂解液Buffer的基本溶液。
进一步地，所述蛋白酶K浓度为20mg/mL。
进一步地，所述磁珠为二氧化硅磁珠。
进一步地，所述清洗液A含有：1.0M NaCl，50mM MOPS和15％异丙醇。MOPS是3-(N-吗啉基)丙磺酸，这里作为一种缓冲液。
进一步地，所述清洗液B含有：50mM Tris-HCl，80％乙醇。
本发明具有以下有益效果：
传统使用的二甲苯是一种有毒的有机试剂，不仅容易造成核酸片段化，核酸得率低，而且对操作者的人身安全有一定的威胁性。本试剂盒将其替换为二甲基硅油，二甲基硅油具有无毒无味、耐高温、化学稳定性高的特点，且能够有效溶解石蜡，起到脱蜡的作用。解决了背景技术中出现的问题，减小对操作者人身安全，提高了核酸的提取产率。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。
图1：本发明不同磁珠型号核酸产率条形图。
图2：本发明与不同试剂盒对比核酸产率条形图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
FFPE样本DNA快速提取的方法，包括以下几个步骤，
(1)将石蜡组织样本(FFPE组织样本)放入切片机切取5-10张切片，厚度为10μm，放入1.5mL离心管中，做好标记；
(2)在装有FFPE组织样本的1.5mL的离心管中加入裂解液buffer200ul、蛋白酶K20ul和脱蜡液二甲基硅油50ul，涡旋震荡2min，4000r/min离心2min；
所述裂解液Buffer含有:10mM EDTA、30mM Tris-HCl、3M异硫氰酸胍、Tween 20。
所述蛋白酶K浓度为20mg/mL。
(3)水浴锅预热至56℃，将离心过的有FFPE组织样本在56℃条件下孵育1小时，然后水浴锅升温至90℃，继续孵育1小时，可观察到管中分层，上层为油相层，下层为水相层，孵育结束后，取出离心管冷却至室温，用移液器小心将下方水相溶液完全取出转移至另外一支1.5mL离心管中；如果需要去除体系中的RNA，可在取出的水相溶液中加入2μl RNaseA，室温放置5min即可。
(4)在放有水相层的离心管中加入异丙醇200μL和磁珠20μL，混合均匀，室温反应5min；磁珠为二氧化硅磁珠。
(5)放磁力架上吸附去上清；
(6)加入400ul清洗液A，上下颠倒混匀30秒使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，待磁珠完全吸附时，用移液器小心去除液体；然后加入400ul清洗液B，上下颠倒混匀30秒使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，待磁珠完全吸附时，用移液器小心去除液体；所述清洗液A含有：1.0M NaCl，50mM MOPS和15％异丙醇。所述清洗液B含有：50mM Tris-HCl，80％乙醇。
(7)晾干磁珠约2min；
(8)加入50μL洗脱液进入离心管中，室温孵育2min；
(9)放磁力架上吸附取上清，上清即为最终核酸产物。
1、根据以上的操作步骤，对同一FFPE样本取3片10μm厚切片进行提取，本发明对比了3中磁珠的提取效果，磁珠的型号分别为507、511、517，磁珠对应的507、511、517型号是供应商的货号，磁珠均来自英芮诚生化科技有限公司。以磁珠的型号为横坐标，最终核酸产物的提取浓度为纵坐标，制作条形图，结果如图1所示：结果表明517型号的磁珠提取效率最高。
2、对同一FFPE样本使用TaKaRa DEXPATTM Easy和QIAamp DNA FFPE Tissue Kit两种试剂盒及对应的操作说明与本发明提取方法提取浓度作对比，本发明采用磁珠为517型号。结果如图2所示：本发明提取方法提取的DNA核酸的浓度最高，然后依次是QIAamp和TaKaRa试剂盒，表明本发明的提取方法，不仅避免了采用二甲苯等有机提取试剂，同时可以大大提高核酸的提取效率。
TaKaRa DEXPATTM Easy和QIAamp DNA FFPE Tissue Kit都是石蜡包埋组织DNA提取试剂盒，一个是TaKaRa(宝生物)，一个是QIAGEN(凯杰)的。
本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (7)

1.FFPE样本DNA快速提取的方法，其特征在于：包括以下几个步骤，
(1)将石蜡组织样本放入切片机切取5-10张切片，厚度为10μm，放入1.5mL离心管中，做好标记；
(2)在装有FFPE组织样本的1.5mL的离心管中加入裂解液buffer200ul、蛋白酶K 20ul和脱蜡液二甲基硅油50ul，涡旋震荡2min，4000r/min离心2min；
(3)水浴锅预热至56℃，将离心过的有FFPE组织样本在56℃条件下孵育1小时，然后水浴锅升温至90℃，继续孵育1小时，可观察到管中分层，上层为油相层，下层为水相层，孵育结束后，取出离心管冷却至室温，用移液器小心将下方水相溶液完全取出转移至另外一支1.5mL离心管中；
(4)在放有水相层的离心管中加入异丙醇200μL和磁珠20μL，混合均匀，室温反应5min；
(5)放磁力架上吸附去上清；
(6)加入400ul清洗液A，上下颠倒混匀30秒使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，待磁珠完全吸附时，用移液器小心去除液体；
然后加入400ul清洗液B，上下颠倒混匀30秒使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，待磁珠完全吸附时，用移液器小心去除液体；
(7)晾干磁珠约2min；
(8)加入50μL洗脱液进入离心管中，室温孵育2min；
(9)放磁力架上吸附取上清，上清即为最终核酸产物。
2.根据权利要求1所述FFPE样本DNA快速提取的方法，其特征在于：在步骤(3)和步骤(4)之间如果需要去除体系中的RNA，可在取出的水相溶液中加入2μl RNase A，室温放置5min即可。
3.根据权利要求1所述FFPE样本DNA快速提取的方法，其特征在于：所述裂解液Buffer含有:10mM EDTA、30mM Tris-HCl、3M异硫氰酸胍、Tween20。
4.根据权利要求1所述FFPE样本DNA快速提取的方法，其特征在于：所述蛋白酶K浓度为20mg/mL。
5.根据权利要求1所述FFPE样本DNA快速提取的方法，其特征在于：所述磁珠为二氧化硅磁珠。
6.根据权利要求1所述FFPE样本DNA快速提取的方法，其特征在于：所述清洗液A含有：1.0M NaCl，50mM MOPS和15％异丙醇。
7.根据权利要求1所述FFPE样本DNA快速提取的方法，其特征在于：所述清洗液B含有：50mM Tris-HCl，80％乙醇。
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