CN102628079B - 一种通过环化方式构建测序文库的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，提供了一种通过环化方式构建测序文库的方法。所述方法包括以下步骤：A.将核酸片段与连接组件连接，并以不增加其大小的形式进行环化，得到第一环形分子；所述连接组件含有至少一个酶切识别位点；B.基于步骤A所述酶切识别位点，利用内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。本发明的方法适用范围广，能够在小片段核酸分子中定向插入已知序列，从而构建测序文库，并能进一步提高建库过程中环化的效率。

Description

一种通过环化方式构建测序文库的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种通过环化方式构建测序文库的方法。
背景技术
过去几年间，第二代高通量测序技术取得了突飞猛进的发展。其中，基于连接酶来实现测序的方法具有准确率高的优点，但由于其单一读长短，限制了这类测序方法的应用。针对这种情况，近些年出现了通过构建具有特殊结构的测序文库来提高测序读长的方法，即在待测片段中插入一个或多个接头序列，从而使同一测序文库分子具有多个连接测序起始的位点，然后分别在这些不同的起始位点上进行连接测序，从而增加测序读长。这种方法的核心在于，如何实现在待测片段中定向插入一个或多个接头序列。
现有技术中是通过多次环化、酶切来实现的，其大致实现过程如下：1)将待测片段与第一接头连接，所述第一接头包含限制酶的结合位点；2)环化来自步骤1)的产物以产生第一环形多核苷酸；3)用限制酶切割第一环形多核苷酸；4)连接第二接头，所述第二接头包含限制酶的结合位点；5)环化来自步骤4)的产物以产生第二环形多核苷酸；重复步骤3)到5)以在待测片段中插入多个接头。但是该方法对待测片段的大小均有一定的要求，如果待测片段过短，将降低环化的效率，甚至不能环化，或者环化后得到的是非目标产物，从而使得测序文库构建失败。即，现有技术中构建具有特殊结构的测序文库的方法，要求用于构建测序文库的原材料(源核酸)大于150bp，而且当建库方法中还包括片段化步骤时，原材料的大小还要进一步加大，一般要求原材料与片段化产物的大小比在10∶1以上，才能保证经片段化步骤后得到的片段化产物的随机性，进而保证后续测序结果的准确性。
由上可知，现有技术在构建上述具有特殊结构的测序文库时，很大程度上局限于原材料的大小，无法对小片段核酸分子通过环化方式完成文库构建，使得现有技术的实际应用范围较窄。
因此需要一种新的通过环化方式构建测序文库的方法，能够突破对原材料大小的局限性，扩大测序文库构建方法的适用范围，并能进一步保证测序文库构建过程中环化的效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的通过环化方式构建测序文库的方法，旨在解决现有技术在构建测序文库时对原材料的大小具有较强的局限性，无法采用环化方式对小片段核酸分子进行测序文库构建的问题。
为了实现发明目的，本发明提供了一种通过环化方式构建测序文库的方法，包括下述步骤：
A.将核酸片段与连接组件连接，并以不增加其大小的形式进行环化，得到第一环形分子；所述连接组件含有至少一个酶切识别位点；
B.基于步骤A所述酶切识别位点，利用内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。
其中，所述连接组件与核酸片段的大小比值大于等于4，即连接组件的大小至少是核酸片段的4倍。
其中，所述连接组件的大小大于等于140bp；更优选的，所述连接组件的大小大于等于400bp。
上述任一方案中，所述连接组件包括接头和桥序列，所述接头和/或桥序列含有IIs型限制性内切酶识别位点。
其中，所述步骤A包括以下步骤：
A1.将核酸片段与接头连接，得到含接头的核酸片段；
A2.将含接头的核酸片段与桥序列连接并环化，得到第一环行分子。
进一步的，所述接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头含有IIs型限制性内切酶识别位点，所述步骤A1包括以下步骤：
A11.将核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段；
A12.利用IIs型限制性内切酶酶切含第一接头的核酸片段，得到含第一接头的酶切产物；
A13.将含第一接头的酶切产物与第二接头连接，得到含接头的核酸片段。
更进一步的，所述步骤A11包括以下步骤：
A111.对核酸片段进行处理，得到处理过的核酸片段；所述处理方法包括去磷酸化、末端补平、加A尾、加polyA尾中的至少一种；
A112.将处理过的核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段。
其中，所述步骤A2包括以下步骤：
A21.利用特异性切割剂分别对含接头的核酸片段和桥序列进行切割，得到相对应的切割产物；
A22.利用连接酶，将相对应的切割产物连接并环化，得到第一环形分子；
所述接头和桥序列均含有用于切割的识别位点；
所述特异性切割剂能够特异性的识别接头和桥序列的用于切割的识别位点，并对接头、桥序列进行切割。
上述任一方案中，所述接头包括平末端接头、突出末端接头、分叉接头和含茎环结构的接头中的至少一种。
上述任一方案中，所述连接组件含有至少2个IIs限制性内切酶识别位点，所述步骤B具体为：
利用连接组件含有的IIs限制性内切酶识别位点，通过相应的限制性内切酶，对第一环行分子中的核酸片段中对应的两个酶切位点进行切割，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。
上述任一方案中，在步骤B之后还包括以下步骤：
C.更换内切酶和桥联组件，对步骤B得到的桥联环化物进行酶切、连接和环化，以在核酸片段中插入至少两个桥联组件，得到环形测序文库。
进一步的，所述桥联组件含有IIs型限制性内切酶识别位点。
进一步的，所述步骤B的桥联组件为第一桥联组件，其含有两个IIs型限制性内切酶识别位点，所述步骤C包括以下步骤：
C1.利用IIs型限制性内切酶酶切桥联环化物中的核酸片段，该IIs型限制性内切酶能特异性的识别第一桥联组件中的一个IIs型限制性内切酶识别位点；
C2.将第二桥联组件与步骤C1的产物连接并环化，得到第二环形分子；
C3.利用IIs型限制性内切酶酶切第二环形分子中的核酸片段，该IIs型限制性内切酶能特异性的识别第一桥联组件中的另一个IIs型限制性内切酶识别位点；
C4.将第三桥联组件与步骤C3的产物连接并环化，得到环形测序文库。
上述任一方案中，所述步骤C之后还包括以下步骤：
D.利用与环形测序文库中的连接组件和/或桥联组件互补的引物，对环形测序文库进行扩增，得到线形测序文库。
上述任一方案中，所述步骤A之前包括以下步骤：
A’.片段化源核酸，得到核酸片段。
由上可知，本发明通过连接组件与核酸片段的连接，突破了构建测序文库时对原材料大小的限制，扩大了构建测序文库方法的适用范围，并能进一步提高测序文库构建过程中环化的效率。
附图说明
图1是本发明一种实施例中的通过环化方式构建测序文库的方法流程图；
图2是本发明一个实施例中各实验组的连接反应产物和连接反应产物经PS-DNase消化处理后回收的产物的电泳结果图；
图3是本发明四个实施例中核酸片段与连接组件的连接环化示意图；
图4是本发明一个实施例中核酸片段与连接组件连接的方法流程图；
图5是本发明一个实施例中硫代磷酸脂键的结构示意图；
图6是本发明一个实施例中的通过环化方式构建测序文库的方法示意图；
图7是本发明另一个实施例中的通过环化方式构建测序文库的方法示意图；
图8是本发明另一个实施例中的通过环化方式构建测序文库的方法示意图；
图9是本发明另一个实施例中的通过环化方式构建测序文库的方法示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
图1示出了本发明的构建测序文库的方法的一种实施方案，包括下述步骤：
S1.将核酸片段与连接组件连接，并以不增加其大小的形式进行环化，得到第一环形分子；所述连接组件含有至少一个酶切识别位点；
S2.基于步骤S1所述酶切识别位点，利用内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。
需要说明的是：
在步骤S1中，所述核酸片段可以是基因组中的任意片段，包括但不限于基因、基因的一部分、调控序列、内含子或内含子的一部分；也可以是基因组DNA、cDNA、RNA(包括但不限于mRNA和rRNA)或DNA与RNA的杂合分子；还可以是基因组DNA、cDNA、RNA(包括但不限于mRNA和rRNA)上特定区域的扩增片段。所述核酸片段可以是任意长度，包括但不限于10bp～1000bp、20bp～900bp、30bp～800bp、30bp～700bp、30bp～600bp、30bp～500bp、30bp～400bp、30bp～300bp、30bp～250bp、30bp～200bp、10bp～150bp、10bp～100bp、20bp～130bp、30bp～100bp、40bp～150bp、50bp～200bp、60bp～300bp、70bp～250bp；可以是单链核酸分子，也可以是双链核酸分子。
优选的，所述核酸片段为双链核酸分子，大小在25bp～100bp之间。
在步骤S1中，所述连接组件为序列信息已知的核酸分子，用于与核酸片段连接，使连接后得到的产物能够以不增加大小的形式进行环化，其含有至少一个酶切识别位点。
所述以不增加大小的形式环化，是指环化前的底物无需借助与其他核酸分子的连接来实现成环，即环化后得到的产物的大小小于等于环化前的底物。包括但不限于以下几种具体形式：1)环化前的底物直接自身成环；2)环化前的底物的一端或两端，经酶切或特异性切割剂切割后，两端形成互补配合的末端，进而成环。
所述酶切识别位点，用于在步骤S2中对核酸片段进行酶切。进一步的，所述连接组件上的酶切识别位点为IIs型限制性内切酶识别位点；所述IIs型限制性内切酶为切割位点在识别位点之外的限制性内切酶，包括但不限于：Acu I、Alw I、Bbs I、BbV I、Bcc I、BceA I、BciV I、BfuA I、Bmr I、Bpm I、BpuE I、Bsa I、BseM II、BseR I、Bsg I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspCN I、BspM I、BspQ I、BtgZ I、Ear I、Eci I、EcoP15 I、Fau I、Fok I、Hga I、Hph I、HpyAV、Mbo II、Mly I、Mme I、Mnl I、NmeAIII、Ple I、Sap I、SfaN I和TspDT I，优选为Acu I、Bsg I、EcoP15 I或Mme I。
在步骤S1中，所述第一环行分子为核酸片段与连接组件连接并以不增加大小的形式环化后得到的环形分子。
在步骤S2中，基于连接组件含有的酶切识别位点，能利用相应的内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，从而将核酸片段切成两段，并通过已知序列(连接组件)连接。
在步骤S2中，所述桥联组件为序列信息已知的核酸分子，用于与步骤S2中所述的酶切产物连接。
在步骤S2中，所述桥联环化物为步骤S2中的酶切产物与桥联组件连接并环化后得到的，在核酸片段中插入桥联组件的环形分子，其该环形分子可作为测序反应的测序文库。
本方案通过连接组件与核酸片段的连接，保证了连接产物能以不增加连接产物大小的形式进行环化，并利用连接组件上的酶切识别位点，对第一环行分子中的核酸片段进行酶切，进而向核酸片段中定向插入已知序列(包括但不限于桥联组件)，从而完成测序文库的构建。本方案突破了构建测序文库时对原材料大小的限制，扩大了构建测序文库方法的适用范围，适用于任意长度的核酸片段，尤其适用于长度较短的核酸片段，避免了核酸片段因为片段过小而不能成环或成环效率低进而导致不能进行文库构建的现象。本方案可根据核酸片段的具体情况，采用不同的连接组件和具体的环化方式，具体将在后续的实施例中进一步阐述说明。
针对核酸片段的大小，连接组件可进行相应的变化，以保证它们的连接产物能够以不增加连接产物大小的形式进行环化。例如，当核酸片段为15bp的双链核酸分子时，连接组件可设计成大于等于135bp的核酸分子；当核酸片段为30bp的单链核酸分子时，连接组件可设计成大于等于120bp的核酸分子；当核酸片段为50bp的双链核酸分子时，连接组件可设计成大于等于100bp的核酸分子；当核酸片段为70bp的双链核酸分子时，连接组件可设计成大于等于80bp的核酸分子；当核酸片段为100bp的双链核酸分子时，连接组件可设计成大于等于50bp的核酸分子。
要想将线形核酸分子环化成环形核酸分子，要求线形核酸分子的大小在100bp以上，但是当线形核酸分子的大小在100bp～150bp之间时，成环的效率极低，且在环化过程中所需的条件很苛刻，例如所需的连接酶的浓度较高、或者需其它的催化剂等，不适于工业应用；而当线形核酸分子的大小在150bp～400bp之间，线形核酸分子成环的效率仍然较低，且成环的效率随着线形核酸分子的大小的增加而不断增高；当线形核酸分子的大小大于等于400bp时，不同大小的线形核酸分子的成环效率差异不大。
其中，在保证连接组件与核酸片段能够在常规条件下实现环化的前提下，即适于工业应用的前提下，所述连接组件与核酸片段的大小比值大于等于4。
为了使连接组件能够适用于各种大小的核酸片段，优选的，连接组件的大小大于等于140bp；这个实验方案中的连接组件能够保证任意大小核酸片段均能够在与之连接后，以不增加连接产物大小的形式进行环化。
为了，更进一步的提高连接组件与核酸片段连接后得到的连接产物的成环效率，更优选的，连接组件的大小大于等于400bp。
本发明设计了一具体的对比实验以支持上述结论。
试剂：
核酸片段，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2按1∶1的摩尔比退火形成；
连接组件1，由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4按1∶1的摩尔比退火形成；
连接组件2，由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6按1∶1的摩尔比退火形成；
连接组件3，由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8按1∶1的摩尔比退火形成；
连接组件4，由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10按1∶1的摩尔比退火形成；
连接组件5，由SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12按1∶1的摩尔比退火形成；
连接组件6，由SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14按1∶1的摩尔比退火形成；
T4DNA Ligase(Fermentas，EL0011，5U/μL)；
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase(Epicentre，E3101K)；
Figure BSA00000695201800061
Cycle-Pure Kit(OMEGA BIO-TEK，D6492-01)。
实验方案：
本实验共分8组，如下表所示。
表1各实验组的连接反应组分
  实验组   连接反应组分   实验组   连接反应组分
  1   核酸片段   5   核酸片段+连接组件4
  2   核酸片段+连接组件1   6   核酸片段+连接组件5
  3   核酸片段+连接组件2   7   核酸片段+连接组件6
  4   核酸片段+连接组件3   8   连接组件2
1.连接反应
反应体系如下：
10×T4 DNA Ligase Buffer    100μL；
核酸片段                    16pmol；
连接组件                    4pmol；
T4 DNA Ligase(5U/μL)       1μL；
ddH2O                       up to 1000gL。
各实验组按上述体系配置连接反应体系，实验组1中的连接组件用ddH2O代替，实验组8中的核酸片段用ddH2O代替。
反应条件：
16℃反应4h，然后于65℃灭活10min，置-20℃保存备用。
2.连接产物回收
利用利用
Figure BSA00000695201800071
Cycle-Pure Kit，将步骤1中的连接产物分别进行回收处理，并将回收产物溶于40μL的超纯水中。回收的方法和步骤参加该试剂盒的使用说明书。
3.Plasmid-Safe ATP-dependent DNase处理
利用Plasmid-Safe ATP-dependent DNase分别对步骤2的产物进行处理，以消化没有环化的线性DNA，反应体系如下：
连接反应回收产物                                35μL；
25mM ATP                                        2μL；
10×Reaction Buffer                             5μL；
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase(10U/μL)       1μL；
H2O                                             up to 50μL。
反应条件：37℃反应1h，然后于-20℃保存备用。
4.消化产物回收、浓度测定及电泳检测
利用
Figure BSA00000695201800072
Cycle-Pure Kit，将步骤3中的产物进行回收处理，并将回收产物溶于50μL的超纯水中。回收的方法和步骤参加该试剂盒的使用说明书。利用Nanodrop 1000测定回收产物的浓度，并根据回收产物的理论大小计算回收产物的摩尔浓度和环化率，结果如表2所示。
回收产物的摩尔数＝回收产物的浓度÷回收产物的理论大小×50μL；
环化率＝回收产物的摩尔数×40÷35÷16pmol。
表2各实验组消化产物回收浓度
Figure BSA00000695201800081
为了防止核酸片段与连接组件连接后形成的连接产物多聚化，进而在连接酶的作用下成环现象的出现，本实验通过控制连接反应中核酸片段与连接组件的浓度的形式(＜2ng/μL)，使得各实验组能够按照设想的形式进行反应，即每个核酸片段分子只与一个连接组件分子连接，而不发生目标连接产物(核酸片段-连接组件)多聚化进而成环的反应。
对步骤1连接反应的产物，步骤4回收得到的产物分别进行PAGE电泳检测，PAGE胶浓度为8％，得图2。M为20bp DNA Ladder Marker(TaKaRa，D521A)。
如图2中a所示，实验组1、8泳道的条带分别位于50bp和100bp处，说明实验组1、8均未发生连接反应，实验组2至7均发生了连接反应，且连接反应后，实验组2至7中剩余的50bp的核酸片段的条带基本一致，说明实验组2至7中，发生连接的核酸片段的量基本一致。此外，发明人还对本对比实验中的步骤1进行了重复，并将连接产物进行了电泳切胶回收，回收50bp左右的条带，并测定浓度，结果显示实验组2至7的连接产物在50bp左右的条带的浓度无太大差异。
如图2中b所示，实验组1、2、8泳道均无条带，说明实验组2未发生环化反应，实验组3、4得到的连接产物中均只有部分实现了环化。
因为表2中的环化率是以核酸片段中成环的百分比来计算的，而在连接反应体系中，核酸片段的浓度是连接组件的浓度的4倍，因此，理论上环化率的最高值为25％。
综上，表2的结果与图2中b的结果一致。说明实验组2至7中的连接组件均与核酸片段发生了连接反应，且形成的连接产物的摩尔数基本一致；而实验组2中没有连接产物实现了自身环化；随着连接组件的增大，连接产物实现自身环化的比例不断上升，且当连接组件与核酸片段的连接产物在100bp至300bp这个区间内时，连接产物实现自身环化的比例急剧上升，当连接组件与核酸片段的连接产物在300bp至716bp这个区间内时，连接产物实现自身环化的比例变化不大，尤其是连接产物为450bp或716bp时，连接产物实现自身环化的比例差异不明显。
针对连接组件的单双链形式，本发明有多种不同的实施方案。
如图3中a所示，在本发明的一个实施方案中，连接组件为单链核酸分子，核酸片段也为单链核酸分子，连接组件的两端分别与核酸片段的两端互补配对。在无链替代活性的聚合酶作用下，连接组件的3’末端和核酸片段的3’末端分别进行延伸反应，形成具有2个切口的双链环状分子。具有2个切口的双链环状分子可在连接酶的作用下将切口补齐。
如图3中b所示，在本发明的另一个实施方案中，连接组件为双链核酸分子，其含有双突出末端的；核酸片段为单链核酸分子；连接组件的双突出末端分别与核酸片段的两端互补配对。在无链替代活性的聚合酶作用下，连接组件的3’末端可进行延伸反应，形成具有1个切口的双链环状分子。具有1个切口的双链环状分子可在连接酶的作用下将切口补齐。
如图3中c所示，在本发明的另一个实施方案中，连接组件为单链核酸分子；核酸片段为双链核酸分子，其含有双突出末端，连接组件的两端分别与核酸片段的双突出末端互补配对。在无链替代活性的聚合酶作用下，核酸片段的3’末端可进行延伸反应，形成具有1个切口的双链环状分子。具有1个切口的双链环状分子可在连接酶的作用下将切口补齐。
如图3中d所示，在本发明的另一个实施方案中，连接组件为双链核酸分子，核酸片段也为双核酸分子，连接组件的两端分别与核酸片段的两端连接，形成双链环形分子。
应当说明的是，上述实施方案只是本发明的部分实施方案，并不用以限制本发明的保护范围。
针对连接组件的构成，本发明有多种不同的实施方案。
在本发明的一个实施方案中，连接组件本身为一整体，即单链核酸分子或双链核酸分子。
在本发明的另一个实施方案中，连接组件包含有多种组分，这些组分相互之间能够配合形成连接组件。当步骤S1中的核酸片段与连接组件的连接过程，可以是这些组分相互配合形成的连接组件与核酸片段连接，也可以是这些组分中的某个或某些组分先与核酸片段连接，然后再与其它组分连接，最终形成含有核酸片段和连接组件的连接产物。而连接组件所含有的至少一个酶切识别位点可位于其中某一个或多个组分上，也可由这些组分中的某两个组合而成。
优选的，所述连接组件包括接头和桥序列。所述接头，用于与核酸片段连接。所述桥序列，用于保证连接组件与核酸片段连接后得到的产物能够以不增加大小的形式进行环化。所述接头和/或桥序列包含有至少一个酶切识别位点，或者接头与桥序列连接后形成至少一个酶切识别位点，使得步骤S2中，能够基于该至少一个酶切识别位点对第一环形分子中的核酸片段进行酶切。
应当说明的是，本方案对所述接头并无特殊的要求，只要能够与核酸片段进行连接，且连接的产物能与进一步与桥序列连接即可。所述接头可采用多种形式，包括但不限于平末端接头、突出末端接头、分叉接头和含茎环结构的接头。上述各种接头具体已在中国专利CN201110222952.4中公开，在这里通过引用的形式全部引入。
优选的，所述接头含有至少一个IIs型限制性内切酶识别位点。在本方案中，所述步骤S1中连接组件与核酸片段的连接有多种形式。
其中一种是接头与桥序列先进行连接形成连接组件，进而连接组件与核酸片段连接，形成第一环形分子。
另一种连接形式是桥序列先与核酸片段连接，得到的产物再进一步与接头连接。
还有一种连接形式如图4所示，所述步骤S1包括以下步骤：
S11.将核酸片段与接头连接，得到含接头的核酸片段；
S12.将含接头的核酸片段与桥序列连接并环化，得到第一环行分子。
应当说明的是，上述三种连接形式只是本发明的部分实施方式，并不用于限定本发明的保护范围。
针对图4所示的连接形式，本发明还具有多种不同的方案。
在本发明的一实施方案中，所述接头只有一种，所述步骤S11具体为：
将接头与核酸片段的一端连接，得到一端含有接头的核酸片段。
在本发明的另一实施方案中，所述接头只有一种，所述步骤S11具体为：
将接头与核酸片段的两端分别连接，得到两端均含有接头的核酸片段。
在本发明的另一个实施方案中，所述接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头或第二接头含有至少一个IIs型限制性内切酶识别位点；所述第一接头用于与核酸片段的3’端连接，所述第二接头用于与核酸片段的5’端连接。
针对步骤S11，优选的，所述第一接头含有至少一个IIs型限制性内切酶识别位点；所述步骤S11包括以下步骤：
S111.将核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段；
S112.利用IIs型限制性内切酶酶切含第一接头的核酸片段，得到含第一接头的酶切产物；
S113.将含第一接头的酶切产物与第二接头连接，得到含接头的核酸片段。
本方案通过第一接头上的IIs型限制性内切酶识别位点以及相应的限制性内切酶酶切，使得含接头的核酸片段中所含有核酸片段大小一致，进而使得在后续的连接环化过程中各核酸片段成环效率保持一致，以避免因各核酸片段大小的不同使得它们之间的成环效率不一致，保证了各种核酸片段分子在构建测序文库过程中比例的一致性。
更优选的，所述步骤S111包括以下步骤：
S1111.对核酸片段进行处理，得到处理过的核酸片段；所述处理方法包括去磷酸化、末端补平、加A尾、加poly A尾中的至少一种；
S1112.将处理过的核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段。
通过步骤S1111的处理，能够提高核酸片段与第一接头连接的效率，保证第一接头与核酸片段连接的方向性。
针对步骤S12，优选的，所述接头和桥序列均含有用于切割的识别位点；所述特异性切割剂能够特异性的识别接头和桥序列的用于切割的识别位点，并对接头、桥序列进行切割；所述步骤S12包含以下步骤：
S121.利用特异性切割剂分别对含接头的核酸片段和桥序列进行切割，得到相对应的切割产物；
S122.利用连接酶，将相对应的切割产物连接并环化，得到第一环形分子。
需要说明的是，所述用于切割的识别位点上进行的切割可发生在识别位点上，也可发生在识别位点外，例如在该识别位点的3’端方向的特定位置。所述用于切割的识别位点包括但不限于尿嘧啶核苷酸、脱氧肌苷、硫代磷酸酯键或IIs型限制性内切酶识别序列。上述用于切割的识别位点均可在相应的物质的作用下发生特异性的切割。用于切割的识别位点与该相应的特异性切割剂的对应关系包括但不限于：
U——USER酶或UDG酶；
I——大肠杆菌核算内切酶V及其同源物或DNA糖基化酶；
P-S——含有Ag、Hg、Cu、Mn、Zn或Cd原子的切割剂；
IIs型限制性内切酶识别序列——IIs型限制性内切酶。
上述的硫代磷酸酯键是指磷酸二酯键的桥接氧原子之一被硫原子取代。硫代磷酸脂键可以是图5中A所示的5’-S-硫代磷酸酯连接(3’-O-P-S-5’)，也可以是图5中B所示的3’-S-硫代磷酸酯连接(3’-S-P-O-5’)。可用各种含金属的物质切割硫代磷酸酯键。所述金属可以是Ag、Hg、Cu、Mn、Zn或Cd。优选的，该物质是提供Ag+、Hg++、Cu++、Mn++、Zn+或Cd+离子的可溶于水的盐(也可采用提供其它氧化状态的离子的盐)。特别优选含银盐如硝酸银(AgNO3)或其它提供Ag+离子的盐。切割的条件包括例如50mM AgNO3，约22～37℃，10分钟或更长时间如30分钟。优选的，pH为4.0～10.0，更优选5.0～9.0，如约6.0～8.0，如约7.0。参见Mag，M.等，Nucleic Acids Res.，19(7)：1437-1441，1991。
本方案通过对接头和桥序列的特殊设计，使得连接组件(接头或桥序列)在与核酸片段进行连接的反应中，特异性更高，定向效果更好。
针对连接组件所含有的用于切割核酸片段的IIs限制性内切酶识别位点的个数，本发明有多个实施方案。
如图6所示，在本发明的一个实施方案中，连接组件含有一个用于切割核酸片段的IIs限制性内切酶识别位点，在步骤S2中，基于连接组件的这个用于切割核酸片段的IIs限制性内切酶识别位点，只能对核酸片段的一个特定位置进行切割，然后酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。
如图7所示，在本发明的另一个实施方案中，连接组件含有两个用于切割核酸片段的IIs限制性内切酶识别位点，在步骤S2中，通过相应的限制性内切酶，可对第一环行分子中的核酸片段中对应的两个酶切位点进行切割，然后酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物。
应当说明的是，本方案中连接组件所含有的两个用于切割核酸片段的IIs限制性内切酶识别位点的位置，既可如图7中所示的那样，位于连接组件的两端，也可位于连接组件的同一端。在此不再赘述。另外，这两个用于切割核酸片段的IIs限制性内切酶识别位点可相同或不同；基于它们对核酸片段的切割可同时进行也可分开进行，当这两个II s限制性内切酶识别位点相同时，可通过常用的甲基化等保护步骤，先将其中的一个IIs限制性内切酶识别位点保护住，然后进行第一次酶切，酶切完成后，又可经过再一次的甲基化保护步骤，将另一个IIs限制性内切酶识别位点保护住，然后进行第二次酶切。
上述两个实施方案只是本发明的部分实施方案，并不用于限制本发明的具体保护范围。例如，连接组件上还可含有三个用于切割核酸片段的IIs限制性内切酶识别位点，而且这三个IIs限制性内切酶识别位点的位置也可像上一实施方案那样，具有多种变化。
针对上述所有方案，还可在步骤S2之后还包括以下步骤：
S3.更换内切酶和桥联组件，对步骤S2得到的桥联环化物进行酶切、连接和环化，以在核酸片段中插入至少两个桥联组件，得到环形测序文库。
需要说明的是：
步骤S3实际上是对步骤S2的重复。不同的是，步骤S3中内切酶所识别的酶切识别位点与步骤S2中的不同，即切割核酸片段的位置不同；步骤S3中内切酶所作用的底物与步骤S2不同，步骤S2中内切酶所作用的底物是步骤S1的产物；而步骤S3中内切酶所作用的底物是步骤S2的产物。
此外，步骤S3中更换内切酶和桥联组件的次数可有多次，即多次重复步骤S2的操作。而各次重复步骤的作用底物可依上述表述类推。
步骤S3中使用的内切酶识别的酶切识别位点可以是通过连接组件引入的，也可以是通过桥联组件引入的。该酶切识别位点，用于在步骤S3中对核酸片段进行酶切。优选的，所述酶切识别位点为IIs型限制性内切酶识别位点。
步骤S3中使用的内切酶可与步骤S2中的内切酶相同或不同，可根据连接组件和桥联组件的具体设计而进行相应的变化。优选的，步骤S3中使用的内切酶与步骤S2中的内切酶相同，并通过甲基化保护等常见方法，使得步骤S3中的内切酶识别特定位置的酶切识别位点，从而实现正确的切割。本方案可降低实验中的试剂种类，从而降低成本，并避免因选用了多种内切酶，而导致在酶切过程中，错误识别核酸片段中可能潜在的酶切识别位点，进而发生非目标酶切。
同样的，步骤S3中使用的桥联组件可与步骤S2中的相同或不同，且当步骤S3为对步骤S2的多次重复时，更换的桥联组件之间可相同或不同。
本方案所述的更换内切酶和桥联组件，指的是广义的更换，既可以是更换不同种类的内切酶和桥联组件，也可以是将反应过的试剂换成未反应过的试剂。
本方案通过更换内切酶和桥联组件，从而实现在核酸片段中定向插入至少两个桥联组件，从而使得环形测序文库中有多段已知序列，即对环形测序文库进行测序的起始位点可有多个，从而通过测序文库的改进延长了测序长度。
优选的，所述桥联组件含有IIs型限制性内切酶识别位点。即步骤S3中的内切酶所识别的酶切识别位点是由桥联组件引入的，这样可大大降低连接组件的设计难度，并且酶切识别位点的选择更加自由，降低了实验设计难度，简化实验操作，有利于构建测序文库的顺利进行。
如图8所示，本发明提供了一种通过环化方式构建测序文库的方法，包括以下步骤：
S1.将核酸片段与连接组件连接，并以不增加其大小的形式进行环化，得到第一环形分子；所述连接组件含有至少一个酶切识别位点；
S2.基于步骤S1所述酶切识别位点，利用内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，并将酶切产物与桥联组件连接并环化，得到桥联环化物；所述桥联组件含有一个酶切识别位点；
S3.通过更换内切酶和桥联组件，对步骤S2得到的桥联环化物进行酶切、连接和环化，以在核酸片段中插入至少两个桥联组件，得到环形测序文库。
所述环形测序文库，是分别在核酸片段中的特定位置插入至少两个桥联组件的环形分子。
如图9所示，本发明提供了另一种通过环化方式构建测序文库的方法，包括以下步骤：
S1.将核酸片段与连接组件连接，并以不增加其大小的形式进行环化，得到第一环形分子；所述连接组件含有至少一个酶切识别位点；
S2.基于步骤S1所述酶切识别位点，利用内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，并将酶切产物与第一桥联组件连接并环化，得到桥联环化物；
S31.利用IIs型限制性内切酶酶切桥联环化物中的核酸片段，该IIs型限制性内切酶能特异性的识别第一桥联组件中的一个IIs型限制性内切酶识别位点；
S32.将第二桥联组件与步骤S31的产物连接并环化，得到第二环形分子；
S33.利用IIs型限制性内切酶酶切第二环形分子中的核酸片段，该IIs型限制性内切酶能特异性的识别第一桥联组件中的另一个IIs型限制性内切酶识别位点；
S34.将第三桥联组件与步骤S33的产物连接并环化，得到环形测序文库。
需要说明的是：
所述连接组件为序列信息已知的核酸分子，用于与核酸片段连接，使连接后得到的产物能够以不增加大小的形式进行环化，其含有一个酶切识别位点。所述第一环行分子为核酸片段与连接组件连接并环化后得到的环形分子。所述第一桥联组件，为序列信息已知的核酸分子，用于与步骤S2中所述的酶切产物连接，其含有两个IIs型限制性内切酶切识别位点。所述桥联环化物为步骤S2中的酶切产物与第一桥联组件连接并环化后得到的，在核酸片段中插入第一桥联组件的环形分子。所述第二桥联组件，为序列信息已知的核酸分子，用于与步骤S31的产物连接并环化。所述第二环形分子为分别在核酸片段中的特定位置插入第一桥联组件、第二桥联组件的环形分子。所述第三桥联组件，为序列信息已知的核酸分子，用于与步骤S33的产物连接并环化。所述环形测序文库，是分别在核酸片段中的特定位置插入第一桥联组件、第二桥联组件、第三桥联组件的环形分子。
优选的，所述第一桥联组件、第二桥联组件、第三桥联组件均为双链核酸分子。
针对步骤S3的产物，环形测序文库，可利用与环形测序文库中的已知序列(例如：连接组件、桥联组件)互补或部分互补的引物，对环形测序文库进行扩增，从而得到线形测序文库。
上述所有方案中，在进行步骤S1之前，还可包括以下步骤：
S1’.片段化源核酸，得到核酸片段。
需要说明的是：
所述源核酸可是基因组中的任意片段，包括但不限于基因、基因的一部分、调控序列、内含子或内含子的一部分；也可以是基因组DNA、cDNA、RNA(包括但不限于mRNA和rRNA)或DNA与RNA的杂合分子；还可以是基因组DNA、cDNA、RNA(包括但不限于mRNA和rRNA)上特定区域的扩增片段。源核酸的大小不限。
所述片段化源核酸的方法有多种，包括但不限于：超声法、喷雾法、化学剪切法和酶切法。可根据实际情况，采用相适应的方法进行实验。根据后续建库步骤对核酸长度的需要，可对片段化得到的核酸片段进行分离纯化，分离方法可以采用常用方法，如凝胶电泳、蔗糖梯度或氯化铯梯度沉降、柱层析分离等。根据所使用的片段化方法，还可对所得的多核苷酸片段进行进一步的末端修饰，包括但不限于：磷酸化或去磷酸化、末端补平和末端加A，等等；以便于后续的步骤中与连接组件的连接。
下面将通过具体实施例对本发明的通过环化方式构建测序文库的方法进行进一步的详细说明。步骤如下：
一、核酸片段的制备
1.PCR扩增
以Lambda噬菌体DNA(λDNA)作为模板，利用上游引物F1(SEQ IDNO：15)，下游引物R1(SEQ ID NO：16)进行PCR扩增。
反应体系如下：
上游引物(10μM，SEQ ID NO：15)                2μL
下游引物(10μM，SEQ ID NO：16)                2μL；
λDNA                                         50ng；
10×Ex Taq Buffer                             5μL；
Ex Taq(5U/μL)                                0.5μL；
dNTP(各2.5mM)                        4μL；
ddH2O                                up to 50μL。
PCR反应条件如下：
95℃3min；
94℃30s，58℃30s，72℃30s；重复25个循环；
72℃7min。
对反应产物进行纯化回收，得扩增产物。
2.超声破碎
在冰浴条件下，利用超声破碎方式对扩增产物进行片段化处理。具体操作为：将扩增产物(60μg左右)放入400μL TE buffer溶液中，430W功率条件下超声4s，间隔5s，重复12次。超声破碎后的产物利用PAGE胶电泳分离，回收25bp～100bp的DNA片段。对回收的片段进行末端修饰，具体实现如下：
3.磷酸化以及末端补平反应
体系为：
回收的片段化产物                                约2000ng；
dNTP(10mM)                                      1.5μL；
T4DNA Polymersase(Fermentas，EL0061，5U/μL)    1μL；
Klenow Fragment(Fermentas，EP0051，10U/μL)     0.1μL；
T4PNK(Fermentas，EK0031，10U/μL)               0.5μL；
ATP(10mM)                                       1.5μL；
10×T4 DNA Ligase Buffer                        10μL；
加ddH2O至100μL。
反应条件为：20℃孵育20min。反应结束后利用回收试剂盒进行纯化回收。
4.末端加A尾
反应体系为：
磷酸化以及末端补平后的回收产物                  60μL(约1000ng)；
10×NEBuffer2                                   10μL；
10mM dATP                                       2μL；
Klenow Fragment(NEB，M0212L，5U/μL)            2μL；
加ddH2O至100μL。
反应条件为：37℃孵育30min。反应结束后利用纯化试剂盒纯化回收，得核酸片段。
二、连接组件的制备
本实施例中，连接组件包括第一接头(SEQ ID NO：17与SEQ ID NO：18按等摩尔数退火形成)、第二接头(SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20按等摩尔数退火形成)和桥序列。
1.PCR扩增获得桥序列前体
以Lambda噬菌体DNA(λDNA)为模板，利用上游引物F2(SEQ ID NO：21)和下游引物R1(SEQ ID NO：22)进行扩增，得连接组件前体；其中，上游引物F含有Hind III酶切位点，下游引物R含有Pst I酶切位点。PCR反应体系如下：
λDNA                                             300ng；
上游引物F2(10μM)                                 40μL；
下游引物R2(10μM)                                 40μL；
10×Ex Taq Buffer                                 100μL；
Ex Taq(5U/μL)                                    10μL；
dNTP(各2.5mM)                                     20μL；
ddH2O                                             up to 1000μL。
PCR反应条件如下：
95℃3min；
94℃30s，58℃30s，72℃50s；重复28个循环；
72℃7min。
利用PCR清洁试剂盒
Figure BSA00000695201800171
Cycle-Pure Kit，对扩增产物进行清洁，除去未扩增的引物和dNTP，回收得桥序列前体。
2.Hind III和Pst I双酶切桥序列前体
反应体系如下：
桥序列前体                                        10μg；
Pst I(NEB，R0140S，10U/μL)                       5μL；
Hind III(NEB，R0104S，10U/μL)                    5μL；
BSA(100mg/mL)                                     0.1μL；
10×NEBuffer2                                     10μL；
ddH2O                                             up to 100μL。
反应条件：37℃反应2h，65℃灭活20min，纯化双酶切反应的产物，得桥序列约7μg。
三、连接组件与核酸片段的连接
1.第一接头与核酸片段连接
连接反应体系如下：
核酸片段                                          2μg；
第一接头(10μM)                                   20μL；
10×T4DNA Ligase Buffer                           50μL；
T4DNA Ligase(Fermentas，EL0011，5U/μL)           5μL；
PEG 6000(30％)                                125μL；
ddH2O                                         up to 500μL。
反应条件：16℃反应4h，然后于65℃灭活10min，然后对反应产物进行纯化回收，得含第一接头的核酸片段。
2.EcoP15 I酶切含第一接头的核酸片段
反应体系如下：
含第一接头的核酸片段                           1.5μg；
EcoP15 I(NEB，R0646S，10U/μL)                 2.5μL；
10×NEBuffer3                                  10μL；
BSA(10mg/mL)                                   1μL；
ATP(25mM)                                      4μL；
ddH2O                                          up to 100μL。
反应条件：
37℃反应2h，然后于65℃灭活10min，对反应产物进行纯化回收，得EcoP15I酶切产物。
3.EcoP15 I酶切产物与第二接头连接
连接反应体系如下：
EcoP15I酶切产物                                1.2μg；
第二接头(10μM)                                20μL；
10×T4DNA Ligase Buffer                        40μL；
T4DNA Ligase(Fermentas，EL0011，5U/μL)        4μL；
ddH2O                                          up to 400μL。
16℃反应4h，然后于65℃灭活10min，对反应产物进行纯化回收，得含有两个接头的核酸片段。
4.PCR扩增含有两个接头的核酸片段
反应体系如下：
上游引物F3(10μM，SEQ ID NO：17)               2μL
下游引物R3(10μM，SEQ ID NO：23)               2μL；
含两个接头的核酸片段                           50ng；
10×Ex Taq Buffer                              5μL；
Ex Taq(5U/μL)                                 0.5μL；
dNTP(各2.5mM)                                  4μL；
ddH2O                                          up to 50μL。
PCR反应条件如下：
95℃3min；
94℃30s，58℃30s，72℃30s；重复25个循环；
72℃7min。
对反应产物进行纯化回收，得扩增产物。
5.Hind III和Pst I双酶切扩增产物
反应体系如下：
扩增产物                                       10μg；
Pst I(NEB，R0140S，10U/μL)                    5μL；
Hind III(NEB，R0104S，10U/μL)                 5μL；
BSA(100mg/mL)                                  0.1μL；
10×NEBuffer2                                  10μL；
ddH2O                                          up to 100μL。
反应条件：37℃反应2h，65℃灭活20min，对反应产物进行纯化回收，得含两个接头的核酸片段的双酶切产物。
6.第一环形分子的获得
步骤5回收产物                                  0.4μg；
桥序列                                         10μg；
10×T4DNA Ligase Buffer                        500μL；
T4DNA Ligase(Fermentas，EL0011，5U/μL)        5μL；
ddH2O                                          up to 5000μL。
16℃反应4h，然后于65℃灭活10min，对反应产物进行纯化回收，得第一环形分子。
7.Plasmid Safe DNase消化第一环形分子
利用Plasmid-Safe ATP-dependent DNase分别对第一环形分子进行处理，以消化没有环化的线性DNA，反应体系如下：
第一环形分子                                    8μg；
25mM ATP                                        6μL；
10×Reaction Buffer                             15μL；
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase(10U/μL)       7.5μL；
ddH2O                                           up to 150μL。
反应条件：37℃反应3h，然后对反应产物进行纯化回收，得PS-DNase处理产物。
8.Acu I酶切
利用Acu I酶对步骤7回收的产物进行酶切，得Acu I酶切产物。
反应体系如下：
10×NEBuffer4                                   10μL；
PS-DNase处理产物                            5μg；
SAM(3.2mM)                                  1.25μL；
Acu I(NEB，R0641S，5U/μL)                  2μL；
ddH2O                                       up to 100μL。
反应条件：37℃反应2h，65℃灭活20min，然后对反应产物进行纯化回收，至50μL TE中，得Acu I酶切产物。
9.USER酶酶切
反应体系如下：
Acu I酶切产物                               50μL；
10×T4DNA Ligase Buffer                     10μL；
USER酶(NEB，M5505L，10U/μL)                1μL；
ddH2O                                       up to 100μL。
反应条件：37℃反应1.5h，然后对反应产物进行纯化回收，至50μL TE中，得USER酶处理的DNA。
10.切刻平移和加G尾
反应体系如下：
USER酶处理的DNA                               50μL；
10×Reaction buffer(GenScript)                15μL；
10mM dNTP                                     4.5μL；
10mM dGTP                                     22.5μL；
Taq DNA Polymerase(GenScript，E00007，5U/μL) 0.5μL；
ddH2O                                         up to 150μL。
反应条件：70℃反应1.5h，然后对反应产物进行纯化回收，得DNA aferN/G。
四、测序文库的获得
1.DNA after N/G与桥联组件(SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25按等摩尔数退火形成)的连接
反应条件如下：
DNA after N/G                                  200ng；
桥联组件(10μM)                                1μL；
10×T4DNA Ligase Buffer                        15μL；
PEG 6000(30％)                                 25μL；
T4DNA Ligase(Fermentas，EL0011，5U/μL)        2μL；
ddH2O                                          up to 150μL。
反应条件：16℃反应4h，然后于65℃灭活10min，然后对反应产物进行纯化回收，得环形测序文库。
2.线形测序文库的获得
以环形测序文库为模板，利用上游引物F4(SEQ ID NO：17)、下游引物R4(SEQ ID NO：26)进行扩增，得线形测序文库。
反应体系如下：
环形测序文库                                 100ng；
上游引物F4(10μM，SEQ ID NO：17)             2μL；
下游引物R4(10μM，SEQ ID NO：26)             2μL；
10×Ex Taq Buffer                            5μL；
Ex Taq(5U/μL)                               0.5μL；
dNTP(各2.5mM)                                4μL；
ddH2O                                        up to 50μL。
PCR反应条件如下：
95℃3min；
94℃30s，58℃30s，72℃30s；重复25个循环；
72℃7min。
对反应产物进行纯化回收，得线性测序文库。
五、测序文库的测序
利用华因康PStar II Plus高通量基因测序，对步骤四所得的测序文库进行测序，并对测序结果进行分析，得Lambda噬菌体DNA的基因序列SEQ IDNO：27。
对比实验：与利用步骤一中的PCR扩增产物构建克隆，并利用Sanger测序进行双向测序，得克隆的基因序列SEQ ID NO：28。
经比对，SEQ ID NO：27与SEQ ID NO：28完全一致，说明利用本发明的通过环化方式构建测序文库的方法，能够成功实现了对短DNA片段的文库构建，且测序结果准确。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure ISA00000695202000011
Figure ISA00000695202000021
Figure ISA00000695202000031
Figure ISA00000695202000051
Figure ISA00000695202000061
Figure ISA00000695202000071
Figure ISA00000695202000081

Claims (12)

1.一种通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.将核酸片段与连接组件连接，并以不增加连接产物大小的形式进行环化，得到第一环形分子；所述连接组件含有至少一个酶切识别位点；
B.基于步骤A所述酶切识别位点，利用内切酶对第一环形分子中的核酸片段进行酶切，并将酶切产物与桥联组件连接成环，得到桥联环化物；
C.更换内切酶和桥联组件，对步骤B得到的桥联环化物进行酶切、连接和环化，以在核酸片段中插入至少二个桥联组件，得到环形测序文库；
所述桥联组件含有Ⅱs型限制性内切酶识别位点；
所述步骤B的桥联组件为第一桥联组件，其含有两个Ⅱs型限制性内切酶识别位点；
所述步骤C包括以下步骤：
C1.利用Ⅱs型限制性内切酶酶切桥联环化物中的核酸片段，该Ⅱs型限制性内切酶能特异性的识别第一桥联组件中的一个Ⅱs型限制性内切酶识别位点；
C2.将第二桥联组件与步骤C1的产物连接成环，得到第二环形分子；
C3.利用Ⅱs型限制性内切酶酶切第二环形分子中的核酸片段，该Ⅱs型限制性内切酶能特异性的识别第一桥联组件中的另一个Ⅱs型限制性内切酶识别位点；
C4.将第三桥联组件与步骤C3的产物连接成环，得到环形测序文库；
所述核酸片段大小为25bp～100bp。
2.根据权利要求1所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述连接组件与核酸片段的大小比值大于等于4。
3.根据权利要求1所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述连接组件的大小大于等于140bp。
4.根据权利要求3所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述连接组件的大小大于等于400bp。
5.根据权利要求1所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述连接组件包括接头和桥序列，所述接头和/或桥序列含有Ⅱs型限制性内切酶识别位点。
6.根据权利要求5所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤A包括以下步骤：
A1.将核酸片段与接头连接，得到含接头的核酸片段；
A2.将含接头的核酸片段与桥序列连接并环化，得到第一环行分子。
7.根据权利要求6所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头含有Ⅱs型限制性内切酶识别位点，所述步骤A1包括以下步骤：
A11.将核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段；
A12.利用Ⅱs型限制性内切酶酶切含第一接头的核酸片段，得到含第一接头的酶切产物；
A13.将含第一接头的酶切产物与第二接头连接，得到含接头的核酸片段。
8.根据权利要求7所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤A11包括以下步骤：
A111.对核酸片段进行处理，得到处理过的核酸片段；所述处理方法包括去磷酸化、末端补平、加A尾、加poly A尾中的至少一种；
A112.将处理过的核酸片段与第一接头连接，得到含第一接头的核酸片段。
9.根据权利要求6所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤A2包括以下步骤：
A21.利用特异性切割剂分别对含接头的核酸片段和桥序列进行切割，得到相对应的切割产物；
A22.利用连接酶，将相对应的切割产物连接成环，得到第一环形分子；
所述接头和桥序列均含有用于切割的识别位点；
所述特异性切割剂能够特异性的识别接头和桥序列的用于切割的识别位点，并对接头、桥序列进行切割。
10.根据权利要求1所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述连接组件含有至少2个Ⅱs限制性内切酶识别位点，所述步骤B具体为：
利用连接组件含有的Ⅱs限制性内切酶识别位点，通过相应的限制性内切酶，对第一环行分子中的核酸片段中对应的两个酶切位点进行切割，并将酶切产物与桥联组件连接成环，得到桥联环化物。
11.根据权利要求1所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤C之后还包括以下步骤：
D.利用与环形测序文库中的连接组件和/或桥联组件互补的引物，对环形测序文库进行扩增，得到线形测序文库。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的通过环化方式构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤A之前包括以下步骤：
A’.片段化源核酸，得到核酸片段。
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