CN104109709A - 用于癌症个体化诊断治疗的重要基因富集方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于癌症个体化诊断治疗的重要基因富集方法，建立中国患者常见癌症基因的组合，并根据中国患者基因突变的特性设计富集方案，达到高效靶向富集重要癌基因的目的，将2万多个基因的测序通量降低到不到200个基因，大大降低测序成本。同时，本方法加入了“基因转位”等特殊突变的富集方案，可以检测到外显子检测难以发现但对诊断治疗有重要意义的突变。

Description

用于癌症个体化诊断治疗的重要基因富集方法
技术领域
本发明涉及一种基因富集方法。
背景技术
大量证据表明，癌症是一个“基因”病，基因组DNA上不断积累的基因突变是正常细胞转变为癌细胞的主要原因。由此可见，彻底解读癌症基因组DNA“天书”，找出癌细胞与正常细胞间的差异，可能成为癌症的特异性诊断和治疗的重要基础。
随着人类基因组计划的完成和DNA测序技术的进步，系统解读癌症基因组成为可能。大量此类研究表明，貌似相同的癌症，其基因突变是高度异质性的，针对个体患者的肿瘤进行DNA测序，找出特有的基因突变，就可能选出具有针对性和特异性的治疗方案，提高治疗的效率，实现癌症的个体化治疗。早在2010年，患有胰腺肿瘤的苹果公司创始人史蒂夫·乔布斯就邀请麻省理工学院和约翰霍普金斯大学的两个研究组对他所患肿瘤进行了癌症基因组和个体化治疗研究，这可能是最早的基于癌症基因组测序的个体化治疗尝试。这类全外显子组测序涵盖了全部2万多个基因，价格昂贵。事实上，只有少数跟癌症密切相关基因的突变状态跟癌症的诊断治疗密切相关，绝大多数基因是不需要进行测序的。最近美国的PGDx公司和Foundation Medicine公司分别提出了自己的重要癌症基因清单及富集方案，用以靶向性的测定100-200个与癌症诊断治疗密切相关的基因。使用这种技术可以大大提高检测的可靠性并降低检测成本。但这些公司对癌症基因的选择及富集方案的设计主要基于美国患者人群的基因突变特点。
发明内容
本发明的用于癌症个体化诊断治疗的重要基因富集方法，建立中国患者常见癌症基因的组合，并根据中国患者基因突变的特性设计富集方案，达到高效靶向富集重要癌基因的目的，将2万多个基因的测序通量降低到不到200个基因，大大降低测序成本。同时，本方法加入了“基因转位”等特殊突变的富集方案，可以检测到外显子检测难以发现但对诊断治疗有重要意义的突变。
本发明的用于癌症个体化诊断治疗的重要基因富集方法，包括如下步骤：
制备相应的DNA探针微阵列，将包含靶向区域的DNA探针连接进入转录表达载体，并在体外表达RNA探针；
使用biotin标记的单个碱基合成RNA，使合成的RNA探针得到充分的biotin标记；
将待测DNA通过非接触式超声破碎方案破碎成300-500bp的小片段，使用分子生物学方案将小片段末端补平，加上一个“A”碱基，并与带有“T”碱基测序配体连接；
使用配体相应的扩增引物对连接产物进行扩增，获得基因组测序文库；
将测序文库在95摄氏度加热5分钟形成单链DNA，然后在65摄氏度加入上述RNA探针与DNA文库进行24小时的杂交；
然后使用能够特异性结合RNA探针上biotin标记的磁珠，在磁场作用下对DNA/RNA探针复合物进行富集和清洗，使用氢氧化钠洗脱DNA文库并进行扩增，收集靶向测序文库；
使用二代测序平台对靶向测序文库进行靶向测序，经过分析得到靶向区域的DNA序列。
本发明的用于癌症个体化诊断治疗的重要基因富集方法，通过富集方案，使用全外显子测序1.6％的测序通量(测序费用)即可达到筛查主要癌症基因的目的，同时，可以筛查出外显子测序无法检测，但对癌症诊断治疗有重要价值的基因转位型突变。
具体实施方式
本发明的用于癌症个体化诊断治疗的重要基因富集方法，包括如下步骤：
制备相应的DNA探针微阵列，将包含靶向区域的DNA探针连接进入转录表达载体，并在体外表达RNA探针；
使用biotin标记的单个碱基合成RNA，使合成的RNA探针得到充分的biotin标记；
将待测DNA通过非接触式超声破碎方案破碎成300-500bp的小片段，使用分子生物学方案将小片段末端补平，加上一个“A”碱基，并与带有“T”碱基测序配体连接；
使用配体相应的扩增引物对连接产物进行扩增，获得基因组测序文库；
将测序文库在95摄氏度加热5分钟形成单链DNA，然后在65摄氏度加入上述RNA探针与DNA文库进行24小时的杂交；
然后使用能够特异性结合RNA探针上biotin标记的磁珠，在磁场作用下对DNA/RNA探针复合物进行富集和清洗，使用氢氧化钠洗脱DNA文库并进行扩增，收集靶向测序文库；
使用二代测序平台对靶向测序文库进行靶向测序，经过分析得到靶向区域的DNA序列。
本发明的用于癌症个体化诊断治疗的重要基因富集方法，根据中国癌症患者的特点设计了特有的基因组合，包括中国癌症患者常见基因，以及与化疗药物代谢相关的基因和单苷酸多态性位点。基于这些重要区域，设计了靶向富集编码区，富集重要位点，及对基因转位进行富集的方案。共富集基因编码区154个，单苷酸多态性位点156个，基因转位19个。总测序通量仅为目前使用的全外显子测序的1.6％，即涵盖了对中国癌症患者诊断治疗有重要意义的全部基因。
依据本发明的设计，制备相应的DNA探针微阵列。将包含靶向区域的DNA探针连接进入转录表达载体，并在体外表达RNA探针。使用biotin标记的单个碱基合成RNA，是合成的RNA探针得到充分的biotin标记。获得的RNA探针即可用于与DNA文库杂交，从全基因组文库中富集出癌症个体化诊断治疗所需要的一小部分文库。这部分文库的测序所需要的费用将大大低于全基因组测序。
本发明还可有其他多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种用于癌症个体化诊断治疗的重要基因富集方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
制备相应的DNA探针微阵列，将包含靶向区域的DNA探针连接进入转录表达载体，并在体外表达RNA探针；
使用biotin标记的单个碱基合成RNA，使合成的RNA探针得到充分的biotin标记；
将待测DNA通过非接触式超声破碎方案破碎成300-500bp的小片段，使用分子生物学方案将小片段末端补平，加上一个“A”碱基，并与带有“T”碱基测序配体连接；
使用配体相应的扩增引物对连接产物进行扩增，获得基因组测序文库；
将测序文库在95摄氏度加热5分钟形成单链DNA，然后在65摄氏度加入上述RNA探针与DNA文库进行24小时的杂交；
然后使用能够特异性结合RNA探针上biotin标记的磁珠，在磁场作用下对DNA/RNA探针复合物进行富集和清洗，使用氢氧化钠洗脱DNA文库并进行扩增，收集靶向测序文库；
使用二代测序平台对靶向测序文库进行靶向测序，经过分析得到靶向区域的DNA序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中的，共富集基因编码区154个，单苷酸多态性位点156个，基因转位19个。
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