CN109722471B - 改善文库滚环复制效率均一性的方法、文库构建方法及试剂盒 - Google Patents
改善文库滚环复制效率均一性的方法、文库构建方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
一种改善文库滚环复制效率均一性的方法、文库构建方法及试剂盒，所述改善文库滚环复制效率均一性的方法包括：在文库构建的PCR扩增过程中，引入至少一种修饰的PCR引物，所述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团。本发明中的修饰基团不会影响PCR扩增的效率，但是在滚环复制过程中，在同一个体系内，能够同时降低大小片段的滚环复制效率，从而达到相同的时间内，两种片段实现相同或相近的拷贝数扩增，从而达到两种片段的信号值均一性相同。
Description
技术领域
本发明涉及文库构建技术领域，具体涉及一种改善文库滚环复制效率均一性的方法、文库构建方法及试剂盒。
背景技术
基因测序仪(例如，BGISEQ-500)采用先进的DNA纳米球(DNA nanoball,DNB)以及联合探针锚定聚合(Combinatorial Probe Anchor Synthesis,cPAS)测序核心技术，使用一种经过特殊表面修饰的规则阵列芯片，每个修饰位点仅固定一个DNA纳米球，阵列芯片修饰位点的间距均一，可保证不同纳米球的光信号不会互相干扰，从而大幅提高信号处理的准确性。通过仪器的液路系统将测序试剂和带有不同发光波长的荧光标记探针泵入测序芯片流动室，每个DNA纳米球每个测序周期只结合一种荧光标记物，再由激光器激发荧光基团发光，不同荧光基团所发射的光信号被科学级CMOS相机采集。之后规则阵列芯片上的光信号经过处理后由随机软件转换成数字信号，传输到计算机进行处理，就能获取待测样本的碱基序列信息。
由于BGISEQ-500系统采用光信号采集获取待测样本的碱基序列信息，所以信号的强弱决定测序质量的好坏。每一版的测序试剂盒说明书中提示了文库类型、片段大小范围、集中程度等。但由于客户根据自身需求安排测序，文库片段大小范围跨度大，测序结果显示文库插入片段越小，滚环复制(Rolling circle amplification,RCA)效率越高，复制得到的拷贝数越多，测序被采集到的信号越强，测序质量越好。
由于插入片段大小不同，文库构建过程中相同时间内RCA的效率不同，即在反应体系相同的情况下，相同反应时间小插入片段的RCA效率大于大插入片段的RCA效率。因而小插入片段构建的文库每个DNB的拷贝数更多，测序采集到的信号更强，小插入片段的文库测序质量比大插入片段文库更好，得到的数据量更多。因此，存在滚环复制效率不一致以及数据量不均一的问题。
发明内容
本发明提供一种改善文库滚环复制效率均一性的方法、文库构建方法及试剂盒。
根据第一方面，一种实施例中提供一种改善文库滚环复制效率均一性的方法，该方法包括：在文库构建的PCR扩增过程中，引入至少一种修饰的PCR引物，上述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团。
进一步地，上述核苷酸位点是脱氧胸苷酸位点。
进一步地，上述修饰基团选自生物素、Cy3荧光染料和地高辛中的至少一种。
根据第二方面，一种实施例中提供一种用于滚环复制反应的文库的构建方法，该方法包括：在文库构建的PCR扩增过程中，引入至少一种修饰的PCR引物，上述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团。
进一步地，上述方法包括如下步骤：
(1)对片段化的核酸进行末端修复和加A尾反应；
(2)对末端修复和加A尾反应后的产物进行接头连接反应；
(3)对接头连接反应后的产物进行PCR扩增反应，在该PCR扩增反应中，引入至少一种修饰的PCR引物，上述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团；
任选的，还包括：
(4)在上述PCR扩增反应后，对扩增产物进行单链分离和环化反应。
进一步地，上述核苷酸位点是脱氧胸苷酸位点。
进一步地，上述修饰基团选自生物素、Cy3荧光染料和地高辛中的至少一种。
根据第三方面，一种实施例中提供一种用于改善文库滚环复制效率均一性的试剂盒，该试剂盒包括：至少一种修饰的PCR引物，上述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团，上述修饰的PCR引物用作文库构建的PCR扩增过程中的引物。
进一步地，上述核苷酸位点是脱氧胸苷酸位点。
进一步地，上述修饰基团选自生物素、Cy3荧光染料和地高辛中的至少一种。
根据第四方面，一种实施例中提供一种用于构建滚环复制文库的试剂盒，该试剂盒包括：至少一种修饰的PCR引物，上述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团，上述修饰的PCR引物用作文库构建的PCR扩增过程中的引物；
任选的，上述试剂盒还包括如下至少一项：
末端修复试剂；
加A尾反应试剂；
接头序列；
PCR扩增反应试剂；
线性核酸消化酶；以及
核酸片段化酶。
进一步地，上述核苷酸位点是脱氧胸苷酸位点。
进一步地，上述修饰基团选自生物素、Cy3荧光染料和地高辛中的至少一种。
本发明在文库构建的PCR扩增过程中，引入修饰的PCR引物，其在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团，该修饰基团不会影响PCR扩增的效率，但是在滚环复制过程中，在同一个体系内，能够同时降低大小片段的滚环复制效率，从而达到相同的时间内，两种片段实现相同或相近的拷贝数扩增，从而达到两种片段的信号值均一性相同。
附图说明
图1为本发明实施例中文库构建流程示意图；
图2为本发明实施例中DNA打断检测胶图，其中DNA Marker为50bp DNA Ladder；
图3为本发明实施例中小片段化选择后检测胶图，其中DNA Marker为50bp DNALadder；
图4为本发明实施例中大片段化选择后检测胶图，其中DNA Marker为50bp DNALadder；
图5为本发明实施例中小片段PCR扩增后检测胶图，其中DNA Marker为50bp DNALadder；
图6为本发明实施例中大片段PCR扩增后检测胶图，其中DNA Marker为50bp DNALadder；
图7为本发明实施例中大小片段的文库均使用未修饰的PCR引物得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图8为本发明实施例中大片段的文库使用未修饰的PCR引物、小片段文库使用的PCR引物为第9位的T进行生物素修饰(Biotin-dT)的PCR引物得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图9为本发明实施例中大片段的文库使用未修饰的PCR引物、小片段文库使用的PCR引物为第9位的T进行Cy3荧光染料修饰(Cy3-dT)的PCR引物得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图10为本发明实施例中大片段的文库使用未修饰的PCR引物、小片段文库使用的PCR引物为第9位的T进行地高辛修饰(Dig-dT)的PCR引物得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图11为本发明实施例中大片段的文库使用未修饰的PCR引物、小片段文库使用的PCR引物为第13位的T进行生物素修饰(Biotin-dT)的PCR引物得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图12为本发明实施例中大片段的文库使用未修饰的PCR引物、小片段文库使用的PCR引物为第13位的T进行Cy3荧光染料修饰(Cy3-dT)的PCR引物得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图13为本发明实施例中大片段的文库使用未修饰的PCR引物、小片段文库使用的PCR引物为第13位的T进行地高辛修饰(Dig-dT)的PCR引物得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图14为本发明实施例中大小片段文库构建均使用的PCR引物为第9位的T进行生物素修饰(Biotin-dT)得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图15为本发明实施例中大小片段文库构建均使用的PCR引物为第9位的T进行Cy3荧光染料修饰(Cy3-dT)得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图16为本发明实施例中大小片段文库构建均使用的PCR引物为第9位的T进行地高辛修饰(Dig-dT)得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图17为本发明实施例中大小片段文库构建均使用的PCR引物为第13位的T进行生物素修饰(Biotin-dT)得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图18为本发明实施例中大小片段文库构建均使用的PCR引物为第13位的T进行Cy3荧光染料修饰(Cy3-dT)得到的每个循环的荧光信号变化曲线图；
图19为本发明实施例中大小片段文库构建均使用的PCR引物为第13位的T进行地高辛修饰(Dig-dT)得到的每个循环的荧光信号变化曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
本发明一种实施例中提供一种改善文库滚环复制效率均一性的方法，该方法包括：在文库构建的PCR扩增过程中，引入至少一种修饰的PCR引物，上述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团。
本发明所称的“滚环复制效率均一性”是指大片段和小片段之间的滚环复制效率趋向一致的表现。
本发明所称的“修饰的PCR引物”特指具有用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团的引物。该修饰基团修饰的核苷酸没有特别限制，理论上可以是任何核苷酸，包括脱氧腺苷酸(dAMP)、脱氧鸟苷酸(dGMP)、脱氧胞苷酸(dCMP)和脱氧胸苷酸(dTMP)等。在本发明的一个优选的实施例中，核苷酸位点是脱氧胸苷酸位点，原因是其碱基的结构简单，修饰步骤简单，且修饰价格便宜。
需要说明的是，所称的“修饰的PCR引物”在文库构建的PCR扩增过程中的用量和比例没有特别限制，可以是任何适合PCR扩增的用量，并且可以只使用本发明的修饰的PCR引物作为PCR扩增引物，也可以含有其他常规(例如未修饰的)引物，根据具体需要以及欲达到的效果，修饰的PCR引物与常规引物可以以适当的比例组合使用。在本发明的一个优选的实施例中，只使用本发明的修饰的PCR引物作为PCR扩增引物。
本发明所称的“修饰基团”并不局限于某一类化学基团，发明人已经证实，好几类性质完全不同的化学基团都能取得减缓滚环复制反应速度的效果，例如生物素(Biotin)、Cy3荧光染料和地高辛(Dig)等。因此，在本发明的一个优选的实施例中，修饰基团选自生物素、Cy3荧光染料和地高辛中的至少一种。
需要说明的是，本发明中除了PCR引物带有修饰基团以外，PCR扩增过程中的其它反应液组分以及具体的反应条件，可以与现有的文库构建试剂盒相同。
本发明一种实施例中提供一种用于滚环复制反应的文库的构建方法，该方法包括：在文库构建的PCR扩增过程中，引入至少一种修饰的PCR引物，上述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团。】
如图1所示，本发明一个实施例中，文库构建流程包括：DNA打断、片段选择；末端修复和加A尾；接头连接和PCR扩增；单链分离和环化。
本发明的修饰的PCR引物用于PCR扩增过程中，因此，在本发明的一个优选的实施例中，一种用于滚环复制反应的文库的构建方法如下步骤：
(1)对片段化的核酸进行末端修复和加A尾反应；
(2)对末端修复和加A尾反应后的产物进行接头连接反应；
(3)对接头连接反应后的产物进行PCR扩增反应，在该PCR扩增反应中，引入至少一种修饰的PCR引物，上述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团；
任选的，还包括：
(4)在上述PCR扩增反应后，对扩增产物进行单链分离和环化反应。
本发明的修饰的PCR引物通过PCR扩增的方式引入扩增产物，并进一步形成DNA环状模板，在RCA过程中，每当扩增反应到达修饰基团的位置，扩增反应速度即会被减缓。例如，当加入常规PCR引物时，相同时间内，小片段文库RCA扩增3倍时，大片段文库扩增1.5倍；当加入本发明修饰的PCR引物时，相同时间内，小片段文库RCA扩增3倍时，大片段文库扩增2.3倍。随着时间延长，大小片段的文库的RCA效率，在加入本发明修饰的PCR引物后，基本一致或越来越接近，使得得到的拷贝数越接近，测序收集到的信号强度越一致。
本发明一种实施例中提供一种用于改善文库滚环复制效率均一性的试剂盒，该试剂盒包括：至少一种修饰的PCR引物，上述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团，上述修饰的PCR引物用作文库构建的PCR扩增过程中的引物。
此外，本发明一种实施例中提供一种用于构建滚环复制文库的试剂盒，该试剂盒包括：至少一种修饰的PCR引物，上述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团，上述修饰的PCR引物用作文库构建的PCR扩增过程中的引物。
本发明实施例的试剂盒还可以包括如下至少一项：
末端修复试剂，例如末端修复缓冲液和末端修复酶混合物(例如T4多核苷酸激酶、Klenow片段、T4DNA聚合酶等)等；加A尾反应试剂，例如dATP、dATP缓冲液和Taq DNA聚合酶等；接头序列，包括两条单链核苷酸序列，能够退火形成双链接头；PCR扩增反应试剂，例如PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+等；线性核酸消化酶，例如核酸外切酶I和核酸外切酶III等；以及核酸片段化酶，例如Tn5转座酶等，用于核酸片段化处理。
本发明的方法和试剂盒适用于基于滚环复制的测序平台，包括但不限于CG(Complete Genomics)测序平台、BGISEQ-500测序平台等。
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案和效果，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例：在BGISEQ-500测序平台上进行核酸测序
采用MGIEasy DNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)，以大肠杆菌标准菌株(ATCC8739)为原料提取DNA制备用于测序的文库。采用BGISEQ-500高通量测序试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)进行测序。采用生工生物工程(上海)股份有限公司合成的引物。
首先，按照MGIEasy DNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)说明书，以大肠杆菌标准菌株(ATCC8739)为原料提取基因组DNA制备用于测序的26个文库(流程见图1)，打断、磁珠片段筛选(大片段文库选择350bp大小的片段，小片段文库选择250bp大小的片段)、末端修复、接头连接、连接产物纯化、PCR、环化。
(1)基因组DNA打断，打断后DNA片段检测
图2示出了本实施例中DNA打断检测胶图，其中DNA Marker为50bp DNA Ladder。结果显示，打断的DNA呈弥散状，在目标大小范围内(图中方框内部分)有明显的弥散带。
(2)DNA片段化选择
其中13个大片段文库，片段大小约为350bp，13个小片段文库，片段大小约为250bp。
图3示出了本实施例中小片段化选择后检测胶图，其中DNA Marker为50bp DNALadder。结果显示，片段化选择后DNA集中在选择的大小范围内(图中方框内部分)。
图4示出了本实施例中大片段化选择后检测胶图，其中DNA Marker为50bp DNALadder。结果显示，片段化选择后DNA集中在选择的大小范围内(图中方框内部分)。
(3)样本均一化、末端修复和加A尾
按照试剂盒说明书进行。
(4)接头连接
按照试剂盒说明书进行。
(5)PCR扩增
按照试剂盒说明书进行。利用PCR上游引物(SEQ ID NO：1至7中任意一个)和下游引物(SEQ ID NO：8)进行PCR扩增。引物序列具体如下：
/5Phos/GAACGACATGGCTACGA-3'(SEQ ID NO：1)；
/5Phos/GAACGACA(T-biotin)GGCTACGA-3'(SEQ ID NO：2)；
/5Phos/GAACGACA(T-Cy3)GGCTACGA-3'(SEQ ID NO：3)；
/5Phos/GAACGACA(T-Dig)GGCTACGA-3'(SEQ ID NO：4)；
/5Phos/GAACGACATGGC(T-biotin)ACGA-3'(SEQ ID NO：5)；
/5Phos/GAACGACATGGC(T-Cy3)ACGA-3'(SEQ ID NO：6)
/5Phos/GAACGACATGGC(T-Dig)ACGA-3'(SEQ ID NO：7)
5'-TGTGAGCCAAGGAGTTG-3'(SEQ ID NO：8)。
其中，
对照组：大片段文库和小片段文库均使用未经修饰的第一类引物(SEQ ID NO：1)作为上游引物；
实验组1-6：大片段文库使用未经修饰的第一类引物(SEQ ID NO：1)作为上游引物，小片段文库使用经修饰的第二类引物(依次是SEQ ID NO：2至7)作为上游引物；
实验组7-12：大小片段文库均使用相同的经修饰的第二类引物(依次是SEQ IDNO：2至7)作为上游引物。
所有对照组和实验组下游引物均使用SEQ ID NO：8。
对照组和实验组的上游引物使用情况具体如表1所示。
表1
| 组别 | 大片段文库上游引物 | 小片段文库上游引物 |
| 对照组 | SEQ ID NO：1 | SEQ ID NO：1 |
| 实验组1 | SEQ ID NO：1 | SEQ ID NO：2 |
| 实验组2 | SEQ ID NO：1 | SEQ ID NO：3 |
| 实验组3 | SEQ ID NO：1 | SEQ ID NO：4 |
| 实验组4 | SEQ ID NO：1 | SEQ ID NO：5 |
| 实验组5 | SEQ ID NO：1 | SEQ ID NO：6 |
| 实验组6 | SEQ ID NO：1 | SEQ ID NO：7 |
| 实验组7 | SEQ ID NO：2 | SEQ ID NO：2 |
| 实验组8 | SEQ ID NO：3 | SEQ ID NO：3 |
| 实验组9 | SEQ ID NO：4 | SEQ ID NO：4 |
| 实验组10 | SEQ ID NO：5 | SEQ ID NO：5 |
| 实验组11 | SEQ ID NO：6 | SEQ ID NO：6 |
| 实验组12 | SEQ ID NO：7 | SEQ ID NO：7 |
(6)电泳检测
图5示出了本实施例中小片段PCR扩增后检测胶图，其中DNA Marker为50bp DNALadder。结果显示，PCR扩增后，DNA集中在目标大小范围内。
图6为本发明实施例中大片段PCR扩增后检测胶图，其中DNA Marker为50bp DNALadder。结果显示，PCR扩增后，DNA集中在目标大小范围内。
(7)PCR产物纯化、均一化、环化、酶切消化、消化产物纯化、定量
根据BGISEQ-500高通量测序试剂盒说明书，制备DNB并加载到测序芯片上，利用BGISEQ-500平台进行SE50的测序，大小片段文库均使用第一类未修饰的PCR引物构建的文库作为对照组，结果如图7所示；大片段文库使用第一类未修饰的引物，小片段使用第二类经修饰的引物的实验组结果如图8、如图9、图10、图11、图12、图13所示；大小片段文库均使用第二类经修饰的PCR引物建库的实验组结果如图14、图15、图16、图17、图18、图19所示，分别统计分析两组试验中每个循环的荧光信号变化曲线。
如图7所示，示出了大小片段的文库均使用第一类PCR引物得到的每个循环的荧光信号变化曲线，图中，横坐标是测序读长，纵坐标是测序信号，“○”为小片段文库的信号的曲线，“▲”为大片段文库的曲线。结果显示，随着测序循环的增加，测序的信号慢慢降低，大片段文库的荧光信号比小片段文库的荧光信号要弱，说明相同条件下小片段文库的RCA效率充分。
如图8、如图9、图10、图11、图12、图13所示，示出了大片段的文库均使用第一类未修饰的PCR引物，小片段文库使用第二类经修饰的测序引物得到的每个循环的荧光信号变化曲线，图中，横坐标是测序读长，纵坐标是测序信号，“○”为小片段文库的信号的曲线，“▲”为大片段文库的曲线。结果显示，随着测序循环的增加，测序的信号慢慢降低，大片段文库的荧光信号比小片段文库的荧光信号要弱，说明相同条件下小片段文库的RCA效率充分，但与图7比较，两种文库的差距变小。
如图14、图15、图16、图17、图18、图19所示，大小片段均使用第二类经修饰的PCR引物，得到的每个循环的荧光信号变化曲线，横坐标是测序读长，纵坐标是测序信号，“○”为小片段文库的信号的曲线，“▲”为大片段文库的曲线。结果显示，随着测序循环的增加，测序的信号慢慢降低，大片段文库的荧光信号与小片段文库的荧光信号基本一致，说明相同条件下大小片段文库的RCA效率基本一致。两种文库的信号值差异比图7小，说明第二类引物修饰的文库符合预期的效果。
可见，在PCR反应液中添加本发明的修饰的PCR引物，能够有效地改善大小片段文库的RCA效率不一致的问题。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 改善文库滚环复制效率均一性的方法、文库构建方法及试剂盒
<130> 17I25127
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222>
<400> 1
gaacgacatg gctacga 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222>
<220>
<221> 生物素修饰
<222> (9)
<400> 2
gaacgacatg gctacga 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222>
<220>
<221> Cy3修饰
<222> (9)
<400> 3
gaacgacatg gctacga 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222>
<220>
<221> Dig修饰
<222> (9)
<400> 4
gaacgacatg gctacga 17
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222>
<220>
<221> 生物素修饰
<222> (13)
<400> 5
gaacgacatg gctacga 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222>
<220>
<221> Cy3修饰
<222> (13)
<400> 6
gaacgacatg gctacga 17
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222>
<220>
<221> Dig修饰
<222> (13)
<400> 7
gaacgacatg gctacga 17
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222>
<400> 8
tgtgagccaa ggagttg 17
Claims (15)
1.一种改善文库滚环复制效率均一性的方法，所述滚环复制效率均一性是指大片段和小片段之间的滚环复制效率趋向一致的表现，其特征在于，所述方法包括：在文库构建的PCR扩增过程中，引入至少一种修饰的PCR引物，所述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸位点是脱氧胸苷酸位点。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述修饰基团选自生物素、Cy3荧光染料和地高辛中的至少一种。
4.一种用于滚环复制反应的文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括：在文库构建的PCR扩增过程中，引入至少一种修饰的PCR引物，所述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)对片段化的核酸进行末端修复和加A尾反应；
(2)对末端修复和加A尾反应后的产物进行接头连接反应；
(3)对接头连接反应后的产物进行PCR扩增反应，在该PCR扩增反应中，引入至少一种修饰的PCR引物，所述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
(4)在所述PCR扩增反应后，对扩增产物进行单链分离和环化反应。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述核苷酸位点是脱氧胸苷酸位点。
8.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述修饰基团选自生物素、Cy3荧光染料和地高辛中的至少一种。
9.一种用于改善文库滚环复制效率均一性的试剂盒，所述滚环复制效率均一性是指大片段和小片段之间的滚环复制效率趋向一致的表现，其特征在于，所述试剂盒包括：至少一种修饰的PCR引物，所述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团，所述修饰的PCR引物用作文库构建的PCR扩增过程中的引物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述核苷酸位点是脱氧胸苷酸位点。
11.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述修饰基团选自生物素、Cy3荧光染料和地高辛中的至少一种。
12.一种用于构建滚环复制文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：至少一种修饰的PCR引物，所述修饰的PCR引物在至少一个核苷酸位点上具有至少一个用于减缓滚环复制反应速度的修饰基团，所述修饰的PCR引物用作文库构建的PCR扩增过程中的引物。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下至少一项：
末端修复试剂；
加A尾反应试剂；
接头序列；
PCR扩增反应试剂；
线性核酸消化酶；以及
核酸片段化酶。
14.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述核苷酸位点是脱氧胸苷酸位点。
15.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述修饰基团选自生物素、Cy3荧光染料和地高辛中的至少一种。
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|---|---|---|---|---|
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| CN105624272A (zh) * | 2014-10-29 | 2016-06-01 | 深圳华大基因科技有限公司 | 基因组预定区域核酸测序文库的构建方法及装置 |
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| "Construction and Characterization of a Large-Fragment Chicken Bacterial Artificial Chromosome Library";Regis Zimmer et al.;《GENOMICS》;19971231;第42卷;第217-226页 * |
| "一种高效扩增小片段DNA方法的建立";李岩等;《首都医科大学学报》;20110228;第32卷(第1期);第121-124页 * |
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