CN116536409A - 一种兼容宽范围ChIP DNA投入量的三维基因组检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种兼容宽范围ChIP DNA投入量的三维基因组检测方法，通过片段化酶的单次酶切反应可以将一定范围内不同投入量的ChIP DNA打断，再在打断的ChIP DNA末端连接测序接头，并通过生物素富集来捕获三维相互作用的ChIP DNA片段，再进行扩增、筛选，可获得良好的文库，可通过如高通量二代测序仪等测序分析获得三维基因组相互作用模式。由于单个样本的ChIP DNA产量通常在片段化酶兼容的投入量范围之内，该方法仅需单次酶切反应即可完成单个样本所有ChIP DNA的打断处理，降低酶切反应的次数和实验成本，数据质量优异。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于ChIP DNA的三维基因组检测方法。
背景技术
真核生物染色质在细胞核中呈现高度折叠状态，其折叠的空间结构与基因表达有密切联系。因而，以染色质空间结构及其功能为核心的三维基因组学，正逐渐成为了解细胞生命活动、个体发育和疾病发生机制的新突破口。
基于配对末端标签测序的染色质互作分析技术(chromatin interactionanalysis using paired-end tag sequencing，ChIA-PET)整合了染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)和染色质构象捕获技术，可以捕获发生染色质互作的ChIP DNA，进而在全基因组范围内鉴定特定蛋白质介导的染色质相互作用，是三维基因组学研究的经典检测方法。近年来，in situ ChIA-PET通过在细胞核原位进行染色质切割和连接反应，大幅提高了三维基因组互作模式的捕获效率，但是实验难度和成本仍然较高，这主要体现在后期文库处理部分。
目前在后期处理过程中，in situ ChIA-PET采用转座酶对捕获的ChIP DNA进行酶切打断建库。目前单次转座酶反应只能完成特定投入量(譬如50ng)的DNA的打断处理。然而，不同细胞类型、数量，以及识别不同抗原的抗体使用，均会影响ChIP DNA的产量，其范围从几纳克到数百纳克不等。在单次转座酶反应中，DNA投入量不够或者过高常常导致建库失败。现今in situ ChIA-PET实验后期经常需要多次转座酶的酶切反应才能将一部分ChIPDNA打断，同时还可能剩余一部分不够反应所需最低投入量的ChIP DNA。该种后期处理方法未能充分利用单个样本所有ChIP DNA，增加了实验次数、操作难度和试剂耗材成本。为了提升ChIA-PET应用性，有必要开发一种兼容宽范围ChIP DNA投入量的易操作、低成本的后期处理方法。
发明内容
本发明人研究发现，对于已通过前期处理获得样本的所有ChIP DNA，通过单次酶切反应可以一次性将ChIP DNA打断，再在DNA末端连接测序接头，并通过生物素富集来捕获三维相互作用的DNA区域，再进行扩增、筛选，可获得良好的文库，可通过如高通量二代测序仪等测序分析获得三维基因组相互作用模式，从而完成本发明。本发明兼容宽范围的ChIPDNA投入量，仅需一次酶切反应即可完成单个样本所有ChIP DNA的打断处理，降低酶切反应的次数和实验成本，数据质量优异。
本发明的目的提供一种兼容宽范围ChIP DNA投入量的三维基因组检测方法，该方法采用片段化酶对in situ ChIA-PET前期处理所获的ChIP DNA进行一次性酶切反应，以将单个样本所有ChIP DNA进行一次性打断。
在本发明中，所述“in situ ChIA-PET”是指基于配对末端标签测序的染色质相互作用分析技术(chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing)的一种方式，即基于配对末端标签测序的原位染色质相互作用分析。
所述“in situ ChIA-PET前期处理所获的ChIP DNA”，是指通过常规in situChIA-PET前期处理如细胞交联、细胞裂解、限制性酶切、染色质加尾与连接、和染色质免疫共沉淀等过程(如图1所示)获得的ChIP DNA。
在本发明中，片段化酶与单个样本所产生总ChIP DNA的反应为一次性，不需要进行多次反应来完成所有ChIP DNA的片段化过程，从而大幅简化操作。
在本发明中，优选片段化酶FEA Enzyme Mix(诺唯赞)、Smearase(翌圣)、KAPAFrag Enzyme(KAPA)、NEBNext dsDNA Fragmentase(NEB)、NEBNext Ultra II FS EnzymeMix(NEB)、以及其他含有非特异性核酸酶成分的片段化酶，更优选片段化酶FEA EnzymeMix(诺唯赞)、Smearase(翌圣)、KAPA Frag Enzyme(KAPA)、NEBNext dsDNA Fragmentase(NEB)、或NEBNext Ultra II FS Enzyme Mix(NEB)。
在本发明的优选实施方式中，片段化酶投入量为2～10μL，in situ ChIA-PET前期处理所获的ChIP DNA的投加量范围为0.1～1000ng。本发明更优选的实施方式中，片段化酶的投入量为10μL，in situ ChIA-PET前期处理所获的ChIP DNA的投加量范围为1～100ng。
在本发明的优选实施方式中，所述片段化酶进行酶切反应的过程包括：25～37℃温度下反应2～30min，然后65～72℃温度下反应10～30分钟，最后在4～10℃温度下反应5～10分钟。本发明更优选的实施方式中，所述片段化酶混合物酶切反应的过程包括：37℃温度下反应2～6min，然后65℃温度下反应10分钟，最后在4℃温度下反应5分钟。
通过上述片段化酶适宜/兼容的反应温度和反应时间，将in situ ChIA-PET前期处理所获的ChIP DNA一次性打断。在通过片段化酶将in situ ChIA-PET前期处理所获的ChIP DNA打断成小片段后，在DNA末端连接上测序接头。对此没有特别限定，可以使用本领域常用的测序接头，通过常规桥接反应连接测序接头。
在本发明中，亲和素偶联的磁珠进行生物素富集反应，以捕获含有生物素标记的发生三维互作的ChIP DNA。
在本发明中，术语“三维互作”与“三维相互作用”含义相同。
对于通过生物素富集捕获的目标DNA片段，进行文库扩增。对于扩增方式，没有特别限定，可以使用常用扩增方式、手段或方法。
在本发明的优选实施方式中，文库扩增后DNA片段长度分布在200～1000bp之间。
进一步优选地，采用BluePippin及/或DNA提取磁珠对文库扩增产物进行片段筛选，片段范围在280～580bp，以及二代测序所兼容的其它片段范围，以便采用二代测序仪对片段筛选的文库扩增产物进行测序。
本发明的另一目的在于提供一种适用于宽范围ChIP DNA投入量的in situ ChIA-PET后期文库处理方法，该方法采用片段化酶对in situ ChIA-PET前期处理所获的ChIPDNA进行一次性打断，以生成小片段DNA。
在本申请中，以简称“Frag-ChIA-PET”指代本发明的兼容宽范围ChIP DNA投入量的三维基因组检测方法、或者本发明的适用于宽范围ChIP DNA投入量的in situ ChIA-PET后期文库处理方法。
本发明方法具有以下特点/优点：
(1)采用片段化酶，通过单次反应即可完成in situ ChIA-PET单个样本所有ChIPDNA的打断处理，然后进行生物素富集、测序接头的添加、文库扩增、片段筛选和测序分析，以检测蛋白质介导的三维基因组结构信息；
(2)与in situ ChIA-PET后期处理需要多次转座酶反应相比，本发明仅需单次片段化酶的酶切打断反应，可满足宽范围投入量ChIP DNA的建库需求。不需要根据不同ChIPDNA投入量来选配多种规格的酶及其相关试剂耗材，仅需单个规格的片段化酶及其相关试剂耗材，避免了实验耗材的浪费，降低了ChIA-PET后期处理的实验操作难度和成本。
(3)与in situ ChIA-PET后期处理会剩余一部分不满足转座酶最低反应所需投入量的ChIP DNA相比，本发明可以充分利用单个样本产出的所有ChIP DNA，尤其是针对少量珍贵样本；
(4)本发明在降低实验操作难度以及成本同时，仍然保留了与in situ ChIA-PET基本一致的数据质量，在个别指标上甚至表现更优。
附图说明
图1示出本发明方法流程图；
图2示出本发明实施例1中在文库扩增以及片段化筛选阶段DNA长度的分布；
图3示出本发明实施例1中的Frag-ChIA-PET测序数据的统计结果；
图4示出本发明实施例1中Frag-ChIA-PET测序数据的可视化结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
实施例1
1.1概述：
(1)为说明宽范围内不同ChIP DNA投入量对文库构建的影响，在人白血病细胞系K562中，分别采用1ng、10ng和100ng的RNA聚合酶II(RNAPII)靶向的ChIP DNA构建本发明Frag-ChIA-PET文库，并进行比较。
(2)为说明本发明Frag-ChIA-PET的数据质量，在K562细胞中，采用150ng的RNAPII靶向ChIP DNA构建in situ ChIA-PET文库，并与上述文库数据进行比较。
(3)为说明本发明Frag-ChIA-PET对于不同抗原应用的可移植性，在K562细胞中，分别采用5.5ng和7.8ng的组蛋白H3K4me3靶向的ChIP DNA构建本发明文库，并进行文库质量比较。
1.2试验过程
1.2.1前期处理
(1)细胞交联：
采用1％甲醛对人白血病细胞系K562进行室温20分钟交联，再经过0.2M的甘氨酸中和以及1×dPBS洗涤之后，再采用1.5mM的Ethylene glycol-bis(succinic acid N-hydroxysuccinimide ester)进行室温45分钟的第二次交联，以充分固定细胞核中的染色质。
(2)细胞裂解：
取2～4×106交联的K562细胞样本，首先使用100μL 0.1％SDS在4℃反应1小时；然后更换为100μL 0.55％ SDS，分别在室温反应10分钟，在62℃反应10分钟，在37℃反应10分钟。最后使用270μL的无核酶的水以及50μL 10％ Triton X-100来中和细胞裂解液。
(3)限制性酶切：
在上述细胞中和液里加入50μL的10×CutSmart buffer(NEB)，混匀之后再加入30μL 10U/μL的限制性内切酶Alu I(NEB)，在37℃环境下进行过夜反应，进而在细胞核原位对染色质进行充分切割，暴露染色质平头断端。
(4)染色质加尾与连接反应
在酶切之后的细胞中，加入4μL的10x CutSmart buffer(NEB)、12μL 20mg/mL的BSA(Takara)、12μL 10mM的dATP(NEB)，以及12μL 5U/μL的Klenow(3'→5'exo-)(NEB)，在室温反应1小时，以在染色质平头断端添加A尾。随后，添加200μL的5×quick ligase buffer(NEB)、260μL无核酶的水、3μL 200ng/μL生物素标记的bridge linker，以及11μL 400U/μL的T4 DNA ligase(NEB)，在16℃进行过夜反应，进而在细胞核原位进行染色质断端的连接。
(5)染色质免疫共沉淀(ChIP)
采用超声破碎仪将连接之后的染色质进行破碎处理，采用偶联了protein A及/或protein G的磁珠与RNAPII或者组蛋白H3K4me3抗体孵育，将结合有抗体的磁珠与破碎处理后的染色质进行染色质免疫共沉淀反应，获得RNAPII或者H3K4me3靶向的ChIP DNA。
1.2.2后期处理
1.2.2-1传统in situ ChIA-PET的后期处理
针对150ng投入量的RNAPII靶向的ChIP DNA进行传统in situ ChIA-PET的后期处理。
具体而言，在每次转座酶的酶切反应中，取50ng纯化后的ChIP DNA，加入无核酶的水补足到35μL，然后分别加入10μL缓冲液5x TTBL(诺唯赞)和5μL转座酶TTE Mix V50(诺唯赞)，混匀之后进行酶切反应。反应时间为55℃10分钟。
为充分进行ChIP DNA的打断反应，需要进行3次50ng DNA投入量规格的转座酶(诺唯赞)切割反应，消耗3次反应的试剂耗材，然后再进行后续DNA建库、测序和分析流程。
如果单个样本ChIP DNA投入量不够Tn5转座酶反应所需最低50ng的投入量，则将无法进行正常建库，导致原始ChIP DNA材料的浪费。
1.2.2-2本发明Frag-ChIA-PET后期处理
(1)一次性片段化酶反应
提取前期处理所获得的ChIP DNA，然后对不同投入量以及不同抗体来源的ChIPDNA进行片段化酶的一次性打断反应。
具体而言，取纯化后的单个样本的所有ChIP DNA，加入无核酶的水补足到35μL，然后分别加入5μL缓冲液FEA Buffer(诺唯赞)和10μL片段化酶FEA Enzyme Mix(诺唯赞)，混匀之后进行片段化反应。反应参数依次为37℃2～6分钟、65℃30分钟，以及4℃5分钟。
如图2所示，本实例中1ng、10ng和100ng的RNAPII靶向的ChIP DNA，以及5.8ng和7.7ng的H3K4me3靶向的ChIP DNA的片段化酶反应均为一次反应。
(2)连接测序接头
在上述50μL反应产物中，依次加入如下连接反应所需试剂：15μL无核酶水、25μLRapid ligation buffer 3(诺唯赞)、5μL DNA adapter(诺唯赞)，以及5μL Rapid DNAligase(诺唯赞)。混匀之后进行反应，参数依次为20℃15分钟和4℃5分钟。
(3)生物素富集
采用Zymo Genomic DNA Clean&Concentrators试剂盒提取上述片段化和添加了测序接头的ChIP DNA。
所得DNA产物包含有生物素标记的形成了三维互作的DNA，以及不含生物素的未形成三维互作的DNA。因此，需要进一步采用偶联了亲和素的磁珠来富集生物素标记的目标DNA。
接下来，对于每个样本取30μL链霉素亲和素偶联的磁珠进行预处理。首先采用含有2M NaCl、0.5mM EDTA和5mM Tris-HCl的缓冲液洗涤磁珠，使用I-block室温处理1小时，以封闭非特异性大分子结合位点。然后采用含有1M NaCl、0.5mM EDTA和5mM Tris-HCl的缓冲液洗涤，采用不含生物素的基因组DNA片段室温处理1小时，以封闭潜在的非特异性核酸结合位点。然后用2M NaCl、0.5mM EDTA和5mM Tris-HCl的缓冲液按体积比1:1稀释纯化的DNA产物，将该稀释液加入到预处理的磁珠中，室温结合1小时。然后依次采用含有2×SSC和0.5％SDS的洗涤液和含有1M NaCl、0.5mM EDTA和5mM Tris-HCl的缓冲液进行清洗，最后将结合了生物素标记的目标DNA的磁珠重悬于20μL无核酶的水或者EB缓冲液中。
(4)文库扩增
取上述20μL结合了生物素标记的目标DNA的磁珠转入0.2mL无核酶的EP管，然后依次加入5μL PCR Primer Mix 3(诺唯赞)和25μL VAHTS HiFi Amplification Mix(诺唯赞)。混匀之后进行如下文库扩增反应：在95℃单次反应3分钟，在98℃20秒、60℃15秒和72℃30秒进行多轮循环反应，在72℃单次反应5分钟，在4度单次反应5分钟。
其中：对于1ng、10ng和100ng的RNAPII靶向的ChIP DNA文库分别进行了18、17和19轮循环反应；对5.8ng和7.7ng的H3K4me3靶向的ChIP DNA文库进行17轮循环反应。
采用AMPure XP DNA提取磁珠(Beckman)提取文库DNA。最后采用Agilent 2100检测扩增文库的片段分布。
如图2a所示，上述不同投入量以及不同抗原靶向的ChIP DNA文库扩增长度大部分集中于200-1000bp范围之内，符合二代测序所需。
(5)片段筛选
为进一步获得高质量测序数据，采用BluePippin对扩增后的文库进行片段化筛选。
选取2％ Agrarose Gel Cassette预制胶盒以及V1内参marker，片段筛选参数为280～580bp。采用Agilent 2100对筛选的DNA片段进行长度检测。
如图2b所示，最终DNA片段均分布在筛选参数的范围之类，符合上机测序要求。
(6)测序分析
采用二代测序仪如Illumina公司的Hiseq X Ten进行双端150bp的测序，采用ChIA-PIPE进行数据分析，采用Basic browser进行结果的可视化展示。
如图3所示：
①RNAPII靶向的1ng、10ng和100ng ChIP DNA的Frag-ChIA-PET文库含bridgelinker的reads比例(Fraction_read_pairs_with_linker)均大于90％，略高于RNAPII靶向的100ng ChIP DNA的in situ ChIA-PET文库(88％)，说明Frag-ChIA-PET的三维互作DNA片段的捕获率高。
②Frag-ChIA-PET的染色质内部与之间互作配对标签(PET)或者簇(cluster)的比例均大于1，与in situ ChIA-PET的结果保持一致，说明最终可用的有效数据高。
另外，为说明本发明的可移植性，对组蛋白H3K4me3靶向的5.5ng和7.8ng ChIPDNA进行了Frag-ChIA-PET文库构建。
统计结果表明，H3K4me3靶向的Frag-ChIA-PET文库同样具有较高的含bridgelinker的reads比例，以及染色质内部与之间互作的比例。从统计结果来看，Frag-ChIA-PET对宽范围投入量的ChIP DNA构建的文库质量与in situ ChIA-PET保持一致，甚至更优，而且本实施例证明该方法可以移植到于不同抗原来源的ChIP DNA的ChIA-PET文库构建。
如图4所示，从可视化结果来看，RNAPII和H3K4me3靶向的Frag-ChIA-PET文库均可检测到明显染色质互作模式，且在相同基因组区域的互作模式较为一致，进一步说明文库产生数据可视化质量好。其中高投入量ChIP DNA的文库具有更为丰富的基因组可视化细节，进一步证明充分利用单个样本所有ChIP DNA进行后续建库的必要性。
以上结合具体实施方式和范例性实例以及附图对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种兼容宽范围ChIP DNA投入量的三维基因组检测方法，该方法采用片段化酶对insitu ChIA-PET前期处理所获的ChIP DNA进行单次酶切反应，可以一次性完成单个样本所有ChIP DNA的打断处理。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述片段化酶选自FEA Enzyme Mix、Smearase、KAPAFrag Enzyme、NEBNext dsDNA Fragmentase、NEBNext UltraIIFS Enzyme Mix，以及其他含有非特异性核酸酶成分的片段化酶。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述片段化酶进行酶切反应的过程包括：25～37℃温度下反应2～30min，然后65～72℃温度下反应10～30分钟，最后在4～10℃温度下反应5～10分钟。
4.如权利要求1所述的方法，其中，片段化酶投入量为2～10μL，in situ ChIA-PET前期处理所获的ChIP DNA的投加量范围为0.1～1000ng。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述in situ ChIA-PET前期处理所获的ChIP DNA通过细胞交联、细胞裂解、限制性酶切、染色质加尾与连接、和染色质免疫共沉淀过程获得。
6.如权利要求1所述的方法，其中，在打断ChIP DNA后还包括以下步骤：
(2)在打断后的ChIP DNA末端连接上测序接头；
(3)采用亲和素偶联的磁珠进行生物素富集反应，以捕获含有生物素标记的三维互作DNA。
7.如权利要求6所述的方法，还包括以下步骤：
(4)对目标DNA进行文库扩增；
(5)选取文库中合适长度范围的扩增产物；
(6)通过高通量二代测序仪获取文库序列信息，并通过生物信息分析获得三维基因组互作模式。
8.如权利要求7所述的方法，其中，文库扩增后DNA片段长度主要分布在200～1000bp之间。
9.如权利要求7所述的方法，其中，采用BluePippin及/或DNA提取磁珠对文库扩增产物进行片段筛选，片段范围在280～580bp，以及二代测序所兼容的其它片段范围。
10.一种适用于宽范围ChIP DNA投入量的in situ ChIA-PET后期文库处理方法，其包括权利要求1-9中任一项所述的步骤。
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