CN114854642B

CN114854642B - 一种苜蓿内生戊糖片球菌el5及其应用

Info

Publication number: CN114854642B
Application number: CN202210614489.6A
Authority: CN
Inventors: 倪奎奎; 周鸿章; 杨富裕
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-05-30
Filing date: 2022-05-30
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2042-05-30
Also published as: CN114854642A; US20230380454A1

Abstract

本发明涉及一种戊糖片球菌及其应用，该戊糖片球菌是保藏编号为CGMCC No.23923的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)EL5。本发明一实施方式的戊糖片球菌EL5，用于青贮饲料，能够提高乳酸菌的活性并改善青贮发酵的品质。

Description

一种苜蓿内生戊糖片球菌EL5及其应用

技术领域

本发明涉及微生物饲料，尤其涉及一种适用于制备青贮饲料，特别是苜蓿青贮饲料的苜蓿内生戊糖片球菌EL5。

背景技术

紫花苜蓿是豆科苜蓿属多年生草本植物，耐干旱，主要分布在我国西北、华北、东北及江淮流域，在我国已有2000多年的栽培历史。紫花苜蓿具有蛋白含量高、适口性好等优点，是反刍动物尤其是奶牛的优质饲草来源。我国畜牧产业对苜蓿饲草的需求量日益增长，并大量依赖于从国外进口，供给于需求的矛盾日益突出，严重制约着我国畜牧业的发展。

青贮作为一种简单易行、成本较低的牧草贮藏手段，能很好的保存牧草的营养价值，减少营养损失，提高牧草的适口性和消化率，已经成为世界上反刍动物日粮的重要组成部分。将苜蓿制作成青贮饲料，不仅能保持苜蓿草的青绿特性，还能减少其营养损失，是解决冬春季节饲草料不足的有效措施之一。而青贮的关键在于乳酸菌主导的乳酸发酵程度，要使乳酸菌有效生长和繁殖，必须为其提供适宜的生长环境及条件。微生物与其生存环境互相选择与协同进化，目前常规外源乳酸菌添加剂在苜蓿发酵时因对原材料适应性较差而活性较低，是制约苜蓿青贮的重要因素。

发明内容

第一方面，本发明一实施方式提供了一种保藏编号为CGMCC No.23923的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)EL5。

根据本发明一实施方式，所述戊糖片球菌EL5包含SEQ ID NO.1所示的16S rDNA。

根据本发明一实施方式，所述戊糖片球菌EL5自苜蓿内部分离得到。

第二方面，本发明一实施方式提供了一种青贮饲料添加剂，包含上述的戊糖片球菌EL5。

第三方面，本发明一实施方式提供了一种青贮饲料，包含上述的戊糖片球菌EL5。

根据本发明一实施方式，所述青贮饲料为苜蓿青贮饲料，进一步为紫花苜蓿青贮饲料。

第四方面，本发明一实施方式提供了一种上述青贮饲料的制备方法，包括：将青贮原料与上述的戊糖片球菌EL5混合后发酵，制得所述青贮饲料。

根据本发明一实施方式，所述戊糖片球菌EL5的活菌数与所述青贮原料的质量之比为1.0×10⁵～2.0×10⁶CFU/g。

根据本发明一实施方式，所述青贮原料包括苜蓿，进一步包括紫花苜蓿。

第五方面，本发明一实施方式提供了一种上述的戊糖片球菌EL5在制备青贮饲料中的应用。

与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：

1、本发明一实施方式的戊糖片球菌EL5，用于青贮饲料，能够提高乳酸菌的活性并改善青贮发酵的品质。

2、本发明一实施方式的青贮饲料，通过戊糖片球菌EL5改善青贮饲料的发酵品质，成本低、安全、可靠、易于利用。

本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过说明书以及附图中所特别指出的内容中来实现和获得。

附图说明

附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本发明的限制。其中：

图1为实施例的苜蓿内生戊糖片球菌EL5的产酸及生长速率图；

图2为对比例的苜蓿附生乳酸乳球菌L2的产酸及生长速率图；

图3为实施例的苜蓿内生戊糖片球菌EL5和对比例的附生乳酸乳球菌L2的碳源利用速率对比图。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施方式进行具体描述，其中，附图构成本发明一部分，并与本发明的实施方式一起用于阐释本发明的原理，并非用于限定本发明的范围。

本发明一实施方式提供了一种苜蓿内生戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)EL5，其菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.23923，保藏日期为2021年11月16日。

于一实施方式中，戊糖片球菌EL5的16S rDNA如SEQ ID NO.1所示。

本发明一实施方式的戊糖片球菌EL5自苜蓿组织中分离得到，其中，在进行提取分离之前，该苜蓿组织经过严格地表面消毒；进一步地，该苜蓿为紫花苜蓿。

于一实施方式中，戊糖片球菌EL5的分离培养过程包括：

将苜蓿进行灭菌处理后，进行挤压和/或破碎处理(例如研磨)，以使其内部的汁液流出；

将上述处理后的苜蓿与盐水混合，取上层清液并移至MRS培养基中进行培养。

于一实施方式中，EL5菌株的生长温度可以为15～45℃，进一步可以为30～35℃，例如20℃、25℃、27℃、33℃、37℃、40℃。

于一实施方式中，EL5菌株于MRS培养基培养24h后可将培养基的pH值降至3.5～4.0。

本发明一实施方式的苜蓿内生戊糖片球菌EL5的生物学特性为革兰氏染色阳性球菌，葡萄糖同型发酵，在pH＝4.0的条件下可以正常生长，表明其耐酸性较强；在3％和6.5％的盐浓度环境中能够良好生长，表明其耐盐性强；在MRS液体培养基中30℃培养24h后OD₆₀₀为1.5524，表明其生长速率快；在30℃条件下通过对Biolog AN微孔板中95种碳源的利用速率进行测试，EL5 48h碳源总利用速率相较于苜蓿附生乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)L2高103.22％，表明其对不同碳源的总利用速率高。

本发明一实施方式提供了一种青贮饲料添加剂，包含上述的戊糖片球菌EL5，其中，戊糖片球菌EL5为添加剂的活性成分。

于一实施方式中，青贮饲料添加剂可以为苜蓿青贮饲料的添加剂，进一步可以为紫花苜蓿青贮饲料的添加剂。

本发明一实施方式提供了一种青贮饲料，包含上述的戊糖片球菌EL5。

于一实施方式中，青贮饲料可以为苜蓿青贮饲料，进一步为紫花苜蓿青贮饲料。

本发明一实施方式提供了一种青贮饲料的制备方法，包括：将青贮原料与上述的戊糖片球菌EL5混合后发酵，制得青贮饲料。

于一实施方式中，青贮原料可以是苜蓿，进一步可以是紫花苜蓿。

于一实施方式的青贮饲料中，戊糖片球菌EL5的活菌数与青贮原料的质量之比为1.0×10⁵CFU/g～2.0×10⁶CFU/g，例如2.0×10⁵CFU/g、5.0×10⁵CFU/g、8.0×10⁵CFU/g、1.0×10⁶CFU/g、1.5×10⁶CFU/g。

本发明一实施方式的青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：

S1：将苜蓿原料切碎并混合均匀；

S2：向苜蓿原料中加入戊糖片球菌EL5，每克苜蓿原料加入戊糖片球菌EL5有效活菌数为1.0×10⁶个以上。

S3：将添加了戊糖片球菌EL5的苜蓿体系真空密封后贮藏。

于一实施方式中，苜蓿原料可以是紫花苜蓿。

于一实施方式中，在步骤S1中可将人工刈割后的苜蓿原料切碎至2～3cm。

于一实施方式的步骤S3中，可将苜蓿体系在20～25℃的温度下进行储藏，在贮藏60天后可将体系的pH值降至4.69～4.78，例如4.70、4.75。

本发明一实施方式进一步提供了上述的戊糖片球菌EL5在制备青贮饲料中的应用。

本发明一实施方式的戊糖片球菌EL5，耐酸、生长速度快，且对碳源的利用速率最高，综合产酸能力强，能够快速生成乳酸，降低pH、氨态氮的含量，很好地改善青贮饲料的适口性，抑制大肠杆菌及真菌的生长，有利于提高其有氧稳定性，延长青贮饲料的保存期限，最大程度地保留紫花苜蓿青贮原料的营养品质，制备的青贮饲料效果优于紫花苜蓿附生菌株，且生物安全性好，制备成本低。

本发明一实施方式的戊糖片球菌EL5，可以克服青贮时乳酸菌对紫花苜蓿原材料适应性的问题，从而能够提高乳酸菌的活性并改善了青贮发酵的品质。

本发明一实施方式的戊糖片球菌EL5菌株，在正常青贮环境下效果优良，且比植物源附生乳酸菌菌株效果更佳。

本发明一实施方式的青贮饲料或其制备方法，采用植物内生乳酸菌相对于其他外源乳酸菌能够克服青贮时乳酸菌对苜蓿原材料适应性的问题，提高了乳酸菌的活性并改善青贮发酵的品质。

本发明一实施方式的青贮饲料或其制备方法，利用乳酸菌改善青贮饲料的发酵品质，成本低、安全、可靠、易于利用。

以下，结合附图及具体实施例对本发明一实施方式的戊糖片球菌EL5及青贮饲料进行进一步说明。其中，所使用的苜蓿材料为从河北省黄骅市丰茂盛园农业科技有限公司采集的紫花苜蓿。在苜蓿内生戊糖片球菌EL5的分离培养及生长速率、产酸速率等生理生化指标测定中所使用的MRS液体培养基包括：蛋白胨(Proteose peptone NO.3)10.0g、牛肉膏(Beef extract)10.0g、酵母提取物(Yeast extract)5.0g、葡萄糖(Dextrose)20.0g、吐温(Polysorbate 80)1mL、柠檬酸铵(Ammonium citrate)2.0g、醋酸钠(NaAc)5.0g、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.1g、硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)0.05g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)2.0g、蒸馏水(H₂O)1000mL。在MRS液体培养基的基础上加入琼脂(Agar)15g即为MRS固体培养基，以上培养基均于高压灭菌锅中121℃灭菌20分钟。

实施例

苜蓿内生戊糖片球菌EL5的分离培养

将新鲜的苜蓿材料装入无菌采样袋中带回实验室，在超净工作台无菌环境下称取10g整株苜蓿计重后进行表面消毒操作：依次将其浸入70％乙醇90s、3.25～4％次氯酸钠溶液120s、70％乙醇30s，再用无菌水冲洗3次并使用无菌滤纸吸净表面水分，最后一次冲洗的无菌水涂布做为对照。

将消毒后的材料放入灭菌研钵进行研磨(加入少许灭菌的石英砂有助于研磨，碳酸钙做缓冲)，将苜蓿组织研碎后加入9mL的8.5％无菌生理盐水充分搅拌，然后静置3min，取上清液(记为10^-1浓度梯度)1mL并按10倍稀释度依次稀释至10^-2浓度梯度、10^-3浓度梯度，分别取各梯度稀释液100uL在MRS固体培养基上进行平板涂布，将平板放入厌氧袋后置于30℃或37℃培养箱培养。

长出菌落后挑取单菌落反复进行平板划线分离，直到得到单菌落EL5，将EL5用接种针接种至MRS固体培养基试管斜面，于4℃冰箱保存。

苜蓿内生戊糖片球菌EL5的形态鉴定

革兰氏染色和细胞形状观察以及过氧化氢酶实验的测试过程如下：

革兰氏染色法：挑一环水于载玻片中央，再用接种环挑取少量菌与玻片上的水滴均匀混合并涂成薄的菌膜自然干燥；玻片向上在微火上固定：结晶紫初染1min后用水充分淋洗(动作轻柔，避免水流直接冲击菌块)。滴加碘液媒染1～2min，用95％乙醇脱色并水洗，番红复染1～2min水洗；自然干燥；1000倍油镜观察：蓝紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。

过氧化氢酶实验：用枪头吸取3％(体积分数)过氧化氢溶液于平板上，用接种环挑取菌少许，与过氧化氢溶液充分混合，2～3min后观察有气泡产生的为阳性，无为阴性。

苜蓿内生戊糖片球菌EL5的生理生化测试

根据生长温度(4、15、30、35、45℃)和生长pH(3、3.5、4.0、4.5、9.0)等实验对苜蓿内生戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus EL5进行测试，过程如下：

乳酸菌产酸和生长速率的测定及筛选：将已分离纯化的菌株接种到3mL的MRS液体培养基中，置于30℃、250rpm摇床过夜培养约14～16h。按1％(V/V)的接种量转入新的3mLMRS液体培养基中，于30℃、250rpm摇床培养，分别在接种时间后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h测定MRS液体培养基的pH值，在波长600nm下测定吸光度值。每株菌每个时间点需要做3个重复，且培养菌的试管需要同种规格。

温度耐受性试验：按1％(V/V)的接种量分别转入新的MRS液体培养基中，分别置于4℃、15℃、30℃、35℃、45℃的恒温培养中培养2天。

pH耐受性试验：按1％(V/V)的接种量接种到pH为3.0、3.5、4.0、4.5、9.0的MRS液体培养基30℃培养2天(用2.0M的NaOH或者1.0M的HCL调节)。

耐盐性：将乳酸菌接种到NaCl含量分别为3％、6.5％的MRS液体培养基中后置于30℃培养箱中培养2天，观察乳酸菌生长状况。

菌株EL5的形态及生理生化特性如表1、图1所示。

表1菌株EL5的形态及生理生化特性

在表1的结果中，耐受性试验中的“w”“+”“++”“+++”表示如下含义：w:OD600_nm＜0.5；+:0.5≤OD600_nm＜1；++:1≤OD600_nm＜1.5；+++:1.5≤OD600_nm。

图1、表1的结果表明，戊糖片球菌EL5菌株为革兰氏阳性，同型发酵的球菌，具有较强的耐酸、耐盐能力，生长速度快，综合产酸能力强。

苜蓿内生戊糖片球菌EL5的16S rDNA基因同源性分析

将菌株在5mL的MRS培养基中35℃培养过夜，然后将菌液移入1.5mL的离心管中，10000rpm/min离心3～5min收集菌，用TE 0.1(10mmol/L Tris-HCL，0.1mmol/L EDTA，pH8.0)清洗两次，再用TIANamp Bacteria DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.,LTD,Beijing,China)试剂盒提取DNA，在OD600 nm处检测其吸光值。

之后，进行PCR扩增，16S rDNA的扩增引物为27f和1492r(Monis et al,2005)，PCR反应为95℃(5min)-94℃(30s)-55℃(1min)-72℃(1.5min)-72℃(10min)，其中94℃(30s)-55℃(1min)-72℃(1.5min)反应循环30次。扩增产物送美吉生物科技有限公司(中国)测序，结果在NCBI的基因库中比对，找出与此菌亲缘相近的标准菌株戊糖片球菌等，用DNAman软件分析，将筛选菌株的16S rDNA(见SEQ ID NO.1)的部分序列(约1400bp-1500bp)与标准菌进行相似度分析，EL5与戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)相似度超过99％，结合生理生化指标，判定EL5与戊糖片球菌属同一种。

对比例

苜蓿附生乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)L2的分离培养

将新鲜的苜蓿材料装入无菌采样袋中带回实验室，并在超净工作台无菌环境下称取20g整株苜蓿于180mL无菌生理盐水中，摇床180r/min室温振荡2h，得到浓度为100g·L^-1的原液，记为10^-1梯度，然后取该原液1mL加入含有9mL灭菌蒸馏水的试管振荡均匀，使其终浓度为10g·L^-1，记为10^-2梯度，使用该方法依次稀释至10^-4梯度，分别取各梯度稀释液100uL在MRS固体培养基上进行平板涂布，置于30℃或37℃培养箱培养。其中，MRS培养基配方与实施例相同。长出菌落后挑取单菌落反复进行平板划线分离，直到得到单菌落L2，将单菌落用接种针接种至MRS固体培养基试管斜面，于4℃冰箱保存。

苜蓿附生乳酸乳球菌L2的鉴定与测试

对L2菌株进行与实施例相同的测试与鉴定，所采用的测试方法、测试原料也与实施例相同，相关结果参见表2及图2。

表2菌株L2的生理生化特性

在表2的结果中，耐受性试验中的“w”“+”“++”表示如下含义：w:OD600_nm＜0.5；+:0.5≤OD600_nm＜1；++:1≤OD600_nm＜1.5。

表2、图2的结果表明，L2菌株为革兰氏阳性，同型发酵的球菌，具有较强的耐盐能力，生长速度快，综合产酸能力强。

16S rDNA(见SEQ ID NO.2)基因同源性分析结果显示L2与乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)相似度超过99％，结合生理生化指标，判定L2与乳酸乳球菌属同一种。

苜蓿内生戊糖片球菌EL5及附生乳酸乳球菌L2的碳源利用速率对比

采用Biolog AN MicroPlate(Catalog No.1007)进行碳源利用速率测定，所有必要的营养物质以及生化试剂都被预先填充、干化在96个孔中。四唑类氧化还原染料通过色度的变化来指示微生物对碳源的利用程度。碳源利用速率＝(48h对应碳源孔在590nm的吸光值-48h空白对照孔在590nm的吸光值)/48h空白对照孔在590nm的吸光值。

实验结果表明，苜蓿内生戊糖片球菌EL5对半乳糖、岩藻糖、松二糖、纤维二糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、延胡索酸、乙醛酸等几种植物体内主要可利用碳源的总利用速率高于苜蓿附生乳酸乳球菌L2菌株，具体参见图3。

应用例

青贮饲料的制备

将河北省黄骅市丰茂盛园农业科技有限公司收获的紫花苜蓿切短至2-3cm，混合均匀，分别接种实施例的戊糖片球菌EL5(EL5处理组)和对比例的乳酸乳球菌L2(L2处理组)，向每克新鲜材料中加入菌株EL5或菌株L2约1×10⁶个。将均匀混合后的苜蓿装入28cm×35cm的聚乙烯青贮袋中，每个处理装3袋，每袋约500g，用真空密封机抽气、密封，置于20～25℃的温度下贮藏，发酵7、30和60天后开启。

苜蓿原料及青贮饲料的测试

取样分析苜蓿原料的营养成分及EL5处理组和L2处理组的苜蓿青贮饲料的发酵品质和营养成分，具体结果参见表3至6。测试过程如下：

青贮料和原料样品成分分析：取多份苜蓿青贮饲料样品各20g，分别加入180mL蒸馏水并搅拌均匀，用组织捣碎机将其搅碎1min，然后用四层纱布过滤，滤掉草渣得到的浸出液用于pH值、乳酸、乙酸、丙酸和氨态氮含量的测定。用pH计测定苜蓿青贮饲料浸出液的pH值(pHS-3C，中国上海)；乳酸、乙酸、丙酸含量用高效液相色谱仪分析分析，色谱柱：KC-811column，检测器：SPD-M10AVP，检测波长：210nm；流动相：3mmol/L高氯酸，流速：1mL/min，进样量：5uL,柱温50℃；氨态氮采用苯酚次氯酸钠比色法测定(Broderick和Kang，1980)；苜蓿原料和青贮饲料的干物质含量用烘干法测定，样品混匀后置于65℃鼓风干燥箱中烘干48h左右直至质量恒定，测定干物质含量；烘干的样品经植物粉碎机粉碎后过筛用于粗蛋白、粗脂肪、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的测定；粗蛋白用凯氏定氮法测定，粗脂肪用石油醚提取法(AOAC，2010)测定，中性和酸性洗涤纤维含量用范氏洗涤纤维法(VanSoest等，1991)测定。

青贮饲料在每个时间点开启后，准确称取20g青贮样品，放入装有180ml无菌水的三角瓶中，用封口膜封口，放入180r/min的摇床中震荡30min，使微生物充分分散，静置10～40s，即成10^-1的稀释液；吸取100μl10^-1的稀释液，加入装有900μl无菌水的离心管中，充分混匀后，即成10^-2稀释液；再吸取100μl 10^-2稀释液，加入装有900μl无菌水的离心管中，混匀即成10^-3稀释液；用同样方法连续稀释，制成10^-4、10^-5等一系列稀释菌液。取分别装有无菌MRS培养基、蓝光肉汤琼脂培养基、孟加拉红培养基、营养琼脂培养基(NA)和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的3分格培养皿，用记号笔在每个培养皿的3个120°的扇形标出10^-1、10^-3、10^-5等3种稀释度；然后再分别从10^-1、10^-3、10^-5稀释液管中吸取20μl，滴在对应的培养基表面的扇形区域内，再用涂布棒在培养基上均匀涂抹菌液。涂抹好的培养基要静置20～30min，将有MRS培养基的培养皿装入厌氧盒中，与其他培养皿共同放入37℃恒温培养箱培养48h后取出计数，测定青贮饲料发酵过程中乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌、细菌和真菌数量。

表3青贮前苜蓿草的化学及微生物计数

FM：鲜物质，DM：干物质，WSC：可溶性碳水化合物，NDF：中性洗涤纤维，ADF：酸性洗涤纤维

表4 EL5及L2添加剂对苜蓿青贮饲料发酵品质的影响

a-c表示不同的行中的差异显著(P<0.05)。

ND，低于检测水平；T:Treatment；FM:fresh matter；DM:dry matter；TN:总氮；LA:乳酸；AA：乙酸；PA：丙酸；BA：丁酸

CK:Control；EL5:添加苜蓿内生戊糖片球菌EL5处理组；L2:添加苜蓿附生乳酸乳球菌L2处理组。

表5 EL5及L2添加剂对苜蓿青贮饲料微生物的影响

a-b表示不同的行中的差异显著(P<0.05)；ND，低于检测水平；T:Treatment；

表6 EL5及L2添加剂对苜蓿青贮饲料营养成分的影响

a-b表示不同的行中的差异显著(P<0.05)，T:Treatment；FM:fresh matter；DM:dry matter。

从表3至6的结果可以看出，与附生乳酸乳球菌L2处理相比，苜蓿内生戊糖片球菌EL5作为添加剂可以在青贮发酵前期迅速活化并提高乳酸菌的数量，从而快速提高乳酸的含量并降低其pH值，同时抑制了氨态氮的大量产生以及大肠杆菌、酵母、霉菌的繁殖。此外，在60天时，添加EL5的蛋白保持率达98.17％，对每千克蛋白保存量较L2增加22.22克，较CK增加23.32克。因此，戊糖片球菌EL5作为一种新型快速启动苜蓿青贮发酵的添加剂，可以显著改善苜蓿青贮饲料的品质。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种苜蓿内生戊糖片球菌EL5及其应用

<130> 2022.5.10

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1439

<212> DNA

<213> 戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)

<400> 1

ctagctccta aaaggttacc ccaccggctt tgggtgttac aaactctcat ggtgcgatgg 60

gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc 120

gattccgact tcgtgtaggc gagttgcagc ctacagtccg aactgagaat ggttttaaga 180

gattagctta acctcgcggt ctcgcgactc gttgtaccat ccattgtagc acgtgtgtag 240

cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcgtcccca ccttcctccg gtttgtcacc 300

ggcagtctca ctagagtgcc caacttaatg ctggcaacta gtaataaggg ttgcgctcgt 360

tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca 420

ttctgtcccc gaagggaacc tctaatctct tagactgtca gaagatgtca agacctggta 480

aggttcttcg cgtagcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540

aattcttttg agtttcaacc ttgcggtcgt actccccagg cggattactt aatgcgttag 600

ctgcagcact gaagggcgga aaccctccaa cacttagtaa tcatcgttta cggcatggac 660

taccagggta tctaatcctg ttcgctaccc atgctttcga gcctcagcgt cagttgcaga 720

ccagacagcc gccttcgcca ctggtgttct tccatatatc tacgcatttc accgctacac 780

atggagttcc actgtcctct tctgcactca agtctcccag tttccaatgc acttcttcgg 840

ttgagccgaa ggctttcaca ttagacttaa aagaccgcct gcgctcgctt tacgcccaat 900

aaatccggat aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt 960

ggctttctgg ttaaataccg tcactgggta aacagttact cttacccacg ttcttcttta 1020

acaacagagc tttacgagcc gaaacccttc ttcactcacg cggcgttgct ccatcagact 1080

tgcgtccatt gtggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca 1140

gtcccaatgt ggccgattac cctctcaggt cggctacgta tcactgcctt ggtgagcctt 1200

tacctcacca actagctaat acgccgcggg tccatccaga agtgatagca gagccatctt 1260

ttaaaagaaa accatgcggt tttctctgtt atacggtatt agcatctgtt tccaggtgtt 1320

atcccctact tctgggcagg ttacccacgt gttactcacc cgttcgccac tcacttcgtg 1380

ttaaagtctc aatcagtaca agtacgtcat aatcaattaa cggaagttcg ttcgactgc 1439

<210> 2

<211> 1489

<212> DNA

<213> 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)

<400> 2

gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagttgagc gctgaaggtt ggtacttgta 60

ccgactggat gagcagcgaa cgggtgagta acgcgtgggg aatctgcctt tgagcggggg 120

acaacatttg gaaacgaatg ctaataccgc ataaaaactt taaacacaag ttttaagttt 180

gaaagatgca attgcatcac tcaaagatga tcccgcgttg tattagctag ttggtgaggt 240

aaaggctcac caaggcgatg atacatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacattggga 300

ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg caatggacga 360

aagtctgacc gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg 420

gtagagaaga acgttggtga gagtggaaag ctcatcaagt gacggtaact acccagaaag 480

ggacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtcccgagcg ttgtccggat 540

ttattgggcg taaagcgagc gcaggtggtt tattaagtct ggtgtaaaag gcagtggctc 600

aaccattgta tgcattggaa actggtagac ttgagtgcag gagaggagag tggaattcca 660

tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aggaacaccg gtggcgaaag cggctctctg 720

gcctgtaact gacactgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 780

agtccacgcc gtaaacgatg agtgctagat gtagggagct ataagttctc tgtatcgcag 840

ctaacgcaat aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt 900

gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct 960

taccaggtct tgacatactc gtgctattcc tagagatagg aagttccttc gggacacggg 1020

atacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080

acgagcgcaa cccctattgt tagttgccat cattaagttg ggcactctaa cgagactgcc 1140

ggtgataaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200

ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagtcgcgag acagtgatgt ttagctaatc 1260

tcttaaaacc attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc 1320

gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380

ccgtcacacc acgggagttg ggagtacccg aagtaggttg cctaaccgca aggagggcgc 1440

ttcctaaggt aagaccgatg actggggtga agtcgtaaca aggtagccg 1489

Claims

1.一种保藏编号为CGMCC No.23923的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)EL5，自苜蓿内部分离得到。

2.根据权利要求1所述的戊糖片球菌EL5，其包含SEQ ID NO.1所示的16S rDNA。

3.一种紫花苜蓿青贮饲料添加剂，包含权利要求1或2所述的戊糖片球菌EL5。

4.一种青贮饲料的制备方法，包括：将青贮原料与权利要求1或2所述的戊糖片球菌EL5混合后发酵，制得所述青贮饲料；其中，所述青贮原料包括紫花苜蓿。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述戊糖片球菌EL5的活菌数与所述青贮原料的质量之比为1.0×10⁵～2.0×10⁶CFU/g。

6.权利要求1或2所述的戊糖片球菌EL5在制备紫花苜蓿青贮饲料中的应用。