CN114601035B - 一株产酸高乳酸菌及其在提高青贮饲料品质中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产酸高乳酸菌及其在提高青贮饲料品质中的应用，具体涉及饲料加工技术领域。本发明的产酸高乳酸菌为植物乳酸菌(Lactobacillus Plantarum)NCL‑LP2，其保藏号为：CGMCC No.23490，将该株产酸高乳酸菌添加至青贮饲料中，混合均匀，密封处理，室温保存。相较于对照组的青贮荔枝枝叶来看，添加产酸高乳酸菌对四个不同品种的荔枝枝叶青贮品质的改善和营养成分的保存有着明显的改善效果。有效解决新鲜荔枝枝叶材料浪费的问题，还能实现荔枝枝叶的规模化生产，增加饲料资源，有利于解决食草动物季节性草料缺口问题。
Description
技术领域
本发明涉及饲料加工技术领域，具体涉及一株产酸高乳酸菌及其在提高青贮饲料品质中的应用。
背景技术
近年来，我国经济快速发展和人民生活水平不断提高，对肉、蛋和奶类畜产品需求日益增加，推动了畜牧业由放牧、圈养等传统养殖模式向规模化、集约化等现代化养殖模式转变。然而，在以粮食饲料为主的传统饲养方式下，畜禽饲养规模的扩大，严重阻碍了畜牧业的可持续发展，也影响了我国粮食供需平衡。新鲜饲草供应不足，粮食饲料短缺，一定程度上限制了畜牧业的生产需求。因此，寻找其他青贮材料，同时有效利用青贮技术充分发挥饲料的最大化价值和营养品质刻不容缓。
荔枝(Litchi chinensis Sonn)属无患子科(Sapindaceae)荔枝属(Litchi)，起源于中国，主要种植在我国长江以南地区，种植时间长，品种资源丰富，是南方多数地区主要的经济作物。二十世纪90年代以来，荔枝产业在我国迅猛发展，根据国家现代化农业(荔枝龙眼)产业技术体系调研，2015年体系试验站覆盖区域荔枝生产面积569.49万亩，随着我国荔枝种植面积不断增加，2017年统计我国的种植面积占全球一半之多，产量和种植面积排全球第一。荔枝为四季常绿果树，树体高大枝叶繁茂，成年果树可有数米高，羽毛状叶片为复叶。根据古书记载，荔枝具有多种药理功效，如荔枝叶具有祛湿解毒的功效，可用于治疗烂疮和湿疹；树皮可疏肝解郁，祛风健胃；树枝可治虚喘。荔枝叶的矿质元素含量的大小依次为氮、钾、钙、镁、磷、硫、硼、锌、钼；荔枝叶还含有大量木脂素类化合物和多酚化合物，具有较强的抗氧化性；荔枝叶中的石油醚萃取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和痢疾杆菌等病原细菌均有较好的抑制作用。荔枝叶全年可采，并且荔枝树修剪以及采摘荔枝时通常会有大量的荔枝枝叶被荒废，有效利用被废弃的荔枝枝叶成了一项难题。为了更好的解决饲料的供应不足的问题，利用荔枝枝叶青贮可达到一定的效果。
适宜的加工贮藏方式也可有效解决饲料缺乏的问题，青贮是饲草加工储藏方式中应用最广泛的，青贮是指鲜料表面附着的或外源添加的乳酸菌在厌氧条件下，通过利用青贮材料中的可溶性碳水化合物转化为乳酸和乙酸等有机酸，迅速降低pH值，形成酸性贮存环境进而抑制或杀死有害微生物，达到长期保存饲草资源的一种加工方法。青贮对于提高青贮饲料发酵品质，减少营养损失，产生香味刺激家畜食欲提高采食量有重要意义，并且青贮饲料便于制作保存，可以抑制有害菌的生长繁殖，有效降低潜在危害，提高饲喂安全性。
根据不同乳酸菌对碳水化合物代谢途径的差异，可将其分为专性同型发酵乳酸菌、兼性异型发酵乳酸菌和专性异型发酵乳酸菌三大类。同型发酵乳酸菌主要是通过产生乳酸快速降低pH值，从而提高青贮的贮存稳定性；异型发酵乳酸菌可产生高浓度乙酸，抑制酵母菌和霉菌等腐败菌生长，有利于提高青贮开窖后的有氧稳定性。其中，植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)属于兼性异型发酵菌，添加乳酸菌可以增加青贮饲料中乳酸菌群的数量，使pH值迅速降低、有效抑制有害微生物的繁殖，从而提高青贮饲料发酵品质，降低营养损失。同时，还能提高青贮饲料有氧稳定性，对家畜干物质采食量、体增重和乳产量等有一定的促进作用。因此，分离筛选合适的乳酸菌添加剂添加到青贮饲料中，对提高反刍动物生产效率具有十分重要的意义。
发明内容
为解决上述的技术问题，本发明首次提出将产酸高乳酸菌作为青贮添加剂添加到不同品种荔枝枝叶。相比于传统的青贮添加剂，产酸高乳酸菌有效提高青贮饲料中乳酸菌的数量，提高乳酸含量，降低pH值，抑制不良微生物的繁殖，有效改善青贮发酵品质。在产酸高乳酸菌添加条件下，减少了青贮饲料的蛋白降解。该方法不仅可以有效解决新鲜荔枝枝叶材料浪费的问题，还能实现荔枝枝叶的规模化生产，增加饲料资源，有利于解决食草动物季节性草料缺口问题。其中，用于添加的产酸高乳酸菌筛选步骤较简单，且冷冻干燥后易于保存和运输。该方法为青贮饲料提供了一种新的思路，在一定程度上帮助我国解决饲料青贮难题。优化了荔枝枝叶的青贮调制，为荔枝枝叶饲料的规模化、产业化生产提供了理论依据。
本发明的第一个目的是提供一种植物乳酸菌(Lactobacillus Plantarum)NCL-LP2，其保藏号为：CGMCC No.23490。
本发明的第二个目的是提供一种微生物制剂，以上述植物乳酸菌NCL-LP2的培养物或代谢物为活性成分。
本发明的第三个目的是提供上述的植物乳酸菌NCL-LP2或微生物制剂在提高青贮饲料品质中的应用。
优选地，将所述的植物乳酸菌NCL-LP2或微生物制剂添加至青贮饲料中，混合均匀，密封处理，室温保存。
优选地，所述的青贮饲料为荔枝枝叶青贮材料。
优选地，所述的植物乳酸菌NCL-LP2的添加量为106cfu·g-1。
优选地，所述的植物乳酸菌NCL-LP2是含水量为0％的菌粉状态，青贮添加时是菌粉加纯水后活化的菌液状态。
优选地，所述的植物乳酸菌NCL-LP2或微生物制剂添加至青贮饲料前，将所述的青贮饲料切割成2-3cm的长度。
优选地，所述密封处理为袋装密封、桶装密封或捆扎密封。
优选地，所述的菌粉，是将所述的植物乳酸菌NCL-LP2活化富集培养后离心，用无菌生理盐水清洗离心两次后，添加脱脂奶混合均匀倒入培养皿中，预冻后放入真空冷冻干燥机中，真空度小于60pa，冷阱温度小于-55℃，样品温度达到室温时即为干燥结束，将制得的菌粉冷冻保存。
本发明的第四个目的是荔枝枝叶在制备青贮饲料中的应用。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明首次提出将荔枝枝叶作为青贮材料，能够有效利用被废弃的荔枝枝叶，同时为畜牧业提供高营养粮食饲料；
(2)随着青贮天数的增加，添加产酸高乳酸菌的处理组的pH值显著降低；
(3)产酸高乳酸菌添加组显著降低了晚埔荔枝枝叶青贮大肠杆菌的数量和氨态氮的含量；
(4)随着青贮天数的增加，添加产酸高乳酸菌的处理组的酵母菌和霉菌的数量都低于102cfu·g-1检测值；
(5)荔枝枝叶青贮添加LP的处理组的体外48h干物质消化率普遍高于对照组，其中桶仔荔枝品种青贮的体外48h干物质消化率显著高于对照组；
(6)在荔枝枝叶青贮中混合添加产酸高乳酸菌，青贮后的饲料气味醇香、柔软多汁、适口性好，大大提高了其利用价值。
本发明涉及的NCL-LP2，于2021年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为：100101，保藏编号为：CGMCC No.23490。
附图说明
图1为不同荔枝枝叶72h瘤胃体外产气量，其中V1表示晚埔荔枝品种；V2表示乌叶舅荔枝品种；V3表示桶仔荔枝品种；V4表示状元红荔枝品种；CK表示纯水处理的对照组；LP表示添加产酸高植物乳杆菌的处理组。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或者按照试剂盒说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
一般性说明：
本发明对所述黄梁木的品种没有特殊的限制，本发明的实验过程中，荔枝枝叶和黄梁木叶分别采集于华南农业大学荔枝园和华南农业大学启林北试验田中，材料种植过程中未进行浇水和施肥处理。
本发明对采集的荔枝枝叶和黄梁木叶的生长阶段均没有特殊的限制，实验中荔枝枝叶的品种分别为晚埔、乌叶舅、桶仔和状元红。
本发明对乳酸菌菌粉的冷冻干燥程序没有特殊的限制，本发明中涉及的冷冻干燥程序为：-25℃干燥300分钟，-20℃干燥60分钟，-15℃干燥60分钟，-10℃干燥60分钟，-5℃干燥60分钟，-2℃干燥60分钟，-0℃干燥60分钟，5℃干燥60分钟，10℃干燥60分钟，20℃干燥到终点。冷冻干燥的终点为样品温度与室温一致，冷冻干燥过程中机器真空度小于60pa，冷阱温度小于-55℃。
本发明对荔枝枝叶青贮加工的工艺没有特殊的限制，本发明的实验过程中采用的是袋装密封法，桶装青贮和捆包青贮等加工方法均可应用此发明。
实施例1产酸高乳酸菌的筛选
收集新鲜的黄梁木叶，切片后混合均匀，将其放置在真空包装袋中常温保存，29天后取出，称取10g加入到90mL灭菌生理盐水中，逐层稀释后取10-2-10-7梯度稀释液1mL和MRS培养基混合，30℃培养2天后挑选单株菌落进行分离纯化。二代培养获得的单株菌落加到MRS肉汤培养基30℃培养1天测定pH值，筛取到pH值较低的第72号菌株制作菌粉(表1)。
表1黄梁木叶自然青贮29天筛选的乳酸菌的产酸能力
将表1所示的72号菌株进行保存并鉴定：从上述筛选到的菌株中取100μL菌液，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA(天根生化科技有限公司，北京)，加入50μL缓冲液B1充分吸打混匀，静置5min后漩涡摇匀，再加50μL缓冲液B2充分吸打混匀，静置5min后漩涡摇匀，12500rpm离心2min，吸取上清液2.5μL加入到50μL的体系进行PCR反应，引物为27F(5-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3)和1492R(5-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3’)。PCR反应体系：mix酶25μL，前引物(27F)1.5μL，后引物(1492R)1.5μL，二次蒸馏水(ddH2O)19.5μL，cDNA(模板DNA)2.5μL。PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃后延伸5min；4℃终止反应。
制作胶块，使用2000bp的mark取10μL加到胶块第一个孔，按顺序加入10μL PCR扩增产物。凝胶电泳反应程序：电流200A，电压200U，功率50P，时间20min。跑出清晰条带的即可送去擎科生物科技有限公司进行测序。后续通过测序公司发送的测序后得到的结果经NCBI的blast程序进行同源性比对，确定菌株所属，经对比确定为植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)，将其命名为NCL-LP2，并于2021年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为：100101，保藏编号为：CGMCC No.23490。
实施例2产酸高乳酸菌菌粉的制作
将实施例1筛选得到的乳酸菌制作成菌粉，步骤如下：将乳酸菌活化富集培养后，4000rpm离心10min后用无菌生理盐水清洗离心两次后，添加10％无菌脱脂奶混合均匀倒入培养皿中，预冻后放入真空冷冻干燥机中，真空度小于60pa，冷阱温度小于-55℃，样品温度达到室温时即为干燥结束，将制得的菌粉冷冻保存。
实施例3产酸高乳酸菌添加处理青贮饲料
1、荔枝枝叶的采集：
本发明中所述的青贮材料为晚埔、乌叶舅、桶仔和状元红四个不同品种的荔枝枝叶。用砍刀在荔枝树树干处进行砍伐，迅速带回实验室用揉丝机将荔枝枝叶粉碎成2-3cm的长度，混合均匀后分别采集不同品种荔枝枝叶三个重复样测定原料的相关特性指标，不同品种荔枝枝叶原料特性分别如表2所示，其中DM是指干物质，FM是指新鲜样品。
表2不同品种荔枝叶青贮前的化学特性和微生物数量
| 测定项目 | 晚埔 | 乌叶舅 | 桶仔 | 状元红 |
| 干物质(％) | 49.21±0.27b | 49.29±0.19b | 49.87±0.12a | 44.96±0.25c |
| 粗蛋白(％DM) | 9.92±0.25 | 9.73±0.23 | 8.79±1.14 | 9.29±0.40 |
| 中性洗涤纤维(％DM) | 64.89±1.60a | 63.36±0.64ab | 66.14±3.63a | 59.54±0.12b |
| 酸性洗涤纤维(％DM) | 51.21±2.41a | 51.27±2.71a | 52.24±2.35a | 46.36±1.19b |
| 可溶性碳水化合物(％DM) | 1.62±0.15b | 1.72±0.12ab | 1.67±0.04ab | 1.86±0.06a |
| 乳酸菌(log10cfu·g-1FM) | 4.69±0.24 | 4.67±0.42 | 5.11±0.74 | 4.88±0.37 |
| 酵母菌(log10cfu·g-1FM) | 2.92±0.26a | 2.15±0.21b | 2.49±0.20b | 2.42±0.10b |
| 霉菌(log10cfu·g-1FM) | 2.63±0.31 | 2.30±0.30 | 2.36±0.39 | 2.46±0.41 |
| 大肠杆菌(log10cfu·g-1FM) | 4.53±0.63 | 4.26±0.94 | 4.75±0.16 | 4.44±0.11 |
注：表中小写字母表示同行的差异性。
2、产酸高乳酸菌添加处理青贮饲料、青贮袋包装和保存：
青贮荔枝枝叶：取500g切碎的荔枝枝叶，加10mL纯水混合均匀后平均分装在3个聚乙烯塑料袋中作为对照处理(CK)。另取切碎的荔枝枝叶500g按比例添加106cfu·g-1的植物乳杆菌为LP组，混合均匀后平均分装在3个聚乙烯塑料袋中作为处理组。所述植物乳杆菌是利用实施例2所述的菌粉进行加纯水后活化20min获得的。
所有制作的青贮袋，均用微型真空封口机进行密封处理，室温保存3、7、14和30天后分别打开青贮袋测定青贮品质相关指标。
3、青贮品质测定：室温保存3、7、14和30天后，打开青贮袋。测定干物质含量，pH值，乳酸菌、酵母菌、霉菌和大肠杆菌数量，乳酸和乙酸有机酸含量，粗蛋白和氨态氮的含量，体外48h干物质消化率和72h瘤胃体外产气量。结果如表3、表4、表5、表6、表7和图1所示。各项目测定方法如下：
干物质测定：开袋后，将青贮样品混合均匀后，称重取样放在65℃恒温烘箱中48h左右，烘至绝干，计算烘干前后的重量比值，即为干物质含量。
pH值测定：开袋后，按照五点取样法随机取青贮样品20g，加入180mL蒸馏水，混合均匀后经家用榨汁机榨汁1min，依次用4层纱布和中速定性滤纸过滤，得到浸提液，采用pH计(PHS-3C，上海雷磁)测量pH值。
可溶性糖的测定：使用干物质通过可溶性糖测定试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定其含量。
纤维(中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维)测定：使用Ringbio纤维测定仪(山东瑞百澳仪器)测定纤维含量。
粗蛋白(CP)和氨态氮(NH3-N)的测定：采用凯氏定氮法测定粗蛋白；用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮的含量。
有机酸的测定：浸提液经0.22μm孔径的滤膜过滤得到滤液，采用岛津GC-14型高效液相色谱仪(色谱柱：Shodex Rspak KC-811s DVB gel column，日本；检测器：SPD-M10AVP)测定乳酸和乙酸含量，流动相为3mmol·L-1高氯酸，流速为1mL·min-1；柱温为50℃；检测波长为210nm，进样量为5μL。
乳酸菌、酵母菌、霉菌和大肠杆菌数量测定：按照五点取样法随机取样品20g，加入180mL灭菌的生理盐水，混合均匀后逐级稀释，微生物数量测定采用平板计数法。乳酸菌培养采用MRS琼脂培养基，酵母菌和霉菌采用孟加拉红(虎红)琼脂培养基，大肠杆菌培养采用结晶紫中性红胆盐琼脂培养基(广州鼎国生物技术有限公司)；乳酸菌和大肠杆菌30℃培养箱恒温培养2天，酵母菌和霉菌28℃培养箱培养2天。
72h瘤胃体外产气量和体外48h干物质消化率的测定均送至北京正方兴达科技发展有限公司检测。
表3晚埔荔枝枝叶添加植物乳杆菌青贮的发酵品质和蛋白组成
注：T表示处理；D表示天数；T*D表示处理和天数的交互作用；不同小写字母表示同行之间的差异性，不同大写字母表示同列之间的差异性。
表4乌叶舅荔枝枝叶添加植物乳杆菌青贮的发酵品质和蛋白组成
注：T表示处理；D表示天数；T*D表示处理和天数的交互作用；不同小写字母表示同行之间的差异性，不同大写字母表示同列之间的差异性。
表5桶仔荔枝枝叶添加植物乳杆菌青贮的发酵品质和蛋白组成
注：T表示处理；D表示天数；T*D表示处理和天数的交互作用；不同小写字母表示同行之间的差异性，不同大写字母表示同列之间的差异性。
表6状元红荔枝枝叶添加植物乳杆菌青贮的发酵品质和蛋白组成
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注：T表示处理；D表示天数；T*D表示处理和天数的交互作用；不同小写字母表示同行之间的差异性，不同大写字母表示同列之间的差异性。
表7不同荔枝枝叶体外48h干物质消化率
注：CK表示对照组；LP表示添加产酸高植物乳杆菌处理组；不同大写字母表示同列之间的差异性。
从上述表格和图片可知，采用了本发明方法后，荔枝枝叶的青贮品质明显提高。随着青贮天数的增加，对照组和添加产酸高乳酸菌的处理组的pH值均显著降低，并且处理组比对照组的pH值显著降低。相较于对照组的青贮荔枝枝叶来看，产酸高乳酸菌添加组显著增加了青贮晚埔荔枝枝叶的乳酸菌数量；并且显著降低了晚埔荔枝枝叶青贮大肠杆菌的数量和氨态氮的含量；随着天数的增加，处理组的酵母菌和霉菌的数量都低于检测值。荔枝枝叶青贮添加LP的处理组的体外48h干物质消化率普遍高于对照组，其中桶仔荔枝品种青贮的体外48h干物质消化率显著高于对照组。综上所述，添加产酸高乳酸菌对四个不同品种的荔枝枝叶青贮品质的改善和营养成分的保存有着明显的改善效果。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制。
Claims (1)
1.植物乳酸菌NCL-LP2在提高青贮饲料品质中的应用，其特征在于，所述植物乳酸菌NCL-LP2的保藏号为：CGMCC No.23490，所述的青贮饲料为荔枝枝叶，所述的植物乳酸菌NCL-LP2的添加量为106 cfu·g-1。
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