CN113832086B - 两歧双歧杆菌bxm0及其应用 - Google Patents

两歧双歧杆菌bxm0及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物及其应用领域，提供了两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0，其保藏编号为CGMCC No.22146。本发明还提供了两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0在生产GABA和预防和/或治疗抑郁症中的应用。本发明提供的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0具有良好的生产GABA能力，能够明显缓解抑郁症模型小鼠的抑郁样行为，为日后开发有效的抗抑郁益生菌产品提供了很好的科学依据，具有很大的潜在市场价值。

Description

两歧双歧杆菌BXM0及其应用
技术领域
本发明属于微生物及其应用领域，特别涉及两歧双歧杆菌BXM0及其应用。
背景技术
现代都市工作和生活节奏加快，紧张和压力每天不断的充斥着我们每一个人，作息不规律，年龄增长、代谢免疫下降等内在压力不断地变化，失眠、焦虑和亚健康成为很多人的标签，长久积累的压力会导致失眠、精神不振，胃肠道疾病，甚至抑郁等。据2019年世界卫生组织（WHO）统计的最新数据显示，全球有超3.5亿抑郁症患者，截止2019年，中国抑郁人数超过9500万人，抑郁症患者的主要核心表现为心情低落，兴趣丧失以及无精打采，严重者失眠，对生活失去兴趣，轻生厌世，自残自杀。预计2030年抑郁症将成为世界第一大负担疾病。一般来说，女性发病率高于男性，年龄越大，也越容易患抑郁症，女性抑郁症患者约占群体的一半以上（65%），另外，低收入国家的人群也更易患抑郁症。
目前针对抑郁症的治疗除了心理疏导，运动锻炼等外在调节外，临床上采用的抗抑郁药物主要通过改善5-羟色胺来发挥作用的，比如氟西汀，帕罗西汀，舍曲林等调节5-羟色胺的重吸收。但这些药物长久使用会引发较大的副作用，因此这些药物仅限制使用在一些病情严重的患者群体，对于当前庞大的抑郁人群来说，这种药物治疗是不能广泛应用的。因此，寻找和开发毒副作用低，安全性高并且价格经济实惠的治疗策略和产品是当前研究的重点。
γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，简称GABA）是一种非蛋白质天然氨基酸，在动、植物和微生物中广泛存在。GABA是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质。研究表明摄入一定量的GABA能够改善机体睡眠、降低血压、治疗癫痫和调节情绪等生理功效。动物及临床人群试验也证实GABA具有改善小鼠抑郁样行为和缓解人群抑郁症的疗效。随着研究的深入，GABA已发展成为一种新型功能性因子，被广泛应用于医药、食品保健及农业等行业。目前，GABA的食品安全性已获得包括美国和日本在内等国家的广泛认可，我国也于2009年批准GABA为新资源食品（卫生部2009年第12号公告）。因此，含有GABA的膳食补充剂也越来越受到大众的欢迎。
目前GABA的来源主要有三个途径：膳食补充，化学合成和微生物发酵。其中，微生物发酵是当下研究GABA来源的一个热点。肠道微生物，是一类栖居于宿主胃肠道系统内的微生物的统称，对机体代谢和免疫平衡起着至关重要的作用。研究发现，在人体肠道共生菌中，乳杆菌和双歧杆菌中分布较多的具有较高产生GABA能力的菌株，但同一菌属的不同菌种在合成产生GABA的能力上也存在显著的差异，短双歧杆菌、青春双歧杆菌和植物乳杆菌是目前报道较多的几种高产GABA的菌株。两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）是一种可用于保健食品的益生菌，能够缓解和改善过敏，肠道损伤。我们的研究发现两歧双歧杆菌也具有较优的产GABA能力，因此，筛选鉴定出能够高产GABA的两歧双歧杆菌益生菌对于扩充当前可供开发的益生菌库大有裨益，更为抑郁症的益生菌干预治疗提供潜在菌株，具有巨大的市场应用前景。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种具有高效产GABA能力的两歧双歧杆菌BXM0。该两歧双歧杆菌能够在培养基中不额外添加谷氨酸的情况下高产GABA，高效液相色谱HPLC检测其GABA产生量为0.273g/L。并且BXM0菌株能够显减少抑郁症模型小鼠在强迫游泳实验中的绝对不动时间，改善抑郁小鼠的抑郁样行为。
本发明第一方面提供了两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0，其保藏编号为CGMCC No. 22146。
本发明第二方面提供了含有下述至少一种的制剂在生产GABA中的应用：
1）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0；
2）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0菌剂；
3）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0活菌悬液；
4）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0死菌悬液；
5）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0代谢产物；
6）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0提取物；
其中，所述两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0为本发明第一方面所述的保藏编号为CGMCC No. 22146的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0。
本发明第三方面提供了含有下述至少一种的制剂在制备用于预防和/或治疗抑郁症的产品中的应用：
1）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0；
2）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0菌剂；
3）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0活菌悬液；
4）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0死菌悬液；
5）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0代谢产物；
6）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0提取物；
其中，所述两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0为本发明第一方面所述的保藏编号为CGMCC No. 22146的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0。
本发明第四方面提供了一种用于预防和/或治疗抑郁症的产品，含有下述至少一种：
1）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0；
2）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0菌剂；
3）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0活菌悬液；
4）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0死菌悬液；
5）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0代谢产物；
6）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0提取物；
其中，所述两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0为本发明第一方面所述的保藏编号为CGMCC No. 22146的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0。
保藏说明：
菌种名称：BXM0
拉丁名：Bifidobacterium bifidum
分类命名：两歧双歧杆菌
菌株编号：22146
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2021年4月9日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 22146
本发明提供的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0具有良好的生产GABA能力，能够明显缓解抑郁症模型小鼠的抑郁样行为，为日后开发有效的抗抑郁益生菌产品提供了很好的科学依据，具有很大的潜在市场价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本发明中的两歧双歧杆菌BXM0的质谱鉴定图。
图2示出了两歧双歧杆菌BXM0对抑郁症模型小鼠在强迫游泳实验中绝对不动时间的影响。n=8，*1与正常对照组比较，P<0.05；*2与模型对照组比较，P<0.05。
具体实施方式
为使本发明的技术方案、目的和优点更加清楚，下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
除非另外定义，本发明中使用的所有术语（包括技术术语和科学术语）均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在现有技术与本发明冲突的情况下，应当以本发明为准。
下述实施例中所使用的各种试剂、材料等，若无特别说明，均为可以从商业渠道获得的产品；下述实施例中所使用的各种测试、检测方法若无特别说明，均为本领域中的常规测试、检测方法，均可以从教科书、工具书或学术期刊中获得。
实施例1：两歧双歧杆菌BXM0的鉴定的制备
1.1 两歧双歧杆菌BXM0菌株鉴定
采集长期生活在北京城区的健康成年人的粪便样品，稀释后涂布于YCFA培养基，37℃厌氧培养24-48h，分离获得平板上不同的单菌落。用灭菌后的接种环挑取不同单菌落在新的YCFA固体培养基平板上划线纯化，37℃厌氧培养48h，得到纯化单菌落。将每个纯化单菌落涂布在质谱板上，分别加入裂解液和基质，干燥后在MALDI-TOF MS 1000质谱仪（Autobio，郑州安图生物科技有限公司）上进行质谱上机鉴定。鉴定完成后将各菌株于-80℃冻存在本公司的菌种资源库中，以待后用。其中，本发明所涉及的两歧双歧杆菌BXM0菌株鉴定结果如图1所示。根据图1所示的结果可见，BXM0菌株与两歧双歧杆菌具有极高的相似性，据此，将其命名为两歧双歧杆菌BXM0菌株。
1.2 两歧双歧杆菌BXM0菌株制备
取-80℃冻存的BXM0菌液涂布于YCFA固体平板，在37℃条件下倒置培养24-48h后，取单菌落接种于液体YCFA培养基中，37℃培养18-24h，得到一代菌液；取一代菌液10%接种至新鲜YCFA液体培养基，37℃培养18-24h得到二代菌液；取二代菌液10%接种于新鲜的YCFA液体培养基中，37℃培养18-24h得到工作菌液。将工作菌液置于13000 rpm，4℃的条件下离心15 min后，分别收集上清和沉淀留为后续实验用；其中菌体沉淀用生理盐水重悬，即可获得具有活菌体的活菌液。
实施例2：纸层析法检测GABA
取1mL两歧双歧杆菌BXM0发酵液在4℃，12,000 rpm条件下离心10 min以除去菌体，上清转移至新的离心管保存备用。吸取4 μL样品上清（设置2次重复）、对应培养基和任一浓度的GABA标准溶液（0.2，0.4，0.8，1.2，1.6和2.0 g/L）在滤纸上点样，点样线距层析纸边缘2.0 cm，点样间距2.0 cm。待样本斑点干燥后将层析纸在展开剂（V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）＝5∶3∶2，茚三酮用量为1.2%（w/v））中展开50 min（展开剂距离层析纸上缘约1cm左右时即可）。层析结束后，立即将层析纸放入90℃烘箱中干燥显色30 min。显色后将与标准品位置一致的斑点剪下，用5 mL洗脱液 (V75%乙醇：V0.6%硫酸铜=38：2)在40℃、50rpm条件下洗脱40 min。洗脱结束后将洗脱液彻底混匀，取200 μL于酶标板设置3次重复，在510nm处测定其吸光度值。将所测得吸光度值代入根据GABA标准溶液绘制的标准曲线公式（y值），计算样本中所含GABA浓度值（x，单位为g/L）。
两歧双歧杆菌BXM0在YCFA液体培养基中（没有额外添加L-谷氨酸）培养24小时，代谢产生GABA的能力经三次纸层析法检测如表1所示：
表1. 纸层析法检测BXM0菌株产生GABA的量
Figure 379753DEST_PATH_IMAGE001
实施例3：高效液相色谱HPLC法检测菌液GABA
准确称取GABA，配制成质量浓度为0.04，0.08，0.12，0.16和0.20 g/L的GABA标准溶液，取各浓度的GABA标准溶液100μL，向其中分别加入100μL的OPA（邻苯二甲醛）衍生剂，充分混匀后室温条件下孵育至少90s。反应后溶液各取20 μL进样，于338 nm处测吸收峰值。以峰面积建立GABA浓度检测标准曲线。然后，将稀释后的BXM0上清液中加入OPA（邻苯二甲醛）衍生剂，孵育混匀后进样，于338 nm处测吸收峰值。
两歧双歧杆菌BXM0在YCFA液体培养基中（没有额外添加L-谷氨酸）培养24小时，经HPLC法检测能够产生GABA的量为0.273g/L。值得一提的，很多文献报道的产GABA菌株的培养基中会添加不同浓度的谷氨酸以刺激菌株产生GABA，例如，一株青春双歧杆菌能够产生GABA的量为0.2328g/L（朱宗涛等，高产氨基丁酸的双歧杆菌的筛选及对抑郁细胞模型的改善作用，《食品工业科技》，2020）；而我们发现的两歧双歧杆菌BXM0菌株能够在没有外源谷氨酸的培养条件下产生更多的GABA，说明BXM0菌株具有明显的高产GABA的能力。
实施例4：两歧双歧杆菌BXM0对抑郁症模型小鼠的作用
通过慢性应激刺激构建的抑郁症模型小鼠是研究抑郁症发病机制及筛选抑郁症治疗药物研究中最常用的动物模型。因此，在以下实施例中采用通过慢性应激刺激构建的抑郁症模型小鼠作为受试对象。
抑郁症小鼠造模：采购雄性昆明种小鼠32只，体重20g左右，适应性喂养一周后随机分为4组：正常组对照，模型对照组，阳性组（艾司西酞普兰组）和益生菌组，每组8只小鼠。采用慢性应激因素包括晃动鼠笼（5 min）、冷刺激（小鼠放置在冰上，1 h）、束缚（1 h）、拥挤饲养（10只/笼，6 h）、倾斜鼠笼（45°，12 h）、禁水（12 h）、禁食（12 h）、空笼（12 h）、湿笼（12h）、昼夜颠倒（24 h）及令小鼠恐惧的气味（大鼠垫料，12 h）刺激小鼠构建抑郁模型。实验小鼠每天随机接受3种不同的刺激，相邻两天不能接受同一种刺激，慢性应激持续5周。
动物模型：小鼠强迫游泳实验
给益生菌小鼠每日通过灌胃方式（109CFU/mL/只）给受试小鼠灌胃两歧双歧杆菌BXM0活菌，持续15天。正常组合模型组小鼠则给予灌胃对应的YCFA培养基，阳性组小鼠给予艾司西酞普兰（10mg/kg）。在实验最后一天，灌胃1小时后将动物逐只放入实验水槽中观察6分钟，统计后5分钟内小鼠的绝对不动时间。
统计结果如图2所示，由图2可见，两歧双歧杆菌BXM0益生菌能够显著减少受试小鼠的绝对不动时间，与模型组相比，绝对不动时间由~250s降至~160s，并且其降低绝对不动时间的作用效应与药物艾司西酞普兰效果（~150s）相当。
抑郁症的一个主要的症状是动机行为的减少。强迫游泳实验中的游泳、攀爬是动物的动机行为，而绝对不动则反映了实验中动物消极的无动机状态。因此，上述结果表明本发明中的两歧双歧杆菌BXM0菌株能够明显缓解抑郁症模型小鼠的抑郁样行为，为日后开发有效的抗抑郁益生菌产品提供了很好的科学依据。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0，其保藏编号为CGMCC No. 22146。
2.含有下述至少一种的制剂在生产GABA中的应用：
1）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0；
2）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0菌剂；
3）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0活菌悬液；
4）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0死菌悬液；
5）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0代谢产物；
6）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0提取物；
其中，所述两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0为权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No. 22146的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0。
3.含有下述至少一种的制剂在制备用于预防和/或治疗抑郁症的产品中的应用：
1）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0；
2）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0菌剂；
3）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0活菌悬液；
4）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0死菌悬液；
5）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0代谢产物；
6）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0提取物；
其中，所述两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0为权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No. 22146的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0。
4.一种用于预防和/或治疗抑郁症的产品，含有下述至少一种：
1）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0；
2）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0菌剂；
3）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0活菌悬液；
4）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0死菌悬液；
5）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0代谢产物；
6）两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0提取物；
其中，所述两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0为权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No. 22146的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）BXM0。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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