CN105255752A - 高耐酸植物乳杆菌zdy2013 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株具有很强耐酸性的植物乳杆菌ZDY2013保藏地点为武汉市中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC?NO:M2014170。本发明植物乳杆菌分离于福建省农家自制酸豆角,为革兰氏阳性菌,生长速度快,极耐酸耐胆盐,能在胃肠液中保持较高的存活率,并能抑制食源性致病菌的增长。此外,还能调节肠道菌群多样性,改善宿主胃肠道健康。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域,公开一种新型的耐酸性很好的植物乳杆菌。
背景技术
植物乳杆菌是一种革兰氏阳性菌,最适生长温度为30-35℃,兼性厌氧。菌体呈短杆状,不产芽孢,在MRS琼脂平板培养基中呈乳白色不透明,圆形,光滑的菌落。植物乳杆菌为同型发酵乳酸菌,能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等,在发酵过程中只产生乳酸,是典型的兼性厌氧菌,有很强的的发酵碳水化合物的能力,较耐盐。植物乳杆菌与人类的生活密切相关,被广泛用于乳制品、肉类、蔬菜以及果汁中,能通过胃肠道并定植于肠道发挥益生作用。植物乳杆菌已被广泛应用于食品发酵、乳酸发酵和医疗保健。
发明内容
本发明的目的在于提供一种性能优良的植物乳杆菌。
本发明从传统发酵酸豆角中分离出植物乳杆菌,具有良好的益生性能,极高的耐酸耐胆盐性,耐胃肠液,抑菌性和抗药性;并且能调节肠道菌群,降低肠道中的条件致病菌,提高乳杆菌和双歧杆菌的比例,促进肠道健康,发挥益生菌的优良性能。
本发明耐酸植物乳杆菌ZDY2013(LactobacillusplantarumZDY2013),于2014年4月28日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学),编号:CCTCCNO:M2014170。
本发明耐酸植物乳杆菌ZDY2013可以在MRS琼脂平板培养基上生长,为革兰氏阳性杆菌,属于兼性厌氧生长,不产芽孢。为维持时间稳定地保存本发明植物乳杆菌的优良性能,将其保存在含有15%甘油的混合保存液中,于-80℃冻存,或将其保存在10%的脱脂乳中进行冻干保存。
为了对微生物进行鉴定和分类,对本发明所述植物乳杆菌ZDY2013进行了16SrDNA序列分析,结果为,与植物乳杆菌N3114显示出最高的同源性(99%),显示出与植物乳杆菌最高的分子系统学上的亲缘关系。因此,将此微生物鉴定为植物乳杆菌,并命名为植物乳杆菌ZDY2013。于2014年4月28日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:M2014170。植物乳杆菌ZDY2013的16SrDNA测序结果显示的碱基序列如本说明附件中的碱基序列表所示。
本发明的植物乳杆菌ZDY2013作为益生菌,不仅极耐酸耐盐,且具有抑菌性,能调节肠道微生态,促进宿主健康。是一株性能优良的菌种。因此具有很高的研究价值和应用价值。
有益效果:本发明植物乳杆菌相比常规植物乳杆菌具有很高的耐酸耐胆盐能力,对胃肠液的耐受能力,以及对肠道上皮细胞优异的粘附力,还具有调理肠道微生态的作用。本发明所述植物乳杆菌对抗生素具有一定的耐受性,其生长代谢过程中所产生的的有机酸,过氧化氢和生物素能抑制肠道致病菌的生长。从另一个侧面来说,本发明所述植物乳杆菌可用于制作治疗和预防肠道疾病的组合物,还可以用于食品和饲料的防腐。
附图说明
图1植物乳杆菌典型株ATCC8014和植物乳杆菌ZDY2013的生长曲线
图2植物乳杆菌典型株ATCC8014和植物乳杆菌ZDY2013的耐酸性
图3植物乳杆菌ZDY2013体外模拟胃肠道转运后的存活率
图4植物乳杆菌ZDY2013发酵上清液对致病菌的抑菌圈直径
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明,但实施例仅用于说明本发明,而本发明的应用范围不能以任何方式由这些实施例所限制。
实施例1:植物乳杆菌ZDY2013的分离与鉴定
从福建省永安市乡镇收集农户自家天然发酵的酸豆角样品,并及时将样品带回实验室进行乳酸菌分离。将酸豆角发酵液以10-1的梯度稀释,涂布于MRS(加溴甲酚紫作为指示剂)琼脂平板上,厌氧培养24h,挑取使培养基变黄的单菌落,在平板上划线分离,反复进行纯化培养,用革兰氏染色法观察菌落形态选出革兰氏阳性菌。将分离得到的菌株液体培养后,用PH计检测培养24h时pH值,筛选出产酸能力强的菌株。用接种环挑取单一的菌落作为模板,进行菌落PCR。将阳性PCR产物送至公司测序,见序列表。
将16SrDNA序列与数据库进行比对分析,所分离菌株的碱基序列与植物乳杆菌N3114具有很高的同源性(99%),因此被确认为植物乳杆菌,命名为植物乳杆菌ZDY2013,于2014年4月28日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:M2014170。经纯培养24小时后植物乳杆菌ZDY2013的培养上清液pH值为3.4,能产生大量有机酸。革兰氏染色结果呈阳性,可观察得出ZDY2013为棒状短杆菌。
如图1两条生长曲线所示,与植物乳杆菌典型株LactobaccillusplantarumATCC8014相比,植物乳杆菌ZDY2013具有更好的生长性能,生长速度更快,生物量更高,更长的稳定期。
实施例2:耐酸性评价
将植物乳杆菌的单菌落接种于5mLMRS培养基,37℃厌氧发酵18h,传代两次。以1%接种量分别接种于pH为6.5、5.0、3.5和2.0的MRS液体培养基中,测定初始活菌数以及随后的3h,6h,12h和24h的活菌数。
实验结果:
如图2所示,与植物乳杆菌典型株ATCC8014相对比可以发现,植物乳杆菌ZDY2013具有更强的耐酸能力,其能在较大的酸性范围(pH3.5-pH6.5)内生长,并且在pH2.0的MRS培养基中能维持3小时后无明显变化,6小时后活菌数无显著下降。这种长时间的耐酸性是植物乳杆菌典型株植物乳杆菌ATCC8014所不具有的。同时也说明ZDY2013具有长时间在胃肠道中存活的能力。其应用在生产加工中时,对加工条件的酸碱性要求更低。
实施例3:体外模拟胃肠液转运
将植物乳杆菌接种于模拟胃液,pH调为3.0,孵育90min,计数活菌数和存活率,将培养液离心用生理盐水洗一次后加入模拟十二指肠液,孵育10min,计数活菌数和存活率,将培养液离心用生理盐水洗一次,离心加入模拟肠液,孵育120min,计数活菌数和存活率。实验结果:
见图3,结果表明,植物乳杆菌ZDY2013在经胃液,十二指肠液和肠液连续孵育后存活率达到65.84%,活菌数高于益生菌在胃肠道中定植和发挥益生功能的最低要求溶度(106cfu/mL)。综合耐酸性实例和模拟胃肠转运实例,可得出植物乳杆菌ZDY2013具有更好的耐受性,在低pH和胆汁中能存活,顺利通过胃和十二指肠,保持足够高的活力到达小肠。
实施例4:发酵上清液的抑菌能力
将植物乳杆菌的单菌落接种于5mLMRS培养基,37℃厌氧发酵18h,传代两次。离心得上清液。将牛津杯置于MRS琼脂平板上,加入200uL发酵上清液。厌氧培养24h,用卡尺测定其抑菌圈的直径。
实验结果:如图4所示植物乳杆菌ZDY2013的发酵上清液对八种食源性致病菌都具有抑制作用。对单增李斯特的抑制效果最明显。抑菌圈直径分别为,单增李斯特菌(L.monocytogenes,28.33±0.76mm),铜绿假单胞菌(P.aeruginosa,21.83±0.58mm),鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium,19.17±0.29mm),阪崎肠杆菌(E.sakazakii,14.17±0.20mm),大肠杆菌(E.coliO157:H7,18.00±0.50mm),宋内氏志贺氏菌(S.sonnei,14.33±0.58mm),蜡样芽胞杆菌(B.cereus,17.83±0.29),和金黄色葡萄球菌(S.aureus,12.33±0.29mm)。
实施例5:调节胃肠道微生态抑制肠道致病菌。
20只小白鼠随机分为两组,实验组和对照组。实验组每天灌胃200uL菌悬液,对照组等剂量的生理盐水。14天后取结肠和盲肠内容物,以及粪便。用实时荧光定量PCR技术分析肠道菌群的变化。
实验结果:荧光定量PCR结果显示(如表1),
表1
七大菌群 | 结肠 | 盲肠 | 粪便 |
Enterococcus | 0.068±0.14 | 0.08±0.02 | 0.23±0.21 |
Lactobacillus | 1.55±0.75 | 1.73±0.82 | 1.91±0.19 |
Fusobacterium | 0.68±0.24 | 1.65±0.50 | 1.67±0.18 |
Enterobacterium | 0.51±0.24 | 0.25±0.03 | 1.85±0.23 |
Bacteroidetes | 0.68±0.18 | 1.17±0.05 | 2.86±0.48 |
Bifidobacterium | 1.84±0.48 | 1.43±0.46 | 0.50±0.15 |
Clostridium perfringens | 0.51±0.12 | 0.75±0.28 | 3.05±0.60 |
肠道七大类菌群的定量检测结果(倍数大于1表示数量上升,小于1表示数量下降)。小鼠在接受完植物乳杆菌ZDY2013连续灌胃14天的处理后,与对照组相比,肠道和粪便中的微生态发生了明显的改变,主要趋势为有益菌数量上升,条件致病菌数量下降,肠道健康得到明显的改善。有益菌数量的增加,具有维持肠道内菌群平衡,提高机体免疫力,促进营养物质吸收等多种功能。
Claims (1)
1.耐酸植物乳杆菌ZDY2013,于2014年4月28日保藏在中国典型培养物保藏中心,编号:CCTCCNO:M2014170。
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