KR20090077064A - 비타민 ｋ2 생산에 유용한 유산균 변형체의 수득 방법 및 식품 제조에 대한 적용 - Google Patents

비타민 ｋ2 생산에 유용한 유산균 변형체의 수득 방법 및 식품 제조에 대한 적용 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 표준 발효 조건 하에서, 동일한 조건에서 배양된 최초의 유산균 스템(lactic bacteria stem)보다 적어도 약 1.2 배 더 많은 K2 비타민을 생산하는 유산균 스템 변형체의 생산에 관한 것이다. 본 발명은 또한, K2 비타민이 강화된, 발효 제품 및/또는 신선한 유제품을 포함하는 식품의 제조 방법 및 이에 따라 수득된 식품에 관한 것이다.

Description

비타민 Ｋ2 생산에 유용한 유산균 변형체의 수득 방법 및 식품 제조에 대한 적용{METHOD FOR OBTAINING VARIANTS OF LACTIC BACTERIA USEFUL IN THE PRODUCTION OF K2 VITAMIN AND APPLICATIONS FOR THE PREPARATION OF FOOD PRODUCTS}
본 발명은 인간의 영양 흡수의 질적 및 양적 균형과 함량을 개선하기 위한 영양분, 비타민 및/또는 미량 원소가 풍부한 식품의 분야에 관한 것이다.
본 발명은 보다 특히 식품의 비타민 K 강화 방법을 포함한다.
보다 정확하게, 본 발명은, 표준 발효 조건 하에서, 동일한 조건 하에 배양된 최초의(initial) 유산균 균주보다 적어도 약 1.2 배 더 많은 비타민 K2를 생산하는 유산균 균주 변형체의 수득에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 비타민 K2가 강화된, 식품, 특히 발효된 제품 및/또는 신선한 유제품의 제조 방법과, 이에 따라 수득된 식품에 관한 것이다.
비타민 K는 두가지 자연적인 형태: 비타민 K1(또는 필로퀴논(phylloquinone)) 및 비타민 K2(또는 메나퀴논(menaquinone))로 나타나는 지용성 비타민이다.
비타민 K1은 식물에 의해 합성된다. 이는 원칙적으로 녹색 채소(엽채류) 및 대두유에서 발견된다. 비타민 K1는 혈액 응고 과정에 보다 직접 관련된다.
비타민 K2에 관하여, 이는 장내 세균총(intestinal flora)의 세균에 의해 생산된다. 이는 또한 발효 절차 후 특정 식품에서 소량 나타난다(치즈, 발효된 콩에 기초한 일본의 미소 및 낫토와 같은 전형적인 아시아 제품). 다수의 세균이 비타민 K2를 합성할 수 있다. 따라서, 장내 세균총 세균, 그리고 특히 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 박테로이드스 종(Bacteroides spp.) 종들에 추가하여, 유산균의 특정 종들 또는 아종들(subspecies), 이를테면 락토코커스 락티스 종 락티스(Lactococcus lactis spp. lactis), 락토코커스 락티스 종 크레모리스(Lactococcus lactis spp. cremoris), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 메센테로이드스(Leuconostoc mesenteroides) 및 프로피오니박테리움 종(Propionibacterium sp.)가 언급될 수 있다. 이러한 세균들에 의해 합성된 비타민 K2의 양은 일반적으로 발효유에 대해 약 29 내지 90　㎍/L로 변화된다(Morishita et al., 1999). 비타민 K2 생산은 동결-건조된 세포 펠렛 상에서 매우 자주 측정되고, 그리고 이러한 측정의 결과는 생산 수준과 관련하여, 시험된 균주들의 함수로서 상당히 상이하며(heterogeneous), 이것이 3 배를 초과하여 변화될 수 있다는 것을 강조하는 것은 중요하다(Morishita et al., 1999; Parker et al., 2003). 생물학적 활성의 관점에서, 비타민 K2는 특히 연조직 석회화(soft-tissue calcification)에 대한 이의 작용에 대해 알려져 있다.
비타민 K는 최초로는 혈액 응고 과정에서 이의 본질적인 역할에 대해 설명되었다. 따라서, 비타민 K의 심한 결핍(large deficiencies)은, 정상적인 응고 시간이 비정상적으로 연장되면서, 출혈(hemorrhages) 및 반상출혈(ecchymoses)에 이르게 한다. 오랫동안, 비타민 K의 심한 결핍은 성인에게서는 다소 드물고, 그리고 그 요구가, 결장 세균에 의한 비타민의 내생적 생산에 의해 그리고 다양하고 균형잡힌 식사(varied and balanced diet)에 의해 원칙적으로 만족스러운 방식으로 충족될 수 있는 것으로 생각되었다. 이와 관련하여, 위험에 처한 사람은 전형적으로 다음과 같다:
- 신생아, 이들의 장은 출생시에 비타민 K를 생산하는 세균을 갖고 있지 않음;
- 간(hepatic), 담즙 또는 장 기능 장애(간 질환, 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 대장염(colitis), 이질(dysentery) 등)를 갖는 개체; 및
- 오랫동안 항생제를 섭취한 개체.
보다 최근에, 인간의 건강에 미치는 비타민 K의 영향은 혈액 응고 메커니즘에서의 이의 역할로 제한되지 않는 것으로 밝혀졌다. 사실, 1980년대 이후로, 비타민 K는 골대사(bone metabolism)에서의 이의 역할에 대해서도 인식되어 왔다(Hart et al., 1984; Hart et al., 1985).
이 비타민은 골 형성 조절에서 오스테오칼신(osteocalcin)의 활성을 조절하는 효소 반응의 보조 인자(cofactor)이다(Hauschka PV et al., 1989; Ducy P et al., 1996). 이의 역할은 보다 정확하게는, 오스테오칼신, 골 형성 과정을 조절하는 중요한 단백질(key protein)의 카르복실화를 조절하는 것으로 구성된다. 비타민 K 결핍의 경우, 이 반응은 일어나지 않으며, 혈액 내에서 카르복실화된 오스테오칼신에 대한 탈카르복실화된(decarboxylated) 오스테오칼신의 비율이 증가된다(Vaananen et al., 1999).
서부 국가들의 인구통계학적 발전(Demographic development)은, 결과적으로 퇴행성 질환(degenerative diseases), 특히 골다공증의 증가와 관련있는, 점진적인 인구 고령화로 이끌었다. 결과적으로, 골다공증은 현재 주요 공중 보건 문제로서 인식되고 있다.
1990년대에 만들어진 인구통계학적 평가(Demographic estimates)는, 앞으로 50년 후에, 특히 고령자에게서 이 질환의 발병율이 상당히 증가할 것임을 예견함으로써 경고를 하였다. 따라서, 이전에는 거의 검사되지(screened for) 않았고 그리고 늦게 다루어졌던, 이 질환을 예방하기 위해 조치를 취하는 것은 조속히 필요하고 그리고 긴급하게 되었다.
현재, 골다공증의 예방은 아동기에 최적의 골성장을 통해 시작되고, 그리고 인생 전반에 걸쳐 골질량(bone mass)을 유지함으로써 지속되어야 하는 것으로 인식되고 있다. 영양학적 인자들이 골 비축물(bone reserves)의 성장(development) 및 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 현재까지, 골다공증을 예방하기 위해 계획되거나 또는 제안된 영양학적 방법들은 본질적으로 두가지 중요한 인자들, 칼슘 및 비타민 D에 의존하였다. 그러나, 본 발명자들은 현재 다른 영양학적 인자들이 주목할 가치가 있을 수 있다는 것을 알고 있다.
골 형성에서 비타민 K가 주 역할을 하는 결과로, 비타민 K는 점차 문헌에서 인간의 일생의 골 건강을 유지하기 위한 장래성 있는 수단(promising route)으로서 나타난다.
인간에서 비타민 K의 영양 권장 섭취량(recommended dietary intake)(1.5　㎍/일 /kg 체중)은 응고 현상에서 이의 역할을 고려하여 확립되었다. 현재, 최근의 연구가 제시한 바로는, 골 대사에서 비타민 K의 활성을 또한 고려한다면 이러한 영양 권장량(dietary recommendation)은 극히 낮게 어림되어 있다(underestimated)(Ronden et al., 1998).
비타민 K 요구에 대하여 여전히 이해가 부족하다 할지라도, 적은 섭취는 낮은 골 질량 및 성인의 골절(fracture) 위험 증가와 관련된다는 것은 변함 없다(Hart et al., 1985; Knapen et al., 1989; Szulc et al., 1993; Booth et al, 2000). 또한, 폐경기 여성에서의 중재 연구(intervention study)는, 비타민 K가 이러한 표적 그룹의 골 손실을 감소시키는 것을 보였다(Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003). 마지막으로, 동물 연구는, 이것이 피크 골 질량(peak bone mass) 동안, 특히 비타민 D와 공동 조합(synergetic combination)하는 경우에, 유리한 역할을 할 것으로 제시한다. 그러나, 비타민 K 및 골 성장을 확실히 연결하는 연구는 지금까지 동물에서만 실시되었다.
또한, 최근의 연구에서, 비타민 K가 골대사에, 그리고 특히, 골 질량의 구성 및 보존에 영향을 준다는 것을 지지하는 추가적인 주장이 발표되었다(Booth et al., 2000; Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003; Hirano et Ishi, 2002).
성인과 달리, 어린이에게서 비타민 K가 골 대사에 미치는 유익한 효과에 관한 이용가능한 데이터는 거의 없다. 최대 골 보존을 확립하기 위해 그리고 장래 골다공증의 위험으로부터 성인을 보호하기 위해, 성장기동안 골질량을 최적화하는 것이 필수적이라는 것만이 알려져 있다.
어쨌든, 현재 이용가능한 모든 데이터의 결과는, 식품에서 비타민 K 함량을 개선하는 것이, 개체가 우수한 골 구조를 확립하고 그리고 유지하도록 하는 흥미있고 그리고 장래성 있는 방법이라는 것이다.
이와 관련하여, 상당한 양의 비타민 K를 포함하는 시중의 상업적 제품이 이미 존재한다. 본 출원인이 프랑스에서 판매한 "Petits Gervais aux Fruits"와 같은, 젖산균을 포함하는 특정 유제품을 특히 들 수 있다. 그럼에도 불구하고, 한편으로는, 이러한 제품들의 비타민 K 함량은 일반적으로 사용된 발효체(ferments)의 종류에 따라 달라지고, 그리고 다른 한편으로는, 유제품에 통상적으로 사용되는 락토코커스 락티스 균주(Lactococcus lactis strain)는 사람들의 필요를 정확히 충족시키거나 또는 심지어 가능한 비타민 K 결핍의 완화를 돕기에 충분한 양의 비타민 K를 생산하지 못한다는 것이 주목된다.
따라서, 식품, 특히 발효된 식품 및/또는 신선한 유제품 분야의 현 상태에서, 요건을 만족시키고 그리고 필요시, 어린이, 청소년, 성인 및 노인 결핍을 치료하는데 기여하도록, 비타민 K를 충분한 양으로 포함하도록 요구된다.
이하에서, "비타민 K2" 및 "비타민 K" 라는 용어는 비타민 K2를 나타내기 위해 교환가능하게 사용된다.
따라서, 본 발명은, 변형체가 유도되는 균주에 의해 생산되는 것보다 훨씬 더 많은 양의 비타민 K를 생산하는 유산균 균주의 신규한 변형체를 사용하여 식품, 특히 발효된 제품 및/또는 신선한 유제품을 제조하는 것을 제안함으로써, 이러한 요구를 해결하고자 한다.
또한, 본 발명자들은 연구동안에 통상적인 생산 조건에 관하여 매우 잘 인지할 수 있는 방식으로 비타민 K의 생산을 개선하는 유산균의 사용 조건을 개발하였다. 따라서, 비타민 K2가 강화된, 발효된 제품 및/또는 신선한 유제품과 같은 식품을 제조하기 위하여, 2006년 10월 4일자 프랑스 특허 출원 제 06/08690 호의 주제인 비타민 K의 생산에 특히 유리한 것으로서 본 발명자에 의해 확인된 사용 조건 하에서 본 발명의 주제인 비타민 K "과잉생산자(overproducer)" 변형체를 유리하게 사용할 수 있다.
여기서, "변형체"라는 용어는 이하를 포함한다(cover):
- 자연적인 변형체, 즉 선택 압력(selection pressure)에 의해 표준(reference) 유산균 균주로부터 자발적으로 얻어진 자연적인 변형체; 어떤 유전가 조작이 가해졌던 것이 아니라 원칙적으로 표준 균주로부터 돌연변이 및 선택에 의해 얻어진 자연적인 변형체; 그리고
- 게놈 중에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이체, 이는 표준 균주에 적용된, 유전공학(genetic engineering)에 의해, 즉 유도 돌연변이 기술(directed mutagenesis technique)에 의해, 특히 벡터를 사용한 유전 형질전환에 의해 유도되었음.
일부 국가에서(특히 유럽에서), 식품 생산자가 미생물, 특히 살아있는 미생물이 혼입되어 있는 인간 및/또는 동물 식품용 제품을 개발할 때 주의(precautions)를 해야 함을 주목한다. 실제로, 유전자-변형된(genetically-modified) 유기체(여기서는 미생물)(GMOs 또는 돌연변이체)는 소비자에게 두려움 및 우려를 유발할 수 있다. 특정 나라에서 이러한 GMOs의 부정적인 이미지는, 대중이 GMOs를 포함하는 식품에 대해 불매운동을 벌이는 경향을 갖도록 한다. 따라서, 소비자가 계속적으로 이들에게 제공되는 식품의 내용물 및 이러한 제품이 포함하는 구성성분의 기원(origin)에 관해 보다 큰 투명성을 요구하는 상황에서, 생산자는 거의 독점적으로(exclusively) 또는 심지어 독점적으로 GMOs가 없는 제품을 제공하도록 동기부여될 수 있다. 따라서, 본 발명과 관련하여, 미생물을 포함하는 가공된 식품이, 독점적으로 자연적인 균주 또는 자연적인 균주의 변형체를 사용하여 제조되는 것은 유리할 수 있다.
제 1 측면에 따르면, 본 발명은 표준 발효 조건 하에서, 동일한 조건 하에 배양된 유산균 균주에 의해 생산된 것보다 적어도 약 1.2 배만큼 더 많은 양의 비타민 K2를 생산하는 유산균의 자연적인 변형체의 수득 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 적어도 다음을 포함한다:
a) 상기 유산균 균주를 표준 발효 조건 하에 세포 산화환원 상태(cellular redox state)의 변형을 유도하는 선택 배지 상에서 배양하는 단계; 및
b) 상기 변형체가, 동일한 조건 하에 배양된 상기 유산균 균주보다 적어도 약 1.2 배 더 많은 비타민 K2를 생산한다면 이를 선택하는 단계.
"변형체"는, 본 발명의 의미에서, 그들이 기원한 균주보다 더 많은 비타민 K2를 생산할 수 있는 유산균 균주이다. 보다 정확하게는, 본 발명에 따른 변형체는 최초의 균주보다 적어도 약 1.2 배 더 많은 비타민 K2를 생산할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 변형체에 의해 생산된 비타민 K2의 양은 동일한 표준 발효 조건 하에서 최초의 유산균 균주를 배양하여 수득된 것보다 적어도 약 1.5 배만큼 더 많다. 더 바람직하게는, 이러한 인수(factor)는 적어도 약 1.7, 더 바람직하게는 적어도 약 1.8, 그리고 더더욱 바람직하게는 적어도 약 1.9이다. 이러한 인자의 훨씬 더 바람직한 값은 적어도 2, 2.2, 2.4, 2.5, 2.7, 2.8, 2.9, 및 3이다.
"표준" 또는 "최초의" 유산균 균주는, 본 발명에 따른 변형체가 얻어지는 균주이다. 이러한 균주는 자연적일 수 있거나 또는 심지어 변형체 자체, 즉 자연적인 변형체 또는 돌연변이체일 수 있다.
본 발명의 범위 내에서, "실험실 조건"은 당업자에게 주지된 완전한 표준 발효 조건이다. 따라서, "실험실 조건" 및 "표준 발효 조건"이라는 표현은 완전히 동의어이다. 본 발명의 의미에서 바람직한 "실험실 조건"은 다음과 같다: 균주를 시판 M17 배지(DifcoTM M17) 상에서 또는 대응하는 배지 상에서 예비배양한다(precultured). 연이은 배양을 위해, 접종(inoculation)이 1%에서 예비배양물로 실시된다. 배양 온도는 약 30℃이다. 실험실 조건은 당업자에게 필요하다면, 일반 지식에 기초하여, 그리고 아마도 통상적인 실험 후에, 변경될 수 있다. 배양 배지는 유산균 균주, 특히 락토코커스 종 균주를 배양하기에 적합한 배지이다.
바람직한 실시형태에 따르면, 유산균 균주는 락토코커스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 엔테로코커스(Enterococcus) 및 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속들 가운데에서 선택된다. 이는 특히 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 슈도메센세로이드(Leuconostoc pseudomesenteroides), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 및 프로피오니박테리움 종(Propionibacterium sp.) 종들 가운데에서 선택된다.
바람직하게는, 이하 전개된 바와 같이, 본 발명에 따른 처리에서, 바시트라신(bacitracin) 또는 과산화물과 같은 산화제를 포함하는 배양 배지 가운데에서 선택된 선택 배지가 사용된다.
이와 같이 사용된 선택 배지는 세포 산화환원 상태에서 변형이 유발되는 것을 허용한다. 유리하게, 이러한 변형은, 상기 변형체에서 그리고 변형체가 유도되는 유산균 균주와 비교하여, 이하 표 1에 나열된 유전자 1 내지 27 가운데에서 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현의 변형과 상관관계가 있다.
Figure 112009026521515-PCT00001
바람직하게는, 유산균 균주와 관련하여 유전자 1 내지 27의 발현이 상기 변형체에서 변형된다.
"유전자 발현의 변형(modification of the gene expression)"은 본 명세서에서, 고려되는 유전자 발현이 최초의 유산균 균주에서 관찰되는 것에 대해 정량적으로(quantitatively) 변형되는 것을 의미한다:
- 발현은 증가되거나, 그리고 이는 바람직하게는 1 내지 15로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에 대해 그러할 것임;
- 또는 발현은 감소된다, 그리고 이는 바람직하게는 16 내지 27로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에 대해 그러할 것임.
바람직하게는, 변형체는, 변형체가 표준 발효 조건 하에서 이하를 생산하면 단계 b)로부터 선택된다:
- 발효체 CHN-12보다 적어도 약 1.5 배, 바람직하게는 적어도 약 2 배, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 3 배 더 많은 비타민 K; 및/또는
- 모범적인(model) 자연적인 균주 MG1363보다 적어도 약 1.5 배, 바람직하게는 적어도 약 2 배, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 3 배 그리고 유리하게는 최대 약 10 배 더 많은 비타민 K2.
유리하게는, 변형체는, 변형체가 표준 발효 조건 하에서 발효유(fermented milk) 100g 당 적어도 약 5.5㎍의 비타민 K2를 생산한다면 단계 b)에서 선택된다.
변형체에 의해 생산된 비타민 K2의 양이 표준 실험 조건 하에서 발효유 100 g 당 적어도 약 5.5㎍이라면, 이는 비타민 K2 "과잉생산자" 변형체로 불릴 수 있다. 특히, 본 발명의 의미에서 변형체는 표준 발효 조건 하에서 발효유 100g 당 적어도 약 5.7㎍, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 5.9㎍, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 6.1㎍, 그리고 더 우수하게는, 적어도 약 6.3㎍의 비타민 K2를 생산한다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 변형체는 표준 발효 조건 하에서 발효유 100g 당 적어도 약 6.5㎍, 바람직하게는 적어도 약 7㎍, 더 바람직하게는 적어도 약 7.5㎍, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 8㎍, 훨씬 더 바람직하게는 8.5　㎍, 훨씬 더더욱 바람직하게는 적어도 약 9㎍, 그리고 훨씬 우수하게는, 적어도 약 9.5㎍, 그리고 더 우수하게는, 적어도 약 10㎍의 비타민 K2를 생산한다.
제 2 측면에서, 본 발명은 상기된 바와 같은 처리에 의해 얻어질 수 있는 유산균 균주의 자연적인 변형체와, 상기 변형체의 생물학적으로 순수한 배양물(culture) 및 배양물 분획에 관한 것이며, 상기 변형체는 표준 발효 조건 하에서, 동일한 조건 하에 배양된 최초의 유산균 균주에 의해 생산된 것보다 적어도 약 1.2 배 더 많은 양의 비타민 K2를 생산한다.
특히, 본 발명에 따르는 변형체는, 실험실 조건(또는 표준 발효 조건) 하에서 이하를 생산한다:
- CHR. Hansen A/S (Horsholm, DK)에 의해 판매되는 CHN-12 발효체보다 적어도 약 1.5 배, 바람직하게는 적어도 약 2 배, 더 바람직하게는 적어도 약 3 배 더 많은 비타민 K2; 및/또는
- CBS (Baarn, NL)가 번호 CBS　364.89 하에 기탁한 모범적인 자연적 균주 락토코커스 락티스 종 크레모리스 MG1363(Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363)보다 적어도 약 1.5 배, 바람직하게는 적어도 약 2 배, 더더욱 바람직하게는 약 3 배, 그리고 유리하게는, 최대 적어도 약 10 배 더 많은 비타민 K2. 이러한 락토코커스 락티스 종 크레모리스의 모범적인 균주는 당업자에게 완전히 주지되어 있다. 이는 Gasson이 1983년에 최초로 기술하였다(Gasson M., 1983).
상기 주어진 "자연적인 변형체"의 정의와 일치하여, 본 발명에 따른 변형체는 적절한 배양 배지 상에서 선택 압력에 의해 얻어진 자연적인 변형체이다.
선택 압력에 의해 얻어진 이러한 자연적인 변형체의 몇가지 예가 본 출원에서 제공된다. 간단히(보다 상세한 설명에 대해서는, "실시예" 부분을 참조), 자연적인 변형체의 바람직한 예 및 이들의 수득 방법은 다음과 같다.
제 1 실시형태에 따르면, 본 발명에 따르는 자연적인 변형체는 바시트라신(bacitracin)을 함유하는 배양 배지 내에서 선택 압력에 의해 얻어진다. 최초의 균주의 함수로서, 배지 내 바시트라신의 농도는 예를 들어, 적어도 약 0.4　mg/L, 바람직하게는 적어도 약 1　mg/L, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 2　mg/L, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 3　mg/L 그리고 무엇보다도 가장 바람직하게는 적어도 약 4　mg/L이 될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르는 자연적인 변형체를 얻기 위해 사용되는 바시트라신의 농도는 처음에 사용된 유산균 균주의 바시트라신 내성 수준의 함수로서 결정될 것임은 당업자에게 명백하다. 필요하다면, 당업자는 최초의 균주의 특성의 함수로서 선택된 몇가지 상이한 농도들로 작업할 것이다. 유리하게는, 당업자는 바시트라신 농도 범위로 작업할 수 있다.
특히 흥미있는 자연적인 변형체는 본질적으로, 2006년 1월 20일자로 Collection Nationale de Culture des Microorganismes [National Microorganism Culture Collection] (CNCM, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 기탁된, 자연적인 변형체 I-3557와 동일한 생물학적 특성을 갖는다.
"자연적인 변형체 I-3557과 본질적으로 동일한 생물학적 특성을 갖는 변형체 A"는 여기서 바시트라신을 함유하는 배지 내에서 선택 압력에 의해 얻어진 자연적인 변형체이다. 그러나, 변형체 A를 얻기 위해 배지에 사용된 바시트라신의 농도는 본 정의를 만족시키기 위해 결정적인 것은 아니다. 결정적인 조건은, 대신에, 변형체 A가 실험실 조건 하에서, 대략 변형체 I3557 만큼 많은, 바람직하게는 적어도 변형체 I3557 만큼 많은 비타민 K2를 생산할 수 있는 것이다. 본 발명의 의미에서 자연적인 변형체는 바람직하게는 자연적인 변형체 I-3557이다.
제 2 실시형태에서, 본 발명에 따른 자연적인 변형체는, 적어도 하나의 산화제를 함유하는 배양 배지 상에서 선택 압력에 의해 얻어진다. 예를 들어, 산화제는 과산화물, 과염소 이온(perchloric ion), 제 1 철 이온(ferrous ion), 메나디온(menadione), 패러콰트(paraquat), 산소 또는 어떤 다른 적합한 산화제 화합물 가운데에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 산화제는 과산화물이다. 바시트라신에서와 같이, 배지 내 과산화물 농도는 최초의 유산균 균주의 함수로서 결정된다. 예를 들어, 다음 범위의 하나 이상의 과산화물 농도가 시험될 수 있다: 적어도 약 20, 25, 27, 28.5　mg/L. 다시 한번, 당업자는, 실험적으로 일반적인 방법으로 시험되는 과산화물에 적합한, 하나 이상의 농도, 또는 심지어 농도범위를 결정한다.
유리하게, 본 발명에 부합하는 자연적인 변형체는 본질적으로 자연적인 변형체 I-3558(2006년 1월 20일자로 CNCM에 기탁)와 동일한 생물학적 특성을 갖는다. 여기서는 상기 주어진 "본질적으로 자연적인 변형체 I-3557과 동일한 생물학적 특성을 갖는 변형체 A" 라는 표현의 정의가 필요한 변경을 가하여(바시트라신 대신 과산화물; 변형체 I-3557 대신 변형체 I-3558) 적용된다. 바람직하게는, 이러한 변형체는 자연적인 변형체 I-3558이다.
본 발명의 제 3 측면은, 앞선 상세한 설명에 부합하는, 표준 발효 조건 하에서, 동일한 조건 하에 배양된 최초의 균주보다 적어도 약 1.2 배 더 많은 비타민 K2를 생산하는, 유산균 균주의 자연적인 변형체를 얻기 위한 특정 선택 조건의 용도에 관한 것이다.
이는 특히:
- 바시트라신 내성의 용도; 및/또는
- 과산화물과 같은 산화제에 대한 내성의 용도이다.
앞서 지시된 바와 같이, 상기 자연적인 변형체는 유리하게는, 표준 발효 조건 하에서 발효유 100g 당 적어도 약 5.5 ㎍의 비타민 K2를 생산할 수 있다.
본 발명의 제 4 측면은 상기된 바와 같은 적어도 하나의 변형체를 포함하는 유산 발효체(lactic ferment)에 관한 것이다.
제 5 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 이하를 포함하는, 비타민 K2가 강화된 식품의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 상기 식품의 중간 제조에, 상기된 바와 같은 적어도 하나의 변형체 및/또는 적어도 하나의 발효체를 사용하는 단계; 및
b) 비타민 K2가 강화된 상기 제품을 얻는 단계.
대안적으로, 식품의 비타민 K2 함량 증가 방법은 적어도 다음을 포함한다:
a) 상기 식품의 중간 제조에, 상기된 바와 같은 적어도 하나의 변형체 및/또는 적어도 하나의 발효체를 사용하는 단계; 및
b) 비타민 K2가 강화된 상기 제품을 얻는 단계.
변형체 및/또는 유산 발효체는 특히, 제자리에서(in place)(식품 생산 위치에서) 예비배양된 세균 농축액(concentrates)을 사용함으로써, 또는 발효체 공급업자에 의해 예비배양되고 이어서 포장되고 그리고 식품 생산 위치 또는 위치들로 보내어진 세균을 사용함으로써 제공되고 있다. 공급업자는 세균을 신선하거나(fresh) 또는 동결된 상태로 포장할 수 있다; 대안적으로, 세균은 건조되거나 또는 동결-건조될 수 있다. 세균은 모든 경우에, 완전히 통상적인 방식으로 (어떤 다른 알려진 유산 발효체와 같이) 유제품 매스(mass)에 첨가된다.
본 발명의 제 6 측면은 상기된 바와같은 방법에 의해 얻어질 수 있는 비타민 K2가 강화된 식품에 관한 것이다. 본 발명은 인간 및/또는 동물 식품에 관한 것이며, 인간 식품이 강조된다. 유리하게는, 이러한 비타민 K2 강화 식품은, 이를 소비하는 사람의 뼈 고형성(bone solidity)을 강화시킨다. 바람직하게는, 이러한 사람은 어린이다.
바람직하게는, 본 발명의 의미에서 식품은 발효된 제품, 신선한 발효되거나 또는 발효되지 않은 유제품, 발효되거나 또는 발효되지 않은 식물즙(과일, 야채, 곡물, 콩 등)에 기초한 제품, 및 이의 조합 가운데에서 선택된다. 보다 특히 바람직한 방식으로, 본 발명의 의미에서 식품은 발효된 제품 및/또는 신선한 유제품이다.
본 발명과 관련하여, "신선한 유제품"은, 사람이 소비하기 위한, 보다 특히 신선하고 그리고 발효된 유제품, 즉 신선하고 그리고 발효된 유식품(dairy food)을 나타낸다. 본 출원은 특히 발효유 및 요구르트에 관한 것이다. 상기 신선하고 그리고 발효된 유식품은 대안적으로 프로마쥬 블랑(fromage blanc) 또는 쁘띠-스위스(petit-suisse)이 될 수 있다.
"발효유" 및 "요구르트"라는 용어는 낙농 산업에서 이의 일반적인 의미이다, 즉 인간 소비가 의도되는 그리고 우유 기질의 유산 발효에 기인하는 제품이다. 이러한 제품은 과일, 야채, 당(sugar) 등과 같은 이차 구성성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 1988년 12월 31일자로 문헌(Journal Officiel de la Republique Francaise)에 공개된, 발효유 및 요구르트에 관한, 1988년 12월 30일자 프랑스 법령(French Decree) 88-1203를 참조한다.
"식품법(Codex Alimentarius)"을 또한 참조할 수 있다. (FAO 및 WHO의 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission)에서 작성되고, 그리고 FAO의 정보부(Information Division)에서 공개됨, http://www.codexalimentarius.net에서 온라인 이용가능; 보다 특히 식품법(Codex Alimentarius "Codex Standards for milk and dairy products") 12권 및 표준 "CODEX STAN A-1 (a)-1975" 참조).
따라서, "발효유"라는 표현은 본 출원에서, 적어도 저온살균(pasteurization)과 같은 처리가 수행되고(undergone), 그리고 이어서 각 제품에 대한 하나 이상의 특징적인 종에 속하는 미생물이 접종된 우유 기질로부터 제조된 유제품에 대한 것이다. "발효유"는 사용된 우유 기질의 구성 요소를 제거하는 어떤 처리가 수행되지 않았고, 그리고 특히 응고물(coagulum)이 제거되지(drained) 않았다. "발효유"의 응고는 사용 미생물의 활성에 기인하는 것 이외의 수단에 의해 이루어지지 않아야 한다.
"요구르트"라는 용어는 지역적인 그리고 확립된 관습(usage)에 따라, 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)라 불리는 특정 호열성 유산균의 성장(development)에 의해 얻어진 발효유에 대한 것이며, 이는 유즙부(lacteous portion) g 당 세균수 적어도 천만의 양으로, 최종 제품에서 살아있어야 한다.
특정 나라에서, 규정은 요구르트 제품 내에 다른 유산균의 첨가, 그리고 특히 비피도박테리움(Bifidobacterium) 및/또는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및/또는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)의 부가적인 사용을 허용한다. 이러한 부가적인 유산 균주는, 장내 세균총의 균형을 개선하거나 또는 면역계를 조절하는 것과 같은 다양한 특성을 최종 제품에 부여하기 위한 것이다.
실제로, "발효유"라는 표현은 이와 같이 일반적으로 요구르트 이외의 발효유를 나타내기 위해 사용된다. 발효유 제품은 국가에 따라, 예를 들어 "케피어(Kefir)", "쿠미스(Kumis)", "라시(Lassi)", "다히(Dahi)", "레벤(Leben)", "필므조크(Filmjolk)", "빌리(Villi)", 및 "애시도필러스 우유(Acidophilus milk)"와 같은 다양한 이름을 가질 수 있다.
발효유의 경우, 발효된 우유 기질에 함유된 자유 유산(free lactic acid)의 양이 소비자에게 판매시 100g 당 0.6g보다 적지 않아야 하고, 그리고 유즙부에 대한 단백질의 함량은 보통 우유의 함량보다 적지 않아야 한다.
마지막으로, "프로마쥬 블랑" 또는 "쁘띠-스위스"라는 이름은 본 출원에서 유산균에 의해서만 발효된(그리고 유산 발효 이외의 어떤 발효도 없는), 숙성되지 않은 무염 치즈(unaged, unsalted cheese)에 대한 것이다. 프로마쥬 블랑의 건조 고체 내의 내용물은, 완전 탈수(complete desiccation) 후, 이의 지방 함량이 프로마쥬 블랑 100g 당 20g을 초과하는지 또는 20g 이하인지에 따라, 프로마쥬 블랑 100g 당 15g 또는 10g까지 낮춰질 수 있다. 프로마쥬 블랑의 건조 고체 함량은 13 내지 20%로 이루어진다. 쁘띠-스위스의 건조 고체 함량은 쁘띠-스위스 100g 당 23g 이상이다. 이는 일반적으로 25 내지 30%로 이루어진다. 프로마쥬 블랑 및 쁘띠-스위스는 일반적으로, 본 발명의 기술 분야에서 통상적으로 사용되는, "신선한 치즈(fresh cheese)"라는 이름 하에 그룹지어진다.
제 7 측면에서, 본 발명은 비타민 K2가 강화된 식품을 제조하기 위한, 상기된 바와 같은 적어도 하나의 변형체 및/또는 적어도 하나의 발효체의 용도에 관한 것이다.
유리하게, 이러한 비타민 K2가 강화된 식품은 이를 소비하는 사람의 뼈 고형성을 강화시킨다. 바람직하게는, 이러한 사람은 어린이다.
본 발명이 상기된 단일의 설명에 의해 제한되지 않는다는 것은 명백하다. 본 발명의 다른 실시형태 및 이점은, 순수하게 설명할 목적으로 제공된 이하의 실시예를 읽고 알 수 있다.
머리말에서와 같이, 이하 기재된 자연적인 변형체 수득을 위한 프로토콜은, 어떤 최초의 유산균 균주에 적용할 수 있다는 것을 유념해야 한다. 실질적인 이유로, 최초의 균주의 함수로서, 당업자는 본발명자에 의해 개발된 특정 실험 조건을 변형하게 될 수 있다. 어떤 경우든, 당업자가 이하의 절차에 도입할 수 있는 변형은, 사소하고 그리고 어떤 진보성을 포함하지 않는 단순한 통상적인 작업만을 필요로 할 것이다.
I- 바시트라신에 내성인 자연적인 변형체의 수득 및 사용
바시트라신 또는 과산화물과 같은 작용제(agent)에 노출되면 이러한 작용제에 대해 증가된 내성을 갖는 세균 균주를 선택할 수 있는 것으로 알려져 있다고 하더라도, 바시트라신 또는 과산화물 내성 및 세균의 비타민 K2 생산 수준 간의 결합은 문헌에 결코 확립된 바 없었다.
본 발명자들은 연구 범위 내에서, 세균이 비타민 K2 생산 증가를 수반하면서 바시트라신 또는 과산화물과 같은 특정 작용제에 대한 내성을 위한 고유의 메커니즘(original mechanism)을 발전시킬 수 있다는 것을 완전히 예상밖의 방식으로 발견하였다. 본 발명자들은 선택제(selection agent)로서 바시트라신 또는 과산화물을 사용함으로써 비타민 K2를 과잉생산할 수 있는 유산균(특히 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis))의 자연적인 변형체를 얻기 위해, 이러한 발견으로부터 이 익을 얻을 것으로 예상하였다.
I-1 바시트라신에 내성인 변형체를 얻기 위한 프로토콜
5　g/L 락토오스 (이하 M17 Lac 배지) 및 헤민(hemin)(20 μL/mL)(이하, M17 Lac + 헤민 배지)을 첨가한 2mL의 통상적인 시판 M17 배양 배지(M17 배지, DifcoTM)의 존재 하에 락토코커스 락티스의 자연적인 균주의 결정(crystal)으로부터 예비배양물(preculture)을 제조한다. 배양(incubation)은 30℃에서 교반하면서 수행되었다.
예비배양물은 바시트라신(4㎍/mL)이 보충된 2mL의 M17 Lac + 헤민에 접종하기 위한 것이었다. 접종도(degree of inoculation)는 1%였다. 이어서, 배양물은 30℃에서 48시간동안 교반하면서 배양되었다.
이어서, 100　μL의 이 현탁물(suspension)을 M17 Lac 아가 상에 위치시켰다. 2.5　mg 바시트라신으로 적신(soaked) 페이퍼 디스크를 접시 중심에 위치시켰다. 아가를 30℃에서 48시간동안 배양하였다. 페이퍼 디스크 부근의 클론을 2mL의 M17 Lac + 헤민　내에서 바시트라신 (4μg/mL)의 존재 하에 배양하였다. 배양은 30℃에서 24시간동안 교반하면서 지속되었다.
48시간동안 30℃에서 배양한 후 바시트라신(2　μg/mL)의 존재 하에 M17 Lac 아가 상에 세포를 분리하였다. 분리된 클론을 M17 Lac + 헤민 상에서 배양하였고, 그리고 이어서 30℃에서 24시간동안 교반하면서 배양하였다. 이 현탁물은 동결 스톡(frozen stock)을 생성하기 위하여 사용되었다.
이러한 실험은, 본 발명자들이, 2006년 1월 20일자로 CNCM에 기탁된 자연적인 변형 체 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 I-3557(Lactococcus lactis subsp. cremoris I-3557)을 선택할 수 있도록 한다.
I-2 "바시트라신" 변형체를 갖는 유제품 예 제조 프로토콜
예비배양이 2　mL M17 Lac 중에서 균주의 결정으로부터 수행되었다.
예비배양은 50mL UHT 전유(whole milk)에 1%로 접종에 사용되었고, 이는 30℃에서 24시간동안 배양되었다.
이하의 표 II는, 바시트라신 내성 변형체 및 대응하는 야생-형(wild-type)에 대하여, 비타민 K2 어세이의 결과를 ㎍ 등가물 MK-4/100g의 생성물로 나타낸다.
균주 I-3557 야생-형
비타민 K (㎍/100　g) 8.90 3.32
바시트라신-내성 변형체는 최초의 야생-형 균주에 비해 비타민 K를 3 배만큼 과잉생산한다.
II- 과산화물에 내성인 자연적인 변형체의 수득 및 사용
락토코커스 락티스 호흡(Lactococcus lactis respiration)은 꽤 최근에 발견되었다(Duwat et al., 2001). L.락티스(IL1403)의 균주의 게놈을 서열분석(Sequencing)하여, 유기 호흡(aerobic respiration)에 필요한 기능을 암호화하는 유전자의 존재를 확인하였다(Bolotin et al., 2001). 사실, L. 락티스는 메나퀴논 합성 및 시토크롬 D의 생물발생(biogenesis)에 필요한 단백질을 암호화하는 men 및 cytABCD 오페론을 갖는다. 이러한 종들은 또한 헴 합성의 마지막 단계들과 관련되는 세 유전자(hemH, hemK 및 hemN, 이들은 철을 헴에 부착시키기 위한 포르피린(porphyrin)의 산화에서 요구됨)를 갖지만, 이러한 처리의 처음의 단계들과 관련되는 유전자를 갖지 않는다. 그러나, L. 락티스는 프로토포르피리노겐(protoporphyrinogen)의 존재 하에 산화 포스포릴화(oxidative phosphorylation)를 수행할 수 있다.
L. 락티스는 배양 배지 내에서 산소 및 헴의 존재 하에 호흡할 수 있는 것으로 또한 나타났다. 이러한 호흡은, 세포가 보다 큰 생물량(biomass)에 도달할 수 있도록 하였고, 그리고 관찰된 최종 pH는 일반적으로 얻어지는 것보다 더 높다. 산소 및/또는 헴의 존재 하에서 배양하면 대략 발효의 최초 6 또는 7 시간동안 비슷한 성장 곡선(comparable growth curves)을 얻을 수 있다. 이어서, 산소 및 헴의 존재 하 배양물의 경우에 글루코오스 소비가 감소되고, 그리고 이에 따라 락테이트의 생산이 감소된다. 이는 배양물 내에서 후기에 일어나는 대사 시프트(metabolic shift)를 설명한다(translate). L. 락티스 호흡은 따라서, 급격한 성장기(exponential growth phase)의 끝을 향해 일어난다(Duwat et al., 2001).
L. 락티스 호흡의 역할은 아직 알려져 있지 않고, 이러한 타입의 발효성 대사(fermentative metabolism)에서 비타민 K2의 역할도 알려져 있지 않다. 본 발명자들은 또한, 호흡이 시험된 조건 하에서 아직 유도되지 않은 동안(배지 내에 어떤 헴도 없었고 그리고 배지의 우수한 산소화(oxygenation)를 허용하는 어떤 교반도 없었음) 비타민 K2가 L.락티스 균주에 의해 생산되었음을 관찰하였다.
세포질(cytoplasm) 내에서, 단백질은 세포외 단백질과 달리 다이술파이드 브릿지(disulfide bridge)를 거의 갖지 않았다. 다이술파이드 브릿지의 수의 제한을 허용하는 널리 보급된 효소 시스템(enzymatic system)이 존재한다. S-S 결합은 효소, 티오레독신(thioredoxin)에 의해 SH 작용기로 환원된다. 이 효소는 티오레독신 리덕타아제에 의해 재생된다. 비도 등(Vido et al (2005))은 유전 공학에 의해 L. 락티스 돌연변이체 trxB1 를 생성하였다. trxB1 유전자는 티오레독신 리덕타아제를 암호화한다. 이러한 돌연변이체에 의해 합성된 단백질의 2-차원 전기영동 연구(two-dimensional electrophoresis study)는, 이것이 비타민 K2 합성 경로의 특정 효소, 즉 MenB 및 MenD 효소를 과잉생산하는 것을 보였다.
이러한 데이터의 관점에서 그리고 개인적인 관찰 후에, 본 발명자에게는 L. 락티스에 의한 비타민 K2의 생산을 증진시키기 위해 가능한 방법 중 하나가 호흡을 유도하는 것일 수 있는 것으로 생각되었다. 또다른 방법은 산화성 스트레스(oxidative stress)에 반응하도록 비타민 K2를 이동시키기(mobilize) 위해 노력하는 것이 될 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명자들은 산화성 스트레스에 내성인 자연적인 변형체를 얻고자 노력하였다. 얻어진 자연적인 변형체가 Men 오페론의 과발현을 보이지 않는다는 것을 유념하는 것은 중요하다.
I-11 산화성 스트레스에 내성인 변형체 수득 프로토콜
과산화물이 사용가능한 산화물의 일례로서 선택되었다. 물론, 과염소 이온, 제 1 철 이온, 메나디온, 패러콰트, 산소 또는 어떤 다른 적합한 산화제 화합물과 같은 다른 산화제가 유사한 조건 하에서 사용될 수 있다.
M17 Lac 배지 상에서의 예비배양 후, 최초의 자연적인 균주는 증가 농도(예를 들어, 적어도 20 내지 적어도 약 25, 27, 28.5 mg/L의 범위)의 과산화물을 함유하는 배지 내에 이식되었다(transplanted). 배양물은 30 ℃에서 배양되었다. 24 시간 후, 농도 범위의 첫번째 튜브들은 어떤 성장도 보이지 않았으므로, 이들은 추가 24 시간동안 배양하기 위해 되돌려보내졌다. 이어서, 클론이 아가 배지 상에서 스트리킹(streaking)에 의해 분리되었다. 클론이 27　mg/L의 과산화물 농도에 대해 선택되었다. 본 발명자들은, 28.5　mg/L의 과산화물 농도를 넘어서는 어떤 성장도 없었다는 것을 주목하였다.
이러한 실험은, 본 발명자들은 2006년 1월 20일자로 CNCM에 기탁된 자연적인 변형체 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 I-3558을 선택하도록 하였다.
II-2 "과산화물" 변형체를 갖는 유제품 예의 제조 프로토콜
선택된 클론을 24 시간동안 전유 내에서 성장시켰다. 이어서, 시료를 취하고 그리고 최종 비타민 K 어세이를 위해 -80℃에서 동결시켰다.
이하의 표 III은, 과산화물-내성 변형체에 의해 생산된 비타민 K2의 양을, 최초의 균주에 의해 생산된 양과 비교하여 나타낸다(양은 ㎍ 등가물 MK-4/100g의 발효유로 나타냄).
균주 비타민 K (㎍/100g)
야생-형 2.92 ± 0.45
1-3558 5.94 ± 0.76
상기 표 III에서 알 수 있는 바와 같이, 변형체는 대응하는 야생-형 균주보다 대략 두배만큼 많은 비타민 K2를 생산한다.
III- 자연적인 변형체 I-3557 및 I-3558의 유전자형 특징화(genotype characterization).
III-1-물질 및 방법
균주를 M17 락토오스 배지 상에서 30℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 시판 전유는 각각의 이러한 균주에 의해 1% 예비배양물의 양으로 접종되었다. 접종된 우유는 12mL 튜브 내에 위치되었다. 발효는, 원하는 생리학적 상태, 급격한 성장기 또는 둔화기(slowing phase)에서, 튜브를 액체 질소 내에 넣음으로써(plunging) 중단시켰다. 이어서, 튜브를 사용될 때까지 -80℃에서 저장하였다. 앞의 실험에서, 비타민 K는 본질적으로 둔화기에서 생산되는 것으로 나타났다(데이터는 도시 않음).
·전체 RNA의 추출(extraction)
모든 시료는 동일하게 처리되었다.
이러한 시료를 RNA의 열화(degradation)를 막기 위해 RNA 보호물(RNA protect)(Qiagen - ref 76506)의 존재 하에 녹였다. 이러한 시료로부터의 세포를 원심분리로 회수하였다.
이어서, 각 시료의 세포 RNA를 Trizol®(Invitrogen-ref 15596-026)의 존재 하에 비드(Biospec 제품 - ref 11079101z, 지르코니아/실리카 비드 직경 0.1　mm)를 갖는 믹서 밀 MM 300 세포 디스럽터(Mixer Mill MM 300 cell disrupter)(Qiagen)로 분리하였다. 이어서, RNA의 농도 및 순도비(230/260 및 260/280　nm)를 ND-1000 Nanodrop® 분광광도계(Nanodrop Technologies)를 사용하여 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정하였다. RNA 품질(RIN, 비 16/23　S)도 2100 바이오분석기(2100 Bioanalyzer-expert software, version B.02.05)(Agilent Technologies) 및 RNA 6000 시리즈 II 나노 키트(Agilent Technologies - ref 5067-1511)로 측정하였다.
·mRNA의 라벨링(labeling) 및 DNA 칩 상의 혼성화
표적을 DNA 칩 상에 스포팅된(spotted) PCR 산물(PCR product)의 합성에 사용된 것과 동일한 특정 역 프라이머(specific reverse primer)의 역전사(reverse transcription)로 합성하였다. 이러한 직접 표지(direct marker)는 CyScribe 제 1 가닥 cDNA 라벨링 시스템 dCTP/정제 CyScribe GFX 키트(Amersham - ref RPN6202X) 및 뉴클레오타이드에 결합된 형광 분자 Cy3-dCTP/Cy5-dCTP(Perkin Elmer - ref NEL576/NEL577)로 유로젠텍 컴퍼니(Eurogentec company)에 의해 제조되었다.
락토코커스 락티스 크레모리스(Lactococcus lactis cremoris) MG1363 균주(NCBI 상에서 이용가능한 서열)의, PCR 산물에 DNA 칩 상의 라벨링된 표적을 혼성화(hydridization)하는 것은 유로젠텍 컴퍼니에 의해 수행되었고, 이들은 이러한 DNA 칩 자체를 생산 및 판매한다. 이 회사는 통상적인 혼성화 및 세척 프로토콜(washing protocol)을 사용한다(유로젠텍 혼성화 완충액(buffer)- ref AR-HYB-01, Advalytix Slidebooster SB800 station-Implen 내에서 42℃에서 하룻밤동안 배양, 혼성화된 DNA 칩을 0.2X SSC/0.1% SDS 완충액 중에서 5분동안 주변 온도에서 교반하면서 세척하고, 이어서 0.2X SSC 완충액에서 5분동안 주변 온도에서 이따금 교반하면서 헹구고, 이어서 DNA 칩을 1000 rpm에서 5분동안 원심분리함으로써 건조시킴).
혼성화 데이터는 Axon 4100A 스케너 및 GenePix Pro 5.1 소프트웨어(Axon Instruments)로 유로젠텍 컴퍼니에 의해 얻어졌다. 이어서, 혼성화된 DNA 스캔은 유로젠텍 컴퍼니에 의해 본 발명자들에게 보내졌다.
·Data 가공(process)
혼성화된 DNA 칩 스캐닝으로부터의 디지털 결과는 GenePix Pro 6.0 소프트웨어로 본 발명자들에 의해 얻어졌다.
이러한 예비(preliminary) 디지털 결과는 이어서 Gif sur Yvette (91)의 Transcriptomique GODMAP platform에 의해 개발된 MANGO 소프트웨어로 통계 가공하여 상당한 발현 비율을 얻었다; 유전자에 대응하는 각 스폿(spot)은 DNA 칩 상에 복제되었고(duplicated) 그리고 각 생물학적 실험은, 뉴클레오타이드에 결합된 혼입 혈광 분자에서 고유한 바이어스를 제한하기 위한 라벨 교환(label swap)(염료-교환(dye-swap))을 포함하여, 세번 재현되고, 이에 따라 비교를 위한 여섯 슬라이드를 나타내었다.
미분 발현 비(differential expression ratio)는, 발현비의 값(r ≥ 2.00 및 r ≤ 2.00)에 그리고 평균 배경 잡음(background noise)에 대해 조정된 p-값(<0.01)과 같은 재현성 기준(reproducibility criteria)에 기초하여 선택되었다.
III-2 - 결과
두 변형체는 특정 유전자 발현에 대해 유사한 결과를 나타냈다. 대다수의 관심대상 유전자는 세포의 산화환원 상태와 그리고 특히 Fe-S 클러스터와 관련하여 관계되었다. 이와 관련하여, 메티오닌 및 시스테인 대사는 철 전달(iron transport)에서와 같이 변형된다. 산화성 스트레스 방어 기제(defense mechanisms)와 관련된 몇가지 효소의 발현은 변형되었다: 티오레독신 H, 티오레독신 B1, NADH 데하이드로게나아제(NADH dehydrogenase), NADH 데하이드로게나아제들, 글루타티온 퍼옥시다아제 등.
급격한 상에서, L. 락티스 호흡과 관련있는 특정 효소가 과발현된다: 푸마레이트 리덕타아제(frdC) 그리고 시토크롬 옥시다아제(cydD). 유사하게, 퓨린 염기 대사가 변형되는 것으로 보인다.
이하의 표 IV는 특정 유전자의 발현비를 나타내고 그리고 둔화기에서 변형체 및 야생-형 균주 간의 비교를 확립한다.
Figure 112009026521515-PCT00002
이하의 표 V는 급격한 성장기에서 야생-형 균주와 비교하여 변형체의 유전자의 발현비를 나타낸다.
Figure 112009026521515-PCT00003
참조문헌
Figure 112009026521515-PCT00004
Figure 112009026521515-PCT00005
Figure 112009026521515-PCT00006
Figure 112009026521515-PCT00007
Figure 112009026521515-PCT00008

Claims (19)

  1. 적어도 다음을 포함하는, 표준 발효 조건 하에서, 동일한 조건 하에 배양된 유산균 균주에 의해 생산된 것보다 적어도 약 1.2 배만큼 더 많은 양의 비타민 K2를 생산하는 상기 유산균의 자연적인 변형체의 수득 방법:
    a) 상기 유산균 균주를 표준 발효 조건 하에 세포 산화환원 상태의 변형을 유도하는 선택 배지 상에서 배양하는 단계; 및
    b) 상기 변형체가, 동일한 조건 하에 배양된 상기 유산균 균주보다 적어도 1.2 배 더 많은 비타민 K2를 생산한다면 이를 선택하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균 균주는 락토코커스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 엔테로코커스(Enterococcus) 및 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 변형체의 수득 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 유산균 균주는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 슈도메센세로이드(Leuconostoc pseudomesenteroides), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 엔테로코커스 패시 움(Enterococcus faecium), 및 프로피오니박테리움 종(Propionibacterium sp.) 종들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 변형체의 수득 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 배지는 바시트라신 또는 과산화물과 같은 산화제를 포함하는 배양 배지로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 변형체의 수득 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 유전자 1 내지 27로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현이 상기 유산균 균주에 대한 상기 변형체에서 변형되는 것을 특징으로 하는 변형체의 수득 방법.
    Figure 112009026521515-PCT00009
  6. 제 5 항에 있어서,
    유전자 1 내지 27의 발현이 상기 유산균 균주에 대한 상기 변형체에서 변형되는 것을 특징으로 하는 변형체의 수득 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    유전자 1 내지 15로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현이 상기 유산균 균주에 관한 상기 변형체에서 증가되는 것을 특징으로 하는 변형체의 수득 방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 16 내지 27로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현은 상기 유산균 균주에 대한 상기 변형체에서 감소되는 것을 특징으로 하는 변형체의 수득 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는, 표준 발효 조건 하에서, 동일한 조건 하에 배양된 유산균 균주에 의해 생산된 것보다 적어도 약 1.2 배 더 많은 양의 비타민 K2를 생산하는 유산균 균주의 자연적인 변형체와, 상기 변형체의 생물학적으로 순수한 배양물 및 배양물 분획.
  10. 제 9 항에 있어서,
    2006년 1월 20일자로
    Figure 112009026521515-PCT00010
    에 기탁된 자연적인 변형체 I-3557인 것을 특징으로 하는 자연적인 변형체.
  11. 제 9 항에 있어서,
    2006년 1월 20일자로
    Figure 112009026521515-PCT00011
    에 기탁된 자연적인 변형체 I-3558인 것을 특징으로 하는 자연적인 변형체.
  12. 표준 발효 조건 하에서, 동일한 조건 하에 배양된 유산균 균주에 의해 생산된 것보다 적어도 약 1.2 배만큼 더 많은 양의 비타민 K2를 생산하는, 유산균 균주의 자연적인 변형체의 수득을 위한 바시트라신 내성의 용도.
  13. 표준 발효 조건 하에서, 동일한 조건 하에 배양된 유산균 균주에 의해 생산된 것보다 적어도 약 1.2 배만큼 더 많은 양의 비타민 K2를 생산하는, 유산균 균주의 자연적인 변형체의 수득을 위한, 과산화물과 같은 산화제에 대한 내성의 용도.
  14. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 변형체를 포함하는 유산 발효체.
  15. 적어도 이하를 포함하는, 비타민 K2가 강화된 식품의 제조 방법:
    a) 상기 식품의 중간 제조에, 제 9 항내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 변형체, 및/또는 제 14 항에 따른 발효체를 사용하는 단계; 및
    b) 비타민 K2가 강화된 상기 제품을 얻는 단계.
  16. 제 15 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 비타민 K2가 강화된 식품.
  17. 제 16 항에 있어서,
    발효된 제품 및/또는 신선한 유제품인 것을 특징으로 하는 식품.
  18. 비타민 K2가 강화된 식품을 제조하기 위한, 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 변형체, 및/또는 제 14 항에 따른 적어도 하나의 발효체의 용도.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 비타민 K2가 강화된 식품은 소비자의 뼈를 강화시키는 것을 특징으로 하는 용도.
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