BRPI0718039B1

BRPI0718039B1 - Process of obtaining variables of useful lactic bacteria to produce vitamin k2 and applications to the preparation of food products

Info

Publication number: BRPI0718039B1
Application number: BRPI0718039-0A
Authority: BR
Inventors: Garault Peggy; Quere Gaëlle; Beal Chloé; Bomchil Natalia; Michel Faurie Jean-; Gobert Guillaume; Lipowski Gérard
Original assignee: Compagnie Gervais Danone
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2007-10-04
Publication date: 2017-10-31
Also published as: MX2009003620A; WO2008040793A1; JP2010505407A; EP2079837A1; FR2906816A1; EP2079837B1; JP5330997B2; RU2446211C2; US7981657B2; JP2013150621A; CN101600795B; CA2664938A1; ZA200902294B; ES2498045T3; US20100047396A1; CN101600795A; CN102732457B; FR2906816B1; RU2009116436A; BRPI0718039A2

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE OBTENÇÃO DE VARIANTES DE BACTÉRIAS LÁCTICAS ÚTEIS PARA PRODUZIR A VITAMINA K2 E APLICAÇÕES AO PREPARO DE PRODUTOS ALIMENTÍCIOS". A presente invenção refere-se ao domínio dos produtos alimentícios ricos em nutrimentos, vitaminas e/ou oligoelementos, a fim de melhorar o teor e o equilíbrio qualitativo e quantitativo dos fornecimentos nutricionais no homem. A invenção refere-se mais particularmente, pelos meios de enriquecer os alimentos com vitamina K.

Mais precisamente, a presente invenção refere-se à obtenção de variantes de cepas de bactérias láctieas que produzem, em condições de fermentação-padrão, pelo menos aproximadamente 1,2 vez mais de vitamina K2 que as cepas de bactérias láctieas de partida cultivadas nas mesmas condições. A invenção refere-se também a um processo de preparo de produtos alimentícios, notadamente de produtos fermentados e/ou de produtos lácticos frescos, enriquecidos com vitamina K2, assim como os produtos alimentícios assim obtidos. A vitamina K é uma vitamina lipossolúvel que se apresenta sob duas formas naturais: a vitamina K1 (ou filoquinona) e a vitamina K2 (ou me-naquinona). A vitamina K1 é sintetizada pelos vegetais. É encontrada princi- [ palmente nos legumes verdes (legumeè-folhas) e no óleo de soja. A vitamina K1 interfere mais diretamente nos procèssos de coagulação do sangue. A vitamina K2 é produzida pelas bactérias da flora intestinal. Ela aparece também em pequenas quantidades em certos alimentos após um processo de fermentação (queijo, produtos asiáticos típicos, tais como o mi-so e o nabo japonês, à base de soja fermentada, etc.). Numerosas bactérias são capazes de sintetizar a vitamina K2. Assim, além das bactérias da flora intestinal e, notadamente, as espécies Escherichia coli, Bacillus subtilis e Bacteróides spp., podem-se citar certas espécies ou sub-espécies de bacté- rias lácticas, tais como Lactococcus lactis spp. Lactis, Lactococcus lactis spp. Cremoris, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteróides e Propioni-bacterium SP. A quantidade de vitamina K2 sintetizada por essas bactérias varia geralmente de aproximadamente 29 a 90 pg/l de leite fermentado (Mo-rishita et al., 1999). É importante sublinhar que medidas de produção de vitamina K são mais frequentemente realizadas a partir de liofilizados de resíduos celulares e os resultados dessas medidas revela uma grande hetero-geneidade dos níveis de produção, em função das cepas testadas, podendo variar do simples a no máximo o triplo (Morishita et al., 1999; Parker et al., 2003). Em termos de atividade biológica, a vitamina K2 é sobretudo conhecida por sua ação sobre a calcificação dos tecidos moles. A vitamina K foi inicialmente descrita por seu papel essencial no processo de coagulação do sangue. Assim, grandes carências em vitamina K acarretam hemorragias, com alongamento anormal do tempo de coagulação e das equimoses. Durante muito tempo considerou-se que as grandes carências em vitamina K eram mais raras no adulto, as necessidades podendo ser, em princípio, cobertas de maneira satisfatória por uma melhoria variada e equilibrada, e graças à produção endógena das vitaminas pelas bactérias cólicas. Em relação a isso, as pessoas com risco são tipicamente: - os recém-nascidos, cujos intestinos não possuem no nascimento as bactérias produtoras de vitamina K; - as pessoas, cujas funções hepáticas, biliares ou intestinais são perturbadas (doenças hepáticas, mucoviscidose, colites, disenterias...); e Mais recentemente, descobriu-se que o impacto da vitamina K sobre a saúde humana não se limitava a seu papel nos mecanismos de coagulação sanguínea. Com efeito, a partir dos anos 80, a vitamina K é também reconhecida por seu papel no metabolismo ósseo (Hart et al., 1984; Hart et , al., 1985).

Essa vitamina exerce o papel de cofator em uma reação enzimá-tica que acondiciona a atividade da osteocalcina no âmbito da regulagem da formação óssea. (Hauschka PV et al., 1989; Ducy P et al., 1996). Seu papel consiste mais precisamente em acondicionar a carboxilação da osteocalcina, proteína-chave que regula o processo de formação óssea. Em caso de deficiência em vitamina K, essa reação não ocorre, acarretando o aumento da proporção sanguínea osteocalcina descarboxilada sobre osteocalcina carbo-xilada (Vããnãnen et al., 1999). A evolução demográfica dos países ocidentais se traduziu por um envelhecimento progressivo das populações, associado em corolário a um aumento da prevalência das patologias degenerativas, notadamente da osteoporose. A esse respeito, a osteoporose está daqui para o futuro reconhecida como um problema maior de saúde pública.

As estimações demográficas estabelecidas nos anos 90 tocaram a campainha de alarme, prevendo um aumento considerável da incidência dessa patologia nos 50 anos futuros, notadamente nos idosos. Rapidamente, portanto, se impôs a necessidade e a urgência de empreender ações, a fim de prevenir essa patologia, até então raramente despistada e considerada tardiamente.

Daqui para o futuro foi reconhecido que a prevenção da osteoporose deve começar desde a infância, através de um crescimento ósseo ótimo, e continuar por toda a vida por uma manutenção da massa óssea. Sabe-se que os fatores nutricionais exercem um papel importante no desenvolvimento e na manutenção do patrimônio ósseo. Até hoje, as estratégias nutricionais consideradas ou propostas para prevenir a osteoporose se baseiam essencialmente em dois fatores-chaves que são o cálcio e a vitamina D. Contudo, sabe-se hoje em dia que outros fatores nutricionais poderíam apresentar um interesse notável.

Por seu papel maior na formação óssea, a vitamina K aparece cada vez mais na literatura como uma pista promissora para preservar a saúde óssea do homem ao longo da vida.

Os fornecimentos nutricionais recomendados em vitamina K no homem (1,5 pg/d/kg de peso) foram estabelecidos levando-se em consideração apenas seu papel nos fenômenos de coagulação. Ora, estudos recentes sugerem que esses fornecimentos nutricionais recomendados são finalmente sub-estimados, caso se considere também a atividade da vitamina K no metabolismo ósseo (Ronden et al., 1998).

Se as necessidades de vitamina K não são ainda bem-conhecidas, apenas pequenos complementos são associados a uma pequena massa óssea e a um risco aumentado de fraturas no adulto (Hart et al., 1985; Knapen et al., 1989; Azule et al., 1993; Booth et al., 2000). Além disso, estudos de intervenção nas mulheres na menopausa mostraram que a vitamina K podia permitir diminuir as perdas ósseas para esse alvo (Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003). Enfim, estudos no animal sugerem que ela poderia exercer um papel favorável no decorrer do pico de massa óssea e isto tanto melhor em caso de associação sinérgica com a vitamina D. Todavia, os estudos que ligam claramente a vitamina K e o crescimento ósseo no momento só foram feitos em animais.

Além disso, estudos recentes permitiram fornecer argumentos suplementares em favor do impacto da vitamina K sobre o metabolismo ósseo e, em particular, sobre a constituição e a preservação da massa óssea (Booth et al., 2000; Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003; Hirano et Ishi, 2002).

Contrariamente ao adulto, poucos dados estão ainda disponíveis, no que refere-se aos efeitos benéficos da vitamina K sobre o metabolismo ósseo da criança. Sabe-se somente que é essencial otimizar a massa óssea durante o período de crescimento, a fim de constituir um reservatório ósseo máximo e proteger o adulto contra o risco de osteoporose que possa vir.

De qualquer forma, sobressai do conjunto dos dados disponíveis atualmente a melhoria do teor em vitamina K dos produtos alimentícios é uma pista particularmente interessante e promissora para permitir ao indivíduo construir e manter uma boa constituição óssea.

Nesse contexto, existem produtos industriais no mercado alimentício contendo uma quantidade notável de vitamina K. Podem notada-mente citar certos produtos lácticos contendo bactérias lácticas, tais como os ílPetits Gervais aux Fruits" comercializados na França pela requerente. No-tar-se-á, todavia, que, por um lado, o teor desses produtos em vitamina K depende geralmente do tipo de fermentos utilizados e, por outro lado, as cepas de Lactococcus lactis classicamente utilizados nos produtos lácticos não produzem uma quantidade suficiente de vitamina K para verdadeiramente completar as necessidades da população, até mesmo para auxiliar a prevenção de eventuais carências em vitamina K.

Existe, portanto, uma necessidade na técnica atual para produtos alimentícios, notadamente produtos fermentados e/ou produtos lácticos frescos, que contêm a vitamina K em quantidades suficiente para contribuir para satisfazer e, se necessário, para completar as carências, tanto na criança e no adolescente, quanto no adulto e na pessoa idosa.

No que se segue, os termos “vitamina K2” e “vitamina K” são utilizadas indiferentemente para designar a vitamina K2. A presente invenção visa, portanto, responder a essa necessidade, propondo preparar produtos alimentícios, notadamente produtos fermentados e/ou produtos lácticos frescos, utilizando novas variantes de cepas de bactérias lácticas, que produzem quantidades de vitamina K significativamente superiores àquelas produzidas pelas cepas das quais elas derivam.

Além disso, no decorrer de seus trabalhos, os inventores desenvolveram condições de utilização das bactérias lácticas que favorecem, de maneira inteiramente sensível, a produção de vitamina K em relação às condições de produção clássicas. Assim, para fins do preparo de produtos alimentícios, tais como produtos fermentados e/ou produtos lácticos frescos, enriquecidos com vitamina K2, poder-se-á vantajosamente utilizar as variantes “superprodutoras” de vitamina K que constituem o objeto da presente invenção nas condições de utilização identificadas pelos inventores como sendo particularmente favoráveis à produção de vitamina K e constituindo o objeto do pedido de patente francesa n° 06 / 08690 de 4 de outubro 2006. O termo “variante” abrange no caso: - as variantes naturais, isto é, obtidas espontaneamente a partir de uma cepa de bactéria láctica de referência sob o efeito de uma pressão de seleção; as variantes naturais não sofrem, portanto, nenhuma manipula- ção genética, mas são obtidas principalmente por mutação e seleção a partir da cepa de referência; e - os mutantes que compreendem uma ou várias mutações em seu genoma, que foram induzidas por engenharia genética, isto é, por técnicas de mutagênese dirigida, notadamente por transformação genética com o auxílio de vetores aplicados à cepa de referência.

Notar-se-á que, em certos países (notadamente na Europa), precauções devem ser tomadas pelas indústrias dos alimentos, quando desenvolvem produtos destinados à alimentação humana e/ou animal, nos quais são incorporados microorganismos, mais particularmente microorganismos. Com efeito, os organismos (no caso, organismos) geneticamente modificados (OGM ou mutantes) podem suscitar um sentimento de temor e de apreensão nos consumidores. Essa imagem negativa da qual sofrem os OGM em certos países é tal que o público tem tendência a “boicotar” os alimentos que contêm OGM. Também, em um contexto no qual os consumidores exigem sempre mais transparência nos níveis do conteúdo dos produtos alimentícios que lhes são propostos e da origem dos ingredientes que esses produtos contêm, os industriais podem ser levados a propor produtos quase exclusivamente, até mesmo exclusivamente, sem OGM. No contexto da presente invenção, pode, portanto, ser vantajoso que os produtos alimentícios, oriundos da indústria e contendo sejam preparados, utilizando exclusivamente cepas naturais ou variantes naturais de cepas naturais.

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de uma variante natural de uma cepa de bactéria láctica produzindo, em condições de fermentação-padrão, uma quantidade de vitamina K2 superior, de um fator pelo menos igual a aproximadamente 1,2, àquela produzida por essa cepa de bactéria láctica cultivada nas mesmas condições, esse processo compreendendo pelo menos; a) a cultura dessa cepa de bactéria láctica em condições de fermentação-padrão, em um meio de seleção que induz uma modificação do estado de óxido-redução celular; e b) a seleção dessa variante se produz pelo menos aproximada- mente 1,2 vezes mais vitamina K2 que essa cepa de bactéria láctica cultivada nas mesmas condições.

As “variantes” são, no sentido da invenção, as cepas de bactérias lácticas capazes de produzir mais vitamina K2 do que as cepas das quais são oriundas. Mais precisamente, as variantes, de acordo com a invenção, são capazes de produzir pelo menos aproximadamente 1,2 vezes mais vitamina K2 do que as cepas de partida. De preferência, a quantidade de vitamina K2 produzida por uma variante, de acordo com a presente invenção, é superior, de um fator pelo menos igual a 1,5 àquela obtida, cultivando-se a cepa de bactéria láctica de partida nas mesmas condições de fermentação-padrão. Esse fator é de maneira ainda preferida pelo menos igual a aproximadamente 1,7, mais preferencialmente pelo menos igual a aproximadamente 1,8, mais preferencialmente ainda pelo menos igual a a-proximadamente 1,9. Valores desse fator ainda mais preferidos são de pelo menos cerca de 2; 2,2; 2,4; 2,5; 2,7; 2,8; 2,9; 3.

As cepas de bactérias lácticas “de referência” ou “de partida” são as cepas a partir das quais as variantes, de acordo com a invenção, são obtidas. Essas cepas podem ser naturais ou podem ser elas mesmas variantes, isto é, variantes naturais ou mutantes.

No âmbito da presente invenção, as “condições de laboratório” são condições de fermentação inteiramente padrão e bem-conhecidas do técnico. Assim, as expressões “condições de laboratório” e “condições de fermentação-padrão” são, no caso, perfeitamente sinônimas. As “condições de laboratório” preferidas no sentido da presente invenção são as seguintes: uma pré-cultura da cepa é realizada em meio comercial M17 (Difco® M17) ou em um meio equivalente. Para a cultura que se segue, a inseminação é feita a 1% com o auxílio da pré-cultura. A temperatura de incubação é de 30 °C aproximadamente. Reter-se-á que as condições de laboratório podem ser modificadas, em caso de necessidade pelo técnico, na base de seus conhecimentos gerais e, eventualmente, após experiências de desenvolvimento de rotina. O meio de cultura é um meio apropriado para cultivar as cepas de bactérias lácticas, notadamente as cepas de Lactococcus spp.

De acordo com um modo de realização preferido, a cepa de bactéria láctica é escolhida dentre os gêneros Lactococcus, Leuconostoc, Ente-rococcus e Propionibacterium. Ela é mais particularmente escolhida dentre as espécies Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudo-mensoteroides, Leuconostoc menseteróides, Leuconostoc dexatranicum, Enterococcus faecium, Propionibacterium SP.

De preferência, como foi desenvolvido no que se segue, no processo, de acordo com a invenção, utiliza-se um meio de seleção escolhido dentre os meios de cultura contendo a bacitracina ou um agente oxidante, tal como o peróxido. O meio de seleção assim utilizado permite induzir uma modificação do estado de óxido-redução da célula. Vantajosamente, essa modificação é correlacionada com a modificação, nessa variante e por comparação com a cepa da bactéria láctica da qual é oriunda, da expressão de pelo menos um gene escolhido dentre os genes n° 1 a 27 listados na seguinte tabela I: Tabela I

De preferência, a expressão dos genes n° 1 a 27 é modificada nessa variante, em relação à cepa da bactéria láctica.

Por “modificação da expressão de um gene”, no caso quer se dizer que a expressão do gene considerado é quantitativamente modificada em relação àquela observada na cepa de bactéria láctica de partida: - ou a expressão é aumentada, e este será, de preferência, o caso para pelo menos um gene escolhido dentre os genes n° 1 a 15 - ou a expressão é reduzida, este será, de preferência, o caso para pelo menos um gene escolhido dentre os genes n° 16 a 27.

De preferência, a variante é selecionada na etapa b), se produzir, em condições de fermentação-padrão: - pelo menos 1,5 vez mais aproximadamente, de preferência, pelo menos duas vezes mais aproximadamente, de preferência ainda pelo menos três vezes mais aproximadamente, de vitamina K2 que o fermento CHN-12; e/ou - pelo menos 1,5 vez mais aproximadamente, de preferência pelo menos 2 vezes mais aproximadamente; de preferência ainda pelo menos 3 vezes mais aproximadamente e, vantajosamente, de vitamina K2 que a cepa natural modelo MG1363.

Vantajosamente, a variante é selecionada na etapa b) se produz, em condições de fermentação-padrão, pelo menos 5,5 pg aproximadamente de vitamina K2 para 100 g de leite fermentado.

Se a quantidade de vitamina K2 produzida pelas variantes for de pelo menos 5,5 pg aproximadamente para 100 g de leite fermentado em condições de fermentação-padrão, será possível falar de variante “superpro- dutora” de vitamina K2. Em particular, uma variante no sentido da presente invenção produz pelo menos 5,7 pg aproximadamente, de preferência ainda pelo menos 5,9 pg aproximadamente, de maneira ainda preferida pelo menos 6,1 pg aproximadamente de vitamina K2 para 100 g de leite fermentado em condições de fermentação-padrão. Mais preferencialmente, uma variante, de acordo com a presente invenção, produz pelo menos 6,5 pg aproximadamente, de preferência pelo menos 7 pg aproximadamente, de preferência ainda pelo menos 7,5 pg aproximadamente, de maneira mais preferida pelo menos 8 pg aproximadamente, de maneira mais preferida ainda pelo menos 8,5 pg aproximadamente, de maneira ainda mais preferida pelo menos 9 pg aproximadamente, mais, pelo menos 9,5 pg aproximadamente, e ainda mais pelo menos 10 pg aproximadamente de vitamina K2 para 100 g de leite fermentado em condições de fermentação-padrão.

Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma variante natural de uma cepa de bactéria láctica capaz de ser obtida por um processo, tal como descrito acima, assim como as culturas e frações de culturas biologicamente puras dessa variante, essa variante produzindo, em condições de fermentação-padrão, uma quantidade de vitamina K2 superior, de um fator pelo menos igual a aproximadamente 1,2 àquela produzida pela cepa de bactéria láctica de partida cultivada nas mesmas condições.

Em particular, uma variante, de acordo com a presente invenção, produz, em condições de laboratório (ou condições de fermentação-padrão): - pelo menos aproximadamente 1,5 vezes mais, de preferência, pelo menos aproximadamente duas vezes mais, de preferência ainda pelo menos aproximadamente 3 vezes mais, de vitamina K2 que o fermento CHN-12 comercializado por CHR, Hansen A/S (Horsholm, DK); e/ou - pelo menos aproximadamente 1,5 vezes mais, de preferência pelo menos aproximadamente duas vezes mais, de preferência ainda pelo menos aproximadamente 3 vezes mais e, vantajosamente, até pelo menos aproximadamente 10 vezes mais, de vitamina K2 que a cepa natural modelo Lactococcus lactis ssp. Cremoris MG1363 depositada CBS (Baam, NL) sob o número CBS 364.89. Essa cepa modelo de Lactococcus lactis ssp. Cremo-ris é perfeitamente conhecida do técnico. Ela foi descrita pela primeira vez porGasson em 1983 (Gasson M., 1983).

Em acordo com a definição de “variante natural” dada mais acima, uma variante, de acordo com a presente invenção, é uma variante natural obtida por pressão de seleção sobre um meio de cultura apropriado. Vários exemplos dessas variantes naturais obtidos por pressão de seleção são fornecidos no presente pedido. Em resumo (para maiores detalhes ver a parte “exemplos” abaixo), exemplos preferidos de variantes naturais e métodos para obtê-las são os seguintes.

De acordo com um primeiro modo de realização, uma variante natural, de acordo com a invenção, é obtida por pressão de seleção sobre um meio de cultura contendo a bacitracina. Em função das cepas de partida, a concentração de bacitracina no meio pode ser, por exemplo, de pelo menos 0,4 mg/l aproximadamente, de preferência de pelo menos 1 mg/l aproximadamente, de preferência ainda de pelo menos 2 mg/l aproximadamente, de maneira ainda preferida de pelo menos 3 mg/l e de maneira preferida entre todas de pelo menos 4 mg/l aproximadamente. Todavia, é claro para o técnico que a concentração de bacitracina a utilizar para se obterem variantes naturais, de acordo com a invenção, será determinada em função do nível de resistência à bacitracina da cepa de bactéria láctica utilizada na partida. Se necessário, o técnico trabalhará com várias concentrações diferentes que ele escolherá em função das propriedades da cepa de partida. De maneira vantajosa, o técnico poderá trabalhar com faixas de concentrações de bacitracina.

Uma variante natural, particularmente interessante, apresenta essencialmente as mesmas propriedades biológicas que a variante natural I-3557, depositada na Coleção Nacional de Cultura dos Microorganismos (CNCM, Instituí Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França) em 20 de janeiro de 2006.

Pela expressão “uma variante A apresenta essencialmente as mesmas propriedades biológicas que a variante natural I-3557”, entende-se no caso que a variante A é uma variante natural obtida por pressão de seleção sobre um meio que compreende a bacitracina. Todavia, a concentração de bacitracina utilizada no meio para se obter a variante A não é determinan- í te para satisfazer a presente definição.: A condição determinante, ao contrário, é que a variante A seja capaz de piroduzir, nas condições de laboratório, aproximadamente tanto, de preferêncija pelo menos tanto, de vitamina K2 quanto à variante 1-3557. Uma variante natural no sentido da invenção é, de preferência, a variante natural 1-3557.

Em um segundo modo de realização, uma variante natural, de acordo com a invenção, é obtida por pressão de seleção sobre um meio de cultura, contendo pelo menos um agente oxidante. Por exemplo, o agente oxidante pode ser escolhido dentre o peróxido, os íons hipercalóricos, os íons ferrosos, aminadiona, o paraquat, o oxigênio ou qualquer outro composto oxidante apropriado. De preferência, o agente oxidante é o peróxido. Como para a bacitracina, a concentração de peróxido no meio é determinada em função da cepa de bactéria láctica de partida. Por exemplo, será possível testar uma ou várias concentrações de peróxido nas seguintes faixas: pelo menos 20, 25, 27, 28,5 mg/l aproximadamente. Ainda uma vez, o técnico determinará uma ou várias concentrações, até mesmo uma ou várias faixas de concentrações, apropriadas de peróxido que ele testará experimentalmente como de hábito.

Vantajosamente, uma variante natural, de acordo com a invenção, apresenta essencialmente as mesmas propriedades biológicas que a variante natural 1-3558 (depositada na CNCM em 20 de janeiro de 2006). A definição da expressão “uma variante A apresenta essencialmente as mesmas propriedades biológicas que a variante natural 1-3557”, dada mais acima, se aplica no caso mutatis mutancfis (peróxido ao invés de bacitracina; variante 1-3558 ao invés da variante 1-3557). De preferência, essa variante é a variante natural 1-3558.

Um terceiro aspecto da presente invenção visa utilizações de condições de seleção particulares para serem obtidas variantes naturais de cepas de bactérias lácticas que, de acordo com descrição precedente, pro- duzem, em condições de fermentação-padrão, pelo menos 1,2 vezes mais ainda de vitamina K2 do que as cepas de partida cultivadas nas mesmas condições.

Essas utilizações são notadamente: - a utilização da resistência à bacitracina; e/ou - a utilização da resistência a um agente oxidante, tal como o peróxido.

Conforme indicado anteriormente, essas variantes naturais são vantajosamente capazes de produzirem pelo menos 5,5 pg aproximadamente de vitamina K2 para 100 g de leite fermentado em condições de fermentação-padrão.

Um quarto aspecto da presente invenção refere-se a um fermento láctico que compreende pelo menos uma variante, tal como será descrito supra.

De acordo com um quinto aspecto, a presente invenção refere-se a um processo de produção de um produto alimentício enriquecido em vitamina K2, compreendendo pelo menos: a) a utilização de pelo menos uma variante e/ou pelo menos um fermento tal(is) como descrito(s) mais acima, em um preparo intermediário desse produto; e b) a obtenção desse produto enriquecido com a vitamina K2.

Alternativamente, um processo para aumentar o teor em vitamina K2 de um produto alimentício compreende pelo menos: a) a utilização de pelo menos uma variante e/ou pelo menos um fermento tal(is) como descrito(s) mais acima, em um preparo intermediário desse produto; e b) a obtenção desse produto enriquecido com vitamina K2.

As variantes e/ou o fermento láctico podem notadamente ser utilizados, utilizando-se concentrados de bactérias pré-cultivadas no local (no local de produção dos produtos alimentícios), ou, utilizando-se bactérias pré-cultivadas por um fornecedor de fermentos, depois acondicionadas e expedidas para o(s) local(is) de produção dos produtos alimentícios. Os for- necedores podem acondicionar as bactérias no estado fresco ou congelado; alternativamente, as bactérias podem ser secas ou liofilizadas. As bactérias são, em todos os casos, acrescentadas à massa leiteira, de maneira inteiramente clássica (como qualquer outro fermento láctico conhecido).

Um sexto aspecto da presente invenção visa um produto alimentício enriquecido em vitamina K2, capaz de ser obtido por um processo, tal como divulgado acima. A invenção se interessa pelos produtos alimentícios para o homem e/ou o animal, com uma preferência pelos produtos destinados à alimentação humana. Vantajosamente, esse produto alimentício enriquecido em vitamina K2 reforça a solidez dos ossos da pessoa que o consome. Essa pessoa é, de maneira preferida, uma criança.

De preferência, um produto alimentício, no sentido da invenção, é escolhido dentre os produtos fermentados, os produtos lácticos frescos fermentados ou não, os produtos à base de suco de origem vegetal (frutos, legumes, cereais, soja, etc) fermentados ou não, e suas combinações. De maneira mais particularmente preferida, um produto alimentício, no sentido da invenção, é um produto fermentado e/ou um produto láctico fresco.

No contexto da invenção, os “produtos lácticos frescos” designam mais particularmente produtos lácticos frescos e fermentados, prontos para o consumo humano, isto é, alimentos lácticos frescos e fermentados. No presente pedido, são mais particularmente visados os leites fermentados e iogurtes. Esses alimentos lácticos frescos e fermentados podem alternativamente ser queijos brancos ou petit-suisses. Dão-se aos termos “leites fermentados” e “iogurtes” suas significações usuais no domínio da indústria leiteira, isto é, produtos que são destinados ao consumo humano e que são oriundos da fermentação láctica aci-dificante de um substrato láctico. Esses produtos podem conter ingredientes secundários, tais como frutos, vegetais, açúcar, etc. Pode-se, por exemplo, se reportar ao decreto Francês n° 88-1203 de 30 de dezembro de 1988 relativo aos leites fermentados e ao iogurte, publicado no Journal Offície! de Ia République Française de 31 de dezembro de 1988.

Pode-se também ser reportar ao “Codex Alimentarius” (prepara- do pela comissão do Codex Alimentarius sob a égide da FAO e da OMS e publicado pela Divisão de Informação da FAO, disponível em linha sobre http://www.codexalimentarius.net ; cf. mais particularmente o volume 12 do Codex Alimentarius “Normas Codex para o leite e os produtos lácticos”, e a norma “CODEX STAN A-1 1(a)-1975”) A expressão “leite fermentado” é assim reservada no presente pedido ao produto láctico preparado com um substrato láctico que sofreu um tratamento pelo menos equivalente à pasteurização, inseminado com microorganismos pertencentes à espécie ou às espécies característica(s) de cada produto. Um “leite fermentado” não sofreu nenhum tratamento permitindo subtrair um elemento constitutivo substrato láctico utilizado e sobretudo não sofreu um esgotamento do coágulo. A coagulação dos “leites fermentados” não deve ser obtido por outros meios que aqueles que resultam da atividade dos microorganismos utilizados. O termo “iogurte” é reservado ao leite fermentado obtido, segundo os usos locais e constantes pelo desenvolvimento das bactérias lácticas termófilas específicas ditas Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus ther-mophilus, que devem se achar vivas no produto acabado, à razão de pelo menos 10 milhões de bactérias por grama levadas à parte láctea.

Em certos países, a regulamentação autoriza o acréscimo de outras bactérias lácticas na produção de iogurte, e notadamente a utilização adicional de cepas de Bifidobacterium e/ou Lactobacillus acidophilus e/ou Lactobacillus casei. Essas cepas lácticas adicionais são destinadas a conferir ao produto acabado diversas propriedades, tais como aquela de favorecer o equilíbrio da flora intestinal ou de modular o sistema imunológico.

Na prática, a expressão “leite fermentado” é, portanto, geralmente utilizada para designar os leites fermentados diferentes dos iogurtes. Ela pode, além disso assumir, conforme os países, nomes tão diversos quanto, por exemplo, “Kefir”, “Kumiss”, “Lassi”, “Dahi”, “Leben”, “Filmjôlk”, “Villi”, “A-cidophilus milk”.

Tratando-se dos leites fermentados, a quantidade de ácido láctico livre contida no substrato láctico fermentado não deve ser inferior a 0,6 g para 100 g, quando da venda ao consumidor, e o teor em matéria protéica fornecida à parte láctea não deve ser inferior àquela de um leite normal.

Enfim, a denominação “queijo branco” ou “petit-suisse” é, no presente no pedido, reservada a um queijo não afinado, não salgado, que sofreu uma fermentação por bactérias lácticas unicamente (e nenhuma outras fermentação além da fermentação láctica). O teor em matéria seca dos queijos brancos pode ser reduzido até 15 g ou 10 g para 100 g de queijo branco, segundo o fato de seu teor em matérias graxas ser superior a 20 g, ou no máximo igual a 20 g para 100 g de queijo branco, após completa des-secamento. O teor em matéria seca de um queijo branco está compreendido entre 13 e 20%. O teor em matéria seca de um petit-suisse não é inferior a 23 g para 100 g de petit-suisse. Ele está geralmente compreendido entre 25 e 30%. Os queijos brancos e petit-suisse são geralmente agrupados sob a denominação “queijos frescos”, utilizada de maneira clássica no domínio técnico da presente invenção.

Em um sétimo aspecto, a presente invenção refere-se à utilização de pelo menos uma variante e/ou pelo menos um fermento conforme descrito(s) mais acima, para preparar um produto alimentício enriquecido em vitamina K2.

Vantajosamente, esse produto alimentício enriquecido em vitamina K2 reforça a solidez dos ossos da pessoa que o consome. Essa pessoa é, de maneira preferida, uma criança. É claro que a presente invenção não se limita à única descrição acima. Outros modos de realização e vantagens da invenção poderão sobressair da leitura dos exemplos abaixo, fornecidos a título puramente ilustrativo.

Exemplos A título de observações preliminares, deve ser observado que os protocolos de obtenção de variantes naturais descritas abaixo são aplicáveis a qualquer tipo de cepa de bactéria láctica de partida. Em função das cepas de partida que o técnico utilizará, ele poderá eventualmente ser levado, por razões essencialmente práticas, a modificar determinadas das condições experimentais desenvolvidas pelo inventores. De qualquer modo, as modificações que o técnico será capaz de fazer nos procedimentos abaixo serão menores e necessitarão unicamente de simples manipulações de rotina não implicando nenhuma atividade inventiva. 1. Obtenção e utilização de variantes naturais resistentes à bacitracina Embora uma exposição a agentes, tais como a bacitracina ou o peróxido seja.conhecido para permitir selecionar cepas bacterianas que a-presentam uma resistência aumentada a essesíagentes, jamais foi estabelecido laço na literatura, entre a resistência à bacitracina ou ao peróxido e os níveis de produção de vitamina K2 pelas bactérias.

No âmbito de seus trabalhos, os inventores descobriram, de maneira inteiramente inesperada, que as bactérias eram capazes de.desenvolver um mecanismo original de resistência a certos agentes, tais como a bacitracina ou o peróxido, implicando em íum aumento da produção de vitamina K2. Os inventores pensaram em aproveitar essa descoberta para fins de obtenção, utilizando a bacitracina ou o peróxido, por exemplo,· como agente de seleção, de variantes naturais de cepas de bactérias lácticas (notadamente Lactococcus lactis),capazes de superproduzir a vitamina K2. 1-1 Protocolo de obtenção de variantes resistentes à bacitracina Um pré-cultura foi realizada a partir de um cristal de uma cepa natural de o Lactococcus lactis em presença de 2 mL de meio de cultura comercial clássica M17 (meio M17, Difco™) adicionado de lactose a 5 g/l (a seguir, meio M17 Lac) e de hemina (20 pL/mL) (a Seguir, mèio M17 Lac + hemina). A incubação foi feita sob agitação a 30 °C: A pré-cultura serviu para inseminar 2 ml de M17 Lac + hemina suplementado em bacitráciria (4 pg/mL). Â taxa de inseminação era de 1%. A cultura foi em seguida incubada durante 48 horas sob agitação a 30 °C. ‘ Dèpois, 100 pL dessa suspensão foram depositados sobre uma geloséde M17 Lac. Um disco'de papel embebido com 2,5 mg de bacitracina foi depositado no centro da caiXa. Ágelose foi incubada durante 48 horas a 30 °C. Os clones próximos do disco de papel foram cultivados em presença de bacitracina (4 pg/ml) em 2 mL de M17 Lac + hemina. A incubação durou 24 horas sob agitação a 30 °C.

As células foram isoladas sobre gelose M17 Lac em presença de bacitracina (2 pg/mL) após uma incubação de 48 horas a 30 °C. Os clones isolados foram cultivados em M17 Lac + hemina, depois incubados durante 24 horas sob agitação a 30 °C. Essa suspensão serviu para a elaboração do estoque congelado.

Essas experiências permitiram ao inventores selecionar a variante natural Lactococcus lactis subsp. Cremoris I-3557 depositado na CNCM em 20 de janeiro de 2006. I- 2- Protocolo de realização de um exemplo de produto láctico com a variante “bacitracina” Uma pré-cultura foi realizada a partir de um cristal da cepa em 2 mL de M17 Lac. A pré-cultura serviu para inseminar, a 1%, 50 mL de leite completo UHT que foi incubado a 30 °C durante 24 horas. A tabela II abaixo dá o resultado da dosagem de vitamina K2 expresso em pg Equivalente MK-4/100 g de produto, para a variante bacitracina - resistente e a cepa correspondente selvagem.

Tabela II A variante bacitracina - resistente superproduz, portanto, à razão de um fator 3, a vitamina K, quando se compara à cepa selvagem de partida. II- Obtenção e utilização de variantes naturais resistentes ao peróxido A respiração da Lactococcus lactis foi colocada em evidência bem recentemente (Duwat et al., 2001). A sequenciação do genoma de uma cepa de L. lactis (IL1403) confirmou a presença dos genes codificando as função necessárias à respiração aeróbica (Bolotin et al., 2001). L. lactis possui com efeito os operons men e cytABCD codificando as proteínas necessárias à síntese de menaquinona e à biogênese do citocromo D. Essa espécie possui também os três genes implicados nas últimas etapas da síntese de heme (hemH, hemK e hemN, que são requeridos na oxidação da porfirina para a ligação do ferro a heme), mas não possui os genes implicados nas primeiras etapas desse processo. Todavia, L. lactis é capaz de realizar uma fosforilação oxidativa em presença de protoporfirinogene.

Mostrou-se também que L. lactis podia respirar em presença de oxigênio e de heme no meio de cultura. Essa respiração permite às células atingir uma biomassa mais importante e o pH final observado é mais elevado do que aquele habitualmente obtido. Culturas em presença de oxigênio e/ou de heme permitem obter curvas de crescimentos comparáveis durante aproximadamente as seis ou sete primeiras horas de fermentação. Em seguida, o consumo de glicose diminui no caso das culturas em presença de oxigênio e de heme, e a produção de lactato é, então menor. Isto traduz um “shift” de metabolismo que se produz bastante tardiamente no decorrer da cultura. A respiração de L. lactis é feita, portanto, para o final da fase exponencial de crescimento (Duwat et al., 2001). O papel da respiração de L. lactis não é ainda conhecido não mais que o papel que pode ter a vitamina K2 nessa espécie com metabolismo antes de tudo fermentário. Os inventores constataram, além disso, que a vitamina K2 era produzida por cepas de L. lactis, enquanto a respiração não era induzida nas condições testadas (sem heme no meio e sem agitação, permitindo uma boa oxigenação do meio).

No citoplasma, as proteínas apresentam apenas poucas pontes dissulfetos contrariamente às proteínas extra-celulares. Existe um sistema enzimático amplamente difundido que permite limitar o número de pontes di-sulfetos. As ligações S-S são reduzidas em função SH por intermédio de uma enzima, a tio-redoxina. Essa enzima é regenerada pela tio-redoxina reductase. Vido et al (2205) criaram pela engenharia genética um mutante trxB1 de L. lactis. O gene trxB1 codifica para a tio-redoxina reductase. O estudo por eletroforese bidimensional das proteínas sintetizadas por esse mutante mostrou que ele superproduzia determinadas das enzimas da via de síntese da vitamina K2, a saber as enzimas MenB e MenD.

Considerando esses dados, assim como a partir das observações pessoais, os inventores supuseram que uma das vias possíveis para melhorar a produção de vitamina K2 por L. lactis poderia ser de induzir a respiração. Uma outra pista poderia ser tentar mobilizar a vitamina K2 para responder a um estresse oxidativo.

Os inventores pesquisaram, portanto, para conseguir variantes naturais resistentes a um estresse oxidativo. É importante notar que as variantes naturais obtidas não mostravam superexpressão do operon Men. 11-1- Protocolo da obtenção de variantes resistentes a um estresse oxidativo O peróxido foi escolhido como exemplo de agente oxidante utilizável. Naturalmente, outros agentes oxidantes, tais como os íons hiperclóri-cos, os íons ferrosos, a menadiona, o paraquat o oxigênio ou qualquer outro composto oxidante apropriado, poderíam ser utilizados em condições similares.

Após uma pré-cultura sobre meio M17 Lac, as cepas naturais de partida foram repicadas sobre o mesmo meio, contendo concentrações crescentes de peróxido (por exemplo, uma faixa que vai de pelo menos 20 a pelo menos 25, 27, 28,5 mg/l aproximadamente). As culturas foram incubadas a 30 °C. Após 24 horas, os primeiros tubos da faixa de concentração não a-presentando aumento foram recolocados para incubar durante 24 horas suplementares. Os clones foram, em seguida, isolados por esgotamento em meio gelosado. Um clone foi selecionado para uma concentração de peróxido de 27 mg/l. Os inventores anotaram que, além de uma concentração de peróxido de 28,5 mg/l, não havia aumento.

Essas experiências permitiram assim aos inventores selecionar a variante natural Lactococcus lactis subsp. Cremoris I-3558 depositada na CNCM em 20 de janeiro de 2006. II-2- Protocolo de realização de um exemplo de produto láctico com a variante “peróxido”. O clone selecionado foi colocado em crescimento em leite completo durante 24 horas. Amostras foram, em seguida, retiradas e congeladas a -80 °C para uma dosagem posterior de vitamina K. A tabela III abaixo indica a quantidade de vitamina K2 produzida pela variante resistente ao peróxido, comparada à quantidade produzida pela cepa de partida (quantidades expressas em pg Equivalente MK-4/100 g de leite fermentado).

Tabela III

Conforme mostra a tabela III acima, a variante produz aproximadamente duas vezes mais de vitamina K2 do que a cepa selvagem correspondente. III- Caracterização qenotípica das variantes naturais I-3557 e I-3558 111-1- Materiais e métodos As cepas foram cultivadas durante uma noite a 30 °C sobre meio M17 lactose. Um leite completo do comércio foi inseminado com o auxílio de cada uma dessas cepas à razão de 1 % de pré-cultura. O leite inseminado foi colocado em tubos de 12 ml. As fermentações foram paradas no estado fisiológico desejado, fase exponencial de aumento ou fase de redução de velocidade, mergulhado os tubos no nitrogênio líquido. Os tubos foram, em seguida, esticados a -80 °C até à utilização. Experiências precedentes mostraram que a vitamina K é essencialmente produzida em fase de redução de velocidades (dados não mostrados).

Extração dos ARN totais Todas as amostras foram tratadas de forma idêntica.

Essas amostras foram descongeladas em presença de RNA pro-tect (Qiagen - referência 76506) a fim de evitar a degradação dos ARN. As células dessas amostras foram recuperadas por centrifugação.

Em seguida, os ARN das células de cada amostra foram isolados com o auxílio do moedor de células Mixer Mill MM300 (Qiagen) com esferas (Biospec Products - referência 11079101z, Zircônia/Sílica Beads dia-meter 0,1 mm) e em presença do Triazol® (Invitrogen - referência 15596-026). A concentração e as razões de pureza (230/260 e 260/280 nm) dos ARN foram, em seguida, controlados por espectro fotometria com o espec-trofotômetro ND-1000 Nanodrop® (Nanodrop Technologies). A qualidade dos ARN (RIN, razão 16/23 S) foi também controlada com o auxílio do 2100 Bioanalyzer - logiciel expert, versão B.02.05 (Agilent Technologies) e Kits RAN 6000 Séries II Nano (Agilent Technologies - referência 5067 - 1511). Marcações dos ARNm e hibridacões sobre chip com ADN

Os alvos foram sintetizados por transcrição inversa dos ARNm, utilizando as mesmas atrações reversas específicas que aquelas utilizadas para a síntese dos produtos PCR SPOTTÉS sobre os chips com ADN. Essas marcações diretas foram realizadas pela sociedade Eurogentec com o auxílio do Kit CyScribe [sistema de marcação de cDNA de primeira fita] de CTP/purificação CyScribe GFX (Amersham - ref RPN6202X) e de moléculas fluorescentes acopladas com nucleotídeos Cy3-dCTP/Cy5-dCTP (Perkin Elmer-referência NEL576/NEL577).

As hibridações dos alvos marcados sobre os chips com ADN com produtos PCR, da cepa Lactococcus lactis cremoris MG1363 (sequência disponível sobre NCBI), foram realizadas pela sociedade Eurogentec, que tem ela mesma produziu esses chips com ADN e as comercializa. Essa sociedade utilizou um protocolo de hibridação e de lavagem clássica (tampão de hibridação Eurogentec - referência AR-HYB-01, incubação durante uma noite a 42 °C, em estação de hibridação Advalytix Slidebooster SB800 -Implen, lavagem dos chips com ADN hibridados em um tampão 0,2X SSC / 0,1% SDS, durante 5 minutos sob agitação à temperatura ambiente, depois enxaguamento em um tampão 0,2X SSC durante 5 minutos à temperatura ambiente sob agitação ocasional, depois secagem dos chips com ADN por centrifugação a 1 000 rpm durante 5 minutos). A aquisição dos dados das hibridações foi realizada pela sociedade Eurogentec com o auxílio de um scanner Αχοη 4100A e do soft Gene-Pix Pro 5.1 (Axon Instruments). Os scans dos chips com ADN hibridados foram em seguida enviadas aos inventores pela sociedade Eurogentec. Tratamento dos dados Os resultados numéricos oriundos dos scans dos chips com ADN hibridados foram obtidos pelos inventores com o auxílio do soft Gene-Pix Pro 6.0.

Esses primeiros resultados numéricos acompanharam um tratamento estatístico com o soft MANGO, desenvolvido pela plataforma Trans-criptomique GODMAP do CNRS de Gif sur Yvette (91), de forma a conseguir razões de expressão significativas; cada spot correspondente a um gene sendo duplicado sobre os chips com ADN e cada experiência biológica sendo reproduzida três vezes, incluindo uma inversão das marcações (DyeS-wap), a fim de limitar o viés de incorporação das moléculas fluorescente a-copladas a nucleotídeos representando assim seis lâmias por comparação.

As razões de expressão diferencial foram selecionadas sobre os critérios de reprodutibilidade, tal como a mais valia ajustada (<0,01), em relação ao ruído de fundo médio e sobre o valor das razões de expressão (r > 2,00 e r < 2,00). III-2 Resultados As duas variantes apresentam resultados similares quanto à expressão de certos genes. A maioria dos genes referidos refere-sem ao estado de óxido-redução da célula e notadamente em relação com os clusters Fe-S. Nesse âmbito, o metabolismo da metionina e da cisteína são modificados, assim como o transporte do ferro. Várias enzimas implicadas nos mecanismos de defesa no estresse oxidante vêem sua expressão modificada: tío-redoxina H, tio-redoxina B1, NADH desidrogenase, NADH desidroge-nases, glutationa peroxidase...

Em fase exponencial, certas enzimas implicadas na respiração de L. lactis são superexpressas: a fumarato reductase (frdC) e a citocromo oxidase (cydD). Da mesma forma, o metabolismo das bases purinas parece ser modificado. A tabela IV abaixo informa sobre as razões de expressão de certos genes e estabelece uma comparação entre as variantes e a cepa selvagem em fase de redução de velocidade.

Tabela IV A tabela V abaixo dá as razões de expressão dos genes nas variantes por comparação com a cepa selvagem em fase exponencial de aumento.

Tabela V

Referências Bolotin etal. 2001. Genome Research 11, 731-753 Duwat etal. 2001. J. Bacteriol. 183(15), 4509-16 Morishita etal. 1999. J. Dairy Sei. 82, 1897-1903 Parker et al. 2003. Journal of Food Science 68(7), 2325-2330 Vido etal. 2005. J. Bact. 187, 601-10 Gasson M. 1983. J. Bact. 154, 1-9 Hart JP, etal. [letter]. Lancet. 1948;2:283 Hart JP, et al. J. Clin Endocrinol Metab. 1985;60:1268-9 Hauschka PVetal. Physiol Rev. 1989;69:990-1047 Ducy P, etal. Nature. 1996;382:448-52 Vããnãnen HK, etal. Calcif Tissue Int. 1999;64:S79 'Ronden JE, etal. Biochim Biophys Acta. 1998;1379:16-22 Knapen MH, etal. Ann Intern Med. 1989 Dec 15; 111(12):1001-5 Szulc P, etal. J Clin Invest. 1993 Apr;91 (4):1769-74 Booth SL, etal. Am J Clin Nutr. 2000;71:1201-8 Shiraki M, etal. J Bone Miner Res. 2000;15:515-21 Braam LAJLM, etal. CalcifTissue Int. 2003 Jul;73(1 ):21-6 Hirano J and Ishii Y. J Orthop Sei. 2002;7:364-369 Tsukamoto Y, et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001 ;65(9):2007-2015 Cocaign-Bousquet, M., et ai Journal of Applied Bacteriology 1995:79,108-116 REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Processo de obtenção de uma variante natural de uma cepa de bactéria láctica do gênero Lactococcus, produzindo, em condições de fermentação-padrão, uma quantidade superior de vitamina K2, de um fator pelo menos igual a aproximadamente 1,2, àquela produzido por essa cepa de bactéria láctica cultivada nas mesmas condições, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos: a) a cultura dessa cepa de bactéria láctica em condições de fermentação-padrão, em um meio de seleção, selecionado dentre meio de cultura contendo bacitracina ou um oxidante tal como peróxido, que induz uma modificação do estado de óxido-redução celular; e b) a seleção dessa variante ocorre pelo menos aproximadamente 1,2 vez mais vitamina K2 que essa cepa de bactéria láctica cultivada nas mesmas condições.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que essa cepa de bactéria láctica é Lactococcus lactis.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene escolhido dentre os seguintes genes n° 1 a 27: - gene 1: cysD apresentando um n° de acesso NCBI llmg_0091; - gene 2: gpo apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1088; - gene 3: metE apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1225; - gene 4: gene apresentando um n° de acesso NCBI llmg_0195; - gene 5: metF apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1226; - gene 6: trxH apresentando um n° de acesso NCBI llmg_0406; - gene 7: fur apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1023; - gene 8: qor apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1850; - gene 9: frdc apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1441; - gene 10: adhE apresentando um n° de acesso NCBI llmg_2432; - gene 11: purC apresentando um n° de acesso NCBI llmg_0973; - gene 12: cydB apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1863; - gene 13: purE apresentando um n° de acesso NCBI llmg_0999; - gene 14: purQ apresentando um n° de acesso NCBI llmg_0975; - gene 15: trxA apresentando um n° de acesso NCBI llmg_0779; - gene 16: noxB apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1734; - gene 17: cpo apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1737; - gene 18: metK apresentando um n° de acesso NCBI llmg_2160; - gene 19: trxB1 apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1588; - gene 20: cysK apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1775; - gene 21: metC apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1776; - gene 22: metS apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1764; - gene 23: feoB apresentando um n° de acesso NCBI llmg_0199; - gene 24: citB apresentando um n° de acesso NCBI llmg_0636; - gene 25: Icd apresentando um n° de acesso NCBI llmg_0637; - gene 26: fhuD apresentando um n° de acesso NCBI llmg_0349; - gene 27: idh apresentando um n° de acesso NCBI llmg_1120. é modificada nessa variante, em relação à cepa da bactéria láctica.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a expressão dos genes n° 1 a 27 é modificada nessa variante em relação a essa cepa de bactéria láctica.

5. Processo, de acordo com as reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene escolhido dentre os genes n° 1 a 15 é aumentada nessa variante em relação a essa cepa de bactéria láctica.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene escolhido dentre os genes n° 16 a 27 é reduzida nessa variante em relação a essa cepa de bactéria láctica.

7. Produto lácteo fermentado, caracterizado pelo fato de que compreende uma variante natural de uma bactéria de ácido láctico que é a variante natural I-3557, depositada na Coleção Nacional de Cultura dos Microrganismos (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França) em 20 de janeiro de 2006.

8. Produto lácteo fermentado, caracterizado pelo fato de que compreende uma variante natural de uma bactéria de ácido láctico que é a variante natural 1-3558, depositada na Coleção Nacional de Cultura dos Microrganismos (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França) em 20 de janeiro de 2006.

9. Uso de bacitracina, caracterizado pelo fato de que é para seleção de cepas de bactérias lácticas produzindo, em condições de fermentação-padrão, uma quantidade superior de vitamina K2, de um fator pelo menos igual a aproximadamente 1,2, àquela produzida por essa cepa de bactéria láctica cultivada nas mesmas condições.

10. Uso de um agente oxidante, tal como o peróxido, caracterizado pelo fato de que é para seleção de cepas de bactérias lácticas, produzindo, em condições de fermentação-padrão, uma quantidade superior de vitamina K2, de um fator pelo menos igual a aproximadamente 1,2, àquela produzida por essa cepa de bactéria láctica cultivada nas mesmas condições.

11. Processo de produção de um produto alimentício enriquecido em vitamina K2, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos: a) a utilização de pelo menos uma variante natural de cepas de bactérias lácticas, produzindo, em condições de fermentação-padrão, uma quantidade superior de vitamina K2, de um fator pelo menos igual a aproximadamente 1,2, àquela produzida por essa cepa de bactéria láctica cultivada nas mesmas condições, obtidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e/ou um fermento láctico compreendendo pelo menos uma variante natural de cepas de bactérias lácticas, produzindo, em condições de fermentação-padrão, uma quantidade superior de vitamina K2, de um fator pelo menos igual a aproximadamente 1,2, àquela produzida por essa cepa de bactéria láctica cultivada nas mesmas condições, obtidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em uma preparação intermediária desse produto; e b) a obtenção desse produto enriquecido com vitamina K2.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a variante natural é a variante natural 1-3557, depositada na Coleção Nacional de Cultura dos Microrganismos (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França) em 20 de janeiro de 2006.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a variante natural é a variante natural I-3558, depositada na Coleção Nacional de Cultura dos Microrganismos (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França) em 20 de janeiro de 2006.

14. Produto alimentício enriquecido em vitamina K2, caracterizado pelo fato de que é capaz de ser obtido por um processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13.

15. Produto alimentício, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser um produto fermentado e/ou um produto láctico fresco.

16. Uso de pelo menos uma variante natural de cepas de bactérias lácticas, produzindo, em condições de fermentação-padrão, uma quantidade superior de vitamina K2, de um fator pelo menos igual a aproximadamente 1,2, àquela produzida por essa cepa de bactéria láctica cultivada nas mesmas condições, obtidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e/ou um fermento láctico compreendendo pelo menos uma variante natural de cepas de bactérias lácticas, produzindo, em condições de fermentação-padrão, uma quantidade superior de vitamina K2, de um fator pelo menos igual a aproximadamente 1,2, àquela produzida por essa cepa de bactéria láctica cultivada nas mesmas condições, obtidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para preparar um produto alimentício enriquecido em vitamina K2.

17. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a variante natural é a variante natural I-3557, depositada na Coleção Nacional de Cultura dos Microorganismos (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França) em 20 de janeiro de 2006.

18. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a variante natural é a variante natural I-3558, depositada na Coleção Nacional de Cultura dos Microorganismos (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França) em 20 de janeiro de 2006.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de esse produto alimentício enriquecido em vitamina K2 reforçar a solidez dos ossos do consumidor.