KR20130033026A

KR20130033026A - 프로테아제 생산능이 향상된 신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 ｂｙ０４ 균주 및 이를 이용한 프로테아제 생산방법

Info

Publication number: KR20130033026A
Application number: KR1020110096825A
Authority: KR
Inventors: 안병용
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2011-09-26
Publication date: 2013-04-03

Abstract

본 발명은 청국장 또는 된장으로부터 분리된 프로테아제(Protease) 생산능이 향상된 신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) BY04 (수탁번호: KCTC18219P )균주에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기의 신규한 균주를 이용하여 프로테아제를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

프로테아제 생산능이 향상된 신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 ＢＹ０４ 균주 및 이를 이용한 프로테아제 생산방법{Novel Bacillus amyloliquefaciens BY04 having high Protease producing activity and Process for producing protease using the same}

본 발명은 프로테아제 생산능이 우수한 신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 BY04(수탁번호: KCTC18219P) 에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 신규한 균주를 이용한 프로테아제 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 프로테아제 생산을 위한 최적의 배양 조건에 관한 것이다.

현재 식품산업, 의약산업 및 환경산업 등 광범위한 분야에서 각종 효소가 응용[Kim 등, 1995a]되고 있는데, 그 중에서도 단백질에 작용하여 펩타이드 결합을 가수 분해하는 단백질 가수분해 효소는 전 세계적으로 공업효소 판매량의 약60%를 차지할 만큼 사용량이 많은 중요한 효소 중 하나이다.[Kook 등, 2011]. 미생물 유래의 단백질 분해 효소는 세제, 식품, 농약, 제약, 피혁, 섬유 및 사료 산업 등에 널리 이용되기 때문에 단백질 분해 효소의 유용성을 확보하기 위한 단백질 분해 효소능이 높은 균주의 분리 및 배지 조성과 발효 조건에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

바실러스(bacillus) 계열은 이미 다양한 연구가 진행 중인 미생물 중 하나로서 알칼리 조건, 중성 조건 등에 따라 증식하는 종이 상이하고 이들이 방출하는 단백질 분해 효소는 이미 세제, 피혁, 식품, 의학적 용도 등에 활용도를 인정받고 있다.

단백질 가수 분해 효소는 아미노산으로 구성된 단백질의 펩타이드 결합을 가수 분해하는 효소로서 이들은 미생물의 세포질 내부 또는 세포막에 결합하고 있거나 세포질 밖에 존재한다. 단백질 분해 효소의 종류는 일반적으로 세린프로테아제, 메탈로프로테아제, 티올프로테아제 그리고 산프로테아제 4종류로 구별 가능하며 다른 구분 방식으로는 효소의 최적 pH에 따라 산성, 중성, 알칼리성의 프로테아제로 구별하는 방법이 있다.

한편, 된장 또는 청국장은 우리 나라의 전통 대두 발효 식품으로 섭취 시 항암 효과 및 혈전 용해 효과가 있는 것으로 알려져 있고 된장의 숙성에 관여하는 미생물에 대한 연구도 진행되고 있다. 그러나 된장에 대한 연구는 주로 된장의 향이나 맛에 관한 미생물의 영향에 대한 연구가 이루어지고 있으며 이로부터 분리된 유용한 미생물을 이용한 연구에 대해서는 아직 미비한 실정이다.

본 발명의 목적은 된장 또는 청국장으로부터 분리되는 프로테아제 생산능이 향상된 신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 BY04(수탁번호: KCTC18219P)를 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 또다른 목적은 상기 신규한 균주를 이용하여 프로테아제를 생산함에 있어서 가장 적절한 배양 온도, 시간, 배지 조성을 제공함으로써 프로테아제를 생산하기 위한 적절한 방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 프로테아제(Protease)생산능이 향상된 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) BY04 (수탁번호: KCTC18219P )균주를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 신규한 균주를 배양하는 단계; 및 배양액으로부터 프로테아제를 수득하는 단계를 포함하는 프로테아제 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 된장 또는 청국장 등의 전통 장류로부터 단백질 분해능이 우수한 균주를 분리해 낼 수 있으며 프로테아제의 생산성이 최적화되는 조건을 이용하여 상기 균주로부터 프로테아제를 대량 생산함으로써 식품 산업 등에 유용하게 이용될 수 있다.

도1은 B. subitlis KCTC1021, B. amyloliquefaciens KCTC1660와 B. amyloliquefaciens BY04(수탁번호)의 단백질 분해능을 비교한 결과를 도시한다. (A: BY04; B: B. subtilis KCTC1998 (음성 대조군); C: B. subtilis KCTC 1021 (양성 대조군), Bacillus amyloliquefaciens KCTC 1660 (양성 대조군))
도2는 분리된 균주 B. amyloliquefaciens BY04(수탁번호: KCTC18219P)를 gyrB서열 분석을 통해 계통도로 나타낸 결과를 도시한다.
도3은 B. amyloliquefaciens BY04(수탁번호: KCTC18219P)를 이용한 프로테아제 생산에서 배양 온도의 영향을 도시한다.
도4는 B. amyloliquefaciens BY04(수탁번호: KCTC18219P)를 이용한 프로테아제 생산에서 배양 시간의 영향을 도시한다.
도5는 탄소원의 종류에 따른 B. amyloliquefaciens BY04(수탁번호: KCTC18219P)의 프로테아제 생산 능을 도시한다.
도6은 수용성 전분의 첨가 농도에 따른 B. amyloliquefaciens BY04(수탁번호: KCTC18219P)의 프로테아제 생산능을 도시한다.
도 7은 질소원의 종류에 따른 B. amyloliquefaciens BY04(수탁번호: KCTC18219P)의 프로테아제 생산능을 도시한다.
도8은 효모 추출물의 첨가 농도에 따른 B. amyloliquefaciens BY04(수탁번호: KCTC18219P)의 프로테아제 생산능을 도시한다.
도9는 K₂HPO₄ 첨가에 따른 B. amyloliquefaciens BY04(수탁번호: KCTC18219P)의 프로테아제 생산 능을 도시한다.
도10은 프로테아제 생산주인 B. subtilis KCTC1021 및 B. amyloliquefaciens KCTC1660 과 B. amyloliquefaciens BY04(수탁번호: KCTC18219P)의 프로테아제 생산성을 비교한 결과를 도시한다. (A: B. amyloliquefaciens BY04(수탁번호: KCTC18219P), B: 프로테아제 생산 균주 B. subtilis KCTC1021, C: 프로테아제 생산 균주 B. amyloliquefaciens KCTC1660))

본 발명은 프로테아제(Protease) 생산능이 향상된 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) BY04 (수탁번호: KCTC18219P )균주를 제공한다.

본 발명의 균주로부터 얻어지는 프로테아제는 엑소프로테아제(exoproteases) 또는 엔도프로테아제(endoprotease)일 수 있다.

본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) BY04 (수탁번호: KCTC18219P )균주는 전통 장류인 재래장, 된장, 간장, 고추장 등에서 분리될 수 있으나 바람직하게는 된장 또는 청국장에서 분리할 수 있다.

본 발명의 균주를 이용하여 프로테아제를 생산하기 위해서는 균주 자체만을 이용할 수 있으며, 이를 특정의 배지에서 특정 조건하에서 배양하여 얻어진 배양물, 배양 상등액을 이용할 수 있다.

또한 본 발명은 새롭게 분리해낸 프로테아제 생산능이 향상된 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) BY04 (수탁번호: KCTC18219P )균주를 배양한 후 프로테아제를 수득하기 위한 프로테아제 생산 방법을 제공한다.

상기 배양물은 당업계에서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주를 배양하는데 널리 쓰이는 배양 방법을 통하여 얻어질 수 있다.

예를 들어 글루코스, 프락토스, 만니톨, 덱스트린, 수용성 전분, 셀로바이오스 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 저분자 탄소원 및 제빵 개량제, 쌀전분, 미강, 현미유 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 고분자 탄소원으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원을 첨가한 배지에서 배양할 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 명세서상에서는 최적의 프로테아제 생산을 위하여 배지에 첨가될 수 있는 탄소원으로 수용성 전분, 자일로스, 프락토스, 글루코스, 말토스, 수크로오스, 소르비톨 등 당업계에 널리 사용되고 있는 탄소원 중 어느 하나를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 수용성 전분을 탄소원으로 첨가하여 배양할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 수용성 전분은 배지에 1 내지 3%(w/v)로 첨가될 수 있으며 이를 초과하는 경우 효소의 생산성이 저해될 수 있다.

또한 배지에는 적절한 질소원으로써 배양균에 질소를 공급할 수 있는 모든 물질, 예컨대, 효모 추출액 및 질산암모늄으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종을 첨가할 수 있으며, 보다 구체적으로는 암모늄 설페이트 및 질산나트륨 등의 무기 질소원 및 효모 추출물, 카세인, 펩톤, 콩가루, 소이톤 등의 유기 질소원으로 이루어진 질소원 중 어느 하나를 이용할 수 있다. 바람직하게는 효모 추출물을 첨가한 배지에서 본 발명의 균주를 배양함으로써 프로테아제를 수득할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 효모 추출물을 0.1 내지 0.5%(w/v) 배지에 첨가할 수 있다.

배지에 첨가될 수 있는 적절한 인산원은 본 발명의 균주의 배양을 저해하지 않는다면 당업계에서 첨가되고 있는 모든 종류의 인산원으로 사용 가능한 물질을 첨가 가능하나 바람직하게는 인산염(K₂HPO₄)을 첨가할 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 인을 0.25%내지 1.50%(w/v)로 첨가할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 배지는 상기 탄소원 및 질소원을 모두 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 배양 방법에 있어서, 배양 온도는 23 내지 44℃일 수 있으며, 배양 pH는 5 내지 8, 바람직하게는 6 내지 7인 것이 좋으며, 배양 시간은 24시간 내지 48시간 이내로 이루어 질 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주의 분리 및 사용 균주

단백질 분해능이 높은 균주의 분리는 Ahn 등 [2006]의 방법에 따라 된장과 청국장으로부터 분리하였다. 즉, 시료10g을 멸균수 100 mL에 현탁한 후 1%(w/v) 스킴밀크(skim milk)가 첨가된 nutrient agar(NA)에 도말하여 37℃에서 36시간 배양을 수행하여 균주를 분리하였다.

단백질 양성대조(positive control)균주로 B. subtilis KCTC1021와 B. amyloliquefaciens KCTC1660를, 음성대조(negative control)균주로 B. subtilis KCTC1998를 사용하였다. Bacillus subtilis (KCTC1998), Bacillus subtilis (KCTC1021), Bacillus amyloliquefaciens (KCTC1660)는 한국 생명공학 연구소에 분양 받아 사용하였다.

형성된 집락 중 집락 주변에 투명환 (clear zone)이 나타나는 미생물을 선별한 다음, 재차 tooth pick로 1%(w/v) 스킴밀크가 첨가된 NA 고체 배지에 배양한 후 투명환의 길이를 측정하여 우수한 미생물을 선발하였다. 단백질 분해효소 양성 균주인 B. subitlis KCTC1021, B. amyloliquefaciens KCTC1660와 분리균주 BY04의 단백질 분해능을 비교한 결과 투명환의 길이는 각각 16 mm, 14 mm, 24 mm를 나타내었으며, 이러한 결과로부터 분리한 균주의 단백질 분해효소 활성이 우수함을 확인 할 수 있었다 (도 1).

실시예2 . 분리된 균주의 동정

2.1 API kit 에 의한 생화학분석

분리된 균주의 생화학적 특성을 조사하기 위해 API 50CHB kit (Biomereux Co., France)를 사용 하여 분석하였다. API kit을 이용한 당의 발효능 조사는 kit manual 에 따라 실시하였으며 희석한 균을 kit의 스트립에 옮기고 37℃에서 24시간 배양하면서 배양액의 색도 변화 및 탄수화물 이용능을 관찰하였다. 또한 분리된 균주의 생화학적 특성을 판별하기 위하여 apiweb (apiweb.biomerieux.com)에 입력하여 조사하였다.

조사한 결과 분리된 프로테아제 생산능이 우수한 균주는 B. subtilis / B. amyloliquefaciens와 유사도가 99.8%로 나타나 B. subtilis 또는 B. amyloliquefaciens로 추정되었다. (표 1 참조)

분리된 균주의 탄수화물 이용 패턴

Carbohydrate	Results¹ ⁾	Carbohydrate	Results
Blank	－	Esculin ferric citrate	－
Glycerol	＋	Salicin	－
Erythritol	－	D-Celliobiose	＋
D-Arabinose	－	D-Maltose	＋
L-Arabinose	＋	D-Lactose	＋
D-Ribose	－	D-Melibiose	－
D-Xylose	－	D-Saccharose (sucrose)	＋
L-Xylose	－	D-Trehalose	＋
D-Adonitol	－	Inulin	－
Methyl-β-D-xylopyranoside	－	D-Melezitose	－
D-Galactose	－	D-Raffinose	－
D-Glucose	＋	Amidon (starch)	－
D-Fructose	＋	Glycogen	－
D-Mannose	＋	Xylitol	－
L-Sorbose	－	Gentiobiose	－
L-Rhamnose	－	D-Turanose	－
Dulcitol	－	D-Lyxose	－
Inositol	＋	D-Tagatose	－
D-Mannitol	＋	D-Fucose	－
D-Sorbitol	＋	L-Fucose	－
Methyl-α-D-mannopyranoside	－	D-Arabitol	－
Methyl-α-D-glucopyranoside	＋	L-Arabitol	－
N-Acetylglucosamine	－	Potassium Gluconate	－
Amygdalin	－	Potassium 2-ketogluconate	－
Arbutin	－	Potassium 5-ketogluconate	－

¹⁾ Symbol denote positive (＋) and negative (－) in carbohydrate utilization patterns determined using API 50CHB kit.

2.2 분자계통 분류학적 분석

Gyrase B 유전자염기서열에 기초한 분자 계통 분류학적 분석을 이용하여 분리된 균주의 동정을 실시하였다. Gyrase B 유전자의 프라이머인 정방향 프라이머 (5`-CCC AAG CTT AAC TGC ACT GGG AAA TYG THG AYA AYA G-3') gyrB135와 역방향 프라이머(5`-CGG AAT TCG GAT CCA CRT CGG CRT CBG TCA TRA T-3') gyrB1510을 제작하였다. GyrB 유전자를 클로닝하기 위한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 반응을 수행하였다. PCR 반응조건은 94℃에 4분간 denaturation을 1 사이클로 반응하고 94℃에 1분 동안 denaturation과 58℃에 1 분간 annealing 시킨 후 72℃에 1분간 elongation과정을 30 사이클 반응한 후 72℃에서 10 분 동안 final extension을 통하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 밴드는 Agarose Gel Extraction Kit(MEGA-spinTM, Intron Co, Seoul, Korea)를 이용하여 정제하고, 코스모진텍 유전자 해석센터(Seoul, korea) 에 염기 서열 분석을 의뢰하였다. 염기 서열 분석을 통하여 얻은 각 균주의 염기서열은 Blast Network Service를 이용하여 NCBI GenBank database의 염기서열과 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석하였으며 ClustalW Multiple Sequence Alignment 프로그램을 이용하여 phylogenetic tree를 분석하였다.

gyrB유전자 fragments와 GeneBank 중 DNA서열을 비교한 결과 Bacillus amyloliquefaciens와 99%의 상동성을 나타내었으며, 생화학 분석 및 이러한 결과를 참조하여 분리된 균주는 Bacillus amyloliquefaciens로 최종 확인되었다. 따라서 최종 분리 균주는 B. amyloliquefaciens BY04로 명명하고 한국생명공학연구원에 2011년 8월 25일에 수탁번호 KCTC18219P 로 기탁하였다.

실시예3 . 프로테아제 활성 측정

프로테아제의 활성은 카제인을 기질로 이용하는 Ahn의 방법[Ahn 등, 2006]으로 측정하였다. 조효소액은 TSB 배양액을 3,200 rpm에서 15분간 원심분리 후 얻어진 상등액을 10배 희석하여 사용하였다. 시험관에 2% 카제인 용액 1.5 mL와 Mcllvain buffer (pH 6.0) 1.0 mL을 시험관에 넣은 다음 조효소액 0.5 mL을 순서대로 넣고 혼합한 후 40℃에서 60분간 반응시켰다. 반응이 종료되면 각각의 시험관을 바로 얼음물에 담근 후 0.4 N trichloroacetic acid (Yakuri Pure Chemicals Co., Kyoto)용액 3 mL을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 실온에서 10분간 방치한다. 그 다음 8,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 (Union 32R, Hanil, Incheon) 후 상징액 1 mL을 취하여 동량의 0.4 N Na₂CO₃ 용액 5 mL이 담긴 각각의 시험관에 상징액 1 mL을 넣는다. 그리고 5배 희석한 Folin-phenol 시약 용액 1 mL을 첨가하여 혼합한 후 40℃에서 30분간 발색시켜 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값을 표준곡선으로부터 티로신의 양으로 환산하였으며 60분간 티로신 1 ㎍을 생성하는 효소량을 1 unit로 표시하여 효소 활성 단위로 삼았다.

통계처리는 SPSS 12.0K을 사용하여 p＜0.05 수준에서 ANOVA test 후 Duncan's multiple rang test에 의해 군 간의 평균치의 통계적 유의성을 검정하였다..

실시예4 . 최적의 배양 온도 및 배양 시간 선별

본 발명의 프로테아제 생산능이 향상된 새로운 균주 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) BY04 (수탁번호: KCTC18219P )를 이용한 최적의 프로테아제 생산 방법을 찾기 위하여 배양 온도 및 배양 시간을 달리하여 프로테아제 생산능을 측정하였다.

배양 온도의 변화에 따른 영향을 검토하기 위하여 TSB 액체 배지에 하룻밤 전 배양된 균액을 1% (v/v)가 되도록 접종한 후 23, 30, 37 및 44℃에서 180 rpm으로 24시간 배양하여 생성된 프로테아제의 활성을 측정하였다. 선별된 균주의 배양 시간에 따른 프로테아제의 활성을 측정하기 위하여 TSB 액체배지에서 전배양액을 동일한 1% (v/v) 접종하고 24시간 간격으로 96시간 동안 분비된 프로테아제의 활성을 측정하였다.

온도에 따른 프로테아제의 활성은 다음과 같다(도 3 참조). 배양온도를 23-44℃의 범위로 변화시키면서 24시간 배양한 결과 30℃에서 프로테아제 생산량이 63.8 units/mL로 가장 높게 나타났다(도 3).

또한 B. amyloliquefaciens BY04를 30℃에 배양할 때 배양 시간이 프로테아제 생산에 미치는 영향을 검토한 결과, 도 4에서와 같이 24시간부터 48시간까지는 급격히 증가하는 것을 확인하였으며 48시간째에 최대 활성을 나타내었다. 이상의 결과로 B. amyloliquefaciens BY04를 이용한 프로테아제 생산을 위한 최적 배양 온도와 배양 시간은 30℃, 48시간임을 확인하였다.

실시예5 . B. amyloliquefaciens BY04 를 이용한 프로테아제 생산을 위한 최적의 배지 조성 선별

분리 동정한 균주의 프로테아제 생산에 미치는 배지 성분의 영향을 조사하기 위해서 탄소원, 질소원 및 인의 종류와 첨가량을 검토하였다.

5.1 최적의 탄소원 선별

탄소원에 대한 배지조성시험은 수용성 전분, 자일로스, 프락토스, 글루코스, 말토스, 수크로오스, 소르비톨 등 각각 2%씩 영양 배지에 첨가하여 30℃, 180 rpm으로 48 시간 배양한 후 상등액을 이용하여 프로테아제 활성을 측정하여 수행하였다.

B. amyloliquefaciens BY04는 수용성 전분을 첨가한 경우 (31.8 units/mL), 대조구 (19.1 units/mL)와 비교할 때 프로테아제 생산성이 약 66% 증가하였다. 프락토스와 글루코스를 첨가하였을 때는 대조구와 큰 차이를 나타나내지 않았으나, 자일로스, 말토스, 수크로오스 및 스르비톨을 첨가한 배지에서는 대조구보다 프로테아제 생산능이 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 5참조). B. licheniformis 및 B.cereus 균주의 경우 수용성 전분을 첨가하였을 때 프로테아제 생산성이 높은 것으로 보고된 바 있어 유사한 결과를 나타내었으나 B. amyloliquefaciens의 경우 탄소원으로 프락토스가 최대의 효소 생산을 보였다는 기존의 보고와는 상이한 것을 확인하였다.

프로테아제 생산성을 가장 높게 증가시키는 탄소원인 수용성 전분의 최적의 첨가량을 확인하기 위하여 0, 1, 2, 3, 4% (w/v)로 다르게 첨가한 배지에서 배양하여 프로테아제 생산능을 살폈다. 그 결과 프로테아제 생산성은 수용성 전분의 첨가량에 따라 증가하여, 3% 수용성 전분이 첨가되었을 경우 이를 첨가하지 않았을 때보다 3배 이상 증가하는 것으로 나타났다 (도6 참조). 그러나 3%이상 수용성 전분을 첨가하였을 경우 효소 생산성은 3% 수용성 전분을 첨가하였을 때보다 저하되었다. 이상의 결과로부터 수용성 전분의 최적 첨가 농도는 3%임을 확인하였다.

5.2 최적의 질소원 선별

최적의 첨가 질소원을 선별하기 위하여 무기 질소원과 유기질소원을 각각 1% (w/v) 씩 첨가하여 상기 탄소원의 영향과 동일한 방법으로 검토하였다.

보다 구체적으로 질소원이 프로테아제 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해서 수용성 전분의 첨가량을 3%로 고정하고 질소원을 제외한 성분은 동일한 조건으로 하여 종류가 다른 무기질소원 (ammonium sulfate 및 sodium nitrate)과 유기질소원(yeast extract, casein, peptone, soytone 및 soybean powder)을 각각 1% (w/v)씩 첨가하여 30℃에 48시간 배양한 후 B. amyloliquefaciens BY04의 프로테아제 생산성을 조사하였다.

그 결과 질소원을 첨가하지 않았을 때의 프로테아제 생산성은 11 units/mL으로 확인되었고, 유기 질소원을 첨가하였을 때는 무기 질소원을 첨가하였을 때보다 프로테아제 생산성이 매우 높았으며, 효모 추출물(yeast extract, 78 units/mL), 소이톤(soytone, 33 units/mL), 콩가루(soybean powder, 32 units/mL), 펩톤(peptone, 31 units/mL), 카제인(casein, 20 units/mL)의 순서로 균의 프로테아제 생산성이 높게 나타냈다 (도 7). 이러한 결과로부터 효모 추출물을 첨가하였을 때 가장 높은 수준의 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과는 분리한 Bacillus sp. 균주의 경우 질소원으로 효모 추출물이 최대의 효소 생산을 보였다는 기존의 보고와는 일치하나 이전 연구에서 B. cereus MCMB-326은 특이하게 효모 추출물, 펩톤, 카제인과 같은 유기질소원 보다는 암모늄 클로라이드를 질소원으로 사용하였을 때 효소생산성이 더 높다고 보고된 것과는 상이한 결과였다. 따라서, 균주에 따라 배지에 첨가되어야 하는 적절한 질소원이 달라져야 하며 본 발명의 새로운 균주의 경우 효모 추출물이 가장 바람직한 질소원임을 확인할 수 있었다.

프로테아제 생산에 첨가한 질소원인 효모 추출물의 최적 농도를 조사한 결과는 도 8과 같다. 프로테아제 생산성은 0-0.5% 첨가량 범위에서는 효모 추출물의 첨가량에 따라 증가하지만, 1.0% 이상에서는 효모 추출물의 첨가량이 증가할수록 효소 생산성은 감소하는 것으로 나타났다. 이상의 결과로부터 본 발명의 균주는 효모 추출물이 0.5%로 첨가된 배지에서 프로테아제 생산성이(79 units/mL) 가장 우수한 것을 확인하였다.

5.3 최적의 인산원 조건 선별

인산염(K₂HPO₄)을 각각 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25 및 1.50% (w/v) 농도로 첨가하여 배양한 후 상등액을 이용하여 프로테아제 활성을 측정하였다. 이 때 탄소원 (soluble starch 3%)과 질소원(yeast extract 0.5%)의 양을 고정하고 K₂HPO₄를 0.25%부터 1.50%(0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25 및 1.50% 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25 및 1.50%)까지 첨가하여 배양하였다.

그 결과 배양액 내의 프로테아제 활성은 K₂HPO₄을 첨가하지 않은(107 units/mL) 것보다 첨가하였을 때 향상되었으며 1.25%를 첨가한 경우에 174 units/mL으로 가장 높은 활성을 나타내었다 (도. 9).

5.4 프로테아제 생산성 비교

수용성 전분(Soluble starch, 3%), 효모 추출물(yeast extract, 0.5%) 및 K₂HPO₄(1.25%)을 포함하는 것으로 구성된 최적화 배지에 30℃에서 36시간 배양한 균주의 프로테아제 생산량은 175, 46, 40 units/m으로 나타났다. 이러한 결과로 B. amyloliquefaciens BY04가 프로테아제를 생성하는 대조구와 비교한 경우 3-4배 높은 프로테아제 생산능을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.(도 10 참조)

한국생명공학연구원

KCTC18219P

20110825

Claims

프로테아제(protease)생산능이 향상된 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) BY04 (수탁번호: KCTC18219P )균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 된장 또는 청국장으로부터 분리된 균주임을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 BY04(수탁번호: KCTC18219P)균주.
제1항의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 BY04 (수탁번호: KCTC18219P) 배양 상등액.
제1항 또는 제2항의 균주를 배양하는 단계; 및
배양액으로부터 프로테아제를 수득하는 단계를 포함하는 프로테아제 생산 방법.
제4항에 있어서, 상기 배양은 23 내지 44℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로테아제 생산 방법.
제4항에 있어서, 상기 배양은 24시간 내지 48시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로테아제 생산 방법.
제4항에 있어서, 상기 배양은 수용성 전분을 첨가한 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로테아제 생산방법.
제7항에 있어서, 상기 수용성 전분은 1 내지 3%(w/v)로 첨가되는 것을 특징으로 하는 프로테아제 생산 방법.
제4항에 있어서, 상기 배양은 펩톤(peptone), 질산나트륨(sodium nitrate), 효모 추출물(yeast extract), 카제인(casein), 소이톤(soytone), 콩가루(soybean powder) 로 이루어지는 군에서 1이상 선택된 질소원을 포함한 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로테아제 생산 방법.
제9항에 있어서, 상기 효모 추출물은 0.1 내지 0.5%(w/v)로 첨가되는 것을 특징으로 하는 프로테아제 생산 방법.
제4항에 있어서, 상기 배양은 K₂HPO₄를 0.25%내지 1.50%(w/v) 첨가한 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 프로테아제 생산 방법.