KR102466220B1

KR102466220B1 - 글루텐 분해를 통해 빵의 물리·화학적 소화율을 높여주는 락티플랜티바실러스 플랜타럼 lrcc 5318 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102466220B1
Application number: KR1020210126261A
Authority: KR
Inventors: 전윤주; 임아영; 이병곤; 박재웅; 양시영; 김준환; 윤인섭; 조현; 윤원주; 이경훤; 이은주
Original assignee: 롯데제과 주식회사
Priority date: 2021-09-24
Filing date: 2021-09-24
Publication date: 2022-11-11
Also published as: JP7465930B2; JP2023047348A

Abstract

본 발명은 Protease 활성과 글루텐 이용능이 우수한 균주와 이를 적용한 유산균 발효액종 및 유산균 발효 식빵에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 제빵 적용 시 글루텐 분해를 통해 빵의 물리·화학적 소화율을 높여주는 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318(기탁번호 KCCM12988P) 및 이를 포함하는 유산균 발효액종과 발효빵의 제조방법, 그리고 그 유산균 발효액종과 발효빵에 관한 것이다.

Description

글루텐 분해를 통해 빵의 물리·화학적 소화율을 높여주는 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318 균주 및 이의 용도 {Lactiplantibacillus plantarum Strain LRCC 5318 for Increased Physicochemical Digestibility of Bread by Decomposing Gluten, and Use thereof}

본 발명은 글루텐 분해 및 빵의 소화율 증가 효과를 가진 신규한 락티플랜티바실러스 플랜타럼 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

전통적으로 쌀을 주식으로 하는 한국인의 식생활은 경제 성장과 생활수준의 향상 등에 따른 변화로 인하여 식생활의 형태도 다양해짐과 동시에 빵류에 대한 소비가 크게 증가해오고 있다. 그러나 빵 섭취 시, 속이 더부룩하거나 소화가 잘 되지 않는 느낌을 받는 소비자들도 많은 실정이다.

빵이 소화가 잘 되지 않는 것은 글루텐에서 그 원인을 찾을 수 있는데, 글루텐은 글리아딘(Gliadin)과 글루테닌(Glutenin)이라는 단백질로 이루어진 단백질 복합체이다. 밀가루 단백질 중 하나인 글루테닌은 길게 늘어나 있는 형태로, 양쪽 말단부에 황화수소(-SH)를 가지는 아미노산 시스테인을 포함한 구조이기 때문에, 다른 글루테닌의 시스테인 말단부와 이황화결합(-S-S-)을 할 수 있다. 이렇게 여러 글루테닌이 이황화결합으로 연결되면 쉽게 분해되지 않는 그물망 구조를 이루게 된다. 반면, 글리아딘은 공처럼 생긴 단백질로, 글루테닌처럼 강력한 이황화결합을 형성하지는 못하지만 글리아딘 단백질끼리 수소결합 또는 이온결합으로 연결되어 점성을 가지는 긴 사슬 구조를 이루거나, 빵의 반죽 과정에서 글루테닌의 그물망 구조 안에 엉겨 들어가 점성과 탄성을 동시에 가지는 글루텐 구조를 형성하게 된다.

이처럼 글루텐은 물에 잘 녹지 않고 강력한 이황화결합 기반의 그물망의 구조를 가지고 있기 때문에 빵 섭취 시 더부룩하고 소화가 쉽게 되지 않는 것이다. 또한, 글리아딘 단백질 자체가 인체의 소화 효소에 저항성이 강한 펩타이드 Sequence(프롤린, 글루타민)를 함유하고 있다는 것도 소화에 어려움을 주는 요소라고 할 수 있다.

일반적으로 빵의 소화를 개선하기 위해 밀가루 대신 쌀가루를 활용하여 빵을 제조하거나, 일부 개인 제과점에서는 빵에서 밀가루를 포함한 고형분 함량을 낮춰 밀도가 낮은 빵을 만들어 소화가 잘 되게 만드는 경우도 있다. 그러나 쌀가루로 만든 빵은 떡에 가까운 식감을 가져 '빵' 특유의 식감과 맛을 가지고 있다고 보기 힘드며, 후자의 경우에도 수분 함량이 높아 미생물의 증식 위험이 커져 유통기한이 짧아지고 쫄깃한 식감보다는 다소 푸석푸석한 식감을 가지는 등 관능적 품질에도 영향을 줄 수 있다는 단점을 가지고 있다.

따라서, 빵 특유의 식감과 맛을 유지 혹은 개선하면서 동시에 글루텐 구조로 인해 빵 섭취 시 더부룩하고 소화가 안되는 점을 동시에 해결할 수 있는 기술에 대한 요구가 있어왔다.

한국등록특허 제 10-1370941호 한국공개특허 제 10-1315393호 한국등록특허 제 10-0747754호

Frances Smith etc., Mol. Nutr. Food Res., 59:2034-2043, 2015 김희승 등., 한국식품과학회지, 26(5):603-608, 1994 조유나 등., 한국식품영양과학회지, 47(10):1029-1035, 2018

상기와 같은 배경하에서 이러한 문제의 해결을 위해, 본 발명은 Protease 활성이 높은 신규 유산균을 선별하여 발효종을 제조한 후 이를 빵 반죽에 첨가하여, 발효 과정 동안 반죽 내의 글루텐을 일부 분해하고 유기산을 통해 글루텐의 망상 구조를 느슨하게 하여 쉽게 소화될 수 있게 하였다. 즉, 상기 신규 유산균은 높은 글루텐 이용능과 Protease 활성을 가지고 있어 빵 제조 시 유산균을 첨가하지 않고 만든 빵보다 글루텐 함량이 낮고, In vitro 인공 소화 모델에서 물리화학적 소화율이 높은, 소화가 잘 되는 빵을 생산할 수 있게 한다.

이에, 본 발명자들은 하기와 같은 신규 미생물 및 이의 용도를 제공하고자 한다.

본 발명의 일측면은 락티플랜티바실러스 속의 균주로 제빵 적용시 글루텐 함량을 낮춰 물리화학적 소화율을 증가시키는 균주 및 이의 제제를 제공하고자 한다.

본 발명의 목적은 수탁번호 KCCM12988P로 기탁된 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318 (Lactiplantibacillus plantarum LRCC 5318) 균주를 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 유산균 발효액 및 그의 제조 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유산균 발효액을 이용하는 단계;를 포함하는 빵의 제조 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 하나의 다른 목적은 상기 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 빵의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 빵을 제공하고자 한다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.

본 발명의 일측면은 제빵 시에 빵의 물리화학적 소화율을 개선하는 효과를 갖는 락티플랜티바실러스 플랜타럼 (Lactiplantibacillus plantarum) 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 글루텐(Gluten) 함량 감소로 인해 발생하는 것인, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 발효 시 글루텐과 같은 단백질 분해력이 우수한, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16S rDNA를 갖는, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318인, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCCM 12988P인, 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 유산균 발효액을 제공한다.

일 구현예에 있어서, 상기 유산균 발효액을 이용하는 단계를 포함하는 빵의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 빵 및 이의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 물리화학적 소화율이 높아 소비자의 소화력 향상에 도움이 된다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 글루텐 함량이 유산균을 첨가하지 않고 제조된 빵보다 적다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 유산균 자체의 산 생성력으로 인한 낮은 pH 로 빵 반죽의 글루텐 구조를 느슨하게 하는 효과가 있다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 빵 반죽의 글루텐 구조를 느슨하게 하여 부피 팽창력을 높일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 부피 팽창력이 우수하여 우수한 텍스쳐를 구현할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 부피 팽창력이 우수하여 부드러운 식감 구현이 가능하다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.

도 1a는 본원발명 균주의 당 이용성 분석(API 50 CHL kit) 결과이다.
도 1b는 본원발명 균주의 16s rDNA 의 BLAST 분석 결과이다.
도 1c는 본원발명 균주의 계통도이다.
도 2는 균주 배양액의 Protease 농도를 정량하기 위한 Standard curve이다.
도 3은 균주 8종의 글루텐 이용능을 글루텐 배지에서의 생장성을 통해 측정한 결과이다.
도 4는 유산균 발효액의 Protease 농도를 정량하기 위한 Standard curve이다.
도 5는 빵 4종의 인공 소화 모델을 통해 물리적 소화율(%)을 계산한 결과이다.
도 6은 빵 4종의 초기 단백질 함량과 소화액 처리 후 유리 아미노산 함량을 통해 화학적 소화율(%)을 계산한 결과이다.
도 7은 빵 4종의 글루텐 함량을 정량하기 위한 Standard curve이다.
도 8은 빵 4종의 글루텐 함량을 측정한 결과이다.

이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 제빵 적용 시, 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318 및 이를 이용한 유산균 발효 식빵의 제조방법을 제공하고자 한다. 구체적으로 본 발명은 소화가 잘 되는 빵에 적합한 균주와 이를 적용한 유산균 발효액종 및 유산균 발효 식빵에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 제빵 적용 시 글루텐 함량을 저감시키고 빵의 물리화학적 소화율을 증가시키는 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318(기탁번호 KCCM12988P) 및 이를 포함하는 유산균 발효액종과 발효빵의 제조방법, 그리고 그 유산균 발효액종과 발효빵에 관한 것이다. 또한, 글루텐은 반죽의 발효 과정에서 부피를 팽창시키고 탄산가스를 포집하며 소성(굽는 과정) 후에도 빵의 형태를 유지해준다는 측면에서 없어서는 안되는 원료인데, 본 발명은 반죽의 초기에서부터 글루텐의 양이 적게 투입되는 것이 아니라 반죽의 발효 과정에서부터 유산균에 의해 글루텐이 서서히 분해되며, 글루텐 구조를 느슨하게 만들어 소화율을 높인 것이므로 빵의 품질에 부정적인 영향을 주지 않아 제빵 산업에서 널리 활용될 수 있다.

본 발명은 허브의 일종이 애플민트로부터 분리하여 제빵 적용 시 글루텐 함량 저감의 효과가 우수한 식물성 유산균 락티플랜티바실러스 플랜타럼을 제공하는데 그 목적이 있다. 또한, 본 발명은 제빵 적용 시 물리화학적 소화율이 우수한 락티플랜티바실러스 플랜타럼을 제공하는데 그 목적이 있다. 또한, 본 발명은 발효액종 제조 시 발효 전보다 Protease 활성이 강화된 락티플랜티바실러스 플랜타럼을 제공하는데 그 목적이 있다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밀가루, 말토덱스트린, 포도당을 락티플랜티바실러스 플랜타럼 균주로 발효시킨 유산균 발효액종을 제공한다.

또한, 본 발명은 밀가루 100 중량부를 기준으로 상기 유산균 발효액종을 3 내지 20 중량부, 바람직하게 10 중량부를 투입하여 4시간 이상 발효하여 제조하는 유산균 발효빵을 제공한다.

본 발명은 Protease 활성과 글루텐 이용능이 높은 균주와 이를 적용한 유산균 발효액종 및 발효빵에 관한 것으로, 빵의 글루텐 함량을 저감시키고 유산균 자체의 산 생성력으로 인한 낮은 pH로 빵 반죽의 글루텐 구조를 느슨하게 하여 물리화학적 소화율을 높임으로써, 소화가 잘 되는 빵에 효과적으로 적용될 수 있다.

본 발명은 락티플랜티바실러스 플랜타럼을 접종하고 배양한 밀가루 발효물(유산균 발효액)을 사용하여 빵을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 허브의 일종인 애플민트에서 분리한 락티플랜티바실러스 플랜타럼 균주를 접종배양한 유산균 발효액을 사용하여 빵을 제조하는 방법에 관한 것이다. 식생활의 서구화로 인해 빵의 소비량은 꾸준히 증가해오고 있다. 그러나 빵을 섭취할 경우, 밥을 주식으로 섭취하는 경우에 비해 속이 더부룩하고 소화가 잘 안 된다는 문제점이 있었다. 이에 따라, 본 발명의 목적은 소화를 어렵게 하는 글루텐의 함량을 저감하고 구조를 느슨하게 만드는 균주(락티플랜티바실러스 플랜타럼)를 개발하여 유산균 미첨가 빵보다 소화가 잘 되고 건강지향적 소비자들에게 소구할 수 있는 빵을 제조하는 방법을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318을 접종배양한 유산균 발효액을 사용함을 그 특징으로 한다.

특히, 상기 유산균 발효액은 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318을 접종 후 36 내지 38℃에서 16 내지 18시간 배양하여 얻어진다. 이와 같이 얻어진 유산균 발효액은 제빵 원료 중 밀가루 총 중량에 대해 5중량% 내지 20중량%, 바람직하게는 10중량%의 양으로 사용되는 것이 바람직하다. 이보다 많은 양이 사용될 경우 빵 반죽 시 너무 질어지고 글루텐 형성이 약해져 오히려 최종 제품의 부피가 작아지는 문제가 발생할 수 있다.

이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 설명한다.

본 발명의 일측면은 제빵 시에 물리화학적 소화율이 높아지는 효과를 갖는 락티플랜티바실러스 플랜타럼 (Lactiplantibacillus plantarum ) 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면은 빵의 소화력이 증가하는 효과를 갖는 락티플랜티바실러스 플랜타럼(Lactiplantibacillus plantarum ) LRCC 5318인 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 높은 물리화학적 소화율은 저감된 글루텐 함량으로 인해 발생하는 것인, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어성, 상기 균주는 제빵 발효 시 글루텐 저감량이 우수한, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 제빵 시 부피 팽창력이 우수한, 균주를 제공한다.

이하, 실시예, 제조예 및 실험예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예, 제조예 및 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예, 제조예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

균주실시예 1. 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318 균주의 분리

(1) 시료 채취 및 유산균 분리

빵의 소화율을 높여주는 유산균을 선별하고자, 전국 각지의 전통재래시장에서 약 150종의 김치 시료와 미래원몰에서 허브 6종을 구매하였다. 구매한 김치 시료에는 멸균 증류수를 첨가하여 10배 희석한 후, 분쇄균질기(Stomacher, Pro-Media SH-001, ELMEX)를 이용하여 균질화하였고, 허브 시료에는 설탕과 증류수를 첨가하여 30℃에서 7일간 배양하여 여과하였다. 상기 희석액과 여과액을 멸균 식염수로 다단 희석하여 0.1ml를 취하여 0.002중량%의 BCP(Bromocresol purple)와 1.5중량%의 한천(Agar)이 첨가된 MRS 고체배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다.

배양 후, 노란색의 환이 나타나는 콜로니(Colony)를 선별하여 개체별로 위에 기술한 BCP-MRS 고체배지에 2~3회 계대배양하여 각 균주를 순수분리하였다.

상기 균주를 개체별로 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 48시간 재배양한 후 4℃ 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.

(2) 내산성 우수 균주 선별

빵의 제조 과정에서 반죽의 pH는 4.5까지도 떨어지는데, 이러한 환경에서도 생장하기 위해서는 내산성이 우수한 균주가 요구된다. 따라서 상기에서 분리한 균주들의 내산성을 비교하여 우수한 균주를 선별하였다.

상기에서 분리한 유산균을 MRS 평판배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 콜로니 일부를 채취하여 MRS 액상배지에 접종한 다음 또 다시 37℃에서 24시간 동안 정치배양하여 종균 배양액을 제조하였다.

분리 유산균의 내산성 시험을 위해 종균 배양액 1%를 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 균체를 침전시킨 후 상등액을 제거하였고, 10% H₂SO₄를 이용하여 pH를 3.0으로 조정한 0.1M 인산완충액(0.1M Phosphate buffer)을 동일한 부피로 첨가하였다. pH 3.0 완충액을 첨가한 시점을 기준으로 37℃ 배양기에서 0, 2, 4, 8시간, 그 이후로는 24시간 단위로 시료 1ml를 채취하여 이의 다단 희석액을 MRS 평판배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 초기 생균수와 pH 3.0 인산완충액 처리 후의 생균수를 각각 측정한 후, (초기 생균수 / pH 처리 후 생균수)로 내산성을 계산하였다. 이 결과, 가장 오랜 시간 동안 내산성이 높게 나타나는 균주를 선택하여 본 발명의 최종 균주로서 선별하였다.

최종 선별된 균주는 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양하여 증식시킨 다음 원심분리(10,000g, 10분)하여 균체를 획득하였다. 상기 균체를 크라이오튜브(Cryo-tube)에 미리 분주해 둔 MRS 액체배지와 글리세롤(Glycerol)이 4 : 1 비율로 혼합된 냉동보관용액(Freezing solution) 1ml에 넣어 -70℃에서 냉동보관하였다. 냉동된 균주를 본 발명의 다른 실험을 위한 스타터로 사용하였다.

균주실시예 2. 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318 균주의 생물학적 또는 화학적 형태 파악

선별된 균주의 형태학적 및 생화학적 특징을 분석하였다. 분석 결과는 하기 표 1과 같았다.

특징	결과 판정
콜로니 형태(Colony shape)	소형의 둥근 형태
콜로니 색(Colony color)	옅은 노란색
세포 형태(Shape)	간균(Rod)
그람염색(Gram staining)	+
호기 조건(Aerobic environment)	통성 혐기성
포자 형성능(Endospore)	-
포자 형태(Spore shape)	-
카탈라아제 테스트(Catalase test)	-

상기 표 1과 같이, 본원발명 균주는 그람 양성, 간균이며 포자 형성능 및 카탈라아제(Catalase) 음성으로 확인되었음을 알 수 있다.

균주실시예 3. 플랜타럼 균주의 동정

상기 균주의 간이적인 동정을 위하여 당 이용성을 측정하고자 하였으며 API 50 CHL kit (bioM

rieux, France)를 이용하였다. 상세하게는, MRS 고체배지에서 배양된 콜로니를 API50CHL medium 10㎖에 현탁한 후 API 50 CH 스트립의 튜브에 접종하고, 37℃ 배양기에서 48시간동안 배양하였다.

LRCC 5318의 당 이용성을 분석한 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, L-아라비노스(L-Arabinose), D-리보스(D-Ribose), D-갈락토스(D-Galactose), D-글루코스(D-Glucose), D-프럭토스(D-Fructose), D-만노스(D-Mannose), D-만니톨(D-Mannitol), D-솔비톨(D-Sorbitol), 메틸- α D-만노피라노스(Methyl-α D-Mannopyranoside), N-아세틸 글루코사민(N-Acethyl glucosamine), 아미그달린(Amygdalin), 알부틴(Arbutin), 에스쿨린(Esculin), 살리신(Salicin), D-셀로비오스(D-Cellobiose), D-말토스(D-Maltose), D-락토스(D-Lactose), D-멜리바이오스(D-Melibiose), D-수크로스(D-Saccharose (sucrose)), D-트레할로오스(D-Trehalose), D-멜레치토스(D-Melezitose), D-라피노스(D-Raffinose), 겐티오비오스(Gentiobiose), D-투라노스(D-Turanose), 포타슘글루코네이드(Potassium gluconate)를 대사하는 것, 즉, 상기 탄소원들을 이용하는 것으로 나타났다.

측정된 결과는 bioMerieux사의 DB를 이용하여 간이 동정 결과를 확인하였다(https://apiweb.biomerieux.com). 이하 표 2 및 도 1a에 나와있듯이, 락티플랜티바실러스 플랜타럼일 확률이 99.9%인 것으로 확인되었다.

No.	Carbohydrates	+/-	No.	Carbohydrates	+/-
0	Control	-	25	Esculin	+
1	Glycerol	-	26	Salicin	+
2	Erythritol	-	27	D-Cellobiose	+
3	D-Arabinose	-	28	D-Maltose	+
4	L-Arabinose	+	29	D-Lactose	+
5	D-Ribose	+	30	D-Melibiose	+
6	D-Xylose	-	31	D-Saccharose(Sucrose)	+
7	L-Xylose	-	32	D-Trehalose	+
8	D-Adonitol	-	33	Inulin	-
9	Methyl-β D-Xylopyranoside	-	34	D-Melezitose	+
10	D-Galactose	+	35	D-Raffinose	+
11	D-Glucose	+	36	Starch	-
12	D-Fructose	+	37	Glycogen	-
13	D-Mannose	+	38	Xylitol	-
14	L-Sorbose	-	39	Gentiobiose	+
15	L-Rhamnose	-	40	D-Turanose	+
16	Dulcitol	-	41	D-Lyxose	-
17	Inositol	-	42	D-Tagatose	-
18	D-Mannitol	+	43	D-Fucose	-
19	D-Sorbitol	+	44	L-Fucose	-
20	Methyl-α D-Mannopyranoside	+	45	D-Arabitol	-
21	Methyl-α D-Glucopyranoside	-	46	L-Arabitol	-
22	N-Acetyl Glucosamine	+	47	Potassium Gluconate	+
23	Amygdalin	+	48	Potassium 2-Keto-Gluconate	-
24	Arbutin	+	49	Potassium 5-Keto-Gluconate	-

또한, 정확한 동정을 위해 상기 균주의 16s rDNA를 분석하여 유전동정을 진행하였다. 즉, Genomic DNA preparation kit (Promega co., Ltd., USA) 를 사용하여 Genomic DNA를 추출한 다음 Universal primer인

27F (5`-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3`)와

1492R (5`-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3`)로 PCR reaction을 실시하여 16s rDNA 유전자를 증폭시켰다.

PCR 산물은 QIA quick PCR kit (QIAGEN, USA)로 정제하고 마크로젠(Macrogen co. Ltd., Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였으며, 분석된 염기서열은 NCBI 사이트의 GenBank에서 BLAST분석을 진행하여 데이터베이스와 비교하였다(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

상기 균주의 16s rRNA 유전자 염기서열은 서열번호 1과 같다.

염기서열 분석 결과는 도 1b와 같았다.

염기서열 분석 결과 상기 균주는 락티플랜티바실러스 플랜타럼 균주와 최대 99% 상동성을 가진다. 본원발명 균주의 계통도는 도 1c와 같았다.

이에 본 발명자는 상기 균주를 새로운 락티플랜티바실러스 플랜타럼 균주로 동정하였고, 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318으로 명명하여 한국미생물보존센터에 2021년 5월 13일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM12988P).

하기의 실험예 및 제조예에서는 빵 제품에 적용 시 물리화학적 소화율을 증가시키는 균주를 선별하기 위하여, 배지 단계에서의 단백질 분해력, 단백질 분해효소인 Protease의 활성, 글루텐 이용능을 우선적으로 측정하였다.

실험예 1. 평판배지 상에서의 단백질 분해력 측정

빵에 적용하였을 때 물리화학적 소화율에 영향을 주는 요소 중의 하나로, 단백질 분해력을 평판배지 상에서 측정하였다. 단백질 Source는 Skim milk로 하였고, 지시약으로는 BCP(Bromocresol purple)를 첨가하여 2% Skim milk BCP-PCA 배지를 제조하였다. 이 배지에 유산균 63종의 배양액을 100㎕씩 도말하여 37℃에서 48시간 배양하고 Colony 주변의 Clear zone을 확인하였다.

총 63종의 유산균을 확인한 결과 18종이 단백질 분해력을 나타냈으며, Clear그 중 zone의 판정 기준은 지름 10mm 이상인 경우 +++, 6~10mm인 경우 ++, 5mm 이하인 경우 +로 정하여 상위 8개 균주에 대해서만 하기 표 3에 그 결과를 나타내었다.

No.	균주명	학 명	급 원	단백질 분해력
1	LRCC 5241	Levilactobacillus brevis	김치	+++
2	LRCC 5318	Lactiplantibacillus plantarum	애플민트	++
3	HLY 19-2	Lactiplantibacillus plantarum	펜넬	++
4	LBS 46-3	Lacticaseibacillus paracasei	김치	++
5	LBS 51-3	Lacticaseibacillus paracasei	김치	++
6	LBS 54-3	Lacticaseibacillus paracasei	김치	++
7	LBS 55-3	Lacticaseibacillus paracasei	김치	+
8	LRCC 5240	Lacticaseibacillus paracasei	김치	+

실험예 2. 액체배지 내에서의 Protease 농도 측정

평판배지 상에서 단백질 분해력을 나타낸 균주 18종에 대하여 해당 단백질 분해력의 원인을 명확히 하기 위해 MRS 액체배지 내에서의 Protease 활성을 측정하였다. Protease의 측정은 Protease assay kit(Pierce™Colorimetric Protease Assay Kit, 제조사: Thermo Scientific™)를 사용하여 이루어졌으며, TNBSA(2, 4, 6-Trinitrobenzene sulfonic acid)가 단백질의 분해물인 아미노산, 펩타이드와 정량적으로 반응하여 노란색 화합물을 생성하는 현상을 측정 원리로 한다.

보다 상세하게는 Test well은 Casein을 기질로 하여 각각 Standard 용액과 Sample(균주 배양액)을 처리하고, Blank well은 기질을 첨가하지 않고 각각 Standard 용액과 Sample(균주 배양액)을 처리한다. 일정 시간 반응 후, 발색 반응에 대해 450nm 파장으로 흡광도를 측정하여 ΔAbs(Absorbance, 흡광도) = Abs_Test - Abs_Blank를 계산한 후, Protease(Trypsin)의 농도를 알고 있는 Standard 용액에 대해 Standard curve를 작성하여 Sample 내의 Protease 농도를 추정하는 것이다.

이에 해당하는 Standard curve는 도 2에 나타내었고, 이를 이용하여 추정한 Protease 농도는 상위 8개 균주에 대해서만 하기 표 4에 나타내었다.

No.	균주명	학명	Protease 농도 (㎍/㎖ Trypsin)
1	LRCC 5241	Levilactobacillus brevis	76.08
2	LBS 54-3	Lacticaseibacillus paracasei	15.68
3	HLY 19-2	Lactiplantibacillus plantarum	13.68
4	LBS 51-3	Lacticaseibacillus paracasei	11.15
5	LBS 46-3	Lacticaseibacillus paracasei	9.40
6	LRCC 5318	Lactiplantibacillus plantarum	9.30
7	LBS 55-3	Lacticaseibacillus paracasei	7.00
8	LRCC 5240	Lacticaseibacillus paracasei	5.51

실험예 3. 균주의 글루텐 이용능 측정

평판배지 상에서 단백질 분해력을 나타낸 균주 18종에 대하여 해당 균주가 글루텐을 영양분(질소원)으로 이용할 수 있는지 확인하기 위해, 글루텐을 포함한 배지 내에서의 생장성을 측정하였다. 글루텐 배지의 조성은 하기 표 5에, 생장성 측정 결과 중 상위 8종에 대한 결과는 도 3에 나타내었다.

시약명	중량(g)	배합비(%)
Glucose	9.34	1.0000
Fructose	4.67	0.5000
Maltose	4.67	0.5000
Yeast Extract	2.80	0.3000
Dipotassium phosphate	1.87	0.2000
Tween 80	0.93	0.1000
Magnesium sulfate	0.09	0.0100
Manganese sulfate	0.05	0.0050
L-Cysteine HCl	0.47	0.0500
Gluten	9.34	1.0000
정제수	900.00	96.3350
합 계	934.24	100.0000

제조예 1. 유산균 발효액 제조

(1) 유산균 발효액의 조성

원료명		함량(g)
원료명		실시예1	실시예2	실시예3	실시예4	실시예5	실시예6	실시예7	실시예8
정제수		99.85	99.85	99.85	98.85	99.85	98.85	98.85	99.85
강력분		49.93	49.93	49.93	49.93	49.93	49.93	49.93	49.93
말토덱스트린		0.11	0.11	0.11	0.11	0.11	0.11	0.11	0.11
포도당		0.11	0.11	0.11	0.11	0.11	0.11	0.11	0.11
균주 배양액	LRCC 5241	1.00	-	-	-	-	-	-	-
	LRCC 5318	-	1.00	-	-	-	-	-	-
	LBS 51-3	-	-	1.00	-	-	-	-	-
	LBS 46-3	-	-	-	1.00	-	-	-	-
	LBS 54-3	-	-	-	-	1.00	-	-	-
	HLY 19-2	-	-	-	-	-	1.00	-	-
	LBS 55-3							1.00
	LRCC 5240	-	-	-	-	-	-	-	1.00
합계		150.00	150.00	150.00	150.00	150.00	150.00	150.00	150.00

(2) 상기 발효액 조성에서 균주 8종의 학명과 분리원은 표 3에 표기된 바와 같으며, MRS 배지에 균주 8종을 각각 배양하여 원심분리 및 PBS Wash 후 배양액으로 사용하였다. 이 때의 균주 함량은 10⁹CFU/ml으로 하였고, 배양 온도는 36±1℃ 배양 시간은 18시간으로 정하여 발효시켰다.

실험예 4. 유산균 발효액의 Protease 농도 측정

상기 유산균 발효액 8종(실시예 1~8)에 대하여 Protease 농도를 실험예 2와 같은 방법으로 측정하였고, 결과는 하기 표 7과 같다. 액체배지에서의 Protease 농도와 유산균 발효액 내의 Protease 농도를 모두 확인한 이유는 밀가루를 함유하는 유산균 발효액 조성과 MRS 액체배지 조성에 차이가 있어, 균주별로 Protease를 생성하는 정도가 다를 수 있기 때문이다. 실제 제빵 시에는 유산균 발효액 내 Protease 농도가 최종 제품에 영향을 주므로, 실험예 7의 결과를 우선적으로 참고하여 LRCC 5241, LRCC 5318, LBS 51-3의 3종을 선정하였다.

No.	균주명	학명	Protease 농도 (㎍/㎖ Trypsin)
1	LRCC 5241	Levilactobacillus brevis	62.34
2	LRCC 5318	Lactiplantibacillus plantarum	54.02
3	LBS 51-3	Lacticaseibacillus paracasei	51.51
4	LBS 46-3	Lacticaseibacillus paracasei	44.63
5	LBS 54-3	Lacticaseibacillus paracasei	43.58
6	HLY 19-2	Lactiplantibacillus plantarum	41.55
7	LBS 55-3	Lacticaseibacillus paracasei	39.11
8	LRCC 5240	Lacticaseibacillus paracasei	34.70

제조예 2. 유산균 발효 식빵 제조

(1) 실험예 4에서 선정된 균주 3종의 식빵에서의 효과를 확인하기 위하여, 균주 미첨가 식빵(비교예 3), 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5241 첨가 식빵(실시예 12), 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5318 첨가 식빵(실시예 13), 락티카제이바실러스 파라카제이 LBS 51-3 첨가 식빵(실시예 14)의 4종을 제조하여 비교하였다.

또한, 식빵 4종은 기본적인 중종법을 사용하여 제조하였다. 중종법은 원료의 일부를 혼합하고 발효한 후에 이를 나머지 원료와 섞어(본종) 발효시킨 다음 소성의 과정을 거치는 제빵법을 의미한다.

(2) 유산균 발효 식빵 중종의 조성 및 제조 방법

유산균 발효 식빵 중종의 조성은 하기 표 8과 같다.

원료명		투입량(g)
원료명		비교예2	실시예9	실시예10	실시예11
강력분		700.0	700.0	700.0	700.0
이스트		17.0	17.0	17.0	17.0
이스트푸드		1.0	1.0	1.0	1.0
유산균 발효액	비교예 1 (균주 미첨가)	100.0	-	-	-
	실시예 1 (LRCC 5241)	-	100.0	-	-
	실시예 2 (LRCC 5318)	-	-	100.0	-
	실시예 3 (LBS 51-3)	-	-	-	100.0
정제수		346.0	346.0	346.0	346.0
합계		1164.0	1164.0	1164.0	1164.0

상기 표 8의 조성대로 원료를 계량한 후, 반죽기를 이용하여 저속(1단)으로 3분, 고속(3단)으로 3분간 믹싱하고 28±1℃75±5%의 발효기에서 4시간 동안 발효시켰다.

(3) 유산균 발효 식빵 본종의 조성 및 식빵 제조 방법

원료명		투입량(g)
원료명		비교예3	실시예12	실시예13	실시예14
강력분		300.0	300.0	300.0	300.0
이스트		1.0	1.0	1.0	1.0
액상과당		20.0	20.0	20.0	20.0
정제염		20.0	20.0	20.0	20.0
탈지분유		8.0	8.0	8.0	8.0
백설탕		70.0	70.0	70.0	70.0
쇼트닝		5.0	5.0	5.0	5.0
중종	비교예2 (균주 미첨가)	1164.0	-	-	-
	실시예9 (LRCC 5241)	-	1164.0	-	-
	실시예10 (LRCC 5318)	-	-	1164.0	-
	실시예11 (LBS 51-3)	-	-	-	1164.0
정제수		220.0	220.0	220.0	220.0
합계		1808.0	1808.0	1808.0	1808.0

상기 조성대로 쇼트닝을 제외한 원료를 계량한 후, 반죽기를 이용하여 저속(1단)으로 3분, 고속(3단)으로 3분간 믹싱한다. 그리고나서 쇼트닝을 투입한 후에 또 다시 저속(1단)으로 3분, 고속(3단)으로 3분간 믹싱한다. 그 후 15분의 플로어 타임 후 분할 및 둥글리기하고 중간 발효를 15분간 진행한다. 중간 발효가 끝난 반죽은 가스를 뺀 후 성형한 후 식빵 틀에 넣어 38±1℃ 85±5%의 발효기에서 55~60분 발효시킨다. 최종 발효가 끝난 반죽은 200℃로 예열한 오븐에서 30분간 소성한다.

상기와 같이 제조된 각 시료의 물리화학적 소화율을 실험예 5 및 실험예 6에서 측정하고, 글루텐 함량을 실험예 7에서 측정하였다.

실험예 5. 식빵 4종의 물리적 소화율 측정

식빵 4종(비교예 3, 실시예 12~14)의 물리적 소화율(%)은 인체의 구강, 위, 소장의 소화 과정을 본 따 만든 in vitro 위장 모델을 이용하여 측정하였다. 인공타액은 Pickering Laboratories사의 Artificial Saliva(cat. no. 1700-0304)를 구매하여 사용하였고, 인공위액은 NaCl 2.0g과 Pepsin 3.2g에 HCl 7ml을 첨가하여 용해시킨 후 pH 1.2로 조정한 후 D.W.(Distilled water)로 1L까지 맞추어 제조하였으며 인공장액은 KH2PO4 6.8g에 D.W. 250ml를 넣어 녹이고 0.2N NaOH 77ml, D.W.500ml, Pancreatin 10g를 첨가한 후 pH 6.8로 조정하고 D.W.로 1L까지 맞추어 제조하였다. 제조한 인공소화액은 실험 전 37℃의 Water bath에 보관한다. 그리고나서 식빵 4종을 분쇄하고 각 10g을 취하여 인공타액에서 10분, 인공위액에서 2시간, 인공장액에서 4시간 동안 방치한 후, 소화 완료액 4종을 거름종이(Whatman, No.541)로 걸러낸 고형분을 80℃ Oven에서 건조시켰다. 이의 건조 중량을 측정하여 하기 식 1에 따라 물리적 소화율을 계산하였다.

[식 1]

식빵 4종의 물리적 소화율을 계산한 결과는 도 5에 나타내었다.

실험예 6. 식빵 4종의 화학적 소화율 측정

식빵 4종(비교예 3, 실시예 12~14)의 화학적 소화율(%)은 실험예 5에서 거름종이로 걸러낸 후의 잔존액 내의 유리아미노산 함량을 통해 측정하였다. 상세하게는, 초기 식빵 시료 4종 10g 내의 단백질 함량을 각각 측정하고 소화 후 잔존액 내 유리아미노산 함량을 측정하여 하기 식 2에 따라 화학적 소화율을 계산하였다.

[식 2]

식빵 4종의 화학적 소화율을 계산한 결과는 도 6에 나타내었다.

실험예 7. 식빵 4종의 글루텐 함량 측정

식빵 4종(비교예 3, 실시예 12~14)의 물리화학적 소화율이 실제로 식빵 내 글루텐 함량의 감소와 연관이 있는지 확인하기 위하여 Gluten assay kit(AgraQuant®Gluten G12®, 제조사: Romer Lab®를 이용하여 글루텐 함량을 측정하였다.

측정 원리는 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, 효모면역정량법) 즉, 항원-항체 반응을 이용하여 Sample 내 특정 물질을 정량하는 것이며 특이성과 감수성이 우수하다는 장점이 있다. 글루텐의 농도를 알고 있는 Standard의 흡광도로 4-PL(4-Parameter Logistic) Standard curve를 그린 후 도출된 계산식을 통해 식빵 4종 내의 글루텐 함량(ppm)을 정량하였으며, Standard curve와 글루텐 함량 측정 결과는 도 7 내지 8에, 계산식은 하기 식 3에 나타내었다.

[식 3]

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12988P

20210513

<110> LOTTE CONFECTIONERY CO.,LTD. <120> Lactiplantibacillus plantarum Strain LRCC 5318 for Increased Physicochemical Digestibility of Bread by Decomposing Gluten, and Use thereof <130> DP-2021-0259 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1349 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rDNA of LRCC 5318 <400> 1 atcatagatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg aaacctgccc 60 agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact tggaccgcat 120 ggtccgagct tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga tggtcccgcg gcgtattagc 180 tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta gccgacctga gagggtaatc 240 ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 300 ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg 360 taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta ttgacggtat 420 ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 480 cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 540 agccttcggc tcaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga 600 cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 660 aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag caaacaggat 720 tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag ggtttccgcc 780 cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga 840 aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900 tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat tagacgttcc 960 cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1020 ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa gttgggcact 1080 ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1140 ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgaactcgcg 1200 agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac 1260 atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc 1320 cttgtacaca ccgcccgtca caccatgag 1349

Claims

빵의 소화력이 증가하는 효과를 갖는 기탁번호가 KCCM 12988P인 락티플랜티바실러스 플랜타럼(Lactiplantibacillus plantarum) LRCC 5318 균주.
제1항에 있어서,
상기 소화력 증가는 균주 배양액 및 유산균 발효액의 높은 Protease 농도와 제빵 발효 시의 글루텐 저감으로 인해 발생하는, 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16S rDNA를 갖는, 균주.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 유산균 발효액.
제4항에 따른 유산균 발효액을 이용하는 단계를 포함하는 빵의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 빵.