ITRM20060369A1 - Miscela di batteri lattici per la preparazione di prodotti da forno senza glutine - Google Patents

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ITRM20060369A1
ITRM20060369A1 IT000369A ITRM20060369A ITRM20060369A1 IT RM20060369 A1 ITRM20060369 A1 IT RM20060369A1 IT 000369 A IT000369 A IT 000369A IT RM20060369 A ITRM20060369 A IT RM20060369A IT RM20060369 A1 ITRM20060369 A1 IT RM20060369A1
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Angelis Maria De
Cagno Raffaella Di
Gianmaria Giuliani
Marco Gobbetti
Antonella Luisi
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Description

RM 2 0 0 6 A 00036 ? DESCRIZIONE
a corredo di una domanda di brevetto per invenzione
industriale dal titolo: "Miscela di batteri lattici
per la preparazione di prodotti da forno senza
glutine"
Titolare: Giuliani S.p.A.
Inventori: Giammaria Giuliani, Anna Benedusi,
Raffaella Di Cagno, Maria De Angelis, Antonella
Luisi, Marco Gobbetti
* * *
La presente invenzione concerne una miscela di H fa batteri lattici per la preparazione di prodotti da Ω forno senza glutine. In particolare, l'invenzione
éà concerne l'uso di "lievito naturale" a base di
batteri lattici selezionati come agente lievitante
per la produzione di pane gluten-free destinato
all'alimentazione di pazienti celiaci. L'uso dei
batteri lattici selezionati ed il protocollo di
produzione proposto consentono un miglioramento delle
caratteristiche organolettiche nutrizionali
rispetto al pane gluten-free ottenuto mediante
lievito di birra o lievitazione chimica.
L'epidemiologia della intolleranza al glutine o
celiachia è in continua espansione. Le ultime
indagini a livello della popolazione europea e degli
Stati Uniti descrivono un'incidenza di 1 individuo
ogni 100 (Fasano and Catassi, 2001. Current approaches to diagnosis and treatment of celiac disease: an evolving spectrum. Gastroenterology 120:
630-651) . Allo stato attuale delle conoscenze, l'unico rimedio terapeutico effettivo nei confronti
di tale intolleranza alimentare è una dieta completamente priva di glutine (gluten-free) da
mantenere rigorosamente per tutta la vita (Hamer,
i£à 2005. Coeliac Disease: Background and biochemical
SH3⁄4 aspects. Biotechnol Advanc 23: 401-408). Pazienti
celiaci sottoposti ad uno stretto regime dietetico
(tolleranza zero) recuperano, in molti casi, la morfologia normale dei villi e delle cripte
intestinali (Hamer, 2005. Coeliac Disease: Background
and biochemical aspects. Biotechnol Advanc 23: 401-408) .
Come riportato nel Codex Standard adottato
dalla World Health Organization (WHO) e dalla Food
and Agricultural Organization (FAO) sono definiti
gluten-free quegli alimenti che: (i) sono preparati a partire da ingredienti che non contengono originariamente grano (tutte le specie del genere
Trìticum) , spelta, kamut, segale, orzo, avena o loro varietà incrociate ed hanno una concentrazione di glutine non superiore a 20 ppm; (ii) sono preparati a partire da ingredienti estratti da grano, segale,
orzo, avena, spelta o loro varietà incrociate e sono
resi gluten-free con una concentrazione di glutine
non superiore a 200 ppm; e (iii) sono preparati a partire da una miscela degli ingredienti delle categorie (i) e (ii) con una concentrazione di
glutine non superiore a 200 ppm. Un'ampia varietà di 3255
prodotti gluten-free è disponibile in commercio: & pane, pizza, biscotti e pasta (Gallagher et al., s tSffis 2004. Recent advances in thè formulation of gluten-
free cereal-based products. Trends Food Sci Technol
15: 143-152). In generale, la qualità del pane
gluten-free, in termini di caratteristiche sensoriali
e reologiche, è inferiore rispetto al pane a base di
farina di grano o segale (Gallagher et al., 2004.
Recent advances in thè formulation of gluten-free
cereal-based products. Trends Food Sci Technol 15:
143-152). L'assenza di glutine e, quindi, di proprietà strutturali difficilmente sostituibili, e l'applicazione di protocolli di produzione adattati
ad ingredienti non convenzionali, principalmente determinano la qualità inferiore (Gallagher et al.,
2004. Recent advances in thè formulation of glutenfree cereal-based products. Trends Food Sci Technol
15: 143-152). La più recente letteratura documenta
diversi studi condotti per migliorare le proprietà reologiche e di conservabilità. In particolare, sono
riportati l'uso di amidi di origine diversa
(Gallagher et al., 2002. Novel rices starches in
gluten-free bread. Proceedings of thè International
es iss Association of Cereal Chemists Conference. 24-26; iffis tsS’U Demiate et al., 2000. Relationship between baking *S3⁄4=
«3⁄4! behaviour of modified cassava starches and starch & est Chemical structure by FTIR spectroscopy. Carbohyd
SS. Polym 42: 149-158), gomme ed altri idrocolloidi (es. idrossipropil-metil-cellulosa, carragenani, xantani)
(Kang et al., 1997. Kor Jour Food Sci Technol 29 :
700-704; Schwarzlaff et al., 1996. Guar and locust
bean gums as partial replacers of all-purpose flour
in bread: an objective and sensory evaluation. J Food
Qual 19: 217-229), proteine di soia (Ranhorta et al.,
1975. Preparation and fortification of soy-fortified
gluten-free bread. J Food Sci 40: 62-64) e polveri di
latte e riso (Gallagher et al., 2003. The effect of
dairy and rice powder addition on loaf and crumb characteristics, and on shelf life (intermediate and long-term) of gluten-free breads stored in a modified atmosphere. Eur Food Res Technol 218: 44-48), che in formulazioni diverse possono contribuire a migliorare
la struttura e shelf-life dei prodotti gluten-free.
Poiché è stato dimostrato che i pazienti celiaci sono soggetti ad un minor assorbimento di fibra, minerali
ed altri nutrienti, rispetto ad individui sottoposti
ad un regime alimentare normale (Grehn et al., 2001.
Dietary habits of Swedish adult coeliac patients treated by a gluten-free diet for 10 years. Scand J
Nutr 45: 178-182; Mariani et al., 1998. The glutenfree diet: a nutritional risk factor for adolescents
with celiac disease. J Pediart Gastroenterol Nut 27:
519-523), l'arricchimento dei prodotti gluten-free
con fibre di diversa origine (es. inulina) è stato altresì considerato da diversi gruppi di ricerca
(Gibson and Roberfroid, 1995. Dietary modulation of
thè human colonie microbiota: introducing thè concept
of prebiotics. J Nut 125: 1401-1412; Taylor and Parker, 2002. Quinoa. Pseudocereals and less common cereals, graìn properties and utilization potential
93-122; Tosi et al., 1996. Utilisation of whole amaranthus ( Amarantus cruentus) flour in thè manufacture of biscuits for coeliacs. Alimentaria 34:
49-51) . Particolare attenzione ha, inoltre, destato
la determinazione in vitro ed in vivo dell'indice glicemico dei prodotti gluten-free (Berti et al.,
2004. In vitro starch digestibility and in vivo glucose response of gluten-free foods and their gluten counterparts. Eur J Nutr 43: 198-204; Packer
et al., 2000. The glycaemix index of a range of gluten-free foods. Diabet Med 17: 557-660). Sebbene
sembrano non esserci differenze notevoli tra pani
convenzionali e gluten-free, è stato dimostrato che
iSb il tipo di ingredienti usati, così come il protocolloÉS egs di produzione (es. tipo di lievitazione), possono 53⁄4sS &3⁄4 I© influenzare notevolmente l'indice glicemico dei prodotti destinati ai pazienti celiaci. La tecnologia
dei prodotti gluten-free è principalmente basata sull'impiego di lievitanti chimici o lievito di birra
( Saccharomyces cerevisiae ) (Gallagher et al., 2004.
Recent advances in thè formulation of gluten-free
cereal-based products. Trends Food Sci Technol 15:
143-152) . Allo stato attuale delle nostre conoscenze,
è nota la domanda di brevetto WO02065842 concernente
uno starter per la preparazione di pane e prodotti da
forno, in particolare gluten-free, in cui detto
starter è a base di Lactobacillus fermentum. Inoltre,
è noto uno studio (Arendt unpublished data in Ratina
et al., 2005. Potential of sourdough for healthier
cereal products. Trends Food Sci Technol 16: 104-112)
in cui è descritto l'uso di "lievito naturale" come
agente lievitante biologico e naturale per la
produzione di pane gluten-free, a base di riso, soia,
grano saraceno e xantani, con lo scopo di rendere più
pronunciato il sapore ed aroma, e di estendere la
s3⁄4» shelf-life. I risultati ottenuti hanno dimostrato che «*s©s3⁄45 © l'uso di "lievito naturale" è tecnologicamente e3⁄4s possibile anche in prodotti gluten-free e che, in fi e ·,ί particolare, la conservabilità ed il sapore sono
migliorati rispetto agli stessi prodotti ottenuti con
lievito di birra o lievitazione chimica. L'uso di
"lievito naturale", un cocktail di batteri lattici e
lieviti originati dalla materia prima, è molto
frequente nella tecnologia dei prodotti lievitati da
forno. Numerosi studi condotti nell'ultimo decennio
(Gobbetti et al., 2005. Biochemistry and physiology
of sourdough lactic acid bacteria. Trends Food Sci
Technol 16 : 57-69) hanno dimostrato che il processo
di acidificazione e l'attività proteolitica operati
dai batteri lattici del lievito naturale sono in
grado di migliorare le caratteristiche sensoriali, reologiche, nutrizionali e di conservabilità dei prodotti lievitati da forno. Recenti studi (Di Cagno
et al., 2002. Proteolysis by sourdough lactic acid bacteria: Effects on wheat flour protein fractions
and gliadin peptides involved in human cereal intolerance. Appi Environ Microbiol 68: 623-633; Di
Cagno et al., 2004. A sourdough bread made from wheat
a*and non-toxic flours and started with selected «ss®
3⁄40 O
lactobacilli is tolerated in celiac sprue. Appi
|SU3⁄4 ii i Environ Microbiol 70: 1088-1096; De Angelis et al.,
2005. VSL#3 probiotic preparation has thè capacity to
<538 hydrolyze gliadin polypeptides responsible for celiac sprue. Biochim Biophys Acta-Moleculare Basis of
Disease 1762: 80-93) hanno dimostrato che batteri lattici del "lievito naturale", qualora selezionati
per la loro attività proteolitica, sono in grado di degradare marcatamente frazioni del glutine responsabili della patologia celiaca. In quest'ambito, alcuni studi (Storsrud et al., 2003.
Gluten contamination in oat products and products naturally free from gluten. Eur Food Res Technol 217:
281-485) condotti su prodotti commerciali del Nord-Europa hanno dimostrato che una considerevole percentuale (ca. 30%) dei prodotti gluten-free può essere contaminata da tracce di glutine (100-300
ppm) , le quali possono costituire un potenziale rischio per gli individui soggetti a questa intolleranza.
Sulla base dei dati riportati in letteratura e precedentemente descritti, alcune problematiche appaiono prioritarie per la qualità dei prodotti gluten-free: (i) migliorare la qualità sensoriale
poiché troppo lontana dai prodotti convenzionali;
(ii) incrementare il valore nutrizionale per compendiare le carenze di assorbimento dei pazienti
celiaci e possibilmente abbassare l'indice glicemico
dei prodotti; (iii) ridurre i rischi di
contaminazione da glutine che possono occorrere in
campo o durante il processo di trasformazione; ed
(iv) estendere la conservabilità.
Alla luce di quanto descritto sopra, risulta pertanto evidente l'esigenza di poter disporre di materiale e metodi per la preparazione di prodotti da
forno che non presentino gli svantaggi dei prodotti
noti.
Gli Autori della presente invenzione hanno ora trovato un "lievito naturale" composto da una miscela
di batteri lattici selezionati e messo a punto un protocollo di produzione mirato ad esaltare le caratteristiche sensoriali e nutrizionali, che possono essere considerati strumenti tecnologici in grado di risolvere le problematiche che appaiono prioritarie per la qualità di pane gluten-free.
I batteri lattici secondo la presente invenzione appartengono al genere Lactobacillus e sono stati precedentemente isolati da "lieviti
naturali" per la produzione di pani tipici del Centro
e Sud Italia. La selezione è stata condotta su 55 isolati sulla base delle attività proteolitica,
acidificante, fitasica e più in generale sulla
capacità di determinare caratteristiche sensoriali ottimali .
In particolare, è stata selezionata la seguente miscela da impiegare sottoforma di "lievito naturale": Lactobacillus sanfranciscensis LS40, L. sanfranciscensis LS41 e Lactobacillus plantarum CF1.
E' stato standardizzato ed ottimizzato un protocollo di propagazione del "lievito naturale" che prevede la sua propagazione per 8-24 h in un impasto
a base di ingredienti gluten-free e la sua successiva utilizzazione, in percentuali diverse in funzione
delle caratteristiche desiderate, come starter
naturale o come ingrediente per una breve
lievitazione (ca. 1-3 h) che precede la cottura del
pane .
Il processo di fermentazione mediante "lievito
naturale" secondo la presente invenzione consente
un'eventuale detossificazione (ca. 300 ppm) del
glutine presente come contaminante negli ingredienti
gluten-free; incrementa di 3-10 volte, in funzione
del dosaggio e tipo d'uso, la concentrazione di c effiaSs i3⁄43⁄4 aminoacidi liberi rispetto all'impiego di lievito di 63! birra come agente lievitante, migliorando così il
valore nutrizionale del pane; è caratterizzato da c~> un'attività fitasica ca. 10 volte superiore rispetto
all'uso di lievito di birra come agente lievitante,
incrementando così la biodisponibilità di sali
minerali del pane; determina una riduzione di ca. il
35% dell'indice di idrolisi dell'amido, correlato
alla risposta glicemica in vivo, rispetto all'uso di
lievito di birra come agente lievitante, consentendo
il consumo di un pane più sicuro per i pazienti
celiaci che alla patologia primaria possono
presentare associata una maggiore predisposizione
all'insorgenza del diabete; consente di migliorare le proprietà sensoriali rispetto all'uso di lievito di
birra come agente lievitante, conferendo un sapore ed
aroma tipici del pane tradizionale. Inoltre, la
miscela di ceppi secondo la presente invenzione
mostra un'attività di tipo peptidasica e un potere di
acidificazione molto superiori a quelle ottenute con
L. fermentum impiegato nella tecnica anteriore. Le
attività enzimatiche della miscela secondo la
presente invenzione hanno il vantaggio di favorire
una maggiore liberazione di aminoacidi incrementando
così le disponibilità nutrizionali; liberare una
maggiore quantità di precursori dei composti volatili
generati durante il processo di cottura e
responsabili dell'aroma tipico del pane; e
contribuire alla detossificazione di eventuali tracce
di glutine, quale contaminante dei prodotti glutenfree .
I batteri lattici Lactobacillus rossiae Ci35 e
LR15, Lactobacillus curvatus lHd e Lactobacillus
farciminis 2XA3 possono essere usati in formulazioni
diverse che si differenziano dalla precedente miscela
principalmente per l'aspetto sensoriale.
Forma pertanto oggetto specifico della presente
invenzione una miscela di ceppi di batteri lattici
per la lievitazione di farine senza glutine comprendente almeno due, preferibilmente almeno tre,
ceppi di batteri lattici scelti nel gruppo che consiste in Lactobacillus sanfranciscensis LS40, Lactobacillus rossiae Ci35, Lactobacillus plantarum
CF1, L. sanfranciscensis LS41, Lactobacillus farciminis 2XA3, L. rossiae LR15 e Lactobacillus curvatus lHd (tutti ceppi depositati depositati in
data 11 luglio 2006 presso il DSMZ).
Secondo forme di realizzazione preferite
possono essere impiegate le seguenti miscele, in ES rapporto paritario tra le specie o ceppi,
comprendenti Lactobacillus sanfranciscensis LS40, E-3⁄43
2XA3, L. rossiae LR15 e L. plantarum CF1 ;
Lactobacillus curvatus lHd, L. rossiae CI35 e L. plantarum CF1; o L. sanfranciscensis LS40, L. sanfranciscensis LS41 e L. rossiae CI35.
La miscela di microrganismi secondo la presente invenzione può essere impiegata per la lievitazione
di farine senza glutine come ad esempio farina di
mais, riso, grano saraceno, girasole, lino, teff,
sorgo, quinoa, patata, manioca, amaranto e miglio.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione di farine senza glutine
per la preparazione di prodotti da forno senza glutine mediante l'impiego della miscela di ceppi
come definita sopra, detta composizione di farine comprendendo mais nativo 10-30%, preferibilmente 15%,
mais bianco 10-30%, preferibilmente 15%, farina di «®as riso 20-60% e farina di grano saraceno 1-10%,
r,> preferibilmente 5%, in cui dette percentuali sono espresse in peso rispetto al peso totale della
composizione di farine.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione concerne un procedimento per la preparazione di uno
starter (nella parte sperimentale anche denominato "lievito naturale" secondo la presente invenzione)
per prodotti da forno senza glutine comprendente le seguenti fasi:
a) propagazione in coltura della miscela di ceppi di batteri lattici come definita sopra;
b) impastare la composizione di farine come definita
sopra in concentrazione pari a 50-65% e acqua 35-50%, contenente la miscela di ceppi batterici della fase
a) con una densità cellulare di ca. IO<8>ufc/g;
c) fermentare per 8-24 ore a 20-30°C.
Il procedimento può comprendere ulteriormente
una fase d) di essicamento o congelamento dello
starter ottenuto nella fase c).
Inoltre, la presente invenzione concerne un procedimento per la preparazione di prodotti da forno
senza glutine comprendente le seguenti fasi:
a) impastare la composizione di farine come definita
EE=Ì
sopra in percentuale del 40-60%, preferibilmente 44%, C23> acqua 10-30%, preferibilmente 26%, contenente lievito
di birra 1-3% e sale 0,1-1,2%, e inoculo di starter, ©S ottenibile secondo il procedimento descritto sopra,
fresco nella quantità da 5 a 30%, preferibilmente 30%
(qualora la percentuale sia inferiore al 30%, aumentano proporzionalmente le quantità di farina ed
acqua), o essiccato, come ingrediente senza funzione
di lievitazione, o congelato con funzione lievitante,
dette percentuali essendo percentuali in peso rispetto al peso totale dell'impasto;
b) lasciare fermentare per circa 1-3 ore a 30°C;
c) cuocere per 50 minuti a 220°C.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una miscela starter ottenibile mediante il procedimento definito sopra. Inoltre, la presente invenzione concerne prodotti da forno ottenibili mediante il procedimento definito sopra.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue
forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui:
& la figura 1 mostra l'analisi SDS-PAGE di
EKSK3⁄4 polipeptidi di albumine e globuline liberati dai
53⁄43⁄4 ceppi appartenenti alla specie Lactobacillus
E-:; sanfrancisensis LS40, Lactobacillus curvatus lHd e Lactobacillus rossiae LR15 e Ci35 Ciascun ceppo è & rappresentativo di un profilo di idrolisi. St,
standard; A/G, proteine non idrolizzate.
Figura 2 mostra l'attività aminopeptidasi tipo N
(a), prolina iminopeptidasi (b), dipeptìdasi (c), tripeptidasi (d), prolidasi (e) e prolinasi (f) dei
ceppi appartenenti alla specie Lactobacillus sanfranciscensis, rispettivamente sui substrati sintetici Leu-p-NA, Pro-p-NA, Leu-Leu, Leu-Leu-Leu,
Val-Pro e Pro-Gly. L'attività enzimatica è stata espressa in unità di attività (U), ovvero la quantità
di enzima necessaria per liberare 1 μτηοΐ di pnitroanilide per minuto o 1 μπιοΐ di aminoacido per minuto per le attività di- e tri-petidasica.
Figura 3 mostra ΔρΗ (differenza di pH tra il valore iniziale e finale) (a) e pmax (massima velocità
di acidificazione) (b) degli impasti fermentati per 7
h a 30°C con i ceppi appartenenti alla specie Lactobacillus sanfranciscensis .
Figura 4 mostra ΔρΗ (differenza di pH tra il
valore iniziale e finale) (a) e pmax (massima velocità KS ES
di acidificazione) (b) degli impasti fermentati per CD 12 h a 30°C con le formulazioni di batteri lattici
selezionati. e® Figura 5 mostra la concentrazione di aminoacidi
liberi totali degli impasti fermentati per 12 h a
30°C con le formulazioni di batteri lattici selezionati .
Figura 6 mostra il profilo degli aminoacidi
liberi determinato mediante Amino Acid Analyzer Biochrom 30 dell'impasto fermentato per 12 h a 30°C
con la formulazione n. 2 di batteri lattici selezionati.
Figura 7 mostra il protocollo di produzione di
pane gluten-free mediante l'uso di "lievito naturale"
a base di batteri lattici selezionati.
Figura 8 mostra l'analisi dei componenti principali (PCA) dei dati ottenuti dall'analisi sensoriale dei pani gluten-free ottenuti con "lievito naturale" (formulazioni n. 1, 2, 4 e 5) fresco rispetto al controllo (C) fermentato con lievito di
birra.
Figura 9 mostra la curva dell'indice di ES3⁄4 κ£;3⁄4ί β » idrolisi dell'amido nei pani ottenuti con "lievito naturale" fresco e lievito di birra.
Esempio 1 : Selezione e analisi dei ceppi
secondo la presente invenzione
Cinquantacinque ceppi di batteri lattici
appartenenti alla Collezione di Colture del Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata dell'Università degli Studi
di Bari, precedentemente isolati da "lieviti naturali", sono stati propagati a 30°C per 24 h in
MRS modificato (mMRS), contenente, oltre agli ingredienti normali, 5% maltosio e 10% di acqua di lievito - pH finale 5,6. In Tabella 1 è riportato l'elenco delle specie di batteri lattici isolati da
"lievito naturale" ed usati nella presente
invenzione .
Tabella 1
Specie Ceppi
LS40,LS13,
LS44,LS35, LS14, Lactobacillus sanfransiscensis
LS11, LS18 LS4,
LS15, LS41
CÌ35, LR15 LR19, Lactobacillus rossiae LR13, LR22 LR24,
LR25, LR8, LR18,
LR20
DC400, CF1, DB200, Lactobacillus plantarum
20196, 2MF8, 3DM, eo
G10C3
Lactobacillus brevis 5Z, CRI3, AM7, 1D,
2Hb
Lactobacillus pentosus 8CF, 12H5, 12H6,
14H9
Lactobacillus alimentarius 2B
Lactobacillus fermentum 2S1, D13
Lactobacillus casei subsp.
2752, 2756, 2766
casei
Lactobacillus para casei 12H8, 12H1, lHb, 4H3 Lactobacillus curvatus lHd, 14H10, 13H5 Lactobacillus farciminis 2XA3
Lactobacillus helveticus B26W
Lactobacillus delbrueckii B15Z
Lactobacillus gas seri B24W, B30W
Lactobacillus amylovorus L. amylovorus
(1) Attività proteolitica
a La selezione sulla base dell'attività
»<'■>;·3⁄4 θ proteolitica è stato effettuata utilizzando cellule
6™? coltivate per 24 h, raccolte mediante centrifugazione
•a3⁄4 (10.000 g x 10 min, 4°C), lavate due volte in tampone
m fosfato 50 mM, pH 7,0 e risospese nello stesso
tampone ad una densità ottica di 2,5 (Aconiti)#
corrispondente alla densità cellulare di IO<8>ufc/ml.
L'attività proteinasica è stata saggiata su albumine
e globuline estratte dalla farina di grano (Weiss, et
al., 1993. Electrophoretic characterization of wheat
grain allergens from different cultivars involved in baker's asthma, Electrophoresis 14: 805-816). La miscela di reazione, contenente 0,9 mi della frazione
delle albumine-globuline (ca. 4 mg/ml di proteina) e
0,1 mi di sospensione cellulare, è stata incubata a
3 0°C per 48 h in agitazione (150 rpm).
L'elettroforesi monodimensionale SDS-PAGE è stata
condotta seguendo il sistema di Laemmli (Laemmli,
1970. Cleavage of structural proteins during thè
assembly of thè head of bacteriophage T4, Nature 227:
680-685). Le attività aminopeptidasiche tipo N (PepN)
e prolina iminopeptidasi (Pepi), sono state determinate usando i substrati sintetici, rispettivamente, Leu-p-NA e Pro-p-NA. La miscela di
reazione consisteva in: 0,9 mi di tampone K-fosfato
e··.·; 50 mM, pH 7,0 in cui era disciolto il substrato
sintetico (concentrazione finale 2 mM) e 100 μΐ di sospensione cellulare. L'attività enzimatica,
espressa in unità di attività (U), è corrisposta alla & quantità di enzima necessaria per liberare 1 μπιοΐ di
p-nitroanilide per minuto (Gobbetti et al., 1996. The proteolytic System of Lactobacillus sanfrancìscensis
CB1: purification and characterization of a proteinase, a dipeptidase, and an aminopeptidas.
Appi . Environ . Microbiol . 62: 3220-3226). Prolidasi
(PepQ) e prolinasi (PepR) sono state determinate come descritto da Di Cagno e collaboratori, (Di Cagno et
al., 2004. Sourdough bread made from wheat and
nontoxic flours and starter with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients,
Appi . Environ . Microbiol . 70: 1088-1096) su, rispettivamente, Val-Pro e Pro-Gly. Dipeptidase
(PepV) e tripeptidasi (PepT) sono state determinate mediante il metodo Cd-ninidrina (Gobbetti et al.,
1999. Study of thè effects of temperature, pH, NaCl,
and aw on thè proteolytic and lipolytic activities of
cheese-related lactic acid bacteria by quadratic response surface methodology, Enzyme Microbial
Technol 25: 795-809) usando, rispettivamente, Leu-Leu
e Leu-Leu-Leu. Una unità di attività (U) è stata
definita come la quantità di enzima necessaria per
liberare 1 μπιοΐ di aminoacido per min. a (2) Potere di acidificazione
La selezione sulla base del potere di H mIi, acidificazione è stata eseguita su 100 g di impasto (rendimento dell'impasto pari a 160) impiegando 62,51
g di una miscela di farine, quali, mais nativo, mais
bianco, farina di riso e farina di grano saraceno,
nelle percentuali, 15, 15, 65 e 5%, e 37,5 mi di
acqua contenente la sospensione cellulare dei singoli
batteri lattici ad una densità cellulare finale pari
a 10<B>ufc/g di impasto. La cinetica di acidificazione
degli impasti è stata rilevata on-line mediante
misura del pH (pH-meter 507, Crison, Italia). I dati
sono stati modellati attraverso l'equazione Gompertz modificata da Zwietering e collaboratori (Zwietering
et al., 1990. Modelling of bacterial growth curve.
Appi Environ Microbiol 56 : 1875-1881).
(3) Detossificazione da glutine
Le prove di detossificazione da glutine sono
state condotte su 100 g di impasto (rendimento dell'impasto pari a 160) impiegando 62,51 g di una
a» miscela di farine, quali, mais nativo, mais bianco,
farina di riso e farina di grano saraceno, nelle 3⁄43⁄4 percentuali, 15, 15, 65 e 5%, e 37,5 mi di acqua m contenente le sospensioni cellulari dei batteri
lattici selezionati per la maggiore attività proteolitica ( Lactobacillus sanfranciscensis LS40,
LS41, Lactobacillus rossiae CI35, LR15, Lactobacillus farciminis 2XA3 e Lactobacillus curvatus lHd) ad una
densità cellulare finale pari a IO<8>ufc/g di impasto.
L'impasto è stato addizionato di una quantità di
glutine pari a 500 o 1000 ppm. Due impasti controllo contenenti, rispettivamente, 500 e 1000 ppm di glutine, e 0,15 g di NaN3(p/p), sono stati prodotti
senza inoculo batterico ed acidificati chimicamente
fino a pH 3,6. Gli impasti sono stati incubati a 30°C
per 5, 24 e 48 h. A fine fermentazione, il test ELISA
è stato usato per la quantificazione del glutine
(Transia Piate, Diffchamb).
(4) Caratterizzazione degli impasti fermentati
I batteri lattici selezionati sono stati usati
in cinque differenti formulazioni impiegate per la produzione di impasti a base di una miscela di farine
costituita da mais nativo, mais bianco, farina di
riso e farina di grano saraceno (Tabella 2).
Tabella 2
SS
Formulazioni Specie es di "lievito
naturale"
1 Lactobacillus
sanfranciscensis
LS40
Lactobacillus
rossiae CI35
Lactobacillus
plantarum CF1
2 L.
sanfranciscensis
LS40
L.
sanfranciscensis
LS41
L. plantarum CF1
3 Lactobacillus
farciminis 2XA3
L. rossiae LR15
L. s plantarum
CF1
4 Lactobacillus curvatus lHd
L. rossiae CI35
L. plantarum CF1
5 L. sanfranciscensis LS40
L. sanfranciscensis LS41
L. rossiae CI35
Gli impasti prodotti come precedentemente indicato sono stati incubati per 24 h a 30°C. Un
impasto senza inoculo batterico, fermentato con
lievito di birra (1,5%) per 2 h a 30°C, è stato usato
come controllo. La caratterizzazione degli impasti fermentati con le diverse formulazioni ed il relativo controllo ha riguardato: (i) la cinetica di acidificazione (Zwietering et al., 1990. Modelling of
bacterial growth curve. Appi Environ Microbiol 56 :
& 1875-1881) ; (ii) la determinazione degli acidi
(SS organici (D- e L- acido lattico e acido acetico)
prodotti durante la fermentazione mediante kit
enzimatici (DHFF CHAMB Italia Srl, Italia) (iii) la SS densità cellulare conta in piastra su mMRS agar
(Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England), (iv) l'attività fitasica mediante rilevazione
dell'ortofosfato inorganico rilasciato, usando il
metodo descritto da Fiske e Subbarow (Fiske e Subbarow, 1925. The colorimetrie determination of phosphorus. J. Biol . Chem. 66 : 375) e Shimizu (Shimizu, 1992. Purification and characterization of
phytase from Bacillus subtilis (Natto) n-77. Biosci .
Biotechnol . Biochem. 56: 1266-1269); e (v) la determinazione del contenuto di aminoacidi totali ed individuali mediante "Amino Acid Analyzer Biochrom
3 0" (Biochrom Ltd, Cambridge, UK), utilizzando una
colonna a scambio cationico (Na Oxidised Feedstuff,
20 cm x 4,6 mm).
(5) Produzione di pane gluten-free
Le diverse formulazioni di "lievito naturale" selezionato sono state usate per la produzione di
pane gluten-free considerando diverse soluzioni tecnologiche. Dopo fermentazione per 24 h, esso è
stato usato come (i) starter naturale fresco «..i 03⁄4 inoculando al 5-30% l'impasto base costituito dagli F*3⁄4s) ingredienti precedentemente elencati o come (ii)
p-i ingrediente (15%) provvedendo al preliminare essiccamento. Gli impasti sono stati aggiunti di
lievito di birra (1%) e NaCl (0,3%) ed incubati a
30°C per 2 h prima di procedere alla cottura (50 min
a 220°C) in forno da laboratorio. Un pane controllo è
stato prodotto mediante l'uso di un impasto
fermentato con lievito di birra (2%) a 30°C per 2 h.
I pani prodotti sono stati oggetto delle seguenti determinazioni: (i) analisi sensoriale mediante un
panel test condotto da 6 assaggiatori non addestrati
(Haglund et al., 1998. Sensory evaluation of wholemeal bread from ecologically and conventionally
grown wheat. J. Cerea 1 Sci . 27: 199-207) ed usando
per ciascun attributo una scala continua di intensità crescente nel range di valori compresi tra 0 e 100;
ed (ii) analisi del volume specifico e durezza
secondo i metodi ufficiali AACC 10-10 e AACC 74-09 (Approved Association Cereal Chemistry, X Edizione,
Ed. AACC, St. Paul, Minnesota - U.S.A.).
(6) Indice di idrolisi dell'amido
L'idrolisi in vitro dell'amido è stata studiata
seguendo il protocollo proposto da Liljeberg et al.
(Liljeberg et al., 1996. Resistant starch formation
in bread as influenced by choise of ingredients or
baking conditions. Food Chem 56: 389-394). Una
aliquota di campione di pane, corrispondente a 1 g di
amido totale, è stata masticata da 2 soggetti per 30 secondi. Il prodotto è stato espulso in un beaker contenente 50 mg di pepsina (Sigma Chemical CO) in 6
mi di tampone fosfato 0,05 M, pH 6,9 (contenente 0,4
g/1 di NaCl). I soggetti hanno sciacquato i loro
denti con 5 mi dello stesso tampone per 60 secondi.
La soluzione di lavaggio è stata anch'essa espulsa
nello stesso beaker. Il pH è stato portato a 1,5 con
HC1 2 M. Ciascun campione è stato incubato a 37°C per
3 0 min in agitazione. Successivamente il pH è stato portato a 6,9 con NaOH 0,5 M e incubato con a-amylase porcina (Sigma Chemical CO, Mo USA). L'enzima (110 U
Sigma Chemical CO) è stato disciolto in 10 mi di tampone e 1 mi di questa soluzione è stata addizionata al contenuto del beaker. Il campione è
stato portato al volume finale di 30 mi con tampone fosfato e trasferito in membrana da dialisi (cut.
off. 12400) (Sigma Chemical CO). La membrana è stata
incubata a 37°C per 3 h in tampone fosfato (800 mi), E® e:3⁄4 e c;~:· in bagno agitante. Ogni 30 min, per 3 h, sono state
ίί<">Λ prelevate e refrigerate aliquote di 2 mi.
Successivamente 3 mi di tampone sodio-acetato 0,4 M
pH 4,75 sono stati addizionati a ciascuna aliquota e
■ss 80 μΐ di amiloglucosidasi (140 U/ml, Boehring) sono
stati aggiunti per idrolizzare l'amido digerito in glucosio (45 min a 60°C in bagno agitante). Il glucosio contenuto è stato determinato mediante Enzy
Plus D-Glucose (Diffchamb). Il fattore di conversione utilizzato per passare da glucosio ad amido è stato
0,9. La frazione di amido digerito è stata espressa
come percentuale rispetto all'amido potenzialmente disponibile idrolizzato ai diversi tempi (30, 60, 90,
120 e 180 min.). Attraverso una equazione di primo
ordine sono state ottenute le curve di idrolisi
usando il programma Statistica 6.0 per Windows 1998.
L'equazione usata è stata la seguente: C = C- (l-e<'kt>)
dove C è la concentrazione al tempo t, C- è la concentrazione all'equilibrio, k è la costante
cinetica e t è il tempo.
Risultati
(1) Attività proteinasica
L'attività proteinasica determinata usando
albumine e globuline come substrato ha evidenziato
e» fSS una eterogeneità nei profili di idrolisi. In Figura 1 es i3⁄4 sono riportati i profili di L. sanfranciscensis LS40,
L. curvatus lHd e L. rossiae LR15 e Ci35 i quali sono «β iggs rappresentativi delle attività proteinasiche più
marcate. Tale attività enzimatica che può risultare complementare a quella di enzimi endogeni delle
farine impiegate nella produzione di alimenti glutenfree costituisce lo step iniziale nel processo di degradazione delle proteine. L'attività peptidasica è
stata saggiata su substrati sintetici relativamente
specifici. In Figura 2 sono riportati i risultati
relativi ai ceppi appartenenti alla specie L. sanfranciscensis. E' possibile osservare che per
tutte le attività enzimatiche considerate, con
l'eccezione dell'attività di tipo tripeptidasi, i
ceppi LS40 e LS41 hanno un'attività marcatamente
superiore a quella degli altri isolati. Con lo stesso
criterio è stata eseguita la selezione per i ceppi
appartenenti alle altre specie. La disponibilità di
un'ampia Collezione di Colture su cui eseguire lo
screening e l'elevato numero di attività enzimatiche
saggiate costituiscono la premessa per l'ottenimento
di ceppi selezionati non comunemente disponibili. L.
sanfranciscensis LS40 e LS41, L. rossiae Ci35 e rc·^ LR15, L. curvatus lHd e L. farciminis 2XA3 sono stati t^3 selezionati sulla base dell'attività proteinasica e
peptidasica. In particolare, una comparazione delle
attività di tipo peptidasi delle specie e ceppi
selezionati con i due ceppi di Lactobacillu fermentum
usati nello screening iniziale ha sempre evidenziato
una più intensa attività peptidasica (40-80% in
media) per tutti i substrati considerati.
Le attività enzimatiche sulla base delle quali è
stata effettuata la selezione possono avere una
valenza molteplice: (i) favorire una maggiore
liberazione di aminoacidi incrementando così le
disponibilità nutrizionali; (ii) liberare una
maggiore quantità di precursori dei composti volatili
generati durante il processo di cottura e responsabili dell'aroma tipico del pane; e (iii)
contribuire alla detossifreazione di eventuali tracce
di glutine, quale contaminante dei prodotti glutenfree .
(2) Potere di acidificazione
Il potere di acidificazione degli isolati di
batteri lattici è stato determinato direttamente su
impasti acidi fermentati con singoli microrganismi
ρ*3|3 per 7 h a 30°C. In Figura 3 sono riportati i
risultati relativi ai ceppi appartenenti alla specie tói Ε·3⁄4ί· L. sanfranciscensis. E' possibile osservare che i
Ό ceppi LS40 , ed in particolare LS41, sono stati caratterizzati anche da un buon potere di acidificazione, espresso in termini di ΔρΗ e μπ^χ.
Con lo stesso criterio è stata eseguita la selezione
per i ceppi appartenenti alle altre specie. In particolare, L. plantarum CF1 è stato selezionato
sulla base di un potere di acidificazione caratterizzato da valori di ΔρΗ superiori a 2,3.
Tutte le specie o ceppi selezionati hanno fatto
registrare una velocità e potere di acidificazione
superiori a quelli determinati per i due ceppi di L.
fermentum considerati nello screening.
(3) Detossificazione da glutine
Il pool di batteri lattici selezionati sulla
base dell'attività proteolitica (L. sanfranciscensis
LS40 e LS41, L. rossiae Ci35 e LR15, L. curvatus lHd
e L. farciminis 2XA3) è stato usato per la detossificazione di 500 o 1000 ppm di glutine deliberatamente addizionati agli impasti gluten-free
per simulare la contaminazione. Dopo 48 h di incubazione degli impasti è stato osservato un decremento di ca. 40% in presenza di ambedue le ss concentrazioni di glutine. Tempi inferiori di incubazione pari a 24 h hanno dimostrato percentuali
di detossificazione simili, mentre 5 h di incubazione
.···.≥ non hanno consentito diminuzioni sostanziali delle concentrazioni di glutine. La combinazione L. sanfranciscensis LS40 e LS41 e L. plantarum CF1 ha
mostrato un'attività di idrolisi del glutine simile a
quella del pool composto da un numero maggiore di
isolati. Una simile attività nei confronti del
glutine può consentire una maggiore sicurezza d'uso
di ingredienti gluten-free prospettando una decontaminazione biologica del glutine durante il
processo di fermentazione.
(4) Caratterizzazione degli impasti fermentati
In Tabella 2 sono riportate le formulazioni di
"lievito naturale" a base di batteri lattici selezionati. Ciascuna delle formulazioni è stata
usata per la fermentazione di impasti per 12 h a
30°C. Un impasto fermentato con solo lievito di birra
per 2 h a 30°C è stato usato come controllo. Tutti
gli impasti prodotti hanno raggiunto dopo 12 h di tassi 5 fermentazione, valori di ΔρΗ sempre maggiori di 2,4 Cfy (pH finale dell'impasto di ca. 3,4) (Figura 3),
denotando per tutte le formulazioni la capacità di
provocare una acidificazione marcata. In particolare, l'impasto prodotto con la combinazione n. 5 (L..
sanfranciscensis LS40 e LS41, e L. rossiae CI35) ha
mostrato il valore di ΔρΗ maggiore pari a ca. 2,6,
mentre la combinazione n. 3 ( L . farciminis 2XA3, L. plantarum CF1 e L. rossiae LR15) ha mostrato il
valore di ΔρΗ più basso pari a ca. 2,45. In termini
di velocità massima di acidificazione (ymax)gli
impasti ottenuti con le combinazioni n. 3, 4 { L.
curvatus lHd, L. plantarum CF1 e L. rossiae Ci35) e 5
hanno mostrato il valore più alto pari a ca. 1,3 ΔρΗ
h<"1>. Il potere di acidificazione costituisce uno dei
parametri da considerare per migliorare le caratteristiche organolettiche di un prodotto lievitato, anche se non sempre il più alto potere di acidificazione è costantemente abbinato ad una buona
struttura e/o aroma del pane, in particolare nel caso
di utilizzo di farine gluten-free. In tutti gli
impasti, ad eccezione dell'impasto controllo, è stata
rilevata la presenza di acidi organici, in Sa«SS particolare, l'acido L-lattico è variato da 21 a 82
mM, l'acido D-lattico da 51 a 75 mM e l'acido acetico iBS L-: 5 fra 10 e 30 mM (Tabella 3 mostra la concentrazione di « *<'>s·a ;
*3g s3⁄4S acido L- e D-lattico, acido acetico e quoziente di
fermentazione degli impasti fermentati per 12 h a
30°C con le formulazioni di batteri lattici selezionati).
Tabella 3
Impasto Acido L- Acido D- Acido
lattico lattico acetico Quoziente di
(mM) (mM) (mM)
fermentazione
1 58,0 72.0 25,0
5,2
2 82,0 75.0 30,0
5,2
3 55,0 57.0 10,0
11,2
4 27,0 51.0 20,0
3,9
5 21 , 0 59 , 0 25 , 0
3 , 2
Control nd<b>2 , 00 0 , 10
lo<a>20
<a>Impasto fermentato a 30°C per 2 h con lievito di birra
<b>nd, non determinato
Quoziente di fermentazione, rapporto molare tra acido lattico
ed acido acetico.
Le concentrazioni rilevate per i tre acidi ed
il rapporto tra acido lattico ed acetico rispecchia £3⁄4ìk m il profilo metabolico dei batteri lattici presenti esi e . : nella combinazione. Il rapporto tra gli acidi É^ì ess organici corrisponde a quello normalmente rilevato «SS *a£ negli impasti acidi (pari a 4:1), ad eccezione dell'impasto ottenuto con la combinazione n. 3. La concentrazione degli acidi organici, può fornire
utili informazioni circa il contributo che i batteri
lattici possono dare in termini di aroma al prodotto
finito. In generale, il valore del rapporto molare
tra acido lattico ed acetico, il quale definisce il
quoziente di fermentazione, deve tendere a valori
molto bassi per dare il miglior contributo. Tutti gli
impasti prodotti, ad eccezione della combinazione n.
3, hanno presentato un quoziente di fermentazione
ottimale. La densità cellulare degli impasti prodotti
dopo 12 h di fermentazione varia tra 9,1 e 9,47 Logi0
ufc/g di impasto. Al fine di stimare il contributo
che l'uso del lievito naturale può dare da un punto
di vista nutrizionale in forma di biodisponibilità di
minerali nel pane, gli impasti ottenuti con le cinque
combinazioni sono stati caratterizzati per l'attività
fitasica. In Tabella 4, sono riportati i valori della
attività fitasica degli impasti fermentati per 12 h a iS.
e® 30°C con le formulazioni di batteri lattici K£<«J>fcfrfiv? selezionati, espressa come valore di assorbanza a
a:: 700nm.
c i r*é Tabella 4
Impasto Attività
fitasica
1 0,008
2 0,053
3 0,040
4 0,061
5 0,048
Controllo l<a>0,002
Controllo 2<b>0,003
Controllo 3<C>0,002
Controllo 1: impasto senza inoculo batterico lievitato
per 2 h a 30°C con l'l% di lievito di birra.
<b>Controllo 2: impasto senza inoculo batterico lievitato
per 2 h a 30°C con 0,5% di lievito di birra.
<c>Controllo 3: impasto senza inoculo batterico lievitato
per 2 h a 30°C con 0,25% di lievito di birra.
Con l'eccezione della formulazione 1, tutte le
altre (in particolare le combinazioni 2 e 4) hanno
mostrato valori di attività fitasica circa 30 volte
superiori a quella presente nell'impasto controllo.
In Figura 5 è mostrata la concentrazione totale degli
aminoacidi liberi, la quale per le 5 formulazioni di
"lievito naturale" è variata tra 726,54 e 2415,97
«3⁄4 mg/kg di impasto. L'impasto controllo fermentato con & fri & lievito di birra ha presentato una concentrazione t. -ì pari a 420,07 (mg/kg). La fermentazione per un tempo
superiore (24 h) con la formulazione 2 ha favorito un
raddoppiamento della concentrazione di aminoacidi
liberi ottenuta dopo 12 h di incubazione, a
dimostrazione della possibilità di incrementare il
valore nutrizionale e la digeribilità del pane
fermentato con "lievito naturale" . Il profilo
aminoacidico dell'impasto ottenuto con la
combinazione n. 2, si è distinto per la produzione
degli aminoacidi Arg (178,38 mg/kg), Leu (134,09
mg/kg), Giu (82,45 mg/kg) e Pro (87,30 mg/kg) (Figura
6).
(5) Produzione di pane gluten-free
Le diverse formulazioni di "lievito naturale" a base di batteri lattici selezionati sono state utilizzate per la produzione di pane gluten-free secondo il protocollo biotecnologico descritto in Figura 7. Le due alternative proposte corrispondono a diverse soluzioni tecnologiche. L'uso di "lievito naturale" fresco come starter naturale per l'ulteriore processo di fermentazione (2 h a 30°C) rappresenta una tecnologia tradizionale, non costosa e che richiede il rinfresco giornaliero del "lievito naturale". Una variante all'uso di "lievito naturale" come tale può essere rappresentata dal suo congelamento per consentirne una conservazione più prolungata ed il successivo uso previa riattivazione. L'essiccamento del "lievito naturale" ed il suo uso diretto come ingrediente consente una più agevole conservazione non risultando però attivo nella fase finale di fermentazione (2 h a 30°C). Rispetto all'uso di lievito di birra come agente lievitante, l'impiego di "lievito naturale" fresco al 30% consente di ottenere un pane con una attività fitasica ca. 10 volte superiore; incrementa il contenuto di aminoacidi liberi di ca. 10 volte; e determina una riduzione di ca. il 35% dell'indice di idrolisi dell'amido. In funzione della percentuale di
uso del "lievito naturale", da variare in accordo con
le caratteristiche desiderate, soprattutto
sensoriali, gli incrementi sopra citati sono suscettibili di variazione. Anche l'uso del "lievito
naturale" congelato, previa riattivazione, dimostra ESg 3⁄43⁄40 e$S le stesse performance di quello fresco. Tutti i pani eli (<J>.<'>ί lì3⁄4» ottenuti con le diverse formulazioni di "lievito
naturale" a base di batteri lattici selezionati sono
stati caratterizzati da valori di volume specifico e
lira® durezza simili o lievemente migliori rispetto al pane
g53⁄4 controllo prodotto con solo lievito di birra. I pani ÌÌJ prodotti sono stati sottoposti ad analisi sensoriale.
I parametri sensoriali considerati sono stati: elasticità, colore, aroma acido, sapore acido,
dolcezza, secchezza e aroma. Ciascun attributo è
stato valutato secondo una scala di intensità
crescente nel range di valori compresi tra 0 e 100.
Per una valutazione qualitativa del profilo
sensoriale di ciascun pane, i dati ottenuti sono
stati elaborati mediante analisi statistica delle
componenti principali (PCA). Le due componenti
principali riportate in Figura 8 hanno spiegato il
73% della varianza totale dei campioni. L'asse
orizzontale (Fattore 1) indica la distribuzione delle tipologie dei pani, in funzione del complesso della valutazione sensoriale, l'asse delle ordinate
(Fattore 2) esprime la distribuzione dei pani in funzione del singolo parametro sensoriale considerato. Come dimostrato dalla distribuzione dei
«Eg pani sul piano definito dalle due componenti
principali (Figura 8a), si evince che le tipologie di
pane, prodotte con "lievito naturale" fresco hanno
presentato una valutazione sensoriale abbastanza
simile. Dalla Figura 8b emerge chiaramente che le
caratteristiche sensoriali dell'aroma, sapore e
colore tipiche ed apprezzate sono distribuite nella
parte di piano in cui sono presenti i pani prodotti
con il "lievito naturale", a conferma del ruolo e contributo del "lievito naturale" in termini di aroma
e sapore . UN MANDATARIO
per setper gli al<t>r<i>
Gitto

Claims (1)

  1. RIVENDICAZ IONI 1. Miscela di ceppi di batteri lattici per la lievitazione di farine senza glutine comprendente almeno due, preferibilmente almeno tre, ceppi di batteri lattici scelti nel gruppo che consiste in Lactobacillus sanfranciscensis LS40, Lactobacillus rossiae CI35, Lactobacillus plantarum CF1, L. sanfranciscensis LS41, Lactobacillus farciminis 2XA3, L. rossiae LR15 e Lactobacillus curvatus lHd (tutti ceppi depositati in data 11 Luglio 2006 presso il lift. a® DSMZ ). EIE 2. Miscela secondo la rivendicazione 1, comprendente «3* &G «ai Lactobacillus sanfranciscensis LS40, Lactobacillus
    rossiae CI35 e Lactobacillus plantarum CF1. 3. Miscela secondo la rivendicazione 1, comprendente
    L. sanfranciscensis LS40, L. sanfranciscensis LS41 e L. plantarum CF1. 4. Miscela secondo la rivendicazione 1, comprendente Lactobacillus farciminis 2XA3, L. rossiae LR15 e L. s plantarum CF1. 5. Miscela secondo la rivendicazione 1, comprendente Lactobacillus curvatus lHd, L. rossiae CI35 e L. plantarum CF1. 6. Miscela secondo la rivendicazione 1, comprendente, L. sanfranciscensis LS40, L. sanfranciscensis LS41 e L. rossiae CI35. 7 . Miscela secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a 6 in cui i ceppi sono in rapporto paritario alla densità cellulare di ca. IO<8>cfu/g ad inizio fermentazione .
    8 . Miscela secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a e eevs?<1>7, in cui le farine senza glutine sono scelte nel gruppo che consiste in farina di mais, riso, grano
    saraceno, girasole, lino, teff, sorgo, quinoa, patata manioca, amaranto, miglio.
    9. Miscela di farine senza glutine per la preparazione di prodotti da forno senza glutine mediante l'impiego della composizione di ceppi come definita in ognuna delle rivendicazioni da 1 a 8, detta composizione di farine comprendendo mais nativo 10-30%, preferibilmente 15%, mais bianco 10-30%, preferibilmente 15%, farina di riso 20-60%, farina di grano saraceno 1-10%, preferibilmente 5%, in cui dette percentuali sono espresse in peso rispetto al peso totale della composizione di farine. 10. Procedimento per la preparazione di starter per prodotti da forno senza glutine comprendente le seguenti fasi: a) propagazione in coltura della miscela di ceppi di batteri lattici come definita in ognuna delle rivendicazioni da 1 a 8;
    b) impastare la composizione di farine come definita
    ss» nella rivendicazione 9 in concentrazione pari a 50-64% e acqua 35-50% contenente la coltura di ceppi
    batterici della fase a) con una densità cellulare del
    IO<8>ufc/g in rapporto paritario tra le specie o ceppi in cui dette percentuali sono percentuali in peso
    rispetto al peso dell'impasto totale; c) lasciare fermentare per 8-24 ore a 30°C. 11. Procedimento secondo la rivendicazione 10, che comprende ulteriormente una fase d) di essiccamento o di congelamento dello starter ottenuto nella fase c). 12. Procedimento per la preparazione prodotti da forno senza glutine comprendente le seguenti fasi: a) impastare la composizione di farine secondo la rivendicazione 9 in percentuale del 40-60%, preferibilmente 44%, acqua 10-30%, preferibilmente 26%, contenente lievito di birra 1-3%, preferibilmente 2% e sale 0,1-1,2%, e inoculo di starter, ottenibile mediante il procedimento definito in ognuna delle rivendicazioni 10-11, fresco nella quantità da 5 a 30%, preferibilmente 30%, o essiccato, come ingrediente senza funzione di lievitazione, o congelato con funzione lievitante, ^ dette percentuali essendo percentuali in peso ss® rispetto al peso totale dell'impasto; b) lasciare fermentare per circa 2 ore a 30 °C; c) cuocere per 50 minuti a 220°C. 13. Composizione starter ottenibile mediante il procedimento definito nella rivendicazione 10 o 11. 14. Prodotti da forno ottenibili mediante il procedimento definito nella rivendicazione 12. Roma
    p.p. : GIULIANI S.p.A. BARZANO & ZANARDO ROMA S.p.A. UN MANDATARIO SG per se e per gli altri Serena Gitto (N<®>d’iscr. 962 B)
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Settanni Sourdough and cereal‐based foods: Traditional and innovative products
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Yang Dominant lactic acid bacteria and yeasts in rice sourdough produced in New Zealand: a thesis presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Master of Food Technology, Massey University, Albany, New Zealand
ITMI20080440A1 (it) Batteri lattici e loro uso sotto forma di lievito naturale per la produzione di pane e prodotti da forno con elevate proprieta nutrizionali e sensoriali; pane e prodotti da forno a basso indice glicemico ed alto contenuto di fibra alimentare