PT2046944E - Mistura de bactérias de ácido láctico para a preparação de produtos de panificação sem gluten - Google Patents

Mistura de bactérias de ácido láctico para a preparação de produtos de panificação sem gluten Download PDF

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PT2046944E
PT2046944E PT78056918T PT07805691T PT2046944E PT 2046944 E PT2046944 E PT 2046944E PT 78056918 T PT78056918 T PT 78056918T PT 07805691 T PT07805691 T PT 07805691T PT 2046944 E PT2046944 E PT 2046944E
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Giammaria Giuliani
Anna Benedusi
Raffaella Di Cagno
Maria De Angelis
Marco Gobbetti
Antonella Luisi
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Giuliani Spa
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Description

PE2046944 1 DESCRIÇÃO "MISTURA DE BACTÉRIAS DE ÁCIDO LÁCTICO PARA A PREPARAÇÃO DE PRODUTOS DE PANIFICAÇÃO SEM GLÚTEN" 0 presente invento diz respeito a uma mistura de bactérias lácticas para a preparação de produtos de panificação sem glúten. Particularmente, o invento está relacionado com a utilização de "levedura natural" baseada em bactérias lácticas seleccionadas como "agente levedante" para a produção de pão sem glúten para ser usado por doentes celíacos. A utilização de bactérias lácticas seleccionadas e o protocolo de produção proposto permite melhorar as caracteristicas organolépticas nutritivas e de armazenamento, comparativamente com o pão obtido sem glúten usando a fermentação com levedura de cerveja ou química. A epidemiologia da intolerância ao glúten ou doença celíaca está em crescimento contínuo. Os últimos estudos de vigilância relativamente à população europeia e dos Estados Unidos descrevem uma incidência de 1/100 (Revers, 2005. Epidemiology of celliac disease: what are the prevalence, incidence and progression of celiac disease? Gastroenterology. 128:47-51). De acordo com o conhecimento actual, a única terapia eficaz contra esta intolerância alimentar é uma dieta com ausência total de glúten (sem glúten) a ser rigorosamente mantida durante 2 ΡΕ2046944 toda a vida (Hamer, 2005. Celliac Disease:Background and biochemical aspects. Biotechnol Advanc 23:408). Os doentes celíacos sujeitos a um regime dietético restringente (tolerância zero) recuperam, em muitos casos, a morfologia normal das vilosidades e criptas intestinais (Hamer, 2005. Celliac Disease: Background and Biochemical aspects. Biotechnol Advanc 23:401-408).
Como descrito pelo Standard Codex adoptado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e Organização para a Alimentação e Agricultura (FAO), os alimentos sem glúten são definidos de acordo com o seguinte: (i) são preparados originalmente a partir de ingredientes sem trigo (todas as espécies do género Triticum) , espelta, "Kamut" (Γ. turgidum var. polonicum) , centeio, cevada, aveia ou as suas variedades híbridas e com concentração de glúten inferior a 20 ppm: (ii) são preparados usando ingredientes extraídos de trigo, espelta, "Kamut" (Γ. turgidum var. polonicum), centeio, cevada, aveia ou das suas variedades híbridas e são tornados sem glúten com uma concentração de glúten inferior a 200 ppm; e (iii) são preparados a partir de uma mistura dos ingredientes de (i) e (ii) com uma concentração de glúten não superior a 200 ppm. Comercializa-se uma grande variedade de produtos sem glúten: pão, piza, biscoitos e massas (Gallagher et al. 2004. Recent advances in the formulation of gluten-free cereal-based products. Trends Food Ski Technol 15:143-152). De um modo geral, a qualidade do pão sem glúten, em termos de características sensoriais e reológicas, é inferior à do pão preparado a 3 ΡΕ2046944 partir de farinha de trigo ou centeio (Gallagher et al 2004. Recent advances in the formulation of gluten-free cereal-based products. Trends Food Ski Technol 15:143-152). A ausência de glúten e, assim, as propriedades estruturais dificilmente substituíveis e a aplicação de protocolos de produção adaptados a ingredientes não convencionais, determinam essencialmente a qualidade inferior (Gallagher et al. 2004. Recent advances in the formulation of gluten-free cereal-based products. Trends Food Ski Technol 15:143-152). A literatura mais recente descreve vários estudos realizados de forma a melhorar as propriedades reológicas e de armazenamento. Em particular, o uso de amidos de fontes diferentes (Gallagher et al. 2002. Novel rices starches in glúten free bread. Proceedings of the International Association of Cereal Chemists Conference. 24-26; Demiate et al., 2000. Relationship between baking behavior of modified cassava starches and starch Chemical structure by FTIR spectroscopy. Carbohyd Polym 42:149-158), borrachas e outros hidrocolóides está descrito (por exemplo hidroxipro-pilmetilcelulose, carragenanos, xantanos) (Kang et al., 1997. Kor Jour Food Ski Technol 29:700-704; Schwarzlaff et al., 1996. Guar and locust bean gums as partial replacers of all-purpose flour in bread: an objective and sensory evaluation. J. Food Qual 19:217-229), proteínas da soja (Ranhorta et al., 1975. Preparation and fortification of soy-fortified gluten-free bread. J Food Sei 40:62-64) e pós de leite e arroz (Gallagher et al., 2003. The effect of dairy and poder addition on loaf and crumb characteristics, and on shelf life (intermediate and long-term) of glúten- 4 ΡΕ2046944 free breads stored in modified atmosphere. Eur Food Res Technol 218:44-48), que em várias formulações pode contribuir para melhorar a estrutura e vida de prateleira dos produtos sem glúten. Uma vez que foi demonstrado que os doentes celíacos estão sujeitos a uma absorção menor das fibras, minerais e outros nutrientes, comparativamente com indivíduos sujeitos a um regime alimentar normal (Grehn et al., 2001. Dietary habits of Swedish adult celiac patients treated by to gluten-free diet for 10 years. Scand J Nutr 45:178-182; Mariani et al., 1998 . The gluten-free diet: a nutritional risk factor for adolescents with celiac disease. J Pediart Gastroenterol Nut 27:519-523), o enriquecimento de produtos sem glúten com fibras de várias origens (por exemplo inulina) também foi considerado por vários grupos de pesquisa (Gibson and Roberfroid, 1995. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J Nut 125:1401-1412; Taylor and Parker, 2002, Quinoa. Pseudocereals and less common cereais, wheat properties and utilization potential 93-122; Tosi et al., 1996. Utilisation of whole amaranthus (Amaranthus cruentus) flour in the manufacture of biscuits for celiacs. Alimentaria 34:49-51). A tecnologia dos produtos sem glúten baseia-se principalmente no uso de químicos ou levedura de cerveja (Saccharomyces cerevlsiae) para a fermentação (Gallagher et al., 2004. Recent advances in the formulation of gluten-free cereal-based products. Trends Food Ski Technol 15:143-152) . De acordo com o conhecimento actual, existe o Pedido de Patente WO0265842 relativa a um fermento de partida para a produção de pão e 5 PE2046944 produtos de panificação, em particular sem glúten, em que o referido fermento de partida se baseia em Lactobacillus fermentum. É ainda conhecido um outro estudo (Arendt dados não publicados em katina et ai., 2005. Potential of sourdough for healthier cereal products. Trends Food Sei Technol 16:104-112) em que se descreve o uso de "levedura natural" como agente de fermentação biológico e natural para a produção de pão sem glúten, baseado em arroz, soja, trigo sarraceno e xantanos, de forma a reforçar o sabor e aroma, e prolongar a vida de prateleira. Os resultados obtidos demonstraram que a utilização de "levedura natural" é tecnologicamente possível também em produtos sem glúten e, em particular, o armazenamento e o sabor são melhorados comparativamente com os mesmos produtos obtidos usando levedura de cerveja ou fermentos químicos. A "levedura natural", uma mistura de bactérias lácticas e leveduras originárias de matéria crua, é frequentemente usado na tecnologia de produtos de panificação com levedura. Vários estudos realizados na última década (Gobbetti et al., 2005. Bactéria Biochemistry and physiology of sourdough lactic acid bactéria. Trends Food Sei Technol 16:57-69) demonstraram que no processo de acidificação a actividade de peptidase exercida pelas bactérias lácticas de "levedura natural" é adequada para melhorar o sabor, características reológicas, nutritivas e de armazenamento dos produtos de panificação fermentados com leveduras. Estudos recentes (Di Cagno et al., 2002. proteolysiso of sourdough lactic acid bactéria; effects on wheat four protein fractions and gliadin peptides involved in human cereal intolerance. Appl 6 ΡΕ2046944
Environ Microbiol 68:623-633; Di Cagno et al., 2004. A sourdough bread made from wheat and non-toxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue. Appl Environ Microbiol 70:1088-1096; De Angelis et al., 2005. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to hydrolyse gliadin polypeptides responsible for celiac sprue. Biochim Biophys Acta-Moleculare Basis of Disease 1762:80-93) demonstraram que as bactérias lácticas de "levedura natural", quando seleccionadas pela sua acti-vidade proteolitica, são capazes de degradar notavelmente fracções de glúten responsáveis pela patologia celíaca. Di Cagno et al. (Applied and Environmental Microbiology, vol. 70, n° 2, February 2004, páginas 1088-1096) e De Angelis et al. (Journal of Cereal Science, Academic Press Ltd, XX, vol. 43, n°3, May 2006, páginas 301-314) descreve estirpes de bactérias láticas para a fermentação de farinhas sem glúten, tais como Lactobacillus brevis 14G e L. sanfranciscensis 7A, Gerez et al. (Letters in Applied Microbiology, vol. 42, n° 5, May 2006, páginas 459-464) descreve um método de rastreio para a identificação de estirpes de lactobacilos e de pediococos que digerem o glúten. Neste contexto, alguns estudos (Storsrud et al., 2003. Glúten contamination in oat products and products naturally free from glúten. Eur Food Res Technol 217:281-485) realizados com produtos comerciais no norte da Europa demonstraram que uma percentagem notável (cerca de 30%) dos produtos sem glúten pode estar contaminada com vestígios de glúten (100-300 ppm), que podem constituir um risco possível para os indivíduos sujeitos a esta intolerância. 7 ΡΕ2046944
Com base na literatura referida e nos dados atrás descritos, alguns problemas parecem ser prioritários relativamente à qualidade dos produtos sem glúten: (i) melhorar a qualidade sensorial uma vez que são demasiado diferentes dos produtos convencionais; (ii) aumentar o valor nutritivo de forma a abreviar a deficiência de absorção dos doentes celíacos; (iii) reduzir os riscos de contaminação do glúten que possivelmente ocorre no campo ou durante o processo de transformação; e (iv) prolongar o tempo de armazenamento.
Face ao que foi dito, é pois aparente a necessidade de proporcionar materiais e métodos para a preparação de produtos de panificação sem as desvantagens dos conhecidos.
Os autores do presente invento descobriram agora uma "levedura natural" consistindo numa mistura de bactérias lácticas seleccionadas e proporcionam um protocolo de produção adequado para aumentar o sabor e as características nutritivas, que podem ser considerados instrumentos tecnológicos adequados para resolver os problemas prioritários da qualidade do pão sem glúten. As bactérias lácticas de acordo com o presente invento pertencem ao género Lactobacillus e foram anteriormente isoladas a partir de "leveduras naturais" para a produção de pão típico do Centro e Sul de Itália. A selecção foi realizada entre 55 pães isolados, baseada nas actividades ΡΕ2046944 proteolíticas, de acidificação e da fitase e, de um modo mais geral, na capacidade para determinar características sensoriais óptimas.
As bactérias lácticas de acordo com o presente invento foram depositadas em 11 de Julho de 2006 no centro qualificado de colecções DSMZ, o qual atribuiu às bactérias os números de depósito de acordo com a seguinte correspondência :
Lactobacillus sanfranciscensis LS40 = DSM 18426 L. sanfranciscensis LS41 = DSM 18428 Lactobacillus rossiae LR15 = DSM 18428 Lactobacillus rossiae Ci35 = DSM 18429 Lactobacillus plantarum CF1 = DSM 18430 Lactobacillus curvatus lHd = DSM 18431 Lactobacillus farciminis 2XA3 = DSM 18432
No entanto, após o envio para a DSMZ foi comunicado à agência que realmente as denominações correctas de Lactobacillus curvatus lHd e de Lactobacillus farciminis 2XA3 são Lactobacillus brevis lHd e Pediococcus pentosaceus 2XA3 .
Assim, na continuação da descrição, as bactérias de acordo com o invento Lactobacillus sanfranciscensis LS40, L. sanfranciscensis LS41, Lactobacillus rossiae LR15, Lactobacillus rossiae Ci35, Lactobacillus plantarum CF1, Lactobacillus brevis lHd, Pediococcus pentosaceus 2XA3 de 9 ΡΕ2046944 agora em diante serão denominadas, respectivamente, Lactobacillus sanfranciscensis (DSM18426), L. sanfrancis-censis (DSM 18427), Lactobacillus rossiae (DSM 18429), Lactobacillus plantarum (DSM 18430), Lactobacillus brevis (DSM 18431), Pediococcus pentosaceus (DSM 18432).
Particularmente, foi seleccionada a mistura que se segue para ser usada na forma de "levedura natural": Lactobacillus sanfranciscensis (DSM 18426), L. sanfranciscensis (DSM 18427) e Lactobacillus plantarum (DSM 18430). A Figura 1 mostra as sequências parciais dos genes do rRNA 16S de L. sanfranciscensis (DSM 18426), L. sanfranciscensis (DSM 18427) e L. plantarum (DSM 18430) obtido por amplificação de PCR usando as sequências iniciadoras LpigF/LiPR. (TACGGGAGGCAGCAGTAG/CATGGTGTGACGGGCGGT, respectivamente SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2).
Um protocolo de propagação de "levedura natural" envolvendo a sua propagação durante 8-24 h numa massa consistindo em ingredientes sem glúten e o seu uso sucessivo foi normalizado e optimizado em várias percentagens de acordo com as caracteristicas pretendidas, como fermento de partida ou ingrediente natural para uma fermentação curta (cerca de 1-3 h) precedendo o cozimento do pão. O processo de fermentação usando "levedura natural" de acordo com o presente invento permite (i) uma possível eliminação de glúten (cerca de 300 ppm) do glúten 10 ΡΕ2046944 contaminante nos ingredientes sem glúten; (ii) aumentos de 3-10 vezes, dependendo da dosagem e tipo usados, da concentração dos aminoácidos livres comparativamente com a utilização de levedura de cerveja como agente de fermentação, aumentando assim o valor nutritivo do pão; (iii) caracteriza-se por uma actividade de fitase cerca de 10 vezes superior à derivada da utilização de levedura de cerveja como agente de fermentação, aumentando assim a biodisponibilidade dos sais minerais do pão conforme demonstrado relativamente a Ca2+ e Zn2+ usando espectro-fotometria de absorção atómica; (iv) permite melhorar as propriedades sensoriais, comparativamente com a utilização de levedura de cerveja como agente levedante, conferindo um sabor e aroma típicos do pão tradicional; e (v) determina uma melhor vida de prateleira do pão evitando o uso de agentes conservantes químicos. Ainda, a mistura de estirpes de acordo com o presente invento apresenta actividade do tipo peptidase e poder de acidificação muito superior ao obtido com L. fermentum usado em trabalhos anteriores. As actividades enzimáticas da mistura de acordo com o presente invento possuem a vantagem nutricional de favorecer uma maior libertação de aminoácidos aumentando assim as suas capacidades nutritivas; libertação de uma maior quantidade de precursores dos compostos voláteis gerados durante o processo de cozimento e responsáveis pelo aroma típico do pão; e contribuição para a eliminação de possíveis vestígios de glúten, existentes como contaminantes dos produtos sem glúten. 11 PE2046944
As bactérias lácticas Lactobacillus rossiae (DSM 18429) e (DSM 18428), Lactobacillus brevis (DSM 18431) e Pediococcus pentosaceus (DSM 18432) podem ser usadas em várias formulações diferindo da mistura atrás descrita principalmente do ponto de vista sensorial. Constitui assim um objectivo especifico do presente invento uma mistura de estirpes de bactérias lácticas para levedar farinhas sem glúten compreendendo ou consistindo pelo menos duas, de preferência pelo menos três estirpes de bactérias lácticas seleccionadas do grupo consistindo em Lactobacillus san-franciscensis (DSM 18426), Lactobacillus rossiae (DSM 18429), Lactobacillus plantarum (DSM 18430), L. sanfran-ciscensis (DSM 18427), Pediococcus pentosaceus (DSM 18432). L. rossiae (DSM 18428) e Lactobacillus brevis (DSM 18431).
De acordo com realizações preferidas podem ser usadas as misturas que se seguem, em proporções iguais para as diferentes espécies ou estirpes, compreendendo ou consistindo em Lactobacillus sanfranciscensis (DSM 18426), Lactobacillus rossiae (DSM 18429) e Lactobacillus plantarum (DSM 18430); L. sanfranciscensis (DSM 18426), L. sanfranciscensis (DSM 18427) e L. plantarum (DSM 18430); Pediococcus pentosaceus (DSM 18432). L. rossiae (DSM 18428) L. plantarum (DSM 18430); Lactobacillus brevis (DSM 18431), L. rossiae (DSM 18429) e L. plantarum (DSM 18430); ou L. sanfranciscensis (DSM 18427) e L. rossiae (DSM 18429). A mistura de microrganismos de acordo com o presente invento pode ser usada para a fermentação de 12 ΡΕ2046944 farinhas sem glúten tais como, por exemplo, farinhas de milho, arroz, trigo sarraceno, amido de tapioca, girassol, linho, tef (Eragrostis tef), sorgo, quinoa, batata, mandioca, amaranto e milho painço. Por exemplo, uma composição de farinha sem glúten pode compreender amido de milho 10-30%, de preferência 12%, amido de tapioca 2-10%, de preferência 4%, farinha de arroz 20-60%, de preferência 32% e farinha de trigo sarraceno 1-10%, de preferência 6%, em que as referidas percentagens são expressas como % do peso total da composição de farinha. Às misturas a serem usadas para a preparação de produtos de panificação sem glúten são adicionados outros ingredientes, tais como goma de guar, xantanos, glicerina, inulina, sorbitol, hidrolisado de proteína de soja, lecitina de soja, azeite, óleo de girassol, açúcar, sal, soro de leite e leite em pó desnatado usado em várias percentagens (0,5-3,0%) dependendo do tipo de produto.
Um outro objectivo do presente invento refere-se a um processo para a preparação de uma levedura de partida (também designada "levedura natural" de acordo com o presente invento na secção experimental) para os produtos de panificação sem glúten, compreendendo os seguintes passos: a) propagação em cultura da mistura de estirpes de bactérias lácticas como atrás definidas; b) mistura da composição de farinha como atrás 13 PE2046944 definida numa concentração de 50-65% com 35-50% de água, contendo a mistura de estirpes de bactérias, como definido g no passo a) , tendo uma densidade celular de cerca de 10 ufc/g; c) fermentação durante 8-24 horas a 20-30°C. O processo pode ainda compreender um passo d) de secagem ou congelação do fermento obtido no passo c). O presente invento ainda diz respeito a um processo para a preparação de produtos de panificação sem glúten compreendendo os seguintes passos: a) amassar a composição de farinha como atrás definida numa percentagem de 40-60%, de preferência 44%, água 10-30%, de preferência 26%, contendo levedura de cerveja 1-3% e sal 0,1-1,2% e inoculo de fermento fresco, obtido de acordo com o processo descrito atrás e compreendendo a mistura de estirpes de bactérias lácticas como definido atrás, numa quantidade entre 5 e 30%, de preferência 30% (quando a percentagem é inferior a 30%, as quantidades de farinha e água são proporcionalmente aumentadas) ou seco, como sejam os ingredientes sem actividade fermentativa ou congelados com actividade fermentativa, as referidas percentagens sendo percentagens de peso com referência ao peso total da amassadura; b) fermentação durante aproximadamente 1-3 horas a 30°C; c) cozimento durante 50 minutos a 22°C. 14 ΡΕ2046944 É ainda um objectivo do presente invento uma mistura de fermentos obtida usando o processo atrás definido e compreendendo a mistura de estirpes de bactérias lácticas como atrás definida. Ainda, o presente invento diz respeito a produtos cozidos no forno obtidos usando o processo definido atrás, como seja, por exemplo, pão e compreendendo a mistura de estirpes de bactérias lácticas como definido atrás. 0 presente invento será agora descrito com fins ilustrativos e não limitantes, de acordo com as suas realizações preferidas, com particular referência aos desenhos juntos em que: A Figura 1 mostra as sequências parciais dos genes do rRNA 16S de Lactobacillus sanfranciscensis (DSM 18426), L. sanfranciscensis (DSM 18427) e L. plantarum (DSM 18430) (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, respectivamente). A Figura 2 mostra a análise por SDS-PAGE dos polipéptidos de albumina e globulina libertados das estirpes pertencentes às espécies Lactobacillus sanfranciscensis (DSM 18426), Lactobacillus brevis (DSM 18431) e Lactobacillus rossiae (DSM 18428) e (DSM 18429). Cada estirpe é representativa de um perfil de hidrólise. St, padrão; A/G, proteínas não hidrolisáveis. A Figura 3 mostra a actividade de aminopeptidase 15 ΡΕ2046944 tipo N (a) , prolina iminopeptidase (b) , dipeptidase (c) , tripeptidase (d), prolidase (e) e prolinase (f) de estirpes pertencentes à espécie Lactobacillus sanfranciscensis, respectivamente nos substratos sintéticos Leu-p-Na, For-p-NA, Leu-Leu, Leu-Leu-leu, Val-Pro e For-Gly. A actividade enzimática foi expressa como unidade de actividade de actividade (U) , ou seja a quantidade de enzima necessária para libertar 1 pmol/min de p-nitroanilida ou 1 pmol/min de aminoácido para actividades de dipeptidase e tripeptidase. A Figura 4 mostra ΔρΗ (diferença entre os valores do pH inicial e final) (a) e pmax (velocidade máxima de acidificação) (b) de massas fermentadas durante 7 h a 30°C com estirpes pertencentes à espécie Lactobacillus sanfranciscensis. A Figura 5 mostra ΔρΗ (diferença entre os valores do pH inicial e final) (a) e pmax (velocidade máxima de acidificação) (b) de massas fermentadas durante 12 h a 30°C com formulações de bactérias lácticas seleccionadas. A Figura 6 mostra a concentração de aminoácidos livres totais de massas fermentadas durante 12 h a 30°C com as formulações de bactérias lácticas seleccionadas. A Figura 7 mostra o perfil de aminoácidos livres conforme determinado por meio do analisador de aminoácidos Biochrom 30 na massa fermentada durante 12 h a 30°C com a formulação n° 2 de bactérias lácticas seleccionadas. 16 ΡΕ2046944 A Figura 8 mostra o protocolo de produção de pão sem glúten através do uso de "levedura natural" baseado em bactérias lácticas seleccionadas. Na Figura a referência à mistura de farinha em termos quantitativos e qualitativos é puramente indicativo e na segunda fermentação a adição de outros ingredientes é considerado como anteriormente especificado. A Figura 9 mostra a análise dos principais componentes (PCA) dos dados obtidos a partir da análise sen-sorial de pães sem glúten obtidos usando "levedura natural" fresca (formulações n° 1, 2, 4 e 5) comparativamente com o controlo fermentado com levedura de cerveja (C).
Exemplo 1: Selecção e análise de estirpes de acordo com o presente invento
Cinquenta e cinco estirpes de bactérias lácticas pertencentes à Collezione di Colture del Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata da Universitá degli Studi di Bari, previamente isoladas a partir de "leveduras naturais", foi propagada a 30°C durante 24 h em MRS modificado (mMRS) contendo, para além dos ingredientes normais, 5% de maltose e 10% de água de levedura - pH final 5,6. A Tabela 1 descreve as espécies de bactérias lácticas isoladas a partir de "levedura natural" e usadas no presente invento. PE2046944 17
Tabela 1
Espécies Estirpes Lactobacilus sanfransiscensis (DSM 18426), LS13, LS44, LS35, LS14, LS11, LS18, LS4, LS15, (DSM 18427) Lactobacillus rossiae (DSM 18429), (DSM 18428), LR19, LR13, LR22, LR24, LR25, LR18 , LR20 Lactobacillus plantarum DC400, (DSM 18430), DB200, 20196, 2MF8, 3DM, G10C3 Lactobacillus brevis (DSM 18431), 5Z, CR13, ΡΜΊ, 1D, 2Hb Lactobacillus pentosus 8CF, 12H5, 12H6, 14H9 Lactobacillus alimentarius 2B Lactobacillus fermentum 2S1, D13 Lactobacillus casei subsp. casei 2572, 2756, 2766 Lactobacillus paracasei 12H8, 12H1, lHb, 4H3 Lactobacillus curvatus 14H10, 13H5 Pediococcus pentosaceus (DSM 18432) Lactobacillus helveticus B26W Lactobacillus delbrueckii B15Z Lactobacillus gasseri B24W, B30W Lactobacillus amylovorus L. amylovorus
As bactérias lácticas preferidas de acordo com o invento L. sanfranciscensis (DSM 18426), L. sanfran-ciscensis (DSM 18427) e L. plantarum (DSM 18430) foram caracterizadas através de sequenciação, como ilustrado na figura 1. (1) Actividade proteolitica A selecção baseada na actividade proteolitica foi realizada usando células cultivadas durante 24 h, colhidas por centrifugação (10000 xg, 10 min, 4°C), lavadas duas 18 ΡΕ2046944 vezes em tampão de fosfatos 50 mM, pH 7,0 e suspensas no mesmo tampão a uma densidade óptica de 2,5 (A620nm) , correspondente a uma densidade celular de 108 ufc/ml. A actividade de proteinase foi testada em albuminas e globulinas extraídas de farinha de trigo (Weiss et ai., 1993. Electrophoretic characterisation of wheat grain allergens from different cultivars involved in baker's asthma, Electropheresis 14:805-816). A mistura de reacção, contendo 0,9 ml da fracção albumina-globulina (ca. 4 mg/ml de proteína) e 0,1 ml de suspensão de células, foi incubada a 30°C durante 48 h com agitação (150 rpm). A electroforese monodimensional SDS-PAGE foi realizada de acordo com o sistema de Laemmli (Laemmli, 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4, Nature 227:680-685). As actividades de aminopeptidase tipo N (PepN) e prolina iminopeptidase (Pepl) foram determinadas usando substratos sintéticos, respectivamente, Leu-p-NA e For-p-NA. A mistura de reacção compreendeu: 0,9 ml de tampão K-fosfato 50 mM, pH 7,0 em que o substrato sintético foi dissolvido (concentração final 2 mM) e 100 μΐ de suspensão de células. A actividade enzimática, expressa como unidade de actividade (U), correspondente à quantidade de enzima necessária para libertar 1 pmol/min de p-nitroanilida (Gobbetti et al., 1996. The proteolytic system of Lactobacillus sanfranciscensis CB1: purification and characterization of a proteinase, dipeptidase and aminopeptidase. Appl. Environ. Microbiol. 62:3220-3226). Prolidase (PepQ) e prolinase (PepR) foram determinadas como descrito por Di Cagno e colaboradores (Di Cagno et al., 19 ΡΕ2046944 2004. Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and starter with selected lactobacilli is tolerates in celiac sprue patients. Appl. Environ. Microbiol. 70:1088 — 1096) respectivamente em Val-pro e For-Gly. A actividade de dipeptidase (PepV) e de tripeptidase (PepT) foi determinada de acordo com o método de Cd-ninidrina (Gobbetti et ai., 19999. study of the effects of temperature, pH, NaCl and aw on the proteolytic and lipolytic activities of cheese-related lactic acid bactéria by quadratic response surfasse methodology, Enzyme Microbial Technol 25:795-809 usando, respectivamente, Leu-Leu e Leu-Leu-Leu. Uma unidade de actividade (U) foi definida como a quantidade de enzima necessária para libertar 1 pmol de aminoácido/min. (2) Poder de acidificação A selecção baseada no poder de acidificação foi realizada em 100 g de massa (rendimento de massa 160) usando 62,51 g de mistura de farinhas, como por exemplo milho nativo, milho branco, farinha de arroz e farinha de trigo sarraceno, a 15, 15, 65 e 5 peso % e 37,5 ml de água contendo suspensão de células das bactérias lácticas isoladas numa densidade final de 108 ufc/g de massa. A cinética de acidificação das massas foi determinada medindo em linha o pH (medidor de pH 507, Crison, Itália). Os dados foram modelados usando a equação de Gompertz modificada por Zwietering e colaboradores (Zwietering et ai., 1990. Modelling of bacterial growth curve. Appl Environ Microbiol 56:1875-1881). 20 ΡΕ2046944 (3) Eliminação de glúten
Os testes de eliminação de glúten foram realizados em 100 g de massa (rendimento da massa 160) usando 62,51 g de mistura de farinhas, como por exemplo milho nativo, milho branco, farinha de arroz e farinha de trigo sarraceno, a 15, 15, 65 e 5 peso % e 37,5 ml de água contendo suspensão das células de bactérias lácticas seleccionadas pela sua maior actividade proteolitica (Lactobacillus sanfranciscensis (DSM 18426), (DSM 18427), Lactobacillus rossiae (DSM 18429), Pediococcus pentosaceus (DSM 18431) e Lactobacillus brevis (DSM 18431)) numa densidade celular final de 108 ufc/g de massa. Uma quantidade de glúten de 500 ou 1000 ppm foi adicionada à massa. Duas massas controlo contendo, respectivamente, 500 e 1000 ppm de glúten e 0,15 g de NaN3 (p/p) , foram produzidas sem inoculo bacteriano e acidificadas quimicamente a pH 3,6. As massas foram incubadas a 30°C durante 5, 24 e 48 h. No final da fermentação, foi usado o teste de ELISA para a quantificação de glúten (Transia Plate, Diffcham). (4) Caracterização das massas fermentadas
As bactérias lácticas seleccionadas foram usadas em cinco formulações diferentes e empregues na produção de massas baseadas numa mistura de farinha consistindo em milho nativo, milho branco, farinha de arroz e farinha de trigo sarraceno (Tabela 2). 21 PE2046944
Tabela 2 Formulações do Espécie "levedura natural" 1 Lactobacillus sanfranciscensis (DSM 18426) Lactobacillus rossiae (DSM 18429) Lactobacillus plantarum (DSM 18430) 2 Lactobacillus sanfranciscensis (DSM 18426) Lactobacillus sanfranciscensis (DSM 18427) Lactobacillus plantarum (DSM 18430) 3 Pediococcus pentosaceus (DSM 18432) L. rossiae (DSM 18428) L.s plantarum (DSM 18430) 4 Lactobacillus brevis (DSM 18431) L. rossiae (DSM 18429) L. plantarum (DSM 18430) 5 L. sanfranciscensis (DSM 18426) L. sanfranciscensis (DSM 18427) L. rossiae (DSM 18429)
As massas produzidas como anteriormente indicado foram incubadas durante 24 h a 30°C. Uma massa sem inoculo bacteriano, fermentada usando levedura de cerveja (1,5%) durante 2 h a 30°C, foi usada como controlo. A caracterização das massas fermentadas com as diferentes formulações e correspondente controlo incluiu: (i) cinética de acidificação (Zwietering et al., 1990 . Modelling of 22 ΡΕ2046944 bacterial growth curves. Appl Environ Microbiol 56:1875-1881); (ii) a determinação de ácidos orgânicos (ácido láctico e ácido acético D e L) produzidos durante a fermentação por meio de kits enzimáticos (DHFF CHAMB Italy Srl, Italy) (iii) densidade celular por contagem de placas em agar mMRS (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England), (iv) actividade de fitase através da detecção de ortofosfato inorgânico libertado, usando o método descrito por Fiske e Subbarow (Fiske and Subbarow, 1925. The colorimetric determination of phosphorus. j. Biol. Chem. 66:375) e Shimizu (Shimizu, 1992. Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (Natto) n-77. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56:1266-1269); e (v) a determinação do teor de aminoácidos totais por meio de "Amino Acid Analyser Biochrom 30" (Biochrom Ltd, Cambridge, UK) usando uma coluna de permuta catiónica (Na Oxidised Feedtuff, 20 cm x 4,6 mm) . (5) Produção de pão sem glúten
As diferentes formulações de "levedura natural" seleccionadas foram usadas na produção de pão sem glúten considerando várias soluções tecnológicas. Após fermentação durante 24 h, foi usada como (i) levedura natural fresca de partida através da inoculação, numa base de 5-30% da massa, e consistindo nos ingredientes atrás descritos ou (ii) ingrediente similar (15%) tendo sido proporcionada a secagem preliminar. Levedura de padeiro (1%) e NaCl (0,3%) 23 PE2046944 foram adicionados às massas e incubados a 30°C durante 2 h antes do cozimento (50 min a 220°C) num forno de laboratório. Uma massa controlo foi produzida usando massa fermentada com levedura de cerveja (2%) a 30°C durante 2 h. As determinações que se seguem foram realizadas nos pães produzidos: (i) análise do teor em elementos minerais biodisponiveis através da extracção da água e subsequente determinação por espectroscopia de absorção atómica; (ii) análise sensorial por um teste de painel realizado por 6 provadores não treinados (Haglund et al., 1998. Sensory evaluation of wholemeal bread from ecologically and conventiaonally grown wheat. J. Cereal Sei. 27:199-207) e usando para cada parâmetro uma escala continua de intensidade crescente na gama de valores de 0 a 100; (iii) análise do volume especifico e dureza de acordo com os métodos oficiais AACC 10-10 e AACC 74-09 (Approved
Association Cereal Chemistry, X Edition, Ed. AACC, St. Paul, Minnesota - USA); e (iv) teste de vida de prateleira por meio da produção de pão à escala industrial, embalamento numa atmosfera modificada (40% N2 e 60% C02) e armazenamento subsequente durante 6 meses na ausência de compostos químicos de conservação.
Resultados (1) Actividade de proteinase A actividade de proteinase, determinada usando albuminas e globulinas como substrato, evidenciou perfis de - 24 - ΡΕ2046944 hidrólise heterogéneos. Na Figura 2 os perfis de L. sanfranciscensis (DSM 18426), L. brevis (DSM 18431) e L. rossiae (DSM 18428) e (DSM 18429) são representativos de actividade de proteinase mais marcável. Tal actividade enzimática que pode ser complementar de uma das enzimas endógenas das farinhas, usadas na produção de alimentos sem glúten, constitui o passo inicial no processo da degradação de proteína. A actividade de peptidase foi testada em substratos sintéticos relativamente específicos. Na Figura 3 são descritos resultados relacionados com estirpes pertencentes à espécie L. sanfranciscensis. É possível observar que para todas as actividades enzimáticas consideradas, com excepção da actividade tipo tripeptidase, (DSM 18426) e (DSM 18427) possuem actividade notavelmente superior relativamente às outras estirpes. De com o mesmo critério foi feita a selecção de estirpes pertencentes a outras espécies. A disponibilidade de uma colecção de culturas para o rastreio e o grande número de actividades enzimáticas testadas constituem a premissa de forma a obter estirpes seleccionados geralmente não disponíveis. L. sanfranciscensis (DSM 18426) e (DSM 18427), L. rossiae (DSM 18429) e (DSM 18428), L. brevis (DSM 18431) e P. pento-saceus (DSM 18432) foram seleccionadas com base nas actividades de proteinase e peptidase. Em particular, uma comparação das actividades tipo peptidase de espécies e estirpes seleccionadas com duas estirpes de Lactobacillus fermentum usadas no rastreio inicial sempre apontou para maior actividade de peptidase (40-80% em média) para todos os substratos testados. As actividades enzimáticas com base 25 ΡΕ2046944 nas quais a selecção foi realizada podem ter um valor múltiplo: (i) favorecer uma maior libertação de aminoácidos aumentando assim as disponibilidades nutritivas; (i i) libertar maior quantidade de precursores de compostos voláteis gerados durante o processo de cozedura e responsáveis pelo aroma típico do pão; e (iii) contribuir para a eliminação de possíveis vestígios de glúten, como contaminante dos produtos sem glúten. (2) Poder de acidificação 0 poder de acidificação dos isolados de bactérias lácticas foi determinado directamente nas massas ácidas fermentadas com um único microrganismo durante 7 h a 30°C. Na Figura 4 são descritos os resultados relacionados com estirpes pertencentes a L. sanfranciscensis. É possível observar que as estirpes (DSM 18426) e, e em particular (DSM 18427), foram caracterizadas também por um bom poder de acidificação, expresso em termos de ΔρΗ e pmax. A selecção de estirpes pertencentes a outras espécies foi realizada de acordo com o mesmo critério. Em particular, L. plantarum (DSM 18430) foi seleccionada com base no poder de acidificação caracterizado por valores de ΔρΗ superiores a 2,3. Todas as espécies ou estirpes seleccionadas apresentaram poder de acidificação e velocidade superior aos determinados para as duas estirpes de L. fermentum consideradas no rastreio. 26 ΡΕ2046944 (3) Eliminação de glúten 0 conjunto de bactérias lácticas seleccionadas com base na actividade de proteólise (L. sanfranciscensis (18426) e (DSM 18427), L. rossiae (DSM 18429) e (DSM 18428), L. brevis (DSM 18431) e P. pentosaceus (DSM 18432)) inicialmente, foi usado para a eliminação de 500 a 1000 ppm de glúten deliberadamente adicionado a farinhas sem glúten, de forma a simular contaminação. Após 48 h de incubação das massas, foi observado um decréscimo de aproximadamente 40% na presença de ambas as concentrações de glúten. Tempos de incubação inferiores, i.e. 24 h, apresentaram percentagens de eliminação semelhantes, enguanto uma incubação de 5 h não permitiu decréscimos substanciais das concentrações de glúten. L. sanfranciscensis (DSM 18426) e (DSM 18427) e L. plantarum (DSM 18430) em combinação apresentaram uma actividade de hidrólise do glúten semelhante a uma mistura consistindo num número superior de isolados. A mesma combinação de bactérias lácticas foi adequada para reduzir num patamar de 20 ppm uma concentração inicial de glúten de aproximadamente 300 ppm, o qual é um valor de contaminação razoável para os materiais de partida sem glúten. Uma actividade semelhante contra o glúten pode permitir uso com maior segurança dos ingredientes sem glúten envolvendo uma descontaminação biológica do glúten durante o processo de fermentação. (4) Caracterização de massas fermentadas
Na Tabela 2 são descritas as formulações de 27 PE2046944 "levedura natural" baseadas em bactérias lácticas selec-cionadas. Cada uma das formulações foi usada na fermentação de massas durante 12 h a 30°C. Uma massa fermentada apenas com levedura de cerveja, durante 2 h, a 30°C foi usada como controlo. Todas as massas produzidas após 12h de fermentação atingiram sempre valores de ΔρΗ superiores a 2,4 (pH final da massa de aproximadamente 3,4) (Figura 4), indicando para todas as formulações a capacidade para provocar uma acidificação notável. Em particular, a massa obtida usando a combinação n° 5 (L. sanfranciscensis (18426) e (DSM 18427) e L. rossiae (DSM 18429) apresentaram o valor de ΔρΗ mais elevado, igual a cerca de 2,6, enquanto a combinação n° 3 (P. pentosaceus (DSM 18432), L.s plan-tarum (DSM 18430) e L. rossiae (DSM 18428)) apresentaram o valor de ΔρΗ mais baixo igual a cerca de 2,45. Em termos da velocidade de acidificação máxima (pmax) as massas obtidas usando as combinações n° 3, 4 (L. brevis (DSM 18431), L. plantarum (DSM 18430) e L. rossiae (DSM 18429)) e 5 apresentaram valor de ΔρΗ mais elevado igual a cerca de 1,3 h_1. O poder de acidificação representa um dos parâmetros a ser considerado de forma a melhorar as caracteristicas organolépticas do produto levedado, mesmo se nem sempre o poder de acidificação mais elevado estiver constantemente associado a uma boa estrutura e/ou aroma do pão, em particular no caso do uso de farinha sem glúten. Em todas as massas, com excepção da massa controlo, a presença orgânica foi detectada, em particular, as variações foram como se segue: ácido L-láctico entre 21 e 82 mM, ácido D-láctico entre 51 e 75 mM e ácido acético entre 10 e 30 mM (a Tabela 3 mostra concentrações de ácido láctico L e D, 28 PE2046944 ácido acético e quociente de fermentação das massas fermentadas durante 12 h a 30°C com formulações de bactérias lácticas seleccionadas).
Tabela 3
Massa Ácido L-láctico Ácido D-láctico Ácido acético Quociente de (mM) (mM) (mM) fermentação3 1 58,0 72,0 25,0 5,2 2 82,0 75,0 30,0 5,2 3 55,0 57,0 10,0 11,2 4 27,0 51,0 20,0 3,9 5 21,0 59,0 25,0 3,2 Controlo3 ndb 2,00 0,10 20 a Massa fermentada a 30°C durante 2 h com levedura de cerveja b nd, não determinado 3 Quociente de fermentação, razão molar entre ácido láctico e ácido acético.
As concentrações detectadas dos três ácidos e a razão entre ácido láctico e acético reflectem o perfil metabólico das bactérias lácticas presentes na combinação. A razão de ácidos orgânicos corresponde à normalmente encontrada em massas ácidas (igual a 4:1), com excepção da massa obtida com a combinação n°3. A concentração de ácidos orgânicos, pode proporcionar informação útil sobre a contribuição, em termos de aroma, para o produto acabado que pode resultar das bactérias lácticas. De um modo geral, o valor da razão molar entre ácido láctico e acético, que define o quociente de fermentação, deve tender para valores muito baixos, de forma a proporcionar a melhor contribuição. Todas as massas produzidas, com excepção da PE2046944 combinação n°3, apresentaram um quociente de fermentação óptimo. A densidade celular das massas produzidas após 12 h de fermentação é de 9,1 a 9,47 logio ufc/g de massa. De forma a estimar a contribuição que o uso da levedura natural pode dar do ponto de vista nutritivo, como seja biodisponibilidade mineral na massa, as massas obtidas com as cinco combinações descritas foram caracterizadas relativamente à actividade de fitase. Na tabela 4, são descritos os valores de actividade de fitase das massas fermentadas durante 12 h a 30°C com as formulações de bactérias lácticas seleccionadas, expressos como absorvância a 700 nm.
Tabela 4
Massa Actividade de fitase 1 0,008 2 0, 053 3 0, 040 4 0, 061 5 0, 048 Controlo la 0, 002 Controlo 2b 0, 003 Controlo 3c 0, 002 aControlo 1: massa sem inoculo bacteriano levedada durante 2 h a 30°C com 1% de levedura de cerveja. bControlo 2: massa sem inoculo bacteriano fermentado durante 2 h a 30°C com 0,5% de levedura de cerveja. cControlo 3: massa sem inoculo bacteriano fermentado durante 2 h a 30°C com 0,25% de levedura de cerveja. 30 ΡΕ2046944
Com excepção da formulação 1, todas as outras (em particular as combinações 2 e 4) apresentaram valores de actividade de fitase aproximadamente 30 vezes superior à massa controlo. Na Figura 5 é descrita a concentração total de aminoácidos livres, a qual para as 5 formulações de "levedura natural" é de 726,54 a 2415,97 mg/kg de massa. A concentração para a massa controlo fermentada com levedura de cerveja foi de 420,07 (mg/kg). A fermentação durante tempo prolongado (24 h) com 2 formulações resultou na duplicação da concentração de aminoácidos livres obtida após 12 h de incubação, indicando a possibilidade de aumentar o valor nutritivo e a digestibilidade do pão fermentado com "levedura natural". O perfil de aminoácidos da massa obtido com a combinação n° 2 salienta-se pela produção dos aminoácidos Arg (178,38 mg/kg), Leu (134,09 mg/kg), Glu (82,45 mg/kg) e Pro (87,30 mg/kg) (Figura 6). (5) Produção de pão sem glúten
As várias formulações de "levedura natural" baseadas em bactérias lácticas seleccionadas foram usadas para a produção de pão sem glúten de acordo com o protocolo biotecnológico descrito na Figura 8. As duas alternativas propostas correspondem a diferentes soluções tecnológicas. A utilização de "levedura natural" fresca, como fermento de partida para posterior processo de fermentação (2 h a 30°C), representa uma tecnologia tradicional, não dispendiosa e que requere renovação diária do "fermento natural". 31 PE2046944
Uma variante ao uso de "levedura natural" como tal pode ser a sua congelação de forma a permitir uma conservação mais prolongada e o uso sucessivo após reactivação. A secagem da "levedura natural" e o seu uso directo como ingrediente permite conservação fácil apesar de não estar activo no período de fermentação final (2h a 30°C). Relativamente ao uso de levedura de cerveja como agente de fermentação, o uso de 30% de "levedura natural" fresca permite a obtenção de cerca de 10-30 vezes mais actividade de fitase durante o processo de fermentação, resultando num aumento de aproxi-madamente 21 e 48% do teor de Ca2+ e Zn2+ biodisponível, respectivamente, e o teor dos aminoácidos livres é aumentado em cerca de 10 vezes. Com base na percentagem de uso da "levedura natural" poder ser alterada de acordo com as características pretendidas, acima de tudo as sensoriais, aumentos atrás descritos são susceptíveis de variação. Igualmente, o uso de "levedura natural", após reactivação, apresenta alguns desempenhos da fresca. Todas as massas obtidas com as diferentes formulações de "levedura natural" baseado nas bactérias lácticas selec-cionadas são caracterizadas por valores semelhantes ou ligeiramente melhores do volume específico e dureza comparativamente com o pão controlo produzido apenas com levedura de cerveja. Os pães produzidos foram sujeitos a análise sensorial. Os parâmetros sensoriais avaliados foram: elasticidade, cor, aroma ácido, sabor ácido, dulçor, secura e aroma. Cada um dos parâmetros foi avaliado de 32 PE2046944 acordo com uma escala de intensidade crescente com gama de valores entre 0 e 100. Para uma avaliação qualitativa do perfil sensorial de cada pão, os dados obtidos foram tratados por meio de análise estatística dos componentes principais (PCA). Dois componentes principais descritos na Figura 9 explicaram 73% da variância total da amostra. O eixo horizontal (Factor 1) indica a distribuição da tipologia de pão, em função da avaliação sensorial global, o eixo vertical (Factor 2) expressa a distribuição do pão em função de cada parâmetro sensorial considerado. Como é aparente da distribuição do pão no plano definido a partir dos dois componentes principais (Figura 9a) , deduz-se que as tipologias de pão produzidas usando "levedura natural" fresca apresentam resultados sensoriais muito semelhantes. A partir da Figura 9b é claramente aparente que as características sensoriais típicas e apreciadas de aroma, sabor e cor estão distribuídas na parte do plano em que os pães produzidos com "levedura natural" estão presentes, confirmando o papel e contribuição da "levedura natural" em termos de aroma e sabor. Finalmente o pão produzido com a formulação 2, produzido em escala industrial, embalado em atmosfera i modificada (40% N2 e 60% C02) e sujeito a conservação durante 6 meses. Durante todo o período de conservação o fenómeno de contaminação microbiana (cres- cimento de bolores e pão "pegajoso") sem a adição de compostos químicos conservantes (e.g., Ca-propionato) não foi observado. 33 PE2046944 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Giuliani S.P.A. <120> Mistura de bactérias lácticas para a preparação de produtos sem glúten <130> PCT 26904 <150> RM2006A000369 <151> 2006-08-17 <160> 5 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sequência iniciadora de amplificação LpigF <400> 1 tacgggaggc agcagtag 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sequência iniciadora de amplificação LiPR <400> 2 catggtgtga cgggcggt 18
<210> 3 <211> 719 <212> DNA <213> Lactobacillus sanfranciscensis <220> <221> Misc_feature <222> (28)..(28) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (624)..(624) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (634)..(634) g ou t/u ou <223> "n" é a ou c 34 ΡΕ2046944 <220> <221> Misc_feature <222> (651)..(651) <223> "η" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (653)..(653) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (674)..(674) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (677)..(677) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (697)..(697) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (699)..(699) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (717)..(717) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <400> 3 agtccccatt gattettagt gettgcanta agatgatttt ggatcçgact gagtggcgaa 60 ctggtgagta acacgtgggt aacctgccca gaagaagggg ataacacctg gaaacagatg 120 ctaataccgt ataacaacaa gaaccacatg gttcttgttt gaaagctggc ctttgtgcta 180 gtgcttctgg atggacccgc ggcgtattag ctagttggtg agataatagc tcaccaaggc 240 aatgatacgt agcagacetg agagggtaat ctgceacaat gggactgaga cacggcccat 300 actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa 360 cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc gtaaaactct gttgttagag aagaacagcc 420 gtgagagcaa ctgctcacgg tatgacggta tctaaccaga aagtcacggc taactacgtg 480 ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa acgttgtccg gatttattgg gcgtaaaggg 540 agcgcaggcg gtttattaag tctgatgtga aagccttcgg cttaacccga aaagtgcatc 600 ggaaactgat aaacttgagt gcanaaaagg atantggaac tteatgtgta ncngtgaaaa 660- tgcgtaaata tttnaangaa caccagtggc gaaggcngnt atctggtctg taactgnaa 719 <210> 4 35 ΡΕ2046944
<211> 743 <212> DNA <213> Lactobacillus sanfranciscensis <220> <221> Misc_feature <222> (6)..(6) <223> "η" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (32) . . (32) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (552)..(552) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (565)..(565) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (595)..(595) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (598)..(598) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (645)..(645) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (646)..(646) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (647)..(647) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (675)..(675) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (688)..(688) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u 36 ΡΕ2046944 <22 0> <221> Misc_feature <222> (705)..(705) <223> "η" β a ou c ou g ou t/u <22 0> <221> Misc_feature <222> (712)..(712) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (727)..(727) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (734)..(734) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (735)..(735) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (736)..(736) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <220> <221> Misc_feature <222> (738)..(738) <223> "n" é a ou c ou g ou t/u <400> 4 gacgantccc cattgattct tagtgcttgc antaagatga ttttggatcc gactgagtgg 60 cgaactggtg agtaacacgt gggtaacctg cccagaagaa ggggataaca cctggaaaca 120 gatgctaata ccgtataaca acaagaacca catggttctt gtttgaaagc tggeetttgt 180 gctagtgctt ctggatggac ccgcggcgta tiagctagtt ggtgagataa tagctcacca 240 aggcaatgat acgtagcaga cctgagaggg taatctgcca caatgggact gagacacggc 300 ccatactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga 360 gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt agagaagaac 420 agccgtgaga gcaactgctc acggtatgac ggtatctaac cagaaagtca cggctaacta 480 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaaacgttg rccggattta ttgggcgtaa 540 aagggagcgc angcggttta ttaantctga tgtgaaagcc ttcgcttaac ecganaantg 600 catcgaaact gataaacttg aatgcaaaaa gggggggggg ggggnfmtgt gtaccgttaa 660 attcctaaat atttnaaagg aacaccantg gcgaaggcgg ctatntggtc tntaaaaaaa 720 aaacacnccc cctnnntncg ggg 743 37 ΡΕ2046944
<210> 5 <211> 749 <212> DNA <213> Lactobacillus sanfranciscensis <400> 5 tttcttccca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg 60 gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga gtaactgttc aggtattgac 120 ggtatttaac cagaaageca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 180 gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 240 gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa 300 gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaaeaccagt 360 ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac 420 aggattagat accctggtag tccataccgt aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt 480 ccgcccttca jfgctgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta eggccgcaag 540 gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 600 gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatactat gcaaatctaa gagattagac 660 gttccctttc ggggacatgg atacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 720 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgca 743
Lisboa, 10 de dezembro de 2012

Claims (13)

  1. ΡΕ2046944 1 REIVINDICAÇÕES 1. Mistura de estirpes de bactérias lácticas para a fermentação de farinhas sem glúten, compreendendo ou consistindo em pelo menos duas, de preferência pelo menos três, estirpes de bactérias lácticas seleccionadas do grupo consistindo em Lactobacillus sanfranciscensis DSM18426, Lactobacillus rossiae DSM 18429, Lactobacillus plantarum DSM 18430, L. sanfranciscensis DSM 18427, Pediococcus pentosaceus DSM 18432, L. rossiae DSM 18428 e Lactobacillus brevis DSM 18431.
  2. 2. Mistura de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ou consistindo em Lactobacillus sanfranciscensis DSM18426, Lactobacillus rossiae DSM 18429 e Lactobacillus plantarum DSM 18430.
  3. 3. Mistura de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ou consistindo em L. sanfranciscensis DSM18426, L. sanfranciscensis DSM18427 e L. plantarum DSM 18430.
  4. 4. Mistura de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ou consistindo em Pediococcus pentosaceus DSM 18432, L. rossiae DSM 18428 e L. plantarum DSM 18430.
  5. 5. Mistura de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ou consistindo em Lactobacillus brevis DSM 18431, L. rossiae DSM 18429 e L. plantarum DSM 18430. 2 ΡΕ2046944
  6. 6. Mistura de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ou consistindo em L. sanfranciscensis DSM18426, L. sanfranciscensis DSM18427 e L. rossiae DSM 18429 . uma das em igual cfu/g no
  7. 7. Mistura de acordo com qualquer reivindicações 1 a 6, em que as estirpes estão proporção numa densidade celular de cerca de 10 inicio da fermentação.
  8. 8. Mistura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 em que as farinhas sem glúten são escolhidas do grupo consistindo em farinhas de milho, arroz, trigo sarraceno, amido de tapioca, girassol, linho, tef, sorgo, quinoa, batata, mandioca, amaranto, milho painço.
  9. 9. Processo para a preparação de fermento de partida para produtos de panificação sem glúten compreendendo os seguintes passos: a) propagação da cultura da mistura de estirpes de bactérias lácticas como definida de acordo com cada uma das reivindicações 1 a 8; b) mistura de 50-64% de uma composição de farinha compreendendo ou consistindo em amido de milho 10-30%, de preferência 12%, amido de tapioca 2-10%, de preferência 4%, 3 PE2046944 farinha de arroz 20-60%, de preferência 32%, e farinha de trigo sarraceno 1-10%, de preferência 6%, em que as referidas percentagens são expressas como % do peso total da composição de farinha, e de 35-50% de água contendo a cultura de estirpes bacterianas do passo a) tendo uma densidade celular de aproximadamente 108 cfu/g em proporções iguais entre espécies e estirpes, em que as referidas percentagens da composição de farinha e de água contendo a cultura de estirpes bacterianas são percentagens do peso total da massa; c) fermentação durante 8-24 horas a 20-30°C.
  10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9 compreendendo ainda um passo d) de secagem ou congelação do fermento de partida obtido no passo c).
  11. 11. Processo para a preparação de produtos de panificação sem glúten compreendendo os seguintes passos: a) amassadura de 40-60%, de preferência 44%, de uma composição de farinhas compreendendo ou consistindo em amido de milho 10-30%, de preferência 12%, amido de tapioca 2-10%, de preferência 4%, farinha de arroz 20-60%, de preferência 32% e farinha de trigo sarraceno 1-10%, de preferência 6%, em que as referidas percentagens são expressas como % do peso total da composição de farinha, 10-30% de água, de preferência 26%, contendo levedura de cerveja 1-3%, de preferência 2% e sal 0,1-1,2% e inoculo do 4 ΡΕ2046944 fermento de partida, obtido usando o processo como definido de acordo com cada uma das reivindicações 9-10 e compreendendo a mistura de estirpes de bactérias lácticas como definido de acordo com cada uma das reivindicações 1 a 8, numa quantidade entre 5 e 30%, de preferência 30% ou seca, como ingrediente sem actividade fermentadora, ou congelada com actividade fermentadora, as referidas percentagens sendo percentagens de peso tendo como referência o peso total da massa; b) fermentação durante aproximadamente 1-3 horas a 30°C; c) cozimento durante 50 minutos a 220°C.
  12. 12. Composição da levedura de partida obtida usando o processo definido de acordo com a reivindicação 9 ou 10 e compreendendo a mistura de estirpes de bactérias lácticas como definido de acordo com cada uma das reivindicações 1 a 8.
  13. 13. Produtos de panificação obtidos usando o processo definido de acordo com a reivindicação 11 e compreendendo a mistura de estirpes de bactérias lácticas como definida de acordo com cada uma das reivindicações 1 a 8. Lisboa, 10 de dezembro de 2012
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