ITMI20080440A1 - Batteri lattici e loro uso sotto forma di lievito naturale per la produzione di pane e prodotti da forno con elevate proprieta nutrizionali e sensoriali; pane e prodotti da forno a basso indice glicemico ed alto contenuto di fibra alimentare - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

“BATTERI LATTICI E LORO USO SOTTO FORMA DI LIEVITO NATURALE PER LA PRODUZIONE DI PANE E PRODOTTI DA FORNO CON ELEVATE PROPRIETÀ NUTRIZIONALI E SENSORIALI; PANE E PRODOTTI DA FORNO A BASSO INDICE GLICEMICO ED ALTO CONTENUTO DI FIBRA ALIMENTARE” La presente invenzione concerne ceppi di batteri lattici ed il loro uso per la preparazione di un lievito naturale per la produzione industriale di pane dotato di proprietà nutrizionali e sensoriali migliorate. Inoltre, la presente invenzione concerne il lievito naturale ed il pane ottenuto con detti batteri.

Con il termine “lievito naturale” si indica comunemente una miscela comprendente una farina o una miscela di farine (a solo titolo di esempio, una miscela comprendente farina di grano, segale e/o orzo), acqua ed, opzionalmente, altri ingredienti (ad esempio, sale) dosati in quantità opportune. In detto lievito naturale sono di norma presenti batteri lattici e lieviti.

Nel contesto della presente invenzione, “lievito naturale” descrive la miscela prima, durante o dopo la fermentazione effettuata da batteri lattici e dai lieviti che sono naturalmente presenti nella miscela costituente detto “lievito naturale”. In comparazione con il pane prodotto mediante uso esclusivo di lievito di birra, l’impiego di “lievito naturale” sembra poter potenzialmente consentire un miglioramento delle caratteristiche sensoriali e nutrizionali del pane prodotto, tra cui, ad esempio, un aumento della concentrazione di aminoacidi liberi e della biodisponibilità di minerali e una possibile riduzione del valore di indice glicemico.

L’uso del “lievito naturale” come starter per la fermentazione dei prodotti lievitati da forno (ad esempio pane, prodotti dolciari, cracker) artigianali è noto. In particolare, è noto l’impiego di “lievito naturale” per la produzione artigianale di pane.

E’ anche noto che la composizione microbica del “lievito naturale” è influenzata da fattori endogeni (ad esempio, dalla composizione chimica ed enzimatica della/e farina/e) ed esogeni (ad esempio temperatura, potenziale ossidoriduttivo, rendimento dell’impasto e tempo di fermentazione). Nel “lievito naturale” fermentato predominano i batteri lattici ed i lieviti possono essere assenti.

Al di là della sua immagine naturale e priva di additivi, l’uso di “lievito naturale” sembra promettere una serie di vantaggi per la produzione di prodotti lievitati da forno, in particolare di pane. In comparazione con altri agenti lievitanti (ad esempio, lievito di birra o agenti chimici), l’uso di “lievito naturale” potrebbe determinare un miglioramento delle proprietà reologiche, sensoriali, nutrizionali e di conservazione dei prodotti lievitati da forno.

Purtroppo l’uso di “lieviti naturali” noti presenta un piuttosto sfavorevole o impossibile impiego a livello industriale per la produzione di prodotti lievitati da forno, in particolare il pane, dove è invece diffuso l’impiego di lievito di birra. In particolare, sono da menzionare le seguenti limitazioni: (i) difficoltà di propagazione e/o gestione del “lievito naturale”; (ii) tempi di fermentazione industrialmente inaccettabili (troppo lunghi); (iii) difficoltà di standardizzazione del processo fermentativo tradizionale; (iv) scarsa evidenza dei vantaggi nutrizionali e sensoriali in comparazione con la fermentazione mediante lievito di birra.

Nel contesto della presente invenzione, per propagazione si intende un metodo per riprodurre il “lievito naturale” per uso futuro. Nel contesto della presente invenzione, per gestione si intende l’uso del “lievito naturale” per produrre prodotti lievitati da forno, preferibilmente il pane.

Sulla base di quanto noto al tecnico del settore, risulta pertanto viva la necessità di poter disporre di un “lievito naturale” per la produzione a livello industriale di prodotti lievitati da forno, in particolare il pane, che presenti almeno i vantaggi sopra menzionati rispetto agli analoghi prodotti ottenuti tramite fermentazione con agenti lievitanti noti nell’arte, come lievito di birra.

La Richiedente della presente invenzione ha ora inaspettatamente trovato che un opportuno “lievito naturale” comprendente una miscela di specifici batteri lattici consente di realizzare un procedimento applicabile industrialmente per produrre, prodotti lievitati da forno aventi le desiderate migliorate caratteristiche nutrizionali e sensoriali sopra menzionate. In particolare, detto “lievito naturale” consente di ottenere un pane avente migliorate caratteristiche nutrizionali e sensoriali; più preferibilmente un pane a basso livello indice glicemico (IG). Formano oggetto della presente invenzione i suddetti ceppi batterici, in cui detti ceppi appartengono alle specie Lactobacillus sanfranciscensis e Lactobacillus plantarum. Detti ceppi sono stati isolati e depositati da Gruppo Novelli Srl, Via del Commercio, 22 - 05100 Temi (ITALIA) presso il DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffen Str. 7B, D-38124 Braunschweig, Germania ). I dati riguardanti il deposito sono riassunti nella seguente Tabella 1 :

Tabella 1 - Dati dei ceppi secondo l’invenzione depositati presso il DSMZ

Detti ceppi sono stati isolati ed identificati seguendo il metodo descritto in Esempio 1.

I ceppi dei batteri secondo l’invenzione possono essere coltivati su un mezzo MRS, preferibilmente modificato con aggiunta di 5% v/v estratto di lievito fresco e di maltosio così da raggiungere una concentrazione in maltosio da 28mM. Ancor più preferibilmente il pH del mezzo è 5,6. Ancor più preferibilmente i ceppi sono lasciati in detto mezzo sotto condizioni microaerofiliche e a 30°C, preferibilmente per un periodo cha varia da 24 ore a 7 giorni.

I ceppi di batteri della presente invenzione possono essere conservati scegliendo opportunatamente tra le metodiche note nell’ arte per conservare ceppi di Lactobacillus. Un metodo preferito è mantenere detti ceppi in forma congelata con 20% v/v glicerolo.

Per valutare la vitalità e l’idoneità dei ceppi secondo la presente invenzione, si può controllare se riescono a crescere nel mezzo come sopramenzionato dopo 24 ore. Una crescita dei ceppi dopo 24 ore significa che i ceppi sono vitali ed idonei all’uso come sotto menzionato.

Forma un altro oggetto dell’invenzione un “lievito naturale” comprendente almeno uno dei batteri appartenenti ai ceppi secondo l’invenzione. Preferibilmente l’ almeno un ceppo dei batteri lattici, di cui sopra, è presente in detto “lievito naturale” ad una densità cellulare che varia da lxlO<7>a lxlO<10>ufc (unità formanti colonia)/g di “lievito naturale”; più preferibilmente, da lxlO<8>a 5xl0<9>ufc/g; ancor più preferibilmente da 5xl0<8>a 2x10<9>ufc/g.

Preferibilmente detto lievito naturale comprende una miscela dei ceppi dell’invenzione. In detta miscela i ceppi batterici sono presenti in un rapporto ponderale da 1 :20 a 20:1; preferibilmente da 1:10 a 10:1. In una realizzazione preferita, detti ceppi sono presenti in un rapporto di circa 1:1.

In una realizzazione particolarmente preferita dell’invenzione, il “lievito naturale” della presente invenzione comprende inoltre i seguenti ingredienti (i valori % p/p sono rispetto al peso totale del “lievito naturale”):

- farina tipo manitoba in una quantità che varia da 11% a 15% p/p, preferibilmente da 13% a 14% p/p;

- farina tipo 0 rinforzata in una quantità che varia da 28% a 37% p/p, preferibilmente da 30% a 35% p/p ed ancor più preferibilmente da 31% a 32% p/p;

- acqua in una quantità che varia da 18% a 28% p/p, preferibilmente da 20% a 25% p/p ed ancor più preferibilmente da 22% a 23% p/p.

Per farina tipo 0 rinforzata, si intende una farina di grano tenero tipo 0 per panificazione avente le seguenti caratteristiche reologiche:

• Stabilità (S) > 12 minuti (intervallo di tempo durante il quale l'impasto si mantiene alla massima consistenza) misurata con il Farinografo di Brabender

• Assorbimento (A) > 54 % (percentuale dell' acqua nell' impasto), misurata con il Farinografo di Brabender

• Falling Number o Indice di Hagberg > 300 (misurazione dell'attività alfa amilasica della farina), misurata con l’Amilografo di Brabender

• W > 250 (indice della forza della farina) misurata con l’Alveografo di Chopin

• P/L valori compresi tra 0,4 e 0,55 (rapporto tra tenacità ed estensibilità della farina) misurato con l’Alveografo di Chopin l “lievito naturale” secondo l’invenzione viene preparato secondo qualsiasi metodo noto nell’arte. Preferibilmente, i ceppi e gli ingredienti sopra menzionati vengono aggiunti all’acqua e miscelati o agitati nell’acqua. L’ordine di aggiunta e miscelazione/agitazione può variare.

La propagazione del “lievito naturale” avviene preferibilmente secondo un processo articolato attraverso le seguenti fasi (i valori % p/p sono rispetto al peso totale del “lievito naturale”):

i) impastare una miscela di ingredienti comprendente:

- farina tipo manitoba in una quantità che varia da 11% a 15% p/p, preferibilmente da 13% a 14% p/p;

- farina tipo 0 rinforzata in una quantità che varia da 28% a 37% p/p, preferibilmente da 30% a 35% p/p ed ancor più preferibilmente da 31% a 32% p/p;

- acqua in una quantità che varia da 18% a 28% p/p, preferibilmente da 20% a 25% p/p ed ancor più preferibilmente da 22% a 23% p/p ed

- una quantità di “lievito naturale” secondo l’invenzione preparato in precedenza che varia da 28% a 35% p/p, preferibilmente da 31% a 34% p/p ed ancor più preferibilmente da 32% a 33% p/p;

ii) incubare la miscela impastata in fase i) ad una temperatura che varia da 15 a 20°C, preferibilmente da 15,5 a 16,5°C per un periodo che varia da 18 a 36 ore, preferibilmente da 22 a 26 ore ed ancor più preferibilmente per un periodo che varia da 23,5 a 24,5 ore.

Il “lievito naturale” usato nella fase i) del metodo di propagazione sopra descritto è un “lievito naturale” preparato dal giorno precedente, ancor più preferibilmente propagato il giorno precedente secondo il metodo di propagazione dell’invenzione.

Un vantaggio del metodo di propagazione secondo l’invenzione sopra descritto è che consente al lievito naturale ottenuto di mantenere i batteri lattici impiegati vitali e funzionanti per un periodo di almeno 10 anni, più preferibilmente di almeno 5 anni, ancor più preferibilmente di almeno 1 anno ed ancor più preferibilmente di 6 mesi.

Nel contesto della presente invenzione, il tecnico del settore può scegliere attrezzature per impastare ed incubare il lievito note nell’arte nei vari procedimenti secondo Γ invenzione. Analogamente, il tecnico del settore può scegliere tra tutti i metodi per impastare ed incubare il lievito noti nell 'arte per impastare e incubare il lievito secondo l’invenzione.

Un’altro oggetto della presente invenzione è un procedimento per la produzione industriale di pane avente caratteristiche migliorate comprendente le seguenti fasi (i valori % p/p sono rispetto al peso totale del “lievito naturale”):

a) impastare una miscela di “lievito naturale” secondo l 'invenzione come sopra descritto, preferibilmente comprendente anche del “lievito naturale" propagato dal giorno precedente;

b) incubare la miscela impastata in fase a) per un periodo che varia da 13 a 18 ore, preferibilmente da 14 a 17 ore, ancora più preferibilmente da 14,5 a 15,5 ore ad una temperatura compresa da 8 a 22°C, preferibilmente da 12 a 20°C, ancora più preferibilmente a temperatura ambiente, (questa prima fase di incubazione è definita come “fermentazione lunga”);

c) impastare almeno un tipo di farina in una quantità che varia da 45% a 65% p/p e con acqua in una quantità che varia da 25% a 45% p/p con del “lievito naturale” ottenuto dalla fermentazione lunga della fase (b) nella rimanente quantità p/p, opzionalmente con altri ingredienti noti nell’arte per la produzione del pane,

d) incubare per un periodo che varia da 1 ,5 ore a 3 ore, preferibilmente da 2 ore a 2,5 ore, ancora più preferibilmente per un periodo di circa 2 ore e 20 min. ad un temperatura che varia da 24 a 31 °C, preferibilmente da 26 a 30°C, ancora più preferibilmente intorno a 28°C (questa seconda fase di incubazione è definita come “fermentazione breve”);

e) cuocere l’impasto ottenuto dalla fase d) per un periodo che varia da 35 a 65 minuti, preferibilmente da 45 a 55 minuti, ancor più preferibilmente da 48 a 52 minuti ad una temperatura che varia da 190 a 250°C, preferibilmente da 210 a 230°C, ancor più preferibilmente da 218 a 222°C.

Il procedimento per produrre pane secondo l’invenzione comprende le fasi a) e b) del procedimento per propagare il “lievito naturale” secondo l’invenzione sopra descritto. Pertanto un vantaggio di usare i ceppi dell’invenzione nel “lievito naturale” è che si possono combinare i due procedimenti di propagazione e gestione (produzione del pane) in un solo procedimento ove l’impasto prodotto in fase (a)/(i) viene diviso in due aliquote e lasciato a fermentare sotto condizioni diverse, ogni aliquota avente una sua funzione specifica: uso nella gestione (produzione di pane) o propagazione del “lievito naturale” secondo l’invenzione.

Il pane ottenibile dal procedimento industriale secondo l’invenzione presenta tutti i possibili vantaggi dovuti all’uso di un “lievito naturale” senza manifestare i disagi sopra menzionati (come i lunghi tempi di fermentazione o una scarsa concentrazione di amino acidi liberi e così via). Detti vantaggi sono dati in particolare dal periodo di fermentazione più breve permesso al lievito naturale.

E’ quindi un ulteriore oggetto della presente invenzione un procedimento industriale per preparare prodotti lievitati da forno, preferibilmente pane, tramite l’uso del “lievito naturale” secondo l’invenzione.

In una realizzazione preferita dell’invenzione, la farina di grano, è Γ almeno una farina che viene usata in fase (c). Preferibilmente detta farina è presente in una quantità che varia da 50% a 65% p/p; più preferibilmente da 57% a 59% p/p. In detta realizzazione l’acqua è preferibilmente presente in una quantità che varia da 32% a 35% p/p; più preferibilmente da 33% a 34% p/p e il “lievito naturale” ottenuto dalla fase b) è preferibilmente presente in una quantità che varia da 6% a 12% p/p, preferibilmente da 5% a 10% p/p, ancor più preferibilmente da 7,5% a 8,5% p/p. Eventualmente, a secondo del risultato che si vuole ottenere, è anche possibile aggiungere in fase (c) anche una minima quantità di lievito di birra (inferiore a 0,5% p/p, preferibilmente inferiore a 0,2% p/p).

I valori % p/p sopra menzionati sono rispetto alla quantità totale dell’impasto preparato in fase (c).

Il pane ottenibile tramite il procedimento industriale secondo l’invenzione è pertanto un altro oggetto dell’invenzione perché, grazie all’uso dello specifico “lievito naturale” secondo l’invenzione nel procedimento industriale di cui sopra, il pane ottenibile con detto procedimento mostra almeno i seguenti vantaggi rispetto al procedimento tradizionale che impiega lievito di birra:

i) una concentrazione più alta di almeno due volte, preferibilmente tre volte, di aminoacidi liberi, prontamente assimilabili, nel pane dell’ invenzione rispetto al pane prodotto con lievito di birra; ii) una attività fitasica più alta di almeno due volte, preferibilmente circa tre volte, rispetto al pane prodotto con lievito di birra, incrementando così la biodisponibilità di minerali del pane;

iii) un maggior volume specifico (misurato in unità cm<3>/g secondo il metodo ufficiale AACC 10-10) rispetto al pane prodotto con lievito di birra;

iv) una più alta alveolatura della mollica (misurata in % secondo Crowley et al., 2000. Influence of additives and mixing time on crumb grain characteristics of wheat bread. Cereal Chem 77: 370-375) rispetto alla percentuale ottenuta del pane prodotto con lievito di birra e

v) migliori proprietà sensoriali, conferendo più sapore ed aroma tipici del pane tradizionale casalingo rispetto al pane prodotto con lievito di birra.

Una differenza vantaggiosa nel procedimento che consente i suddetti vantaggi nel pane prodotto è che nel procedimento dell’invenzione si evidenzia un processo di acidificazione lattica al termine della fase di “fermentazione breve”. Detta acidificazione è caratterizzata da valori medi di pH pari a 4,71.

In un’altra realizzazione preferita del procedimento per produrre pane secondo l’invenzione, nella fase (c), la farina consiste di una miscela di farine, cioè:

farina tipo 0 (in una quantità che varia da 43,5% a 45,5% p/p della quantità totale di materiale da impastare nella fase (c); più preferibilmente intorno a 44,5% p/p),

farina di segale integrale (in una quantità che varia da 3% a 7% p/p della quantità totale di materiale da impastare nella fase (c); preferibilmente intorno a 5,5% p/p),

farina di malto d'orzo (in una quantità che è inferiore a 0,5% p/p della quantità totale di materiale da impastare nella fase (c), preferibilmente intorno a 0,25% p/p).

I valori % p/p sopra e sotto menzionati sono rispetto alla quantità totale dell’impasto preparato in fase (c).

In detta realizzazione è preferibile che il “lievito naturale” ottenuto dalla fase (b) sia presente in una quantità che varia da 6% a 12% p/p, più preferibilmente da 8% a 10% p/p, ancor più preferibilmente da 10% a 11% p/p e che l’acqua sia presente in una quantità che varia da 32% a 39%% p/p, preferibilmente da 36% a 37% p/p. Ancor più preferibilmente, sono anche presenti nella miscela della fase (c) sale da tavola in quantità inferiore a 0,2% p/p, acido ascorbico in quantità inferiore a 0,03% p/p, enzimi alfa-amilasi in quantità inferiore a 0,03% p/p, fibra di avena in quantità inferiore a 2,5% p/p e lievito di birra in quantità minime, inferiore a 1% p/p.

II pane ottenibile da detta realizzazione del procedimento è particolarmente vantaggioso perché mostra un valore di IG pari a 41,1% ( challenge in vivo) che tuttavia conserva le proprietà reologiche e sensoriali tipiche del pane tradizionale come sopra descritte.

Formano oggetto dell’invenzione anche gli altri prodotti lievitati da forno, ottenibili tramite il lievito ed il procedimento dell’invenzione, aventi almeno uno dei sopra menzionati vantaggi. Uno di detti prodotti è un pane avente un valore IG inferiore a 53%, preferibilmente inferiore a 50% ed ancor più preferibilmente inferiore a 45%. In una realizzazione preferita, il pane comprende farina di grano, ancor più preferibilmente la farina di grano è in percentuale massiccia, come almeno 43% p/p, preferibilmente 40% p/p ed ancor più preferibilmente 35% p/p di un impasto per fare il pane.

II metodo preferito per valutare l’indice glicemico del pane è preferibilmente l’idrolisi in vitro dell’amido seguendo il protocollo proposto da Liljeberg et al. (Liljeberg et al. 1996. Resistant starch formation in bread as influenced by choice of ingrediente or baking conditions. Food Chem 56: 389-394), ma tutti i metodi noti nell’arte per valutare l’indice glicemico del pane sono contemplati nell’ invenzione.

I pani e prodotti da forno secondo l’invenzione possono essere preferibilmente preparati come prodotti surgelati o parzialmente cotti o precotti.

I pani e prodotti da forno secondo l’invenzione possono essere preferibilmente confezionati in atmosfera protettiva e/o trattati con alcool etilico secondo metodiche note nell ’ arte.

Un altro oggetto dell’invenzione è l’impasto preparato durante la fase c) o d) del procedimento per produrre pane. Detto impasto è preferibilmente confezionato come un prodotto refrigerato o surgelato da sottoporre successivamente a cottura.

La persona esperta dell’arte può scegliere, tra tutti i metodi noti nell’arte, i metodi più opportuni per refrigerare, surgelare e confezionare gli impasti e i pani e i prodotti da forno secondo l’invenzione.

Inoltre, forma oggetto della presente invenzione l’uso di almeno un batterio scelto dal gruppo dei ceppi secondo l’invenzione nella produzione di un “lievito naturale” secondo l’invenzione.

Inoltre forma oggetto dell’invenzione l’uso di almeno un batterio scelto dal gruppo di ceppi secondo l’invenzione e/o l’uso di un “lievito naturale” secondo l’invenzione nella produzione di prodotti lievitati da forno, preferibilmente nella produzione di pane, in particolare nella produzione su scala industriale del pane. Detto pane è preferibilmente caratterizzato da valori di IG sensibilmente bassi. Le realizzazioni dei procedimenti sopra menzionati sono contemplati come realizzazioni di detti usi.

La presente invenzione viene nel seguito descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo alcune sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle Tavole allegate.

La Tavola 1 mostra la cinetica di acidificazione relativa al “lievito naturale” dell’invenzione, preparato e propagato per 15 ore a temperatura ambiente (“fermentazione lunga”) secondo l’Esempio 2. I dati sono stati elaborati mediante l’equazione di Gompertz (software Statistica per Windows).

La Tavola 2 mostra le scansioni originali dei pani ottenuti (colonna a destra) e le relative immagini digitalizzate (colonna a sinistra, pixel bianchi/neri). A-B: pane preparato secondo Esempio 2.3) (con lievito di birra); C-D: pane preparato secondo Esempio 2.2) (con uno dei “lieviti naturali” secondo l’invenzione) e E-F: pane preparato secondo Esempio 3.1) (con uno dei “lieviti naturali” secondo l’invenzione).

La Tavola 3 mostra le curve di idrolisi in vitro della frazione di amido potenzialmente disponibile per il pane preparato secondo l’Esempio 2.3) (con lievito di birra), il pane preparato secondo 1’ Esempio 2.2) (con “lievito naturale”) e il pane preparato secondo l’Esempio 3.1) (con “lievito naturale”).

La Tavola 4 mostra la risposta glicemica media di 20 pazienti monitorata per 2 ore in seguito all'assunzione di 50 g di glucosio (GL) e 106 g di pane preparato secondo Esempio 3.1, corrispondenti a 50 g di carboidrati (PT).

Esempio 1: Isolamento ed identificazione dei batteri lattici secondo l’invenzione

Sono stati isolati e identificati i due ceppi di batteri lattici Lactobacillus sanfranciscensis DSM 21188 e Lactobacillus plantarum DSM 21066, come descritti in precedenza.

Si sono miscelati 33,4% p/p di acqua con una selezione di farine opportunatamente selezionate da un lungo procedimento di selezione. Le farine selezionate erano farina tipo manitoba, presente in una quantità di 20% p/p, e farina tipo 0 rinforzata, presente in una quantità di 46,6% p/p.

I valori % p/p sono rispetto alla quantità totale della miscela preparata.

Si è lasciato fermentare la miscela ottenuta per 24 ore a 16°C.

L’isolamento dei batteri lattici nel “lievito naturale” è stato eseguito mediante diluizioni in serie decimale e conteggio in piastra su terreni colturali mMRS (MRS contenente maltosio 50g/l, acqua di lievito sterile 50 ml/1, pH 5,6) e SDB, dopo incubazione a 30°C per 48 h. I terreni colturali hanno previsto l’aggiunta di actidione (10 μg/ml) per inibire la crescita dei lieviti. I batteri lattici sono stati separati e recuperati dalla coltura e successivamente sono stati propagati nei rispettivi terreni colturali liquidi di cui sopra.

II DNA microbico è stato isolato e purificato in accordo con il metodo De Los Reyes-Gavilan et al. (De Los Reyes-Gavilàn et al., 1992. A Lactobacillus helveticus- specific DNA probe detects restriction fragment length polymorphisms in this species, Appi Environ Microbiol 58: 3429-3432). Tre primer di sequenza arbitraria (Invitrogen Life Technologies, Milano, Italia) sono state usate. Le sequenze usate erano le seguenti:

P4 - SEQ ID N0.1

P7 - SEQ ID NO. 2; ed

MI 3 - SEQ ID NO. 3.

Le sequenze sopra citate sono riportate nell’allegato secondo lo standard intemazionale WIPO ST.25 e sviluppato con il programma Patent-In 3.3.

Le sequenze sono state utilizzate secondo Rossetti e Giraffa. 2005. Rapid Identification of dairy lactic acid bacteria by M13-generated, RAPD-PCR fingerprint database ad esempio, J Microbiol Meth 63: 135-144 per le analisi RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction). La miscela di reazione ha previsto la seguente formulazione: 200 μΜ di ciascun dNTP (2’deossinucleoside 5’trifosfato), 1-2 μΜ primer, 1.5-3 μΜ MgCl2, 1.25 U Taq DNA polimerasi (Invitrogen), 2.5 μΐ PCR buffer, 25 ng DNA e acqua bidistillata sterile fino ad un volume di 25 μΐ. Per l’amplificazione con i primer P4 , P7 ed MI 3, (Termociclatore Parkin Elmer 9700), sono stati impiegati i programmi di PCR descritti da Rossi et al. (Rossi et al. 1998. Identification and clustering of dairy propionibacteria by RAPD-PCR and CGE-REA methods. J Appi Microbiol 85: 956-964) e Giraffa et al. (Giraffa et al., 2000. An evaluation of selex-based DNA purification protocols for thè typing of lactic acid bacteria. J Microbiol Meth 42: 175-184). I prodotti di amplificazione sono stati separati mediante elettroforesi (2h a 130 V) su gel d’agarosio (1,5% p/vol) (Invitrogen) in tampone TAE (Tris-acetato 0,04 M-EDTA 0,001 M). Il DNA è stato visualizzato ai raggi UV dopo colorazione con etidio bromuro (0,5 μg/ml) (Sigma Chemical Co. Milano, Italia). Il peso molecolare dei frammenti di DNA amplificati è stato stimato per confronto con lo standard (100pb-12Kb) I Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Due paia di primer (Invitrogen), LacbF/LacbR e LpCoF/LpCoR, sono stati utilizzati per amplificare la regione 16S rRNA dei lattobacilli, come descritto da De Angelis et al. (De Angelis et al.

2006. Selection of potential probiotic lactobacilli from pig faeces to be used as additives in pelleted feeling. Res Microbiol 157: 792-801). L’identificazione tassonomica dei ceppi è stata effettuata confrontando le sequenze parziali delle regioni 16S rRNA di ciascun isolato con quelle di batteri lattici omologhi riportate in specifici database Basic BLAST. Ceppi mostranti omologia di almeno il 97% sono stati considerati appartenenti alla stessa specie.

Esempio 2: Uso vantaggioso del “lievito naturale” secondo l’invenzione 2.1) Dimostrazione della validità funzionale del lievito naturale ottenuto dal procedimento di propagazione e gestione dell’invenzione.

II “lievito naturale” dell’invenzione è utilizzato come starter per la produzione industriale di pane. Per garantire la costanza delle performance dello starter e la standardizzazione del prodotto, il “lievito naturale” è stato propagato e gestito quotidianamente secondo il seguente protocollo:

Al giorno 0:

a) si è impastato

- farina tipo manitoba (13,5% p/p);

- farina tipo 0 rinforzata 31 ,4% p/p;

- acqua 22,5% p/p ed

- una quantità di “lievito naturale” pari a 32,6% p/p, contenente una densità di batteri lattici selezionati da quelli secondo l’invenzione pari a ca. IO<7>ufc/g.

b) suddivisione dell’impasto in due aliquote ed incubazione di una aliquota a temperatura ambiente, per 15 ore, e dell’altra a 16°C per 24 ore. L'aliquota incubata per 15 ore è destinata alla produzione dell’impasto per la produzione del pane del giorno 1; l’altra è utilizzata per ripristinare il “lievito naturale” il giorno seguente.

Al giorno 1-30:

a) “rinfresco” quotidiano del “lievito naturale”, attraverso l’impasto di farina tipo manitoba (13,5% p/p); farina tipo 0 rinforzata 31,4% p/p; acqua 22,5% p/p e una quantità di “lievito naturale” proveniente dalla produzione del giorno precedente pari a 32,6% p/p, contenente una densità di batteri lattici pari a ca. IO<7>ufc/g.

b) suddivisione dell’impasto in due aliquote ed incubazione di una aliquota a temperatura ambiente, per 15 ore, e dell’altra a 16°C per 24 ore. L'aliquota incubata per 15 ore è destinata alla produzione dell’impasto per la produzione del pane; l’altra è utilizzata per ripristinare il “lievito naturale” il giorno seguente.

2.2) Preparazione industriale di pane usando il lievito naturale secondo l’invenzione preparato nel procedimento (2.1)

La conseguente preparazione del pane a lievitazione naturale ha avuto luogo secondo il seguente processo:

a) impastamento di farina tipo manitoba (13,5% p/p); farina tipo 0 rinforzata 31,4% p/P; acqua 22,5% p/p e una quantità di “lievito naturale” proveniente dalla produzione del giorno precedente pari a 32,6 % p/p (vedasi Esempio 2.1); b) incubazione per 15 ore a temperatura ambiente, (“fermentazione lunga”); c) impastamento di farina nazionale a 58% p/p, acqua 33,83% p/p, lievito di birra 0,17% p/p e “lievito naturale” (proveniente dalla “fermentazione lunga”) a 8% p/p;

d) incubazione ad una temperatura di 28°C per ca. 2 ore e 20 min. (“fermentazione breve”);

e) cottura dell’impasto per ca. 50 min. a ca. 220°C.

2.3) Preparazione di un pane usando il lievito di birra (controllo)

Il pane fermentato con “lievito naturale” è stato posto a confronto con pane preparato esclusivamente con lievito di birra, secondo quella che può essere definita l’opzione tecnologica più diffusa a livello industriale. La produzione di pane con lievito di birra è avvenuta secondo il seguente protocollo:

a) impastamento di farina 0 rinforzata 64% p/p, farina manitoba 13,5% p/p, acqua 22,33% p/p, lievito di birra 0,17%;

b) fermentazione a 28°C per 2 ore e 20 min;

c) cottura dell’impasto per ca. 50 min. a ca. 220°C.

2.4) Caratterizzazione del processo di acidificazione

Il pH degli impasti è stato determinato mediante pH-metro per matrici solide del tipo pH-meter 507 (Crison, Italy). La determinazione dell’acidità di titolazione è stata effettuata mediante diluizione dell’impasto (10 g 90 mi di acqua distillata), omogeneizzazione mediante Sterilmixer LAB (PBI International, Milan, Italy) e titolazione con NaOH 0,1 M. Tutte le rilevazioni sono state effettuate in tre repliche, e ripetute per 30 rinfreschi consecutivi (si veda Esempio 2.1)).

La cinetica di acidificazione del “lievito naturale” è stata monitorata nell intervallo di 15 ore, misurando il pH ogni 30 minuti. I dati ottenuti sono stati elaborati mediante l’equazione di Gompertz,

(software Statistica per Windows, Statsoflt, Oklahoma, USA).

2.5) Determinazione della concentrazione di acido lattico ed acido acetico La concentrazione di acido lattico ed acido acetico negli impasti di fermentazione lunga o di fermentazione breve sono stati determinati mediante kit Enzyplus (Diffchamb, Sweeden). Gli estratti acquosi ottenuti da 10 g di impasto, addizionati di 90 mi di acqua distillata, sono stati omogeneizzati mediante Sterlimixer Lab (PBI International) per 2 min. Dopo omogeneizzazione, la miscela è stata incubata in agitazione a 100 rpm per 30 min e, quindi, centrifugata a 10.000 x g per 15 min. a 4°C.

2.6) Determinazione della concentrazione di aminoacidi liberi

La concentrazione di aminoacidi liberi è stata determinata mediante Aminoacid Analyzer BioChrom 30 (BioChrom Ltd.). La separazione cromatografica è stata eseguita mediante colonna a scambio cationico (Na cation-exchange column, 20x0,46 cm). Come standard sono state utilizzate: una miscela contenente concentrazioni note degli aminoacidi acido cisteico, metionina sulfone e sulfossido, triptofano, omitina (Sigma Chemical Co.); ed una soluzione a concentrazione nota dei restanti aminoacidi. Proteine e peptidi sono stati precipitati dagli estratti acquosi degli impasti mediante aggiunta di acido solfosalicidico (5% vol/vol), incubazione per 1 ora a 4°C e centrifugazione a 15.000 x g per 15 min. Il surnatante è stato filtrato mediante un filtro a porosità 0,22 μm (Millex-HA; Millipore S.A., Saint Quentin, France) e diluito 1:5 con tampone Na-citrato (0,2 M, pH 2.2). Gli aminoacidi, derivatizzati post-colonna con reagente a base di ninidrina, sono stati rilevati mediante detector UV settato a440 nm (per prolina e idrossiprolina) o 570 nm (per altri aminoacidi).

2.7) Determinazione dell’attività fitasica

Estratti acquosi degli impasti sono stati prodotti mediante aggiunta di 4 mi di Tris-HCl 50 mM pH 8,8, per grammo di impasto e successiva incubazione a 4°C per 1 h. Dopo centrifugazione a 12000 rpm per 15 min, 150 μl di estratto acquoso sono stati incubati per 2 ore a 45°C con 600 μΐ di una soluzione contenente Na-fitato 3 mM in Na-acetato 0,2 M (pH 4). La reazione è stata bloccata mediante aggiunta di 750 μΐ di acido tricloroacetico 5% (p/v). L’attività fitasica è stata determinata come ortofosfato inorganico rilasciato a partire dall’acido fitico ad opera delle fitasi. La liberazione di fosfato inorganico è stata misurata in seguito all’aggiunta di una soluzione colorante (750 μΐ), prodotta dalla miscela di ammonio molibdato 1,5% (p/v) in acido solforico 5,5% (4 volumi) e solfato ferroso 2,7% (p/v) (1 volume). L’assorbanza a 700 nm è stata misurata all’inizio ed al termine dell’incubazione. L’unità di attività fitasica (U) è stata definita come incremento di assorbanza pari a 0,001/min a 700 nm. La determinazione è stata eseguita in tre repliche ed è stata calcolata la deviazione standard.

2.8) Caratterizzazione reologica e sensoriale

Il volume specifico del pane (cm<3>g<-1>) è stato determinato secondo il metodo ufficiale AACC 10-10 (Approved Association Cereal Chemistry, X Edizione, Ed. AACC, St. Paul, Minnesota - U.S.A.).

In questo esempio, si sono valutate le caratteristiche reologiche e sensoriali del pane preparato secondo il procedimento 2.2) e 3.1) e secondo il procedimento 2.3) come controllo.

L'alveolatura della mollica è stata valutata mediante una metodica di analisi dell immagine. La digitalizzazione dell'immagine delle fette è stata effettuata mediante Image Scanner (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 300 dots/inch. L'analisi dell'immagine è stata effettuata con il software UTHSCSA ImageTool (Versione 2*0, University of Texas Health Science Centre, San Antonio, Texas, disponibile su FTP maxrad6.uthscsa.edu). L'analisi è stata eseguita su due sub-immagini per campione, selezionate dalla medesima scansione della fetta, della dimensione 500 x 500 pixel. Per ogni campione sono state analizzate due fette. La percentuale dell'area degli alveoli sul totale è stata ottenuta secondo il metodo proposto da Crowley et al. (Crowley et al., 2000. Influence of additives and mixing time on crumb grain characteristics of wheat bread. Cereal Chem 77: 370-375).

La valutazione delle proprietà sensoriali del pane è stata condotta da un panel non addestrato costituito da dieci assaggiatori (Haglund et al., 1998. Sensory evaluation of wholemeal bread frani ecologically and conventionally grown wheat. J. Cereal Sci 27: 199-207). Per ognuna delle caratteristiche sensoriali prescelte è stato attribuito un punteggio compreso nell’intervallo 0-10. Sono state condotte tre osservazioni per campione. In preparazione della valutazione, il pane è stato conservato a temperatura ambiente per 5-6 ore e, successivamente, sezionato in fette dello spessore di 1,5 cm. Le fette sono state, quindi, separate in 4 parti. Ogni assaggiatore ha ricevuto 2 di queste 4 parti per campione.

Descrizione degli attributi sensoriali:

a) elasticità: capacità del quarto di fetta di tornare alla forma originale dopo una leggera pressione tra le dita (0 = deformazione permanente; 10 = ritorno alla forma originale);

b) colore: valutato in una scala colorimetrica compresa tra il marrone molto chiaro ed il grigio scuro (0 = marroncino chiaro; 10 = grigiastro);

c) aroma acido: intensità valutata portando il campione al naso (0 = scarso, 10 = intenso aroma acido);

d) sapore acido: intensità valutata durante la masticazione (0 = scarso, 10 = intenso sapore acido);

e) dolcezza: intensità valutata durante la masticazione (0 = scarsa, 10 = elevata dolcezza);

f) secchezza: determinata in base allo sbriciolamento del pane in bocca. Un basso grado di secchezza è attribuito al pane che rimane aggregato in bocca, mentre la secchezza è elevata se il pane si disgrega facilmente durante la masticazione (0 = impasto compatto; 10 = intenso sbriciolamento);

g) aroma: combinazione dell’intensità aromatica e gustativa (0 = scarso; 10 = elevato aroma)

Esempio 3: produzione di pane da farina di grano a basso indice glicemico flG)

3.1) Preparazione di un pane usando un lievito naturale secondo l’invenzione

La produzione di pane a basso IG è stata eseguita mediante un processo a due stadi (fermentazione lunga e breve) che ha previsto:

a) impastamento di farina tipo manitoba (13,5% p/p); farina tipo 0 rinforzata 31,4% p/P; acqua 22,5% p/p e una quantità di “lievito naturale” pari a 32,6 % p/p ottenuto da esempio 1 , contenente una densità di batteri lattici pari a ca. 10<7>ufc/g.

b) incubazione per 15 ore a temperatura ambiente (“fermentazione lunga”); c) impastamento di: farina tipo 0 (44,54% p/p), farina di segale integrale (5,59% p/p), farina di malto d'orzo (0,25% p/p); sale (0,19% p/p), acido ascorbico (0,03% p/p), alfa-amilasi di origine Funginea (0,03% p/p), lievito di birra (0,88% p/p); “lievito naturale” proveniente dalla”fermentazione lunga” (10,17% p/p); fibra di avena (2,15% p/p) ed acqua 36,17% p/p

d) incubazione dell’impasto a 28°C, per circa 2 ore e 20 min. (“fermentazione breve”);

e) cottura dell’impasto per ca. 50 min. a circa 220°C, con variazioni in funzione della pezzatura.

3.2) L’idrolisi in vitro dell’amido

L’idrolisi in vitro dell’amido è stata studiata seguendo il protocollo proposto da Liljeberg et al. (Liljeberg et al. 1996. Resistant starch formation in bread as influenced by choice of ingrediente or baking conditions. Food Chem 56: 389-394). Una aliquota di campione di pane prodotto in 2.2), 2.3) e 3.1), corrispondente a 1 g di amido totale, è stata masticata da 2 soggetti per 30 secondi. Il prodotto è stato espulso in un beaker contenente 50 mg di pepsina (Sigma Chemical CO) in 6 mi di tampone fosfato 0,05 M, pH 6,9 (contenente 0,4 g/1 di NaCl). I soggetti hanno lavato i denti con 5 mi dello stesso tampone per 60 secondi. La soluzione di lavaggio è stata anch’essa espulsa nello stesso beaker. Il pH è stato portato a 1,5 con HC1 2 M. Ciascun campione è stato incubato a 37°C per 30 min. in agitazione. Successivamente il pH è stato portato a 6,9 con NaOH 0,5 M e incubato con α-amylase porcina (Sigma Chemical CO, Mo USA). L’enzima (110 U Sigma Chemical CO) è stato disciolto in 10 mi di tampone e 1 mi di questa soluzione è stata addizionata al contenuto del beaker. II campione è stato portato al volume finale di 30 mi con tampone fosfato e trasferito in membrana da dialisi (cut. off. 12400) (Sigma Chemical CO). La membrana è stata incubata a 37°C per 3 ore in tampone fosfato (800 mi), in bagno agitante. Ogni 30 min., per 3 ore, sono state prelevate e refrigerate aliquote di 2 mi. Successivamente 3 mi di tampone sodio-acetato 0,4 M pH 4,75 sono stati addizionati a ciascuna aliquota e 80 μΐ di amiloglucosidasi (140 U/ml, Boehring) sono stati aggiunti per idrolizzare l’amido digerito in glucosio (45 min a 60°C in bagno agitante). Il glucosio contenuto è stato determinato mediante Enzy Plus D-Glucose (Diffchamb). Il fattore di conversione da glucosio ad amido è stato pari a 0,9. La frazione di amido digerito è stata espressa come percentuale rispetto all’amido potenzialmente disponibile idrolizzato ai diversi tempi (30, 60, 90, 120 e 180 min.). Mediante equazione di primo ordine sono state determinate le curve di idrolisi usando il programma Statistica 6.0 per Windows 1998. L’equazione è stata la seguente: C = C∞(1-e<" 1⁄2>), dove C è la concentrazione al tempo t, C∞è la concentrazione all’equilibrio, k è la costante cinetica e t è il tempo.

3.3) Determinazione dell’indice glicemico in vivo

L’indice glicemico (IG) in vivo è stato determinato da Farcoderm S.r.l. (Arese -MI-). Una porzione di pane preparato secondo procedimento 3.1) contenente 50 g di carboidrati (metodo volumetrico secondo Feeling) è stata somministrata a 20 soggetti sani. Dopo assunzione e prima di procedere alla determinazione della glicemia, è stata determinata la curva glicemica dei 20 soggetti in seguito all’assunzione di 50 grammi di glucosio (Sciavo Diagnostics 50% sciroppo V04CA02; Sciavo Diagnostics International s.r.l., 53018 Sovicille - SI). Come riferimento è stata usata una soluzione di glucosio (100 mi) con la seguente composizione: glucosio 50 g, aroma di arancio 0,140 mi, estratto arancio amaro fluido 0,535 g, acido citrico 0,250g, sodio cloruro 0,180 g, aroma di limone 0,100 g, sodio benzoato 12,5 mg, metile p-ossibenzoato 3 mg, propile possibenzoato 3 mg, e acqua depurata q.b. a 100 mi. Dopo l’assunzione del pane o della soluzione di glucosio i soggetti sono stati sottoposti a prelievo di sangue capillare mediante sistema pungidito Accu-Check® Soft-Click® e Accu-Chek® Softclix® Lancet (Roche Diagnostics S.p.A., 22052 Monza - MI). La glicemia è stata determinata mediante metodo amperometrico (Accu-Check® Comfort -Roche Diagnostics S.p.A., 22052 Monza - MI). Per ogni soggetto è stata determinata l’area sottesa dalla curva (AUC) della risposta glicemica monitorata per 2 ore. Il valore di IG finale è stato calcolato come la media dei valori di IG individuali dei 20 soggetti. I soggetti partecipanti allo studio sono stati selezionati da un panel di soggetti sani di sesso maschile e femminile, secondo i seguenti criteri di inclusione: (i) età compresa tra i 18 ed i 60 anni; (ii) razza caucasica; (iii) mancata partecipazione a test simili da almeno una settimana; (iv) assenza di patologie cutanee; (v) assenza di intolleranze alimentari; (vi) anamnesi negativa per atopia; (vii) conoscenza delle procedure dello studio; (vili) e firma del consenso informato. Le misurazioni della glicemia sono state acquisite sui soggetti a digiuno, come segue: (1) valutazione (ogni 30 min.) della glicemia in seguito ad assunzione di una soluzione acquosa di glucosio; (2) valutazione (ogni 30 min.) della glicemia in seguito ad assunzione del pane oggetto di studio, a distanza di una settimana (wash out) dall’assunzione della soluzione di glucosio.

Risultati

Esempio 1: Isolamento ed identificazione dei batteri lattici secondo l’invenzione

Da tutto quanto precedentemente descritto, si evidenzia che nel “lievito naturale” fermentato predominano i batteri lattici e questi si possono isolare. Sulla base dell’identificazione mediante sequenziamento parziale della regione 16S rRNA, le seguenti specie di batteri lattici sono state isolate dal “lievito naturale” ed identificate come Lactobacillus sanfranciscensis DSM 21188 e Lactobacillus plantarum DSM 21066.

Esempio 2: Uso vantaggioso del “lievito naturale” secondo l invenzione 2.1) Dimostrazione della validità funzionale del lievito naturale ottenuto dal procedimento di propagazione e gestione dell’invenzione.

E’ stato valutato il processo di propagazione e gestione del “lievito naturale”. La determinazione dei valori di pH ed acidità di titolazione è stata eseguita per 30 gg consecutivi. Il valore di pH del “lievito naturale” all’inizio della propagazione è risultato compreso nell’intervallo 4, 5-4, 6 (Tabella 1). Dopo fermentazione, i valori medi riscontrati sono risultati: 3,84 per l’aliquota fermentata a 16°C per 24 h, destinata al rinfresco del “lievito naturale”, e 3,71 per l’aliquota fermentata a temperatura ambiente per 15 ore (“fermentazione lunga”), da usare come starter per la produzione di pane (Come riportato nella seguente Tabella 2).

Tabella 2 - Valori di pH ed acidità di titolazione (A.T., mi NaOH 0,1 M per 10 g di impasto) (media tra due repliche) del “lievito naturale”, rinfrescato quotidianamente e fermentato a temperatura ambiente per 15 ore (“fermentazione lunga”) e a 16°C per 24 h.

pH iniziale pH finale Acidità di Acidità di titolazione finale titolazione

iniziale

La media dei valori di acidità di titolazione iniziale è risultata 5,1 mi NaOH 0,1 M per 10 g, mentre i valori a fine fermentazione sono risultati compresi nell'intervallo 10,5-11,5 NaOH 0,1 M per 10 g (Tabella 1). I valori medi di pH delTimpasto finale per la produzione di pane, alTinizio ed al termine della fermentazione di 2 ore e 20 min. a 28°C (“fermentazione breve”) sono risultati, rispettivamente, 5,36 e 4,71 (Come riportato nella seguente Tabella 3).

Tabella 3 - Valori di pH ed acidità di titolazione (A.T., mi NaOH 0,1 M per 10 g di impasto) (media tra due repliche) dell’impasto finale per la produzione di pane, prodotto quotidianamente e fermentato a 28°C per 2 ore e 20 min. (“fermentazione breve”) .

L’attività acidificante del “lievito naturale” è risultata costante nell’ intervallo di 30 gg, a dimostrazione della stabilità dell’equilibrio microbico e della selezione di parametri di processo endogeni ed esogeni che consentono una attività metabolica costante dei batteri lattici (Hammes e Gaenzle, 1998. Sourdough breads and related products. In Woods, B.J.B. - Ed. - Microbiology of Fermented Foods, vol. 1. Blackie Academic/Professional, London, pp. 199-216). I valori di densità cellulare dei batteri lattici durante i 30 gg di monitoraggio sono risultati compresi nell’intervallo definito precedentemente (vedasi i risultati di Esempio 1). L’uso industriale del “lievito naturale” per un periodo di ca. 9 mesi ha confermato la costanza delle performance e la semplicità delle operazioni di propagazione, gestione ed uso del “lievito naturale”.

2.4) Caratterizzazione del processo di acidificazione

L’elaborazione statistica della cinetica di acidificazione del “lievito naturale” (“fermentazione lunga”) ha mostrato un valore di ΔρΗ pari a 0,88 (Come riportato nella seguente Tabella 4 e in Tavola 1). I valori di λ (fase di latenza) e gmax(tasso di acidificazione massimo) risultano essere, rispettivamente, di 0,25 ore e 0,14 ΔρΗ per ora (Tavola 1).

Tabella 4 - Acidificazione mediante “lievito naturale” nell’intervallo di 15 ore di fermentazione a temperatura ambiente (“fermentazione lunga”): pH e ΔpH (differenza rispetto al valore di pH al tempo 0),

2.5) Concentrazione di acido lattico ed acido acetico

Al termine delle 15 ore di “fermentazione lunga”, i valori medi della concentrazione di acido lattico ed acido acetico sono stati, rispettivamente, 7,0 g/kg (77 mM) e 3 g/kg (20 mM). Il rapporto molare tra acido lattico ed acido acetico (quoziente di fermentazione), è risultato pari a 3,85. Generalmente, un basso valore del quoziente di fermentazione (detto rapporto molare tra acido lattico ed acido acetico) inferiore a 5 è in grado di connotare positivamente Γ aroma tipico del pane fermentato con “lievito naturale”. La concentrazione di acido lattico ed acido acetico dell’impasto al termine della “fermentazione breve” è risultata, rispettivamente, 0,9 g/kg (10 mM) e 0,16 g/kg (2,67 mM), con un quoziente di fermentazione pari a 3,74. Il rapporto molare tra acido lattico ed acetico si è mantenuto costante anche nella seconda fermentazione che caratterizza il processo biotecnologico a due stadi.

2.6) Determinazione della concentrazione di aminoacidi liberi

La concentrazione totale di aminoacidi liberi è risultata essere ca. 844 mg/kg al termine della “fermentazione lunga”, ca. 464 mg/kg al termine della “fermentazione breve” e ca. 212 mg/kg nell’impasto fermentato con solo lievito di birra (controllo). L’elevata concentrazione di aminoacidi liberi, in particolare al termine della “fermentazione lunga”, è la conseguenza degli eventi di proteolisi primaria, prevalentemente ad opera di proteinasi endogene della farina, attivate dal processo di acidificazione lattica, e secondaria, prevalentemente legata all’attività peptidasica dei batteri lattici del “lievito naturale”. La fermentazione dell’impasto con “lievito naturale”, secondo il processo biotecnologico proposto, consente una produzione di pane con una biodisponibilità doppia (ca. 464 mg/kg) di amino acidi liberi rispetto all’uso esclusivo di lievito di birra (ca. 212 mg/kg). Gli aminoacidi liberi presenti in concentrazione maggiore al termine delle due fermentazioni sono triptofano, leucina, fenilalanina, acido glutammico, tiroxina, arginino, asparagina e metionina (Come riportato nella seguente Tabella 5)

Tabella 5 - La concentrazione di aminoacidi liberi (mg/kg) al termine della fermentazione lunga e breve del procedimento a due stadi

(2.7) Determinazione dell’attività fitasica

Dopo “fermentazione breve”, l’attività fitasica dell’estratto acquoso dell’impasto fermentato con “lievito naturale” è risultata essere ca. 3 volte superiore (2,17 ± 0,058 U) a quella dell’estratto acquoso dell’impasto fermentato con solo lievito di birra (0,7 ± 0,17 U). Una ulteriore conferma di tale differenza è stata ottenuta mediante aggiunta diretta di acido fitico negli impasti prima della fermentazione. L’attività fitasica dell’impasto fermentato con “lievito naturale” è risultata pari a 6,76 ± 0,005 U, mentre quella dell’impasto fermentato con lievito di birra si è attestata su valori di 2,33 ± 0,092 U. L’incremento dell’attività fitasica osservato nell’impasto fermentato con “lievito naturale” è la conseguenza dell’attivazione di fìtasi endogene della farina a causa del processo di acidificazione lattica, e dell’attività fitasica intrinseca dei batteri lattici del “lievito naturale”.

2.8) Caratterizzazione reologica, nutrizionale e sensoriale

Il pane fermentato con “lievito naturale” secondo 2.2) e il pane preparato secondo 3.1) sono stati comparati con il pane preparato secondo 2.3).

Il volume specifico è risultato 2,18 ± 0,02 cm<3>/g per il pane fermentato esclusivamente con lievito di birra, e 2,90 ± 0,02 e 3,85 ± 0,03 cm<3>/g, rispettivamente per i pani con “lievito naturale”. La struttura dei pani fermentati con “lievito naturale” è risultata caratterizzata da una maggiore alveolatura rispetto al pane fermentato con lievito di birra. Rispetto a quest'ultimo, che ha presentato alveoli per il 44% della superficie della fetta, i pani fermentati con “lievito naturale” hanno mostrato alveoli per il 54% e 51 % della superficie. In particolare, analizzando l'area ed il perimetro dei singoli alveoli, il pane con lievito di birra ha presentato maggiore uniformità, mentre nel caso degli altri due pani gli alveoli appaiono mediamente più grandi e notevolmente più difformi (Tabella 6).

Il valore di pH dei pani è risultato 5,6; 4,6 e 4,4, rispettivamente, per pane con lievito di birra, pane preparato secondo 2.2) e pane preparato secondo 3.1). In generale, le condizioni di acidità dell’impasto e, quindi, del pane hanno una positiva influenza sul volume e sulla struttura della mollica poiché consentono la formazione di un network glutinico più resistente ed in grado di trattenere una maggiore quantità di C02.

Il pane prodotto con “lievito naturale” è stato caratterizzato dai seguenti valori nutrizionali per 100 g di prodotto: valore energetico 250 kcal, proteine 8,24 g, carboidrati totali 52,52 g, carboidrati solubili 0,90 g, grassi totali 0,79 g, grassi saturi 0,18 g, fibre alimentari 4,10 g e sodio 0,01 g.

Tabella 6 - Risultati dell'analisi dell'immagine su pane preparato secondo il procedimento di 2.2), 2.3) e 3.1).

I risultati ottenuti dall’analisi mediante panel test sono stati elaborati statisticamente con lo scopo di valutare le caratteristiche sensoriali peculiari di ciascun tipo di pane. L’aroma dei pani prodotti con “lievito naturale” ha mostrato notevoli differenze rispetto al pane fermentato con solo lievito di birra (Come riportato nella seguente Tabella 7).

Tabella 7 Risultati dell’analisi sensoriale (panel non addestrato costituito da 10 soggetti) dei pani fermentati con starter diversi.

Attributi Pane prodotto Pane prodotto Pane prodotto sensoriali secondo secondo secondo procedimento procedimento procedimento

a-c

Medie della stessa riga con differente apice, differiscono significativamente (PO. 05).

In particolare, gli attributi sensoriali relativi aH’aroma ed al sapore acido, caratteristiche di pregio attribuite al pane ottenuto con “lievito naturale”, sono risultate molto più evidenti rispetto al controllo. Differenze minori sono state riscontrate relativamente al colore, mentre non sono state significative le differenze relative alla elasticità e secchezza. Sebbene caratterizzato da una colorazione ed un aroma più marcato, il pane prodotto secondo procedimento 3.1) ha confermato come le caratteristiche tipiche, legate all’uso di “lievito naturale”, siano percepiti nella stessa maniera della produzione tradizionale con “lievito naturale” secondo procedimento 2.2).

3) Produzione di pane da farina di grano a basso indice glicemico (IG) 3.1) Determinazione dell’idrolisi dell'amido in vitro

Il pane prodotto secondo il procedimento 3.1) ha mostrato, infatti, una curva di idrolisi significativamente diversa rispetto al pane prodotto secondo procedimento 2.3)(Tavola 3). Differenze minori sono state osservate per il pane fermentato con “lievito naturale” secondo il procedimento 2.2). Osservando i valori a 180 min. (Tabella 8), le percentuali di idrolisi dell'amido disponibile risultano essere: 51% per il pane preparato secondo 2.3); 44,01 % per il pane preparato secondo 2.2); e 30,52% per il pane preparato secondo 3.1). Sulla base dei risultati ottenuti è stato, quindi, evidenziato come la fermentazione mediante “lievito naturale” secondo l’invenzione riduce marcatamente la percentuale di amido disponibile e, potenzialmente, il valore di IG nel pane.

Tabella 8 - Le percentuali di amido idrolizzato nell 'intervallo di tempo 0 e 180 min, del pane fermentato con lievito di birra e i due pani fermentati con “lievito naturale”

3.2) Determinazione dell'indice glicemico in vivo

II valore di IG del pane è stato calcolato come media dei valori di IG individuali dei 20 soggetti. Nelle condizioni sperimentali dello studio, il pane prodotto secondo il procedimento 3.1) ha evidenziato un valore di IG pari a 41,1% (Tavola 4). Sulla base dei risultati riportati in letteratura, i valori di IG dei pani prodotti da farina di grano si attestano su livelli 70-73%. Solo in riferimento a pani prodotti con farine integrali o pani di segale è possibile osservare valori di IG pari a 58-66% (Mendosa 2002, Revised International Table of Glycemic Index (Gl) and Glycemic Load (GL) Values - 2002 Diabetes, [http://diabetesabout.com/library/mendosagi/ngilists.htm]).

Il pane a basso indice glicemico è stato caratterizzato dai seguenti valori nutrizionali per 100 g di prodotto: valore energetico 233 kcal, ceneri, 0,76 g, umidità 34,79 g, proteine 8,57 g, grassi totali 1,48 g, grassi saturi 0,33 g, carboidrati totali 46,27 g, fruttosio 0,06 g, glucosio 0,06 g, lattosio 0,02 g, maltosio 0,92 g, saccarosio 0,06 g, sodio 0,136 g e fibra alimentare 8,13 g.

SEQUENCE LISTING

<110>

<120> BATTERI LATTICI E LORO USO SOTTO FORMA DI LIEVITO NATURALE PER LA

PRODUZIONE DI PANE E PRODOTTI DA FORNO CON ELEVATE PROPRIETÀ

NUTRIZIONALI E SENSORIALI; PANE E PRODOTTI DA FORNO A BASSO INDICE GLICEMICO ED ALTO CONTENUTO DI FIBRA ALIMENTARE

Claims (18)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un ceppo batterico scelto dai seguenti ceppi: Lactobacillus sanfranciscensis, depositato presso Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in data 15 febbraio 2008 ed identificato con il numero di deposito DSM 21188, e Lactobacillus plantarum, depositato presso Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in data 23 gennaio 2008 ed identificato con il numero di deposito DSM 21066.
2. 2. Un "lievito naturale” comprendente almeno uno dei ceppi batterici secondo la rivendicazione 1.
3. 3. Il "lievito naturale” secondo la rivendicazione 2, in cui detto almeno un ceppo batterico è presente in una quantità che varia da lxlO<7>a lxlO<10>ufc/g di “lievito naturale”, ancor più preferibilmente da 1x10 a 5x10 ufc/g, ancor più preferibilmente da 5x10 a 2x10 ufc/g.
4. 4. Il "lievito naturale” secondo la rivendicazione 2 comprendente una miscela dei ceppi batterici secondo la rivendicazione 1.
5. 5. Il "lievito naturale” secondo la rivendicazione 4, in cui esiste un rapporto ponderale reciproco tra i ceppi da 1:10 a 10:1, preferibilmente 1 :1.
6. 6. Il "lievito naturale” secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 5, in cui sono inoltre compresi i seguenti ingredienti: - farina tipo manitoba in una quantità che varia da 11% a 15% p/p rispetto al peso totale del “lievito naturale”; - farina tipo 0 rinforzata in una quantità che varia da 28% a 37% p/p rispetto al peso totale del “lievito naturale” e - acqua in una quantità che varia da 18% a 28% p/p rispetto al peso totale del “lievito naturale”.
7. 7. Il “lievito naturale” secondo una qualsiasi delle rivendicazione da 2 a 6, in cui è inoltre presente una quantità di “lievito naturale” propagato in precedenza, preferibilmente propagato il giorno precedente.
8. 8. Il “lievito naturale” secondo la rivendicazione 7, in cui detto “lievito naturale” propagato in precedenza è presente in una quantità che varia da 28% a 35% p/p, preferibilmente da 30% a 35% p/p ed ancor più preferibilmente da 31% a 32% p/p.
9. 9. Uso di almeno uno dei ceppi batterici secondo la rivendicazione 1 nella produzione di “lievito naturale”.
10. 10. Uso del “lievito naturale” secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 8 nella produzione di un prodotto lievitato da forno, preferibilmente il pane.
11. 11. Un procedimento per la produzione di pane comprendente le seguenti fasi: a) impastare “lievito naturale” secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, b) incubare la miscela impastata in fase a) per un periodo che varia da 13 a 18 ore ad una temperatura che varia da 8 a 22°C; c) impastare del “lievito naturale” ottenuto dalla fase (b) con almeno un tipo di farina in una quantità che varia da 45% a 65% p/p e con acqua in una quantità che varia da 25% a 45% p/p e opzionalmente con altri ingredienti noti nell’arte per la produzione del pane; d) incubare per un periodo che varia da 1 ,5 a 3 ore, ad un temperatura che varia da 24 a 31 °C ; e) cuocere l’impasto ottenuto in fase (d) per un periodo che varia da 35 a 65 minuti, ad una temperatura che varia da 190 a 250°C.
12. 12. Il procedimento secondo la rivendicazione 11, in cui l’almeno un tipo di farina in fase (c) è farina di grano.
13. 13. Il procedimento secondo la rivendicazione 11 o 12, in cui il “lievito naturale” ottenuto dalla fase (b) è presente in una quantità che varia da 6% a 12% p/p, preferibilmente da 5% a 10% p/p, ancor più preferibilmente da 7,5% a 8,5% p/p.
14. 14. Il procedimento secondo la rivendicazione 11, in cui l’almeno un tipo di farina in fase (c) è una miscela di farina comprendente: - farina tipo 0 in una quantità che varia da 43,5% a 45,5% p/p rispetto alla quantità totale di materiale da impastare nella fase (c), - farina di segale integrale in una quantità che varia da 3% a 7% p/p rispetto alla quantità totale di materiale da impastare nella fase (c) e - farina di malto d’orzo in una quantità che è inferiore a 0,5% p/p rispetto alla quantità totale di materiale da impastare nella fase (c).
15. 15. Il procedimento secondo la rivendicazione 14, in cui il “lievito naturale” ottenuto dalla fase (b) è presente in una quantità che varia da 6% a 12% p/p, preferibilmente da 8% a 11,5% p/p, ancor più preferibilmente da 10% a 11% p/p.
16. 16. Un pane ottenibile da un procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 15.
17. 17. Un pane avente un valore IG inferiore a 53%, preferibilmente inferiore a 50%, ancor più preferibilmente inferiore a 45% ottenibile dal procedimento secondo la rivendicazione 14 o 15.
18. 18. Un procedimento per propagare il “lievito naturale” secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 3 a 7, che comprende le seguenti fasi: i) impastare il “lievito naturale” ii) incubare l’impasto di fase (a) ad una temperatura che varia da 15 a 20°C per un periodo che varia da 18 a 36 ore.