KR102320816B1

KR102320816B1 - 발효취 감소 및 빵 부피 증가 효과를 가지는 락티카제이바실러스 파라카제이 lrcc5240 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102320816B1
Application number: KR1020210014556A
Authority: KR
Inventors: 전윤주; 임아영; 윤석민; 김윤식; 박재웅; 양시영; 김준환; 윤인섭; 현 조; 윤원주; 이경훤
Original assignee: 롯데제과 주식회사
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2021-11-03

Abstract

본 발명은 제빵에 적합한 균주와 이를 적용한 유산균 발효액종 및 유산균 발효 식빵에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 제빵 적용 시 우수한 기능성과 기호성을 가지는 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240(기탁번호 KCCM12894P) 및 이를 포함하는 유산균 발효액종과 발효빵의 제조방법, 그리고 그 유산균 발효액종과 발효빵에 관한 것이다.

Description

발효취 감소 및 빵 부피 증가 효과를 가지는 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240 균주 및 이의 용도 {Lacticaseibacillus paracasei Strain LRCC5240 for Reduced Fermentation Odor and Increased Volume of Bread, and Uses thereof}

본 발명은 발효취감소 및 빵부피 증가 효과를 락티카제이바실러스 파라카제이 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

빵에는 프렌치 빵(French bread), 식빵(white bread) 등 수크로오스(sucrose)를 첨가하지 않거나 첨가량이 적은 빵부터 과자(sweet bread) 등 수크로오스 첨가량이 많은 빵까지 다양한 밀가루 반죽의 조성이 있다. 빵의 제조에 사용되는 빵 효모도 당량(糖量)에 대하여 발효성(醱酵性 : fermenting ability)이 다른 빵 효모가 사용되는 경우가 많다. 수크로오스 첨가량이 많은 빵의 밀가루 반죽의 경우에 사용되는 빵 효모는 내당성(耐糖性 :sugar tolerance)이 강한 빵 효모가 선택되고 있다.

일반적으로 빵은 밀가루를 반죽하여 발효시켜 굽거나 찐 음식으로, 그 제조 방법과 원료 배합 등에 따라 여러종류가 있을 수 있다. 통상적으로, 빵의 제조에 있어서 주원료는 밀가루, 이스트, 물, 식염 등이 사용되고, 준주원료로써 설탕, 유지, 계란, 분유 등이 사용되며, 제빵 개량제로서 산화제, 효소제 등이 사용된다.

보통 빵의 제조방법에는 대표적으로 2가지 방법이 잘 사용되고 있다. 하나는 빵 효모의 발효력이 즉시 반영되는 스트레이트법(straight dough method)으로서, 빵의 밀가루 반죽 원료를 한번에 반죽하여 발효, 베이킹(baking)하는 방법이다. 다른 하나는 빵의 밀가루 반죽 제작을 2단계로 나누어 하고, 전단계(前段階)에서 선발효 반죽(pre-fermented dough) 즉 스펀지 밀가루 반죽(sponge dough : 소위, 스펀지라고도 한다)을 제작·발효한 후에 최종 밀가루 반죽(final dough : 소위, 본반죽이라고도 한다)을 제작·발효하는 스펀지법(sponge dough method)이다. 스펀지법에서는,빵의 유연성(柔軟性 : flexibility) 및 가스 유지력(gas retaining ability)의 증가에 의한 빵 부피(volume)의 증대,빵의 밀가루 반죽의 기계 내성(機械耐性 : machine tolerance) 향상 등의 이점이 있어 빵의 제조에 잘 사용되고 있다.

전통적으로 쌀을 주식으로 하는 한국인의 식생활은 경제 성장과 생활수준의 향상 등에 따른 변화로 인하여 식생활의 형태도 다양해짐과 동시에 간편한 인스턴스식에 대한 소비가 급증하고 있다. 특히, 빵류에 대한 소비가 크게 증가하면서, 그에 따른 소비자 기호도가 다양해지고 있는데, 고령인구의 급속한 증가에 따른 건강과 웰빙 식품에 대한 관심이 높아지면서 소비자들의 식품에 대한 관심 역시 건강 지향적이고 자연 친화적인 성격이 커지면서 이를 고려한 기능성 빵 제품의 상품화 시도 및 다양한 천연물질을 이용한 천연 발효빵에 대한 소비자의 관심이 확대되었고, 천연 발효빵의 품질 향상과 상품화를 위한 다양한 연구가 진행되고 있는 실정이다

천연 발효빵은 오랜 역사를 가지고 있는데, 과거 북유럽에서 밀가루와 호밀 가루 등의 곡류 가루에 물, 설탕, 소금이 첨가된 반죽을 야생 효모와 미생물로 발효시킨 후, 이 반죽을 오븐에서 구워서 천연 발효빵을 만든 것으로 알려지고 있다. 상기와 같은 전통적인 천연 발효빵은 야생의 미생물에 의해 발효되는 과정에서 세균, 곰팡이 등이 쉽게 유입됨으로써 그에 따른 오염으로 인해 발효가 실패하는 경우가 빈번하고, 그로 인해 고품질의 빵을 일정하게 생산하는 데 어려움이 있었다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위해 반죽에 유산균을 사용하게 되었다.

상기 유산균은 빵의 발효 중 유기산을 생성하여 반죽의 신장성을 증가시키고 글리아딘 단백질의 점성을 증가시켜 빵의 부피를 크게 한다. 또한, 젖산 발효에 의하여 락트산의 생성량이 증가하므로 빵의 풍미가 개선되며 특히 유산균 중 비피도박테리아속을 사용하여 발효시키면 유기산 이외에 EPS(exopolysacchrides), gamma aminobutyric acid(GABA), 박테리오신 등의 다양한 대사 물질을 생성함으로써 빵의 풍미가 크게 개선되어 고품질의 빵을 생산할 수 있게 된다.

최근에는 유산균들이 락트산, 아세트산, 안식향산, 과산화수소 등의 항균성 물질을 합성하여 강한 병원성 세균의 성장을 억제할 뿐만 아니라, 발효가 진행되는 동안 유산균은 유기산 이외에 세포벽에 부착되지 않는 점질물 형태의 다당류(exopolysaccharide)를 분비함으로써, 생리활성물질로서도 그 효과가 인정되었다.

그러나, 상기와 같은 천연발효종을 활용한 빵은 고유의 시큼하고 cheesy한 풍미에 거부감을 가지는 국내 소비자들의 입맛을 사로잡지 못하고 있다. 특히, cheesy한 발효취의 원인은 butanoic acid로 알려져 있으며, 상기 butanoic acid를 적게 생산하는 천연발효종을 활용한 발효빵에 대한 연구가 필요한 실정이다.

한편, 천연발효빵의 기호도를 향상시키기 위하여는 발효빵 특유의 텍스쳐 형성이 필요하다. 그러나, 기존의 천연발효종으로 빵을 제조하는 경우 충분한 부피팽창력을 보이기 어려웠다. 따라서, 부피팽창력이 우수한 천연발효종에 대한 연구가필요한 실정이다.

이에 보다 상기와 같은 문제점을 개선한 신규한 발효취 억제 및 빵부피 팽창력이 우수한 우수한 제제에 대한 필요성이 절실하다.

한국등록특허 제 10-0747754호 한국공개특허 제 10-2007-0116234호 한국등록특허 제 10-1512340호 한국등록특허 제 10-1823088호

상기와 같은 배경하에서, 본 발명자들은 하기와 같은 신규 미생물 및 이의 용도를 제공하고자 한다.

본 발명의 일측면은 락티카제이바실러스 속의 균주로 제빵 적용시 발효취가 억제되고 부피팽창력이 우수한 신규한 균주 및 이의 제제를 제공하고자 한다. .

본 발명의 목적은 수탁번호 KCCM12894P로 기탁된 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240 (Lacticaseibacillus paracasei LRCC5240) 균주를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 유산균 발효액 및 그의 제조 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유산균 발효액을 이용하는 단계;를 포함하는 빵의 제조 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 하나의 다른 목적은 상기 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 빵의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 빵을 제공하고자 한다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.

본 발명의 일측면은 제빵 시에 발효취가 억제되는 효과를 갖는 락티카제이바실러스 파라카제이 (Lacticaseibacillus paracasei ) 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 발효취는 뷰탄산(butanoic acid)로 인해 발생하는 것인, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 발효 시 뷰탄산(butanoic acid) 생성량이 적은, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 제빵 시 부피 팽창력이 우수한, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16S rDNA를 갖는, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240인, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCCM 12894P인, 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 유산균 발효액을 제공한다.

일 구현예에 있어서, 상기 유산균 발효액을 이용하는 단계를 포함하는 빵의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 빵 및 이의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 발효취 발생이 적어도 소비자의 기호도 향상에 도움이 된다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 butanoic acid의 발생량이 기존 천연 발효빵에 사용되는 균주 및 이로 제조된 빵보다 적다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 유산균 자체의 산 생성력으로 인한 낮은 pH 로 빵 반죽의 글루텐 구조를 느슨하게 하는 효과가 있다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 빵 반죽의 글루텐 구조를 느슨하게 하여 부피 팽창력을 높일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 부피 팽창력이 우수하여 우수한 텍스쳐를 구현할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 균주, 이를 포함하는 발효액 및 이를 포함하여 제조된 빵은 부피 팽창력이 우수하여 부드러운 식감 구현이 가능하다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.

도 1a은 본원발명 균주의 16s rDNA 의 BLAST 분석 결과이다.
도 1b는 본원발명 균주의 계통도이다.
도 2은 균주 미첨가 빵, 락티플랜티바실러스 플랜타럼LRCC 5193, 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240을 첨가하여 제조한 빵의 향기 성분 중 Butanoic acid를 GC/MS로 분석하여 얻은 결과이다.
도 3는 빵 3종의 부피를 Volscan Profiler(제조사: Stable Micro Systems)를 이용하여 측정한 결과이다.
도 4는 빵 3종의 중량을 측정한 값이다.
도 5은 빵 3종의 부피와 무게값을 통해 비용적을 계산한 결과이다.
도 6은 빵 3종의 Baking loss(계산 방법: (Baking 전 중량 - Baking 후 중량)/(Baking 전 중량)*100)를 계산한 값이다.
도 7은 빵 3종의 수분 함량을 적외선 수분 측정기(모델명: FD-720, 제조사: Kett)로 측정한 결과이다.
도 8는 빵 3종의 수분활성도를 수분활성도 측정기(모델명: Lab Partner-Aw, 제조사: Novasina AG)로 측정한 결과이다.
도 9은 빵 3종의 pH를 pH meter(제조사: Mettler Toledo)로 측정한 결과이다.
도 10은 빵 3종의 TTA(총 적정 산도)를 pH 6.6까지 소모된 0.1N NaOH의 양(ml)으로 나타낸 값이다.

이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 제빵 적용 시, 우수한 기호성과 부피 팽창력을 가지는 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240 및 이를 이용한 유산균 발효 식빵의 제조방법을 제공하고자 한다. 구체적으로 본 발명은 제빵에 적합한 균주와 이를 적용한 유산균 발효액종 및 유산균 발효 식빵에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 제빵 적용 시 우수한 기능성과 기호성을 가지는 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240(기탁번호 KCCM12894P) 및 이를 포함하는 유산균 발효액종과 발효빵의 제조방법, 그리고 그 유산균 발효액종과 발효빵에 관한 것이다. 또한, 다른 유산균(락티플랜티바실러스 플랜타럼)을 함유하는 빵에 비해 부정적인 발효취를 가지는 Butanoic acid 생성이 적어 제빵 산업에서 널리 활용될 수 있다.

식생활의 서구화로 인해 쌀을 주식으로 하던 과거와 달리, 탄수화물 급원이 다양화됨에 따라 빵류의 소비 역시 증가하게 되었다. 그러면서도 건강지향적인 소비자들의 증가로 인해 건강한 빵에 대한 니즈, 특히 천연발효종 빵에 대한 소구가 늘어나고 있는 추세다. 이에 따라, 개인 빵집뿐만 아니라 프랜차이즈 빵집에서도 천연발효종을 활용한 빵을 출시하고 있으나, 천연발효종 고유의 시큼하고 Cheesy한 풍미에 거부감을 가지는 국내 소비자들의 입맛은 사로잡지 못하고 있다. 이에 따라, 본 발명은 유산균 특유의 Cheesy한 발효취의 원인인 Butanoic acid를 적게 생성하는 균주를 개발하여 기존 유산균 발효종 빵보다 거부감이 적으면서도 건강지향적 소비자들에게 소구할 수 있는 빵을 제공하고자 한다. 또한, 부피팽창력이 기존보다 우수하여 부드럽고 폭신한 식감을 느낄 수 있고 대량 생산 시 작업성에도 긍정적인 영향을 줄 수 있을 것으로 기대한다.

본 발명은 김치로부터 분리하여 제빵 적용 시 발효취 성분인 Butanoic acid 생성이 낮아 기호성이 우수한 식물성 유산균 락티카제이바실러스 파라카제이를 제공하는데 그 목적이 있다. 또한, 본 발명은 제빵 적용 시 부피 팽창력이 우수한 락티카제이바실러스 파라카제이를 제공하는데 그 목적이 있다. 또한, 본 발명은 발효액종 제조 시 발효 전보다 소화력이 강화된 락티카제이바실러스 파라카제이를 제공하는데 그 목적이 있다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밀가루, 말토덱스트린, 포도당을 락티카제이바실러스 파라카제이 균주로 발효시킨 유산균 발효액종을 제공한다.

또한, 본 발명은 밀가루 100 중량부를 기준으로 상기 유산균 발효액종을 3 내지 20 중량부, 바람직하게 10 중량부를 투입하여 4시간 이상 발효하여 제조하는 유산균 발효빵을 제공한다.

본 발명은 제빵에 적합한 균주와 이를 적용한 유산균 발효액종 및 발효빵에 관한 것으로, Butanoic acid의 생성량이 적고, 유산균 자체의 산 생성력으로 인한 낮은 pH로 빵 반죽의 글루텐 구조를 느슨하게 하여 부피 팽창력을 높임으로써, 발효취가 낮고 부드러운 식감을 가지는 유산균 발효빵에 효과적으로 적용될 수 있다.

본 발명은 락티카제이바실러스 파라카제이를 접종하고 배양한 밀가루 발효물(유산균 발효액)을 사용하여 빵을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 기존에 사용하던 락티플랜티바실러스 플랜타럼 균주 대신 락티카제이바실러스 파라카제이 균주를 접종배양한 유산균 발효액을 사용하여 빵을 제조하는 방법에 관한 것이다. 건강지향적 소비자 증가에 따라, 건강에 유익하다고 알려진 유산균을 함유하는 빵에 대한 소구가 꾸준히 증가해왔으며 이에 따라, 유산균을 빵에 첨가한 양산빵이 출시되고 있다. 그러나, 유산균 첨가 빵의 경우 경시 변화에 따라 특유의 시큼하고 Cheesy한 발효취가 증가한다는 문제점이 있었다. 이에 따라, 본 발명의 목적은 기존 유산균(락티플랜티바실러스 플랜타럼) 첨가 빵의 관능적 문제점을 해결하기 위해 발효취의 원인인 Butanoic acid를 적게 생성하는 균주(락티카제이바실러스 파라카제이)를 개발하여 기존 유산균 첨가 빵보다 향미가 우수하고 건강지향적 소비자들에게 소구할 수 있는 빵을 제조하는 방법을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240을 접종배양한 유산균 발효액을 사용함을 그 특징으로 한다.

특히, 상기 유산균 발효액은 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240을 접종 후 36~38℃에서 16~18시간 배양하여 얻어진다. 이와 같이 얻어진 유산균 발효액은 제빵 원료 중 밀가루 총 중량에 대해 10중량%의 양으로 사용되는 것이 바람직하다. 이보다 많은 양이 사용될 경우 빵 반죽 시 너무 질어지고 글루텐 형성이 약해져 오히려 최종 제품의 부피가 작아지는 문제가 발생할 수 있다.

이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 설명한다.

이하, 실시예, 제조예 및 실험예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예, 제조예 및 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예, 제조예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

균주실시예 1. 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240 균주의 분리

(1) 시료 채취 및 유산균 분리

발효빵에 적합한 유산균을 선별하고자, 전국 각지의 전통재래시장에서 약 150종의 김치 시료를 채취하였다. 채취한 시료에 멸균 증류수를 첨가하여 10배 희석한 후, 분쇄균질기(Stomacher, Pro-Media SH-001, ELMEX)를 이용하여 균질화하였다. 상기 희석액을 멸균 식염수로 다단 희석하여 0.1ml를 취하여 0.002중량%의 BCP(Bromocresol purple)와 1.5중량%의 한천(Agar)이 첨가된 MRS 고체배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다.

배양 후, 노란색의 환이 나타나는 콜로니(Colony)를 선별하여 개체별로 위에 기술한 BCP-MRS 고체배지에 2~3회 계대배양하여 각 균주를 순수분리하였다.

상기 균주를 개체별로 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 48시간 재배양한 후 4℃ 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.

(2) 내산성 우수 균주 선별

빵의 제조 과정에서 반죽의 pH는 4.5까지도 떨어지는데, 이러한 환경에서도 생장하기 위해서는 내산성이 우수한 균주가 요구된다. 따라서 상기에서 분리한 균주들의 내산성을 비교하여 우수한 균주를 선별하였다.

상기에서 분리한 유산균을 MRS 평판배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 콜로니 일부를 채취하여 MRS 액상배지에 접종한 다음 또 다시 37℃에서 24시간 동안 정치배양하여 종균 배양액을 제조하였다.

분리 유산균의 내산성 시험을 위해 종균 배양액 1%를 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 균체를 침전시킨 후 상등액을 제거하였고, 10% H₂SO₄를 이용하여 pH를 3.0으로 조정한 0.1M 인산완충액(0.1M Phosphate buffer)을 동일한 부피로 첨가하였다. pH 3.0 완충액을 첨가한 시점을 기준으로 37℃ 배양기에서 0, 2, 4, 8시간, 그 이후로는 24시간 단위로 시료 1ml를 채취하여 이의 다단 희석액을 MRS 평판배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 초기 생균수와 pH 3.0 인산완충액 처리 후의 생균수를 각각 측정한 후, (초기 생균수 / pH 처리 후 생균수)로 내산성을 계산하였다. 이 결과, 가장 오랜 시간 동안 내산성이 높게 나타나는 균주를 선택하여 본 발명의 최종 균주로서 선별하였다.

최종 선별된 균주는 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양하여 증식시킨 다음 원심분리(10,000g, 10분)하여 균체를 획득하였다. 상기 균체를 크라이오튜브(Cryo-tube)에 미리 분주해 둔 MRS 액체배지와 글리세롤(Glycerol)이 4 : 1 비율로 혼합된 냉동보관용액(Freezing solution) 1ml에 넣어 -70℃에서 냉동보관하였다. 냉동된 균주를 본 발명의 다른 실험을 위한 스타터로 사용하였다.

균주실시예 2. 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240 균주의 생물학적 또는 화학적 형태 파악

선별된 균주의 형태학적 및 생화학적 특징을 분석하였다. 분석 결과는 하기 표 1과 같았다.

특징	결과 판정
콜로니 형태(Colony shape)	소형의 둥근 형태
콜로니 색(Colony color)	옅은 노란색
세포 형태(Shape)	간균(Rod)
그람염색(Gram staining)	+
호기 조건(Aerobic environment)	통성 혐기성
포자 형성능(Endospore)	-
포자 형태(Spore shape)	-
카탈라아제 테스트(Catalase test)	-

상기 표 1과 같이, 본원발명 균주는 그람 양성, 간균이며 포자 형성능 및 카탈라아제(Catalase) 음성으로 확인되었음을 알 수 있다.

균주실시예 3. 파라카제이 균주의 동정

상기 균주의 16s rDNA를 분석하여 유전동정을 진행하였다.

Genomic DNA preparation kit (Promega co., Ltd., USA) 를 사용하여 Genomic DNA를 추출한 다음 Universal primer인

27F (5`-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3`)와

1492R (5`-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3`)로 PCR reaction을 실시하여 16s rDNA 유전자를 증폭시켰다.

PCR 산물은 QIA quick PCR kit (QIAGEN, USA)로 정제하고 마크로젠(Macrogen co. Ltd., Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였으며, 분석된 염기서열은 NCBI 사이트의 GenBank에서 BLAST분석을 진행하여 데이터베이스와 비교하였다(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

상기 균주의 16s rRNA 유전자 염기서열은 서열번호 1과 같다.

염기서열 분석 결과는 도 1a와 같았다.

염기서열 분석 결과 상기 균주는 락티카제이바실러스 파라카제이 균주와 최대 99% 상동성을 가진다. 본원발명 균주의 계통도는 도 1b와 같았다.

이에 본 발명자는 상기 균주를 새로운 락티카제이바실러스 파라카제이 균주로 동정하였고, 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC5240으로 명명하여 한국미생물보존센터에 2020년 12월 15일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM12894P).

하기의 실시예 및 실험예에서는 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC 5240을 빵에 첨가했을 경우 발효취가 감소하고 최종 빵의 부피가 증가하는 효과를 확인하기 위하여, 유산균 미첨가 식빵과 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5193을 접종배양하여 제조한 유산균 발효액 및 이를 첨가하여 만든 식빵, 그리고 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC 5240을 접종배양하여 제조한 유산균 발효액 및 이를 첨가하여 만든 식빵의 특성을 비교분석하였다.

제조예 1. 유산균 발효액 제조

(1) 유산균 발효액의 조성

원료명		함량(g)
원료명		비교예 1	실시예1	실시예2
정제수		99.85	98.85	98.85
강력분		49.93	49.93	49.93
말토덱스트린		0.11	0.11	0.11
포도당		0.11	0.11	0.11
균주 배양액	LRCC 5193	-	1.00	-
균주 배양액	LRCC 5240	-	-	1.00
합계		150.00	150.00	150.00

(2) 상기 발효액 조성에서 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5193, 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC 5240 균주는 롯데중앙연구소에서 김치로부터 분리하여 보유하고 있는 것으로, MRS 배지에 균주 2종을 각각 배양하여 원심분리 및 PBS Wash 후 배양액으로 사용하였다. 이 때의 균주 함량은 10⁹CFU/ml으로 하였다.

이 때, 실시예 1과 실시예 2는 36±1℃에서 18시간 동안 발효시키고, 비교예 1은 밀가루 자체의 야생효모가 생육하거나 부패할 가능성이 있기 때문에 별도의 발효를 거치지 않고 식빵 제조 직전에 원료를 혼합하여 만든다.

제조예 2. 유산균 발효 식빵 제조

(1) 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC 5240 균주의 식빵에서의 효과를 확인하기 위하여, 균주 미첨가 식빵(비교예 3), 락티플랜티바실러스 플랜타럼 LRCC 5193 첨가 식빵(실시예 5), 락티카제이바실러스 파라카제이 LRCC 5240 첨가 식빵(실시예 6)의 3종을 제조하여 비교하였다.

또한, 식빵 3종은 기본적인 중종법을 사용하여 제조하였다. 중종법은 원료의 일부를 혼합하고 발효한 후에 이를 나머지 원료와 섞어(본종) 발효시킨 다음 소성의 과정을 거치는 제빵법을 의미한다.

(2) 유산균 발효 식빵 중종의 조성 및 제조 방법

유산균 발효 식빵 중종의 조성은 하기 표 3과 같다.

원료명		투입량(g)
원료명		비교예 2	실시예 3	실시예 4
강력분		700.0	700.0	700.0
이스트		17.0	17.0	17.0
이스트푸드		1.0	1.0	1.0
유산균 발효액	비교예 1 (균주 미첨가)	100.0
	실시예 1 (LRCC 5193)		100.0
	실시예 2 (LRCC 5240)			100.0
정제수		346.0	346.0	346.0
합계		1164.0	1164.0	1164.0

상기 표 3의 조성대로 원료를 계량한 후, 반죽기를 이용하여 저속(1단)으로 3분, 고속(3단)으로 3분간 믹싱하고 28±1℃, 75±5%의 발효기에서 4시간 동안 발효시켰다.

(3) 유산균 발효 식빵 본종의 조성 및 식빵 제조 방법

원료명		투입량(g)
원료명		비교예 3	실시예 5	실시예 6
강력분		300.0	300.0	300.0
이스트		1.0	1.0	1.0
액상과당		20.0	20.0	20.0
정제염		20.0	20.0	20.0
탈지분유		8.0	8.0	8.0
백설탕		70.0	70.0	70.0
쇼트닝		5.0	5.0	5.0
중종	비교예 2 (균주 미첨가)	1164.0
	실시예 3 (LRCC 5193)		1164.0
	실시예 4 (LRCC 5240)			1164.0
정제수		220.0	220.0	220.0
합계		1808.0	1808.0	1808.0

상기 조성대로 쇼트닝을 제외한 원료를 계량한 후, 반죽기를 이용하여 저속(1단)으로 3분, 고속(3단)으로 3분간 믹싱한다. 그리고나서 쇼트닝을 투입한 후에 또 다시 저속(1단)으로 3분, 고속(3단)으로 3분간 믹싱한다. 그 후 15분의 플로어 타임 후 분할 및 둥글리기하고 중간 발효를 15분간 진행한다. 중간 발효가 끝난 반죽은 가스를 뺀 후 성형한 후 식빵 틀에 넣어 38±1℃, 85±5%의 발효기에서 55~60분 발효시킨다. 최종 발효가 끝난 반죽은 200℃로 예열한 오븐에서 30분간 소성한다.

실험예 1. 식빵 3종의 향기 비교

식빵 3종(비교예 3, 실시예 5~6)의 향기 비교는 유산균 발효액 제조, 식빵 제조, 전처리, 향미성분 추출, 기기분석 순으로 진행하였다. 전처리는 식빵 3종은 테두리를 잘라낸 후 잘게 갈아 vial에 옮겨 담아 HS-SPME-GC/MS(HeadSpace-Solid Phase MicroExtraction Gas Chromatography/Mass Spectrometry, 제조사: Agilent)를 이용하여 측정하였다.

여러 향기 성분들 중 유의적인 차이를 보였던 Butanoic acid 값의 결과는 도 2에 나타내었다.

실험예 2. 식빵 3종의 부피, 중량 측정

식빵 3종(비교예 3, 실시예 5~6)의 부피는 Volscan Profiler 300(제조사: Stable Micro Systems)를 이용하여 측정하였다. 해당 기기는 각 식빵 시료가 중심축을 기준으로 회전하며 반사되는 레이저를 통해 간접적으로 부피를 측정하는 원리로 작동된다.

각 시료의 부피와 중량을 측정한 결과는 도 3 내지 4에 나타내었고, 3회 반복 측정 후 SPSS 18.0(SPSS Inc., Chicago, USA) 프로그램으로 통계처리하여 유의성을 확인하였다. 비용적은 도 5와 같았다.

실험예 3. 식빵 3종의 수분, 수분활성도 측정

식빵 3종(비교예 3, 실시예 5~6)의 수분 함량(%)은 적외선 수분 측정기(FD-720, 제조사: Kett)를 이용하여 측정하였다. 수분활성도는 수분활성도 측정기(Lab Partnet-Aw, 제조사: Novasina AG)로 측정하였다.

각 시료의 수분 함량과 수분활성도를 측정한 결과는 도 7 내지 8에 나타내었고, 3회 반복 측정 후 SPSS 18.0(SPSS Inc., Chicago, USA) 프로그램으로 통계처리하여 유의성을 확인하였다.

실험예 4. 식빵 3종의 pH 측정

식빵 3종(비교예 3, 실시예 5~6)의 pH는 pH meter(S220-Bio Kit, 제조사: Mettler Toledo)를 이용하여 측정하였다.

각 시료의 pH 측정 결과는 도 9에 나타내었고, 3회 반복 측정 후 SPSS 18.0(SPSS Inc., Chicago, USA) 프로그램으로 통계처리하여 유의성을 확인하였다.

실험예 5. 식빵 3종의 TTA(ml NaOH) 측정

식빵 3종(비교예 3, 실시예 5~6)의 TTA(총 적정 산도)는 pH 6.6에 도달하기까지 소모된 0.1N NaOH의 양(ml)을 측정한 값으로, 도 10에 나타내었다. TTA값 역시 3회 반복 측정 후 SPSS 18.0(SPSS Inc., Chicago, USA) 프로그램으로 통계처리하여 유의성을 확인하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12894P

20201215

<110> LOTTE CONFECTIONERY CO., LTD. <120> Lacticaseibacillus paracasei Strain LRCC5240 for Reduced Fermentation Odor and Increased Volume of Bread, and Uses thereof <130> DP-2020-0743 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1532 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 16s rDNA of LRCC5240 <400> 1 tttttttttt tttttttttt tttctccttc cagatgacgc tggcggcgtg cctaatacat 60 gcaagtcgaa cgagttctcg ttgatgatcg gtgcttgcac cgagattcaa catggaacga 120 gtggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgccctta agtgggggat aacatttgga 180 aacagatgct aataccgcat agatccaaga accgcatggt tcttggctga aagatggcgt 240 aagctatcgc ttttggatgg acccgcggcg tattagctag ttggtgaggt aacggctcac 300 caaggcgatg atacgtagcc gaactgagag gttgatcggc cacattggga ctgagacacg 360 gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg 420 gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttggagaaga 480 atggtcggca gagtaactgt tgtcggcgtg acggtatcca accagaaagc cacggctaac 540 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tatccggatt tattgggcgt 600 aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cctcggctta accgaggaag 660 cgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg 720 tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact 780 gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc 840 gtaaacgatg aatgctaggt gttggagggt ttccgccctt cagtgccgca gctaacgcat 900 taagcattcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 960 ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 1020 ttgacatctt ttgatcacct gagagatcag gtttcccctt cgggggcaaa atgacaggtg 1080 gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1140 acccttatga ctagttgcca gcatttagtt gggcactcta gtaagactgc cggtgacaaa 1200 ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1260 tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga gaccgcgagg tcaagctaat ctcttaaagc 1320 cattctcagt tcggactgta ggctgcaact cgcctacacg aagtcggaat cgctagtaat 1380 cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1440 catgagagtt tgtaacaccc gaagccggtg gcgtaaccct tttagggagc gagccgtcta 1500 aggtgggaca aatgattagg gtgaagtcaa aa 1532

Claims

제빵 시에 발효취가 억제되는 효과를 갖는 기탁번호가 KCCM 12894P인 락티카제이바실러스 파라카제이 (Lacticaseibacillus paracasei ) LRCC5240 균주.
제1항에 있어서,
상기 발효취는 뷰탄산(butanoic acid)로 인해 발생하는 것인, 균주.
삭제
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16S rDNA를 갖는, 균주.
삭제
삭제
삭제
제1항 내지 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 유산균 발효액.
제 8 항에 따른 유산균 발효액을 이용하는 단계를 포함하는 빵의 제조 방법.
제1항 내지 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 빵.