KR20240008070A - 흰점박이꽃무지 유래 신규 진보한 피비2441 균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사이토카인 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능을 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 보이는 기탁번호 KCTC14828BP의 굼벵이 분변 유래 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 및 이를 포함하는 면역 기능 증진용 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 우수한 면역기능 증진 효과를 갖는 신규한 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 굼벵이의 분변으로부터 분리 동정한 우수한 면역기능 증진 효과를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 조성물에 관한 것이다.
인간을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스라고 한다.
이와 같은 프로바이오틱스 중에서 청국장 내지 된장과 같은 콩류의 발효에 이용되어 이와 같은 콩류 발효 식품과 함께 섭취되어 면역 기능을 활성화시키는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 그 성과의 하나로 대한민국 공개특허 공보 제10-2005-0106303호에는 혈전용해능과 면역증강기능이 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CHKJ1339 균주가 개시되어 있다.
그러나 면역증진에 대한 효과가 충분하지 않아서 면역증진용으로 사용하기는 부족한 단점이 있었다.
상기 종래기술의 한계를 극복하여 본 발명은 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12 등) 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능(Phagocytic Activity)을 현저하게 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 보이는 신규한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공하고자 한다,
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은,
사이토카인 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능을 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 보이는 기탁번호 KCTC14828BP의 굼벵이 분변 유래 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 제공한다.
본 발명은 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여,
기탁번호 KCTC14828BP의 굼벵이 분변 유래 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 페이스트화물, 희석물 중 어느 하나를 포함하여 사이토카인 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능을 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 보이는 면역기능 증진용 프로바이오틱스 조성물, 식품 조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 신규한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12 등) 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능(Phagocytic Activity)을 현저하게 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 보이며, 이를 포함하는 프로바이오틱스 조성물은 다양한 식품, 의약품, 건강기능성 식품, 사료 등으로 제조되어 면역기능 증진에 크게 기여할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명은 굼벵이 분변으로부터 분리 동정한 균주가 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12 등) 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능(Phagocytic Activity)을 현저하게 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 가지는 것을 확인하여 완성한 것으로서, 본 발명에 따른 균주는 굼벵이 분변을 배양하여 분리 동정한 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로, 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 실시한 결과 Genome이 99% 이상 일치하여 이를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) PB2441로 명명하였으며, 이를 2021년 12월 15일자로 한국생물공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였으며, 그 이다.
또한, 본 발명은 상기 기탁번호는 KCTC14828BP의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) PB2441 균주 및 이의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물을 포함하는 면역기능 증진용 프로바이틱오스 조성물을 제공하며, 이와 같은 프로바이오틱스 조성물은 식품 내지 의약품에 다양하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 시험예에 의거하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<
시험예
1: 대식세포 사용 면역증진 효능 평가>
1-1) 균주의 세포 독성 평가(
LDH
leakage and
CCK
-8 assay)
마우스 대식세포주 RAW 264.7 cell line을 한국 세포주 은행에서 분양받아 세포 농도가 5Х105 cells/㎖이 되도록 현탁하고, 96-well plate에 100㎕씩 분주하여 시료를 하기 표 1에 나타낸 농도 별로 처리 한 다음 24시간 배양하였다.
세포 독성은 CCK-8 assay kit 및 Cytotoxicity LDH Assay Kit를 이용하여 측정하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 농도 (㎍/ml) |
LDH (Fold of control) (24 hr) |
MTT (% of control) (24 hr) |
|
| 정상군 | - | 1.00±0.02 | 100.0±2.85 |
| PB2441 균주 |
1 | 0.96±0.03 | 98.5±2.74 |
| 10 | 0.98±0.01 | 97.6±2.37 | |
| 100 | 0.97±0.02 | 98.6±3.31 |
상기 표 1에서 보는 바와 같이 마우스 Raw264 .7 대식세포에 1 내지 100㎍/ml의 농도로 24시간 처리한 후 LDH assay와 MTT assay를 수행한 결과 본 발명에 따은 균주에서 세포독성이 나타나지 않았다.
따라서 세포독성이 나타나지 않은 1 내지 100㎍/ml 농도로 이후 실험을 수행하였다.
1-2) 사이토카인
분비능
측정
마우스 대식세포주 RAW 264.7 cell line을 한국 세포주 은행에서 분양받아 세포 농도가 5Х105cells/㎖이 되도록 현탁하여 96-well plate에 100 ㎕씩 분주하였다.
시료를 1㎍/ml, 10㎍/ml, 100㎍/ml의 농도로 처리한 후, TNF-α 3시간, IFN-γ 30시간, IL-1β 30시간, IL-10 20시간, IL-12 20시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액 상층액에서 배양 배지로 분비된 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12)의 양을 ELISA kit(R&D system)를 사용하여 측정하여 측정결과는 하기 표 2에 나타내었다.
| Fold | ||||||
| TNF-α | IFN-γ | IL-1β | IL-10 | IL-12 | ||
| 정상군 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | |
| PB2441 균주 |
1(㎍/ml) | 10.52 | 81.47 | 1.67 | 1.95 | 4.78 |
| 10(㎍/ml) | 15.88 | 115.21 | 2.17 | 2.78 | 7.92 | |
| 100(㎍/ml) | 23.73 | 187.24 | 2.64 | 3.97 | 10.54 | |
상기 표 2의 결과를 보면, 본 발명에 따른 균주는 1, 10 및 100㎍/ml의 농도에서 사이토카인 분비를 현저하게 증가시킨 것으로 확인되었다.
1-3) 대식세포
탐식능
(
Phagocytic
Activity) 측정
마우스 대식세포주 RAW 264.7 cell line을 한국 세포주 은행에서 분양받아 세포 농도가 5Х105[0135] cells/㎖이 되도록 현탁하여 96-well plate에 100 ㎕씩 분주하였다.
시료를 10㎍/ml, 10㎍/ml, 100㎍/ml의 농도로 24시간 처리한 후, 100㎕의 fluorescein-5-isothiocyanate(FITC)-labeled E. coli (Molecular Probe, Eugene, OR, U.S.A.)를 2시간 동안 처리하였다.
이후, 상층액 중에 남아있는 탐식 되지 않은 세포를 세척하여 제거하고, 형광분석기로 FITC를 분석하여 탐식된 E.coli를 측정하였다. 또한, 세포 생존력을 cck-8 assay로 측정하여 대식세포 활성도를 보정하여, 그 결과를 표 3에 나타냈었다.
| 대식세포 탐식능(Phagocytic activity) | ||
| NA | 361.5±2.77 | |
| PB2441 균주 |
1(㎍/ml) | 491.7±2.84 |
| 10(㎍/ml) | 562.3±2.74 | |
| 100(㎍/ml) | 608.9±2.54 | |
상기 표 3에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 균주는 모든 농도에서 Phagocytic Activity를 크게 증가시킨 것으로 확인되었다.
<
시험예
2:
ICR
mouse의 비장 세포 사용 면역증진 효능 평가>
2-1)
ICR
mouse의 비장 세포
증식능
측정
비장 세포를 분리하기 위하여, ICR mouse에서 무균적으로 비장을 적출한 후 RPMI 1640 용액으로 세척하고 분쇄하여 분리된 세포 현탁액을 200 mesh stainless steel sieve에 통과시 후 4℃, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하였다.
cell pellet을 ACK buffer에 5분간 현탁시켜 적혈구를 제거하고, 유출된 비장세포는 10% fetalbovine serum와 1% penicillin-streptomycin을 함유하고 있는 RPMI 1640에 세포의 농도가 1Х105cell/㎖이 되도록 현탁하여 96 well plate에 각각 200㎕씩을 분주하였다.
시료를 10㎍/ml, 10㎍/ml, 100㎍/ml의 농도로 72시간 처리하여 48 시간 동안 배양하고, 비장세포의 증식을 CCK-8 assay kit를 이용하여 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.
| WST-1 (72 hr) | ||
| 정상군 | 100.0±1.8 | |
| PB2441 균주 |
1(㎍/ml) | 122.5±4.1 |
| 10(㎍/ml) | 128.7±3.6 | |
| 100(㎍/ml) | 136.8±5.4 | |
상기 표 4에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 균주는 모든 농도에서 비장 세포 증식률을 현저하게 증가시킨 것으로 확인되었다.
2-
3)사이토카인
분비능
측정
비장 세포의 농도가 5Х105cells/㎖이 되도록 현탁하여 96-well plate에 200 ㎕씩 분주하였다.
시료를 1㎍/ml, 10㎍/ml, 100㎍/ml의 농도로 처리한 후, TNF-α 3시간, IFN-γ 30시간, IL-1β 30시간, IL-10 20시간, IL-12 20시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액 상층액에서 배양 배지로 분비된 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12)의 양을 ELISA kit(R&D system)를 사용하여 측정하였다. 측정결과는 하기 표 5에 나타내었다.
| Fold | ||||||
| TNF-α | IFN-γ | IL-1β | IL-10 | IL-12 | ||
| 정상군 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | |
| PB2441 균주 |
1(㎍/ml) | 124.15 | 598.21 | 2.47 | 4.78 | 21.24 |
| 10(㎍/ml) | 157.21 | 899.35 | 3.25 | 8.74 | 30.85 | |
| 100(㎍/ml) | 195.33 | 1100.77 | 3.87 | 11.77 | 37.14 | |
상기 표 5의 결과를 보면, 본 발명에 따른 균주는 1, 10 및 100 ㎍/ml의 농도에서 사이토카인 분비를 현저하게 증가시킨 것으로 확인되었다.
<
시험예
3: 면역억제제인
Cyclophosphamide
유도 면역억제 동물모델에서 시료의 면역증진 효능 측정(in vivo assay)>
3-1) 실험 방법
6주령 SPF ICR mouse(체중: 20 ± 2 g)를 ㈜ 샘타코로부터 구입하여, 면역억제제인 cyclophosphamide를 80mg/kg 농도로 3일 동안(1회/day) 복강 투여한 후, 시료를 1×108cfu/ml농도로 16일 간 경구로 1 일 1 회 투여하였다.
3-2)
NK
cell 활성도 및 세포증식률 측정
NK cell 활성도는 CCK-8 assay kit를 이용하여 측정하였다. 상기 3-1)의 실험 종료 후 비장을 적출하고, 비장에서 분리한 Splenocytes(1 Х 106cells/mL)를 분리하여 100㎕를 96 well plate에서 배양하였다.
T-cell mitogen인 conA(2㎍/ml)를 처리한 후 target 세포인 YAC-1 cells (1 Х 104cells/mL)을 100 ㎕ 혼합하여 20시간 세포배양기에 배양하였다. 배양 후 CCK-8을 첨가 한 후 4시간 37℃에서 반응시킨 후 Microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한 결과를 표 6에 나타냈으며, 비교예로 바실러스 서브틸리스 ＣＨＫＪ1339균주를 사용하였다.
| Cytotoxicity of Spleen NKcells(%) | Stimulation Index | |
| 정상군 | 41.2±1.7 | 1.35±0.2 |
| Cyclophosphamide | 28.3±1.6 | 0.83±0.1 |
| PB2441 균주 | 40.8±1.8 | 1.31±0.1 |
| ＣＨＫＪ1339균주 | 31.5±1.7 | 1.03±0.1 |
표 6의 결과를 보면, Cyclophosphamide 투여군에서는 정상군과 비교하여 유의성 있게 NK 세포 활성도 및 세포증식 정도가 감소한 반면에 본 발명에 따른 균주 투여군에서는 Cyclophosphamide(CTX) 단독 투여군과 비교하여 현저하게 NK 세포 활성도 및 세포증식능이 증가한 것이 확인되었으며, 특히 비교예의 바실러스 서브틸리스 ＣＨＫＪ1339균주와 비교하였을 때도 현저하게 NK 세포 활성도 및 세포증식능이 증가됨을 알 수 있었다.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 신규한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12 등) 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능(Phagocytic Activity)을 현저하게 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 보이며, 이를 포함하는 프로바이오틱스 조성물은 다양한 식품, 의약품, 건강기능성 식품, 사료 등으로 제조되어 면역기능 증진에 크게 기여할 수 있다.
Claims (5)
- 사이토카인 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능을 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 보이는 기탁번호 KCTC14828BP의 굼벵이 분변 유래 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주.
- 기탁번호 KCTC14828BP의 굼벵이 분변 유래 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 페이스트화물, 희석물 중 어느 하나를 포함하여 사이토카인 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능을 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 보이는 면역기능 증진용 프로바이오틱스 조성물.
- 기탁번호 KCTC14828BP의 굼벵이 분변 유래 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 페이스트화물, 희석물 중 어느 하나를 포함하여 사이토카인 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능을 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 보이는 면역기능 증진용 식품 조성물.
- 기탁번호 KCTC14828BP의 굼벵이 분변 유래 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 페이스트화물, 희석물 중 어느 하나를 포함하여 사이토카인 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능을 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 보이는 면역기능 증진용 건강기능성 식품 조성물.
- 기탁번호 KCTC14828BP의 굼벵이 분변 유래 신규 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주, 이의 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 페이스트화물, 희석물 중 어느 하나를 포함하여 사이토카인 분비, NK cell 활성도 및 세포증식률, 대식세포의 탐식능을 증가시켜 우수한 면역기능 증진 효과를 보이는 면역기능 증진용 사료 조성물.
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| KR1020220084974A KR20240008070A (ko) | 2022-07-11 | 2022-07-11 | 흰점박이꽃무지 유래 신규 진보한 피비2441 균주 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR20050106303A (ko) | 2004-05-04 | 2005-11-09 | 한국식품연구원 | 혈전용해능과 면역세포 활성기능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ｃｈｋｊ1339균주 |
-
2022
- 2022-07-11 KR KR1020220084974A patent/KR20240008070A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050106303A (ko) | 2004-05-04 | 2005-11-09 | 한국식품연구원 | 혈전용해능과 면역세포 활성기능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ｃｈｋｊ1339균주 |
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