CN104328092A - 一种谷胱甘肽合成酶突变体、编码基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种谷胱甘肽合成酶突变体、编码基因及应用，该谷胱甘肽合成酶突变体由序列表中的序列2经点突变所得，所述点突变为在该序列的第128位、第256位及第320位的至少一个突变。本发明通过对谷胱甘肽合成酶基因序列进行突变，最终获得具有高催化活性的谷胱甘肽合成酶突变体。并且该突变体以三磷酸腺苷二钠盐、L-谷氨酸钠、L-半胱氨酸和甘氨酸为底物具有比亲本高出至少50%的谷胱甘肽合成酶催化活性。用固定化谷胱甘肽合成酶突变体制备谷胱甘肽,产生的谷胱甘肽的浓度超过50mM,从而使该谷胱甘肽合成酶突变体可用于工业化生产谷胱甘肽，降低了生产成本，提高了相应产品的市场竞争力。

Description

一种谷胱甘肽合成酶突变体、编码基因及应用
技术领域
 本发明涉及分子生物学与生物技术领域，尤其涉及一种谷胱甘肽合成酶突变体、编码基因及应用。 
背景技术
谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸（glutathione，GSH），是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。 
谷胱甘肽有两种形式：还原型GSH和氧化型GSSG，只有GSH才具有活性，而生物体内的GSSG需还原后才能发挥其重要的生理功能。GSH在自然界中广泛分布于动物、植物和微生物细胞内。GSH在生物体内有着多种重要的生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用。GSH还具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。由于GSH在强化食品风味的同时对人体有保健作用，它的应用前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧化剂。随着GSH的生理生化功能和性质被不断研究发现，GSH作为一种多功能的生物活性添加剂在食品加工业中的应用将会愈来愈广，GSH的需求量正日益增大。 
谷胱甘肽的生产方法主要有提取法、发酵法、酶法及化学合成法。提取法是以谷胱甘肽含量丰富的动、植物和酵母为原料，通过加入适当的溶剂或结合淀粉酶、蛋白酶的处理，再经过多步分离获得。由于天然组织中谷胱甘肽的含量低，仅为干重的0.5~1.0%，以及处理步骤多，使得该方法的总体得率较低。化学合成法生产工艺成熟，但化学合成的谷胱甘肽是D-型和L-型的消旋体，其中，具有生理活性的是L-谷胱甘肽，所以，要想得到有活性的谷胱甘肽需要将化学合成的产物进行光学拆分。此外，化学合成法的步骤多，时间较长，污染大。目前工业规模生产谷胱甘肽的主要方法是发酵法，其中以诱变处理获得高谷胱甘肽含量的酵母变异菌种来生产谷胱甘肽最为常见，但利用酵母菌培养来单独生产谷胱甘肽，存在原料利用率低、成本和能耗高等问题。酶法是指用离体酶催化三种氨基酸L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸形成谷胱甘肽，通常是采用二步酶法，即先用谷氨酰半胱氨酸合成酶将L-谷氨酸和L-半胱氨酸催化合成L-谷氨酰基-L---半胱氨酸, 之后再通过谷胱甘肽合成酶将L-谷氨酰基-L---半胱氨酸与甘氨酸催化合成谷胱甘肽。目前，叶勤等人发现，猪胸膜肺炎放线杆菌等含双功能谷胱甘肽合成酶，与前述二步酶法相比，这些双功能谷胱甘肽合成酶令酶法生产谷胱甘肽工艺变成一步酶法了，效率更高些。但这些双功能谷胱甘肽合成酶效率仍不高，酶法产生的谷胱甘肽浓度较低，致使生产成本高。 
因此，现有技术还有待于改进和发展。 
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种谷胱甘肽合成酶突变体、编码基因及应用，旨在解决现有生产谷胱甘肽工艺中谷胱甘肽合成酶催化活性低、产物谷胱甘肽浓度低及生产成本高的问题。 
本发明的技术方案如下： 
一种谷胱甘肽合成酶突变体，其中，由序列表中的序列2经点突变所得，所述点突变具有选自第128位、第256位及第320位的至少一个突变，并且以三磷酸腺苷二钠盐(ATP)、L-谷氨酸钠、L-半胱氨酸和甘氨酸为底物其具有比亲本高出至少50%的谷胱甘肽合成酶催化活性。
所述的谷胱甘肽合成酶突变体，其中，所述谷胱甘肽合成酶突变体还包括其变体，所述变体包括所述序列2所示氨基酸序列中除第128位、第256位及第320位外的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸形式、氨基端截断形式、羧基端截断形式，及所述序列2的部分或全部串联重复形式。 
所述的谷胱甘肽合成酶突变体，其中，所述点突变具体为：序列2的第128位的谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)。 
所述的谷胱甘肽合成酶突变体，其中，所述点突变具体为：序列2的第256位的丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)。 
所述的谷胱甘肽合成酶突变体，其中，所述点突变具体为：序列2的第320位的亮氨酸(L)突变为赖氨酸(K)。 
所述的谷胱甘肽合成酶突变体，其中，所述谷胱甘肽合成酶突变体具有序列表中序列3或序列4或序列5所示的氨基酸序列。 
一种编码谷胱甘肽合成酶突变体的基因，其含有编码所述谷胱甘肽合成酶突变体的核苷酸序列。 
所述的谷胱甘肽合成酶突变体的应用，其中，所述谷胱甘肽合成酶突变体应用于以三磷酸腺苷二钠盐、L-谷氨酸钠、L-半胱氨酸和甘氨酸为底物制备谷胱甘肽。 
有益效果：本发明提供一种谷胱甘肽合成酶突变体、编码基因及应用，通过对谷胱甘肽合成酶基因序列进行定点突变，最终获得具有高催化活性的谷胱甘肽合成酶突变体。并且该突变体以L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物具有比亲本高出至少50%的谷胱甘肽合成酶催化活性, 产物谷胱甘肽浓度大于50mM，从而使该谷胱甘肽合成酶突变体可用于工业化生产谷胱甘肽，降低了生产成本，提高了相应产品的市场竞争力。 
具体实施方式
本发明提供一种谷胱甘肽合成酶突变体、编码基因及应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 
本发明目的在于提供一种谷胱甘肽合成酶突变体。本发明的另一目的还在于提供一种编码本发明所述的谷胱甘肽合成酶突变体的基因。本发明的再一目的在于将本发明的谷胱甘肽合成酶突变体应用于以L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物催化生成谷胱甘肽。 
为实现本发明的上述目的，本发明人进行了大量深入的实验，通过对谷胱甘肽合成酶基因进行定点突变，PCR扩增后插入适当的载体，随后在培养基上筛选，从而获得了一系列具有高催化活性的谷胱甘肽合成酶突变体，该谷胱甘肽合成酶突变体能以L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物高效催化生成谷胱甘肽。 
具体地，为了获得本发明的谷胱甘肽合成酶突变体，可以利用本领域已知的技术，先构建含有亲本谷胱甘肽合成酶基因的载体质粒，然后设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，再合成适当的引物，以所述的含亲本谷胱甘肽合成酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增DNA片段、装配所扩增的DNA片段以及PCR扩增全长突变基因。然后将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有谷胱甘肽合成酶活性的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变。在确定目的片段插入到载体上后，可通过LB培养基筛选，从而获得具高催化活性的谷胱甘肽合成酶突变体。 
本发明提供了一种谷胱甘肽合成酶突变体，其中，由序列表中的序列2经点突变得到，所述点突变具有选自第128位、第256位及第320位的至少一个突变，并且以三磷酸腺苷二钠盐(ATP)、L-谷氨酸钠、L-半胱氨酸和甘氨酸为底物其具有比亲本高出至少50%的谷胱甘肽合成酶催化活性。 
进一步地，所述谷胱甘肽合成酶突变体还包括其变体，所述变体包括所述序列2所示氨基酸序列中除第128位、第256位及第320位外的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸形式、氨基端截断形式、羧基端截断形式，及所述序列2的部分或全部串联重复形式。 
优选地，所述点突变具体为：所述亲本序列2第128位的谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)，和/或所述亲本序列2第256位的丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)，和/或所述亲本序列2第320位的亮氨酸(L)突变为赖氨酸(K)。亲本序列2第128位的谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)形成序列表中序列3所示的氨基酸序列。亲本序列2第256位的丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)形成如序列表中序列4所示的氨基酸序列。亲本序列2第320位的亮氨酸(L)突变为赖氨酸(K)形成如序列表中序列5所示的氨基酸序列。 
本发明所述的谷胱甘肽合成酶突变体，其中，所述谷胱甘肽合成酶突变体具有序列表中序列3或序列4或序列5所示的氨基酸序列。 
另外，本发明还提供一种基因，其含有编码本发明的谷胱甘肽合成酶突变体的核苷酸序列。 
另外，本发明还涉及谷胱甘肽合成酶突变体的应用，其应用以三磷酸腺苷二钠盐(ATP)、L-谷氨酸钠、L-半胱氨酸和甘氨酸为底物催化制备谷胱甘肽。所述谷胱甘肽合成酶突变体以L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物具有比亲本高出至少50%的谷胱甘肽合成酶催化活性, 催化制得的谷胱甘肽浓度大于50mM。 
进一步地，在上述制备方法中，所适用的载体可以为原核表达载体, 如pRSET和pES21等; 也可以为克隆载体, 如pUC18/19 和pBluscript-SK。 
进一步的，在本发明制备的谷胱甘肽合成酶突变体的方法中，所制得的谷胱甘肽合成酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，当然也可在原核细胞或真核细胞胞外表达。 
进一步地，在本发明制备谷胱甘肽合成酶突变体的方法中，所述载体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述原核细胞可以为大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和链霉菌。所述真核细胞可以为酿酒酵母或毕赤巴斯德酵母。 
进一步地，该突变体可以通过Histag纯化方案进行纯化，经酶活测定后发现本发明的谷胱甘肽合成酶突变体具有比亲本高出至少50%的谷胱甘肽合成酶催化活性。 
此外，本发明提供的谷胱甘肽合成酶突变体的较高催化活性使其可以未经纯化以粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或完全纯化的酶。当然，还可利用固化技术将本发明谷胱甘肽合成酶突变体制成固相酶或固相细胞形式的固化酶。 
本发明的谷胱甘肽合成酶突变体的催化活性较高，即使使用该谷胱甘肽合成酶突变体的粗提物，反应也会以较高的速率进行。另外，本发明的突变体可以在相对较高的温度下用于工业化生产谷胱甘肽，例如40-60℃下生产谷胱甘肽，这样可以保证谷胱甘肽合成酶突变体保持较高的活力，使反应速率保持较高的水平，缩短反应的时间，从而使反应底物因反应时间过长导致的降解得以抑制。 
在本申请文本中所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur. J. Biochem., 138:9-37, 1984)。 
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。 
实施例1 
亲本谷胱甘肽合成酶基因载体质粒的构建：
根据基因库(GenBank NC_015516)基因序列设计引物MP-F和MP-R。用引物对MP-F和MP-R从Melissococcus plutonius ATCC 35311中扩增谷胱甘肽合成酶编码基因。
扩增条件为：20 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1% Triton X-100，50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP，400 nM引物MP-F，400 nM引物MP-R，1.0 U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，用接种环挑取少许Melissococcus plutonius ATCC 35311菌体，再用无菌水调反应体积至50 ml。 
PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，40圈循环： 95℃ 50秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，最后72℃ 10分钟。扩增的产物经限制性内切酶NdeI和AscI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和AscI酶切的载体pRSET-A(源自Invitrogen, USA)连接，得质粒pRSET-MP。经DNA测序，确定该被克隆的谷胱甘肽合成酶的核苷酸序列，具体示于序列表中序列1，相应的氨基酸序列为序列表中的序列2。 
表1 
      实施例2
谷胱甘肽合成酶位点128的定点突变
为了将亲本氨基酸序列中第128位的谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)获得突变体Q128R，以质粒pRSET-MP（见实施例1）为模板，设计引物对128RF和128RR (见表1所示)。
用引物对MP-F和128RR，扩增F-RR片段，引物对128RF和MP-R，扩增RF-R片段。引物MP-F和MP-R的具体序列，见表1所示。 
上述扩增反应条件为：20 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1% Triton X-100，50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP，400 nM引物MP-F和 400 nM引物128RR, 或400 nM引物128RF和 400 nM引物 MP-R，1.5 U Pfu DNA聚合酶 (Promega, USA)，20 ng pRSET-MP，用无菌水调反应体积至50微升。 
PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。 
经1% 琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒 (Promega, USA)回收，分别得到F-RR片段和RF-R片段。然后扩增全长基因。 
扩增反应条件为：20 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1% Triton X-100，50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP, 400 nM引物MP-F和400 nM MP-R，1.5 U Pfu DNA聚合酶，20 ng F-RR片段与20 ng RF-R片段，用无菌水调反应体积至50微升。 
PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，40圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。 
经1% 琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒(Promega, USA)回收，得到全长突变基因Q128R。将 Q128R与载体pRSET-A连接，得质粒pRSET-Q128R。将质粒pRSET-Q128R转入感受态细菌细胞E. coli BL21。经DNA测序确定引入的点突变无误。所得突变体的氨基酸序列见序列表1中的序列3。 
实施例3 
谷胱甘肽合成酶位点256的定点突变
为了将亲本氨基酸序列中第256位点的Ala(A)突变为Ser(S)获得突变体A256S，以实施例1中的质粒pRSET-MP为模板，设计引物对256SF和256SR (见表1所示)。
用引物对MP-F和256SR，扩增F-SR片段，引物对256SF和MP-R，扩增SF-R片段。引物MP-F和MP-R的具体序列见表1所示。 
上述扩增反应条件为：20 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1% Triton X-100，50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP，400 nM引物MP-F和 400 nM引物256SR,或400 nM引物256SF和 400 nM引物 MP-R，1.5 U Pfu DNA聚合酶 (Promega, USA)，20 ng pRSET-MP，用无菌水调反应体积至50微升。 
上述PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。 
经1% 琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒(Promega, USA)回收，分别得到 F-SR片段和SF-R片段。然后扩增全长基因。 
扩增反应条件为：20 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1% Triton X-100，50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP, 400 nM引物MP-F和400 nM MP-R，1.5 U Pfu DNA聚合酶，20 ng F-SR片段与20 ngSF-R 片段，用无菌水调反应体积至50微升。 
PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。 
经1% 琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒(Promega, USA)回收，得到全长突变基因A256S。将A256S与载体pRSET-A连接(见实施例1)，得质粒pRSET-A256S。将质粒pRSET-A256S转入感受态细菌细胞E. coli BL21。经DNA测序确定引入的点突变无误。A256S的氨基酸序列见序列表中的序列4。 
实施例4 
谷胱甘肽合成酶位点320的定点突变
为了将亲本氨基酸序列中第320位点的Leu(L)突变为Lys(K)获得突变体L320K，以实施例1中的质粒pRSET-MP为模板，设计引物对320KF和320KR (见表1所示)。
用引物对MP-F和320KR，扩增F-KR片段，引物对320KF和MP-R，扩增KF-R片段。引物MP-F和MP-R的具体序列见表1所示。 
上述扩增反应条件为：20 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1% Triton X-100，50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP，400 nM引物MP-F和 400 nM引物320KR,或400 nM引物320KF和 400 nM引物 MP-R，1.5 U Pfu DNA聚合酶 (Promega, USA)，20 ng pRSET-MP，用无菌水调反应体积至50微升。 
上述PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。 
经1% 琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒(Promega, USA)回收，分别得到 F-KR片段和KF-R片段。然后扩增全长基因。 
扩增反应条件为：20 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1% Triton X-100，50 mM dATP, 50 mM dTTP, 50 mM dCTP, 50 mM dGTP, 400 nM引物MP-F和400 nM MP-R，1.5 U Pfu DNA聚合酶，20 ng F-KR片段与20 ng KF-R 片段，用无菌水调反应体积至50微升。 
PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，35圈循环：95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分钟，最后72℃ 5分钟。 
经1% 琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒(Promega, USA)回收，得到全长突变基因L320K。将L320K与载体pRSET-A连接(见实施例1)，得质粒pRSET-L320K。将质粒pRSET-L320K转入感受态细菌细胞E. coli BL21。经DNA测序确定引入的点突变无误。L320K的氨基酸序列见序列表中的序列5。 
实施例5 
谷胱甘肽合成酶亲本的提取
谷胱甘肽合成酶的提取与纯化具体过程如下：
将含谷胱甘肽合成酶基因的质粒pRSET-MP转化感受态细菌细胞E. coli HB101，在Luria broth(LB)平板(含100 mg/L卡那霉素)上37℃培养24 小时。接种单个克隆于5 毫升LB液体培养基(含100 mg/L卡那霉素)中于30℃培养20-24小时。离心收集菌体，并悬浮于1毫升100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，17,800 g，10分钟)并收集上清液, 即为粗提蛋白(或称粗提物)。
实施例6 
谷胱甘肽合成酶突变体的提取
谷胱甘肽合成酶的提取与纯化具体过程如下：
将含谷胱甘肽合成酶突变体基因的质粒pRSET-Q128R、pRSET-A256S或pRSET-L320K分别转化感受态细菌细胞E. coli HB101，在Luria broth(LB)平板(含100 mg/L卡那霉素)上37℃培养24 小时。接种单个克隆于5 毫升LB液体培养基(含100 mg/L卡那霉素)中于30℃培养20-24小时。离心收集菌体，并悬浮于1毫升100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，17,800 g，10分钟)并收集上清液, 即为粗提蛋白(或称粗提物)。
实施例7 
谷胱甘肽合成酶活性的测定：
谷胱甘肽合成酶活性的测定参考Bjorn Vergauwen, Dirk De Vos, and Jozef J. Van Beeumen. (2006). J.of Biol. Chem. 281(7):4380-4394.
配制底物溶液: 含5mM的三磷酸腺苷二钠盐(ATP)、50mM L-谷氨酸钠、2mM L-半胱氨酸、20mM甘氨酸、20mM 氯化镁、100mM 氯化钠和200mM Tris盐酸缓冲液, 调pH至7.5。取底物溶液900微升，然后加入100微升谷胱甘肽合成酶粗提蛋白,于30℃进行反应。反应产物每隔1分钟取样50微升进行二次反应, 旨在测定反应产物谷胱甘肽的浓度。 50微升反应产物加入至950微升200mM的磷酸缓冲液(含1mM 二硫硝基苯甲酸、500μM NADPH及1个单位的谷胱甘肽还原酶) 中, 用分光光度计测定412nm吸收峰的增加值。
实施例8 
谷胱甘肽合成酶突变体活性的测定：
配制底物溶液: 含5mM的三磷酸腺苷二钠盐(ATP)、50mM L-谷氨酸钠、2mM L-半胱氨酸、20mM甘氨酸、20mM 氯化镁、100mM 氯化钠和200mM Tris盐酸缓冲液, 调pH至7.5。取底物溶液900微升，然后加入100微升谷胱甘肽合成酶突变体Q128R、A256S或L320K之粗提蛋白,于30℃进行反应。单个突变体Q128R、A256S或L320K的反应产物每隔1分钟取样50微升进行二次反应, 旨在测定反应产物谷胱甘肽的浓度。 50微升反应产物加入至950微升200mM的磷酸缓冲液(含1mM 二硫硝基苯甲酸、500μM NADPH及1个单位的谷胱甘肽还原酶) 中, 用分光光度计测定412nm吸收峰的增加值。结果, 谷胱甘肽合成酶突变体Q128R、A256S和L320K的活力分别比亲本高220%、50%和80%。
实施例9 
谷胱甘肽合成酶突变体固定化
取谷胱甘肽合成酶亲本粗提蛋白，用洗酶缓冲液（0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA, pH7.0溶液）稀释至蛋白含量5-10mg/ml。将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾, pH7.5)等体积混合, 加入环氧型固定化酶载体LX-3000 (10毫克酶/每克载体)，于摇床(转速100rpm)中25℃反应20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5-6次, 得到固定化谷胱甘肽合成酶。
实施例10 
用固定化谷胱甘肽合成酶突变体制备谷胱甘肽
配制底物溶液: 含60mM的三磷酸腺苷二钠盐(ATP)、100mM L-谷氨酸钠、55mM L-半胱氨酸、100mM甘氨酸、60mM 氯化镁、50mM 氯化钠和100mM Tris盐酸缓冲液, 调pH至7.5。每升底物溶液中加入400克固定化谷胱甘肽合成酶突变体Q128R,于37℃进行反应。反应2-6小时后, 按实施例8测定谷胱甘肽的浓度。
结果, 突变体Q128R产生了52mM的谷胱甘肽。 
本发明提供一种谷胱甘肽合成酶突变体、编码基因及应用，通过对谷胱甘肽合成酶基因序列进行定点突变，最终获得具有高催化活性的谷胱甘肽合成酶突变体。并且该突变体以三磷酸腺苷二钠盐(ATP)、L-谷氨酸钠、L-半胱氨酸和甘氨酸为底物具有比亲本高出至少50%的谷胱甘肽合成酶催化活性。用固定化谷胱甘肽合成酶突变体制备谷胱甘肽, 产生的谷胱甘肽的浓度超过50mM, 从而使该谷胱甘肽合成酶突变体可用于工业化生产谷胱甘肽，降低了生产成本，提高了相应产品的市场竞争力。 
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 
SEQUENCE LISTING
 
<110>  邦泰生物工程(深圳)有限公司
 
<120>  谷胱甘肽合成酶突变体及其编码基因和应用
 
<130>  BT-140920-06
 
<160>  2  
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  2274
<212>  DNA
<213>  Melissococcus plutonius ATCC 35311
 
<400>  1
atgaatttta aaagtttatt acaacaaaag aaggtaaaac cttatattct atccgcacgt        60
tttggtttgg aaaaagaaag ccaacgtagt aaaatagatg gtagacttgc aacgacagaa       120
catcctaaag tgctaggaaa ccgttcgtac catccttata tccaaacaga ttttagtgaa       180
acacaaattg agttaattac acctgtagca gattctatcg atgaagtatc tcgttattta       240
tcagcgattc aggaagttgc ctatcgttca ttggaaaagg aagaaatact ttggccactt       300
agtatgccac caaaactgcc agaaaaagat gaagagatta aaattgcaaa attagatgat       360
tttgaggaaa ctttgtatcg acgctattta gctaaaaagt atggcaaacg aaaacagatg       420
attagtggta ttcactttaa ttttgaatat tcaattgatc ttatccagca tatgtttaat       480
gaacaatcag aatttgaaaa aattgaggaa tttaaaaata cattgtacat gaaaatagct       540
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<210>  2
<211>  757
<212>  PRT
<213>  Melissococcus plutonius ATCC 35311
 
<400>  2
Met Asn Phe Lys Ser Leu Leu Gln Gln Lys Lys Val Lys Pro Tyr Ile
1               5                   10                  15     
Leu Ser Ala Arg Phe Gly Leu Glu Lys Glu Ser Gln Arg Ser Lys Ile
            20                  25                  30         
Asp Gly Arg Leu Ala Thr Thr Glu His Pro Lys Val Leu Gly Asn Arg
        35                  40                  45             
Ser Tyr His Pro Tyr Ile Gln Thr Asp Phe Ser Glu Thr Gln Ile Glu
    50                  55                  60                 
Leu Ile Thr Pro Val Ala Asp Ser Ile Asp Glu Val Ser Arg Tyr Leu
65                  70                  75                  80 
Ser Ala Ile Gln Glu Val Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Lys Glu Glu Ile
                85                  90                  95     
Leu Trp Pro Leu Ser Met Pro Pro Lys Leu Pro Glu Lys Asp Glu Glu
            100                 105                 110        
Ile Lys Ile Ala Lys Leu Asp Asp Phe Glu Glu Thr Leu Tyr Arg Gln
        115                 120                 125            
Tyr Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Lys Arg Lys Gln Met Ile Ser Gly Ile
    130                 135                 140                
His Phe Asn Phe Glu Tyr Ser Ile Asp Leu Ile Gln His Met Phe Asn
145                 150                 155                 160
Glu Gln Ser Glu Phe Glu Lys Ile Glu Glu Phe Lys Asn Thr Leu Tyr
                165                 170                 175    
Met Lys Ile Ala Arg Asn Tyr Leu Arg Tyr Arg Trp Leu Ile Thr Tyr
            180                 185                 190        
Leu Phe Gly Ala Ser Pro Val Cys Glu Lys Gly Tyr Phe Thr Glu Gln
        195                 200                 205            
Asp Lys Ser Leu Asn Glu Pro Val Arg Ser Ile Arg Asn Ser Ser Phe
    210                 215                 220                
Gly Tyr Thr Asn Glu Glu Val Ala Ala Val Ser Tyr Ala Ser Leu Lys
225                 230                 235                 240
Asn Tyr Leu Glu Asp Ile His Arg Leu Val Glu Asn Gly Ile Leu Ala
                245                 250                 255    
Lys Glu Lys Glu Phe Tyr Ser Pro Val Arg Leu Arg Gly Gly Lys Gln
            260                 265                 270        
Ile Ser Asp Leu Cys His Thr Gly Ile Arg Tyr Ile Glu Leu Arg Asn
        275                 280                 285            
Leu Asp Leu Asn Pro Phe Thr Ser Leu Gly Ile Asp Glu Asp Thr Leu
    290                 295                 300                
Arg Phe Leu His Ile Phe Leu Leu Tyr Met Leu Trp Thr Glu Glu Leu
305                 310                 315                 320
Glu Thr Pro Asp Glu Trp Ile Met Thr Gly Asn Leu Val Asn Asn Gln
                325                 330                 335    
Ile Ala Leu Met His Pro Phe Gln Ser Ile Asn Leu Leu Ser Glu Gly
            340                 345                 350        
Asp Arg Ile Phe Arg Glu Met Phe Glu Met Leu Asp Glu Leu Glu Leu
        355                 360                 365            
Val Glu Glu Lys Lys Leu Val Asp Met Tyr Tyr Gln Gln Leu Arg Ala
    370                 375                 380                
Pro Glu Thr Thr Ile Ala Gly Lys Met Trp Thr Ile Ile Gln Glu Asn
385                 390                 395                 400
Ser Asn Lys Glu Leu Gly Ile Ile Phe Gly Ser Glu Tyr Gln Ala Ala
                405                 410                 415    
Ile Leu Asn Glu Pro Tyr Gln Leu Thr Gly Phe Gln Gln Met Glu Leu
            420                 425                 430         
Ser Thr Gln Ser Phe Leu Phe Asp Thr Ile Gln Lys Gly Ile Ala Phe
        435                 440                 445            
Glu Ile Leu Asp Glu Gln Glu Gln Phe Leu Lys Leu Thr His Lys Asn
    450                 455                 460                 
His Val Glu Tyr Val Lys Asn Ala Asn Met Thr Ser Lys Asp Ser Tyr
465                 470                 475                 480
Ile Ala Pro Leu Ile Met Gln Asn Lys Thr Val Thr Lys Lys Ile Leu
                485                 490                 495    
Ala Asp Ala Gly Phe Gln Val Pro Val Gly Glu Glu Phe Ile Ser Leu
            500                 505                 510        
Glu Gln Ala Gln Gln Ala Tyr Leu Asp Tyr Glu Asn Lys Ala Phe Val
        515                 520                 525            
Ile Lys Pro Lys Thr Thr Asn Tyr Gly Ile Gly Ile Thr Ile Phe Lys
    530                 535                 540                
His Gly Ala Ser Leu Ala Asp Phe Thr Leu Ala Leu Glu Leu Ala Phe
545                 550                 555                 560
Lys Glu Asp Gln Val Val Ile Ile Glu Glu Phe Leu Glu Gly Thr Glu
                565                 570                 575    
Tyr Arg Phe Phe Val Leu Asp Gly Glu Val Lys Ala Ile Leu Leu Arg
            580                 585                 590        
Ile Pro Ala Asn Val Ile Gly Asp Gly Leu His Thr Val Glu Glu Leu
        595                 600                 605            
Ile Ile Glu Lys Asn Leu Asp Pro Leu Arg Gly Ile Gly His Arg Lys
    610                 615                 620                
Pro Leu Glu Ala Ile Gln Leu Gly Lys Leu Glu Gln Leu Met Leu Lys
625                 630                 635                 640
Glu Gln Ala Leu Ile Ser Val Ser Ile Pro Lys Lys Asp Gln Phe Val
                645                 650                 655    
Tyr Leu Arg Lys Asn Ser Asn Ile Ser Thr Gly Gly Asp Ser Ile Asp
            660                 665                 670        
Val Thr Asp Glu Phe Asn Glu Ser Tyr Lys Lys Leu Ala Val Glu Ala
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Val Gln Ala Leu Gly Ala Lys Ile Cys Gly Ile Asp Phe Ile Leu Ser
    690                 695                 700                
Asp Glu Lys Lys Pro Ile Asn Lys Asn Ser Lys Ser Tyr Gly Ile Ile
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        755                          
                             
              
               
<210>  3
<211>  757
<212>  PRT
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  The Gln residue at position 128 of the parent has been changed to
       Arg.
 
<400>  3               
 
Met Asn Phe Lys Ser Leu Leu Gln Gln Lys Lys Val Lys Pro Tyr Ile
1               5                   10                  15     
Leu Ser Ala Arg Phe Gly Leu Glu Lys Glu Ser Gln Arg Ser Lys Ile
            20                  25                  30         
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    50                  55                  60                 
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Ser Ala Ile Gln Glu Val Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Lys Glu Glu Ile
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Leu Trp Pro Leu Ser Met Pro Pro Lys Leu Pro Glu Lys Asp Glu Glu
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Ile Lys Ile Ala Lys Leu Asp Asp Phe Glu Glu Thr Leu Tyr Arg Arg
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Tyr Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Lys Arg Lys Gln Met Ile Ser Gly Ile
    130                 135                 140                
His Phe Asn Phe Glu Tyr Ser Ile Asp Leu Ile Gln His Met Phe Asn
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Glu Gln Ser Glu Phe Glu Lys Ile Glu Glu Phe Lys Asn Thr Leu Tyr
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Met Lys Ile Ala Arg Asn Tyr Leu Arg Tyr Arg Trp Leu Ile Thr Tyr
            180                 185                 190        
Leu Phe Gly Ala Ser Pro Val Cys Glu Lys Gly Tyr Phe Thr Glu Gln
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Asp Lys Ser Leu Asn Glu Pro Val Arg Ser Ile Arg Asn Ser Ser Phe
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Gly Tyr Thr Asn Glu Glu Val Ala Ala Val Ser Tyr Ala Ser Leu Lys
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Ile Ser Asp Leu Cys His Thr Gly Ile Arg Tyr Ile Glu Leu Arg Asn
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Leu Asp Leu Asn Pro Phe Thr Ser Leu Gly Ile Asp Glu Asp Thr Leu
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Arg Phe Leu His Ile Phe Leu Leu Tyr Met Leu Trp Thr Glu Glu Leu
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465                 470                 475                 480
Ile Ala Pro Leu Ile Met Gln Asn Lys Thr Val Thr Lys Lys Ile Leu
                485                 490                 495    
Ala Asp Ala Gly Phe Gln Val Pro Val Gly Glu Glu Phe Ile Ser Leu
            500                 505                 510        
Glu Gln Ala Gln Gln Ala Tyr Leu Asp Tyr Glu Asn Lys Ala Phe Val
        515                 520                 525            
Ile Lys Pro Lys Thr Thr Asn Tyr Gly Ile Gly Ile Thr Ile Phe Lys
    530                 535                 540                
His Gly Ala Ser Leu Ala Asp Phe Thr Leu Ala Leu Glu Leu Ala Phe
545                 550                 555                 560
Lys Glu Asp Gln Val Val Ile Ile Glu Glu Phe Leu Glu Gly Thr Glu
                565                 570                 575    
Tyr Arg Phe Phe Val Leu Asp Gly Glu Val Lys Ala Ile Leu Leu Arg
            580                 585                 590        
Ile Pro Ala Asn Val Ile Gly Asp Gly Leu His Thr Val Glu Glu Leu
        595                 600                 605            
Ile Ile Glu Lys Asn Leu Asp Pro Leu Arg Gly Ile Gly His Arg Lys
    610                 615                 620                
Pro Leu Glu Ala Ile Gln Leu Gly Lys Leu Glu Gln Leu Met Leu Lys
625                 630                 635                 640
Glu Gln Ala Leu Ile Ser Val Ser Ile Pro Lys Lys Asp Gln Phe Val
                645                 650                 655    
Tyr Leu Arg Lys Asn Ser Asn Ile Ser Thr Gly Gly Asp Ser Ile Asp
            660                 665                 670        
Val Thr Asp Glu Phe Asn Glu Ser Tyr Lys Lys Leu Ala Val Glu Ala
        675                 680                 685             
Val Gln Ala Leu Gly Ala Lys Ile Cys Gly Ile Asp Phe Ile Leu Ser
    690                 695                 700                
Asp Glu Lys Lys Pro Ile Asn Lys Asn Ser Lys Ser Tyr Gly Ile Ile
705                 710                 715                 720
Glu Ala Asn Phe Asn Pro Ala Met Tyr Met His Ile Tyr Pro Tyr Lys
                725                 730                 735    
Gly Lys Gly Arg Pro Leu Thr Met Glu Val Leu Lys Phe Leu Tyr Pro
            740                 745                 750        
Glu Leu Asn Glu Gln           
        755                         
 
  
 
<210>  4
<211>  757
<212>  PRT
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  The Ala residue at position 256 of the parent has been changed to
       Ser.
 
<400>  4               
 
Met Asn Phe Lys Ser Leu Leu Gln Gln Lys Lys Val Lys Pro Tyr Ile
1               5                   10                  15     
Leu Ser Ala Arg Phe Gly Leu Glu Lys Glu Ser Gln Arg Ser Lys Ile
            20                  25                  30         
Asp Gly Arg Leu Ala Thr Thr Glu His Pro Lys Val Leu Gly Asn Arg
        35                  40                  45             
Ser Tyr His Pro Tyr Ile Gln Thr Asp Phe Ser Glu Thr Gln Ile Glu
    50                  55                  60                 
Leu Ile Thr Pro Val Ala Asp Ser Ile Asp Glu Val Ser Arg Tyr Leu
65                  70                  75                  80 
Ser Ala Ile Gln Glu Val Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Lys Glu Glu Ile
                85                  90                  95     
Leu Trp Pro Leu Ser Met Pro Pro Lys Leu Pro Glu Lys Asp Glu Glu
            100                 105                 110        
Ile Lys Ile Ala Lys Leu Asp Asp Phe Glu Glu Thr Leu Tyr Arg Gln
        115                 120                 125            
Tyr Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Lys Arg Lys Gln Met Ile Ser Gly Ile
    130                 135                 140                
His Phe Asn Phe Glu Tyr Ser Ile Asp Leu Ile Gln His Met Phe Asn
145                 150                 155                 160
Glu Gln Ser Glu Phe Glu Lys Ile Glu Glu Phe Lys Asn Thr Leu Tyr
                165                 170                 175    
Met Lys Ile Ala Arg Asn Tyr Leu Arg Tyr Arg Trp Leu Ile Thr Tyr
            180                 185                 190        
Leu Phe Gly Ala Ser Pro Val Cys Glu Lys Gly Tyr Phe Thr Glu Gln
        195                 200                 205            
Asp Lys Ser Leu Asn Glu Pro Val Arg Ser Ile Arg Asn Ser Ser Phe
    210                 215                 220                
Gly Tyr Thr Asn Glu Glu Val Ala Ala Val Ser Tyr Ala Ser Leu Lys
225                 230                 235                 240
Asn Tyr Leu Glu Asp Ile His Arg Leu Val Glu Asn Gly Ile Leu Ser
                245                 250                 255    
Lys Glu Lys Glu Phe Tyr Ser Pro Val Arg Leu Arg Gly Gly Lys Gln
            260                 265                 270         
Ile Ser Asp Leu Cys His Thr Gly Ile Arg Tyr Ile Glu Leu Arg Asn
        275                 280                 285            
Leu Asp Leu Asn Pro Phe Thr Ser Leu Gly Ile Asp Glu Asp Thr Leu
    290                 295                 300                 
Arg Phe Leu His Ile Phe Leu Leu Tyr Met Leu Trp Thr Glu Glu Leu
305                 310                 315                 320
Glu Thr Pro Asp Glu Trp Ile Met Thr Gly Asn Leu Val Asn Asn Gln
                325                 330                 335    
Ile Ala Leu Met His Pro Phe Gln Ser Ile Asn Leu Leu Ser Glu Gly
            340                 345                 350        
Asp Arg Ile Phe Arg Glu Met Phe Glu Met Leu Asp Glu Leu Glu Leu
        355                 360                 365            
Val Glu Glu Lys Lys Leu Val Asp Met Tyr Tyr Gln Gln Leu Arg Ala
    370                 375                 380                
Pro Glu Thr Thr Ile Ala Gly Lys Met Trp Thr Ile Ile Gln Glu Asn
385                 390                 395                 400
Ser Asn Lys Glu Leu Gly Ile Ile Phe Gly Ser Glu Tyr Gln Ala Ala
                405                 410                 415    
Ile Leu Asn Glu Pro Tyr Gln Leu Thr Gly Phe Gln Gln Met Glu Leu
            420                 425                 430        
Ser Thr Gln Ser Phe Leu Phe Asp Thr Ile Gln Lys Gly Ile Ala Phe
        435                 440                 445            
Glu Ile Leu Asp Glu Gln Glu Gln Phe Leu Lys Leu Thr His Lys Asn
    450                 455                 460                
His Val Glu Tyr Val Lys Asn Ala Asn Met Thr Ser Lys Asp Ser Tyr
465                 470                 475                 480
Ile Ala Pro Leu Ile Met Gln Asn Lys Thr Val Thr Lys Lys Ile Leu
                485                 490                 495    
Ala Asp Ala Gly Phe Gln Val Pro Val Gly Glu Glu Phe Ile Ser Leu
            500                 505                 510        
Glu Gln Ala Gln Gln Ala Tyr Leu Asp Tyr Glu Asn Lys Ala Phe Val
        515                 520                 525            
Ile Lys Pro Lys Thr Thr Asn Tyr Gly Ile Gly Ile Thr Ile Phe Lys
    530                 535                 540                
His Gly Ala Ser Leu Ala Asp Phe Thr Leu Ala Leu Glu Leu Ala Phe
545                 550                 555                 560
Lys Glu Asp Gln Val Val Ile Ile Glu Glu Phe Leu Glu Gly Thr Glu
                565                 570                 575    
Tyr Arg Phe Phe Val Leu Asp Gly Glu Val Lys Ala Ile Leu Leu Arg
            580                 585                 590        
Ile Pro Ala Asn Val Ile Gly Asp Gly Leu His Thr Val Glu Glu Leu
        595                 600                 605            
Ile Ile Glu Lys Asn Leu Asp Pro Leu Arg Gly Ile Gly His Arg Lys
    610                 615                 620                
Pro Leu Glu Ala Ile Gln Leu Gly Lys Leu Glu Gln Leu Met Leu Lys
625                 630                 635                 640
Glu Gln Ala Leu Ile Ser Val Ser Ile Pro Lys Lys Asp Gln Phe Val
                645                 650                 655    
Tyr Leu Arg Lys Asn Ser Asn Ile Ser Thr Gly Gly Asp Ser Ile Asp
            660                 665                 670        
Val Thr Asp Glu Phe Asn Glu Ser Tyr Lys Lys Leu Ala Val Glu Ala
        675                 680                 685            
Val Gln Ala Leu Gly Ala Lys Ile Cys Gly Ile Asp Phe Ile Leu Ser
    690                 695                 700                
Asp Glu Lys Lys Pro Ile Asn Lys Asn Ser Lys Ser Tyr Gly Ile Ile
705                 710                 715                 720
Glu Ala Asn Phe Asn Pro Ala Met Tyr Met His Ile Tyr Pro Tyr Lys
                725                 730                 735     
Gly Lys Gly Arg Pro Leu Thr Met Glu Val Leu Lys Phe Leu Tyr Pro
            740                 745                 750        
Glu Leu Asn Glu Gln           
        755                            
  
 
<210>  5
<211>  757
<212>  PRT
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  The Leu residue at position 320 of the parent has been changed to
       Lys.
 
<400>  5               
 
Met Asn Phe Lys Ser Leu Leu Gln Gln Lys Lys Val Lys Pro Tyr Ile
1               5                   10                  15     
Leu Ser Ala Arg Phe Gly Leu Glu Lys Glu Ser Gln Arg Ser Lys Ile
            20                  25                  30         
Asp Gly Arg Leu Ala Thr Thr Glu His Pro Lys Val Leu Gly Asn Arg
        35                  40                  45              
Ser Tyr His Pro Tyr Ile Gln Thr Asp Phe Ser Glu Thr Gln Ile Glu
    50                  55                  60                 
Leu Ile Thr Pro Val Ala Asp Ser Ile Asp Glu Val Ser Arg Tyr Leu
65                  70                  75                  80 
Ser Ala Ile Gln Glu Val Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Lys Glu Glu Ile
                85                  90                  95     
Leu Trp Pro Leu Ser Met Pro Pro Lys Leu Pro Glu Lys Asp Glu Glu
            100                 105                 110        
Ile Lys Ile Ala Lys Leu Asp Asp Phe Glu Glu Thr Leu Tyr Arg Gln
        115                 120                 125            
Tyr Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Lys Arg Lys Gln Met Ile Ser Gly Ile
    130                 135                 140                
His Phe Asn Phe Glu Tyr Ser Ile Asp Leu Ile Gln His Met Phe Asn
145                 150                 155                 160
Glu Gln Ser Glu Phe Glu Lys Ile Glu Glu Phe Lys Asn Thr Leu Tyr
                165                 170                 175    
Met Lys Ile Ala Arg Asn Tyr Leu Arg Tyr Arg Trp Leu Ile Thr Tyr
            180                 185                 190        
Leu Phe Gly Ala Ser Pro Val Cys Glu Lys Gly Tyr Phe Thr Glu Gln
        195                 200                 205            
Asp Lys Ser Leu Asn Glu Pro Val Arg Ser Ile Arg Asn Ser Ser Phe
    210                 215                 220                
Gly Tyr Thr Asn Glu Glu Val Ala Ala Val Ser Tyr Ala Ser Leu Lys
225                 230                 235                 240
Asn Tyr Leu Glu Asp Ile His Arg Leu Val Glu Asn Gly Ile Leu Ala
                245                 250                 255    
Lys Glu Lys Glu Phe Tyr Ser Pro Val Arg Leu Arg Gly Gly Lys Gln
            260                 265                 270        
Ile Ser Asp Leu Cys His Thr Gly Ile Arg Tyr Ile Glu Leu Arg Asn
        275                 280                 285            
Leu Asp Leu Asn Pro Phe Thr Ser Leu Gly Ile Asp Glu Asp Thr Leu
    290                 295                 300                
Arg Phe Leu His Ile Phe Leu Leu Tyr Met Leu Trp Thr Glu Glu Lys
305                 310                 315                 320
Glu Thr Pro Asp Glu Trp Ile Met Thr Gly Asn Leu Val Asn Asn Gln
                325                 330                 335    
Ile Ala Leu Met His Pro Phe Gln Ser Ile Asn Leu Leu Ser Glu Gly
            340                 345                 350         
Asp Arg Ile Phe Arg Glu Met Phe Glu Met Leu Asp Glu Leu Glu Leu
        355                 360                 365            
Val Glu Glu Lys Lys Leu Val Asp Met Tyr Tyr Gln Gln Leu Arg Ala
    370                 375                 380                 
Pro Glu Thr Thr Ile Ala Gly Lys Met Trp Thr Ile Ile Gln Glu Asn
385                 390                 395                 400
Ser Asn Lys Glu Leu Gly Ile Ile Phe Gly Ser Glu Tyr Gln Ala Ala
                405                 410                 415    
Ile Leu Asn Glu Pro Tyr Gln Leu Thr Gly Phe Gln Gln Met Glu Leu
            420                 425                 430        
Ser Thr Gln Ser Phe Leu Phe Asp Thr Ile Gln Lys Gly Ile Ala Phe
        435                 440                 445            
Glu Ile Leu Asp Glu Gln Glu Gln Phe Leu Lys Leu Thr His Lys Asn
    450                 455                 460                
His Val Glu Tyr Val Lys Asn Ala Asn Met Thr Ser Lys Asp Ser Tyr
465                 470                 475                 480
Ile Ala Pro Leu Ile Met Gln Asn Lys Thr Val Thr Lys Lys Ile Leu
                485                 490                 495    
Ala Asp Ala Gly Phe Gln Val Pro Val Gly Glu Glu Phe Ile Ser Leu
            500                 505                 510        
Glu Gln Ala Gln Gln Ala Tyr Leu Asp Tyr Glu Asn Lys Ala Phe Val
        515                 520                 525            
Ile Lys Pro Lys Thr Thr Asn Tyr Gly Ile Gly Ile Thr Ile Phe Lys
    530                 535                 540                
His Gly Ala Ser Leu Ala Asp Phe Thr Leu Ala Leu Glu Leu Ala Phe
545                 550                 555                 560
Lys Glu Asp Gln Val Val Ile Ile Glu Glu Phe Leu Glu Gly Thr Glu
                565                 570                 575    
Tyr Arg Phe Phe Val Leu Asp Gly Glu Val Lys Ala Ile Leu Leu Arg
            580                 585                 590        
Ile Pro Ala Asn Val Ile Gly Asp Gly Leu His Thr Val Glu Glu Leu
        595                 600                 605            
Ile Ile Glu Lys Asn Leu Asp Pro Leu Arg Gly Ile Gly His Arg Lys
    610                 615                 620                
Pro Leu Glu Ala Ile Gln Leu Gly Lys Leu Glu Gln Leu Met Leu Lys
625                 630                 635                 640
Glu Gln Ala Leu Ile Ser Val Ser Ile Pro Lys Lys Asp Gln Phe Val
                645                 650                 655    
Tyr Leu Arg Lys Asn Ser Asn Ile Ser Thr Gly Gly Asp Ser Ile Asp
            660                 665                 670        
Val Thr Asp Glu Phe Asn Glu Ser Tyr Lys Lys Leu Ala Val Glu Ala
        675                 680                 685            
Val Gln Ala Leu Gly Ala Lys Ile Cys Gly Ile Asp Phe Ile Leu Ser
    690                 695                 700                
Asp Glu Lys Lys Pro Ile Asn Lys Asn Ser Lys Ser Tyr Gly Ile Ile
705                 710                 715                 720
Glu Ala Asn Phe Asn Pro Ala Met Tyr Met His Ile Tyr Pro Tyr Lys
                725                 730                 735    
Gly Lys Gly Arg Pro Leu Thr Met Glu Val Leu Lys Phe Leu Tyr Pro
            740                 745                 750        
Glu Leu Asn Glu Gln           
        755                         

Claims (8)

1.一种谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，由序列表中的序列2经点突变所得，所述点突变具有选自第128位、第256位及第320位的至少一个突变，并且以三磷酸腺苷二钠盐(ATP)、L-谷氨酸钠、L-半胱氨酸和甘氨酸为底物其具有比亲本高出至少50%的谷胱甘肽合成酶催化活性。
2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶突变体还包括其变体，所述变体包括对序列2所示氨基酸序列中除第128位、第256位及第320位外的其它位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸形式、氨基端截断形式、羧基端截断形式，及所述序列2的部分或全部串联重复形式。
3.根据权利要求1所述的谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，所述点突变具体为：序列2的第128位的谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)。
4.根据权利要求1所述的谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，所述点突变具体为：序列2的第256位的丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S)。
5.根据权利要求1所述的谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，所述点突变具体为：序列2的第320位的亮氨酸(L)突变为赖氨酸(K)。
6.根据权利要求1所述的谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶突变体具有序列表中序列3或序列4或序列5所示的氨基酸序列。
7.一种编码谷胱甘肽合成酶突变体的基因，其特征在于，其含有编码权利要求1-6任一项所述的谷胱甘肽合成酶突变体的核苷酸序列。
8.根据权利要求1-6任一项所述的谷胱甘肽合成酶突变体的应用，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶突变体应用于以三磷酸腺苷二钠盐、L-谷氨酸钠、L-半胱氨酸和甘氨酸为底物制备谷胱甘肽。
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