CN117417915A - Prpp合成酶突变体及其在高效合成nad及nadp辅酶中的应用 - Google Patents
Prpp合成酶突变体及其在高效合成nad及nadp辅酶中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117417915A CN117417915A CN202311370776.8A CN202311370776A CN117417915A CN 117417915 A CN117417915 A CN 117417915A CN 202311370776 A CN202311370776 A CN 202311370776A CN 117417915 A CN117417915 A CN 117417915A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phosphoribosyl
- pyrophosphate synthetase
- mutant
- seq
- baprs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020000772 Ribose-Phosphate Pyrophosphokinase Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 102000000439 Ribose-phosphate pyrophosphokinase Human genes 0.000 title claims abstract description 48
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 19
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 title abstract description 33
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 title abstract description 6
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims description 48
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 47
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 42
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 39
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 claims description 32
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 24
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 24
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 20
- 108020000161 polyphosphate kinase Proteins 0.000 claims description 20
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 19
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 19
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 19
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 19
- DAYLJWODMCOQEW-TURQNECASA-O NMN(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O2)O)=C1 DAYLJWODMCOQEW-TURQNECASA-O 0.000 claims description 18
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 16
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 16
- 108010064862 Nicotinamide phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 11
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 10
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 10
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 10
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 8
- -1 5-phosphoribosyl Chemical group 0.000 claims description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 7
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 claims description 6
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 claims description 6
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 3
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 2
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N NADP zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims 2
- 102000015532 Nicotinamide phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 81
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 81
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 36
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 31
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 20
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 15
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 102100033223 Nicotinamide phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 13
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 13
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 9
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 9
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 9
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 5-O-phosphono-alpha-D-ribofuranosyl diphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 0.000 description 5
- 101800000628 PDH precursor-related peptide Proteins 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000981399 Aspergillus melleus Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- AAAFZMYJJHWUPN-SOOFDHNKSA-N D-ribose 1,5-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O AAAFZMYJJHWUPN-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N GDP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N guanidine diphosphate Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 2
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- GLSBTKIRCIEEJO-YUZLPWPTSA-N (2s)-2-[[4-[(2,4-diamino-5,6,7,8-tetrahydropteridin-6-yl)methyl-methylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C1NC2=NC(N)=NC(N)=C2NC1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 GLSBTKIRCIEEJO-YUZLPWPTSA-N 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000605111 Cytophaga hutchinsonii Species 0.000 description 1
- 125000000824 D-ribofuranosyl group Chemical group [H]OC([H])([H])[C@@]1([H])OC([H])(*)[C@]([H])(O[H])[C@]1([H])O[H] 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 108010024137 Nicotinamide-Nucleotide Adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000015597 Nicotinamide-nucleotide adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000004235 Orange GGN Substances 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- AVHBSQDUYGGYIU-SOOFDHNKSA-N [(3R,4R,5R)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-3-phosphonooxyoxolan-2-yl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound OC[C@H]1OC(OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1O AVHBSQDUYGGYIU-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000008856 allosteric binding Effects 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 230000008850 allosteric inhibition Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N anthracene-2-sulfonyl chloride Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC(S(=O)(=O)Cl)=CC=C3C=C21 FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 108010084315 endopolyphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1235—Diphosphotransferases (2.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/06—Diphosphotransferases (2.7.6)
- C12Y207/06001—Ribose-phosphate diphosphokinase (2.7.6.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及PRPP合成酶突变体及其在高效合成NAD及NADP辅酶中的应用。本发明构建的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体与野生型酶相比，酶活力提高了1.4～9.8倍，能显著降低酶的使用量，降低发酵容量和成本；且能极大缩短反应时间，降低ADP对酶活的影响，能够满足采用生物酶法制备NAD和NADP的大规模工业化生产的需求，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及PRPP合成酶突变体及其在高效合成NAD及NADP辅酶中的应用。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD)及其磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADP)作为细胞内重要的辅酶，直接参与传递电子，连接柠檬酸循环及电子传递链。它们除了在能量传递上的作用，NAD和NADP还在细胞的氧化还原反应中起到重要的辅助作用。它们能够传递电子，参与多种氧化还原酶的催化反应，以维持细胞内的氧化还原水平及平衡多种酶的活性。此外，它们还在调节细胞信号转导中发挥作用，作为信号分子，与一些特定的酶结合，调节酶的活性与功能，从而影响细胞的生长、分化和凋亡等关键过程，对生物体寿命延长具有重要意义。
NAD和NADP在工业应用上也具有重要作用，它们是许多脱氢酶的辅酶，参与电子间的传递。NAD的酶法合成路线是烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nicotinamidemononucleotide adenylyl transferase，NMNAT)以β-烟酰胺单核苷酸(Nicotinamidemononuclotide，NMN)及腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)为底物合成NAD。再在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Kinase，NADK)的作用下，将ATP的磷酸基团转移到NAD上，进而生成NADP。但考虑到直接以NMN作为底物，成本过高，因此以NMN作为中间底物，再通过NMNAT和NADK的作用下，合成NAD或NADP。其中NMN生物酶法合成路线之一的途径是磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)以5-磷酸核糖(R5P)和腺苷三磷酸(ATP)为底物，合成中间产物PRPP，再在烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)的作用下，以PRPP和烟酰胺(Nicotinamide，NAM)为底物合成NMN。其中5-磷酸核糖-1α-焦磷酸(Phosphoribosyl diphosphate，PRPP)作为整条催化路线的重要中间体，它广泛存在于生物体内，参与形成糖苷键的取代反应。它是嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的从头合成的重要中间体，也参与嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的补救合成，以及辅因子NAD、四氢甲烷蝶呤和某些氨基糖苷类抗生素的生物合成，因此催化其合成的PRS，是多酶级联催化NAD或NADP的限速酶。
根据来自各种生物体内的PRS氨基酸序列比对显示，不同来源的PRS之间具有一定的相似性。根据不同来源的PRS的氨基酸序列同一性，可以对其进行分类，现报道了三类PRS，它们在活性，变构调节机制和二磷酰基供体特异性方面有所不同。I类PRS是目前研究最多的，也是应用最广泛的，但是该类酶对腺苷二磷酸(ADP)和鸟苷二磷酸(GDP)的反馈抑制敏感，其中ADP的变构抑制最为明显。Ⅱ类PRS缺乏ADP的变构结合位点，但该类酶的活性普遍较低。Ⅲ类PRS主要来源于古生菌，这一类的PRS生理生化特性似乎是I类和II类PRS特性的混合物，但目前研究较少，基本没有相关应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，并将其应用于合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸中，以克服现有技术中存在的磷酸核糖焦磷酸合成酶活性不高，易受到腺苷二磷酸的抑制，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸合成产量不理想的问题。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供了一种磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第111位、第187位、第309位进行单突变或多点联合突变后获得。
本发明旨在以PRPP作为重要中间体，通过多酶级联催化合成最终产物NAD或NADP。本申请选取了I类PRS来自于Bacillus amyloliquefaciens的磷酸核糖焦磷酸合成酶(BaPRS)进行了分子改造，以提高其酶活，并降低反应过程中副产物ADP的抑制作用，减少酶的用量，用于高效合成重要中间体PRPP，从而进一步获得终产物NAD或NDAP。来源于Bacillus amyloliquefaciens的磷酸核糖焦磷酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明针对BaPRS，通过大分子建模技术模拟BaPRS的三维结构，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个位点。选择定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类后，相应的引物由杭州擎科生物有限公司合成，以PRS-pET 28a(+)载体质粒为模板，PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增突变DNA片段，分离纯化，然后以PCR将所得片段扩增为全长突变基因。通过将该全长突变基因克隆到pET-28a(+)载体上并转入DH5α宿主菌中，经培养筛选出具有突变基因载体的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变。筛选得到的阳性质粒转入BL21(DE3)宿主菌中诱导表达，从中筛选出活性有显著提高的突变体。具体的，本发明针对BaPRS，通过大分子建模技术以及通过定点突变来降低蛋白整体结构的自由能来增加蛋白稳定性，通过蛋白结构自由能计算预测出了多个位点，可能与提高稳定性有关。
作为优选，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列突变为下列之一：(1)第111位谷氨酸突变变为天冬氨酸、组氨酸或甲硫氨酸；(2)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、组氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺；(3)第309位赖氨酸突变为精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、亮氨酸；(4)第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；(5)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、第309位赖氨酸突变为组氨酸；(6)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、第309位赖氨酸突变为精氨酸；(7)第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第309位赖氨酸突变为天冬氨酸。
作为优选，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第309位赖氨酸突变为天冬氨酸。
作为优选，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。
作为优选，编码所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.25所示。
第二方面，本发明提供了一种含有编码以上所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的基因的重组载体。
具体地，所述的载体可以为各种表达载体，包括但不限于pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体中的任意一种表达载体，优选质粒pET-28a(+)。
第三方面，本发明提供了一种含有编码以上所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的基因的基因工程菌。
所述基因工程菌的宿主细胞可以为任一种合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或毕赤酵母，优选大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)BL21(DE3)。
第四方面，本发明提供了所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体在合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用。
具体为：将磷酸核糖焦磷酸合成酶突变基因工程菌、烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因工程菌、多聚磷酸激酶工程菌和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶工程菌分别经诱导培养获得的湿菌体用缓冲液重悬并采用超声破碎后的上清液为催化剂，以5-磷酸核糖(R5P)、腺苷三磷酸(ATP)和烟酰胺(NAM)为底物，加入氯化镁和多聚磷酸盐(Polyp)，以pH7.5的缓冲液为反应介质，控制反应体系温度在37℃，进行振荡反应，获得NAD。
作为优选，所述5-磷酸核糖(R5P)加入量以缓冲液体积计为10-120mM，优选90mM；所述腺苷三磷酸(ATP)加入量以缓冲液体积计为10-90mM，优选80mM；所述烟酰胺(NAM)加入量以缓冲液体积计为30-100mM，优选70mM；所述氯化镁加入量以缓冲液体积计为5-50mM，优选35mM；所述多聚磷酸盐加入量以缓冲液体积计为10-70mM，优选55mM；所述缓冲液为pH7.5、50mM磷酸钾缓冲液。
作为优选，所述催化剂按如下方法制备：将磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体基因工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体OD600达0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，26℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体沉淀；收集的湿菌体(优选按100g/L的量)用pH为7.5的50mM磷酸钾缓冲液(PBS)重悬，并使用超声波细胞粉碎机破碎，破碎功率为200W，每工作1s，间歇2s，总共破碎5min；收集细胞裂解液，在4℃、8000rpm离心10min，取上清液，即为粗磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体液。
所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt)基因工程菌的上清液制备方法同磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体基因工程菌的上清液，即为粗烟酰胺磷酸核糖基转移酶液。所述Nampt氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述多聚磷酸激酶(PPK)基因工程菌的上清液制备方法同磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体基因工程菌的上清液，即为粗多聚磷酸激酶液。所述PPK氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)基因工程菌的上清液制备方法同磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体基因工程菌的上清液，即为粗烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶液。所述NMNAT氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
催化剂中：磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体上清液加入量以破碎前湿菌体量计为2-20mg/mL缓冲液，优选5mg/mL；烟酰胺磷酸核糖基转移酶上清液加入量以破碎前湿菌体量计为10-30mg/mL缓冲液，优选20mg/mL。多聚磷酸激酶上清液加入量以破碎前湿菌体量计为5-30mg/mL缓冲液，优选10mg/mL；烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶上清液加入量以破碎前湿菌体量计为5-40mg/mL缓冲液，优选25mg/mL。
第五方面，本发明提供了所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体在合成磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸中的应用。
作为优选，以磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体、烟酰胺磷酸核糖基转移酶、多聚磷酸激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶为催化剂，以5-磷酸核糖、腺苷三磷酸和烟酰胺为底物，加入氯化镁和多聚磷酸盐，以pH7.5的缓冲液为反应介质，在37℃下反应，获得磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
具体为：将磷酸核糖焦磷酸合成酶突变基因工程菌、烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因工程菌、多聚磷酸激酶工程菌、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶工程菌和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶分别经诱导培养获得的湿菌体用缓冲液重悬并采用超声破碎后的上清液为催化剂，以5-磷酸核糖(R5P)、腺苷三磷酸(ATP)和烟酰胺(NAM)为底物，加入氯化镁和多聚磷酸盐(Polyp)，以pH7.5的缓冲液为反应介质，在37℃下反应(优选12h)，获得NADP。
所述5-磷酸核糖(R5P)加入量以缓冲液体积计为10-120mM，优选90mM；所述腺苷三磷酸(ATP)加入量以缓冲液体积计为20-150mM，优选100mM；所述烟酰胺加入量以缓冲液体积计为30-100mM，优选70mM；所述氯化镁加入量以缓冲液体积计为10-90mM，优选55mM；所述多聚磷酸盐加入量以缓冲液体积计为10-100mM，优选70mM；所述缓冲液为pH7.5、50mM磷酸钾缓冲液。
所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(NADK)基因工程菌的上清液制备方法同磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体基因工程菌的上清液，即为粗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶液。所述NADK氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
催化剂中：磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体上清液加入量以破碎前湿菌体量计为2-20mg/mL缓冲液，优选8mg/mL；烟酰胺磷酸核糖基转移酶上清液加入量以破碎前湿菌体量计为10-40mg/mL缓冲液，优选25mg/mL；多聚磷酸激酶上清液加入量以破碎前湿菌体量计为5-30mg/mL缓冲液，优选20mg/mL；烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶上清液加入量以破碎前湿菌体量计为5-40mg/mL缓冲液，优选25mg/mL；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶上清液加入量以破碎前湿菌体量计为5-40mg/mL缓冲液，优选30mg/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明构建的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体与野生型酶相比，酶活力提高了1.4～9.8倍，能显著降低酶的使用量，降低发酵容量和成本；且能极大缩短反应时间，降低ADP对酶活的影响，能够满足采用生物酶法制备NAD和NADP的大规模工业化生产的需求，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例4中制备的含突变体的粗酶液相对酶活。
图2为实施例5中制备的突变体的比酶活。
图3为实施例6中制备的含突变体的粗酶液相对酶活。
图4为实施例6中制备的突变体的比酶活。
图5为实施例7中ATP浓度对突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D和野生型酶活的影响。
图6为实施例7中R5P浓度对突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D和野生型酶活的影响。
图7为实施例7中ADP浓度对突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D和野生型酶活的影响。
图8为实施例9中不同反应体系中NAD产量曲线图。
图9为实施例10中不同反应体系中NADP产量柱状图。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
LB平板组成：10g/L胰蛋白胨、10g/L氯化钠、5g/L酵母提取物、15g/L琼脂，溶剂为水，pH自然。
LB液体培养基组成：10g/L胰蛋白胨、10g/L氯化钠、5g/L酵母提取物，溶剂为水，pH自然。
实施例1：野生型Ecoli.BL21(DE3)-BaPRS的构建
根据GenBank中来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的PRS蛋白序列(BaPRS，GenBank号：ADU02858.1)，针对大肠杆菌密码子偏好性优化，并在序列C端融合一个6His标签，由北京擎科生物公司(中国北京)合成长度为972bp的重组基因BaPRS序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
将重组基因BaPRS插入到pET-28a(+)的T7启动子下，得到表达质粒pET28-BaPRS。将该表达质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，挑取阳性克隆，即为野生型Ecoli.BL21(DE3)-BaPRS，用于表达重组BaPRS。
实施例2：野生型Ecoli.BL21(DE3)-BaPRS的诱导表达及野生型磷酸核糖焦磷酸合成酶的提取
(1)粗酶液：将实施例1获得的野生型Ecoli.BL21(DE3)-BaPRS接种至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体OD600＝0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，26℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有表达重组BaPRS的湿菌体。收集的湿菌体按100g/L的量用pH为7.5的50mM磷酸钾缓冲液(PBS)重悬成菌悬液，并使用超声波细胞粉碎机破碎，破碎功率为200W，每工作1s，间歇2s，总共破碎5min。收集细胞破碎液，在4℃、8000rpm离心10min，取上清，即为粗酶液，后续粗酶液的用量以对应破碎前菌悬液中菌体量计。
(2)纯酶：取5mL粗酶液稀释到40mL磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.2)中，然后上样到GEHealthcare公司的HisTrap HP纯化柱中(10mL柱体积，预先用含500mM氯化钠的pH7.2、20mM磷酸钾缓冲液冲洗)。上样后的纯化柱用100mL清洗缓冲液(500mM氯化钠+50mM咪唑的pH7.2、20mM磷酸钾缓冲液)以0.5mL/min的速度洗脱，除去结合在纯化柱上的杂蛋白。然后用洗脱缓冲液(500mM氯化钠+250mM咪唑的pH7.2、20mM磷酸钾缓冲液)以0.5mL/min的速度洗脱，收集含目的蛋白的洗脱液，再用pH7.2的20mM磷酸钾缓冲液在透析袋(截留分子量为14KDa)中透析48h，取截留液，即为纯酶，纯酶用浓度用碧云天BCA蛋白浓度试剂盒(P0012)测定，后续纯酶的用量以蛋白含量计。
实施例3：酶活的测定
0.25mg实施例2方法制备的粗酶液或0.02mg纯酶、终浓度10mM的腺苷三磷酸(ATP)，终浓度20mM的5-磷酸核糖(R5P)，终浓度18mM的MgCl2加入到0.5mL 50mM的磷酸钾缓冲液中(pH7.5)。反应液在37℃孵育5min后加入1mL 0.2M磷酸水溶液终止反应。最终溶液中的副产物AMP含量用HPLC方法测定。
HPLC所用的仪器为Agilent 1260InfinityⅡ(安捷伦科技有限公司，美国)，配置Agilent 2414紫外检测器，Agilent 1525泵，Agilent 717进样器。色谱柱为XBridge C18column(C18,5μm,4.6×250mm,Waters,California,USA)。流动相速率为1mL/min，紫外检测波长为254nm，流动相为磷酸钾缓冲液(50mM，pH7.0),进样量为10μL，检测时间为9min。以不同浓度的AMP(0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0M和5.0mM)进样得到的峰面积数据，得到AMP浓度与峰面积标准曲线，曲线方程为y＝(x-0.3788)/96.39(R2＝0.995)，其中y为AMP浓度(mM)，x为液相得到AMP峰面积。
酶活定义：一个酶活定义为上述条件下每分钟产生1μmolAMP所需的酶量(前5分钟)。
实施例4：BaPRS突变体的构建和筛选
1、突变体的构建
采用大分子建模技术预测出可能有益的突变位点为E111D(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示)、D187A、K309R。采用实施例1中的pET28-BaPRS质粒为模板，采用Quick-change的突变方法，利用表1中列举的引物，将各个位点的氨基酸进行突变。
表1突变位点及引物
2、突变工程菌及粗酶液
将步骤1突变的质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)，采用实施例2方法制备粗酶液，按实施例3方法测定相对酶活。结果如图1显示，以野生型粗酶液的活力为100％，E111D、K309R突变体酶活提高1.4倍和1.8倍，D187A突变后酶活显著提高，是野生型的3.3倍，证明这些位点对BaPRS活力影响较大，所以这些位点在实施例5中进行了饱和突变研究。
实施例5：饱和突变提高BaPRS的活力
1、定点饱和突变
采用Quick-change的突变方法，以实施例1方法构建的pET28-BaPRS质粒为模板，采用表2引物，选取位点E111、D187、K309进行饱和突变。
表2突变位点及引物
上述中N＝A,T,G,C；K＝G,T；M＝A,C。
2、突变工程菌及粗酶液
将步骤1突变的质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)，采用实施例2方法制备纯酶，按实施例3方法测定酶活。
结果如图2所示，含有E111H(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)、E111M(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示)、D187H(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示)、D187Q(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示)、D187A(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示)、D187T(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示)、K309H(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示)、K309L(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示)、K309R(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示)、K309D(其对应的氨基酸序列如SEQ IDNO.19所示)的单残基突变体酶活有显著提升，是野生型纯酶的2.7～4.1倍。
实施例6：有益突变体组合提高BaPRS的活力
1、双突变
将带有E111H、E111M、D187H、D187Q、D187A、D187T、K309H、K309L、K309R、K309D的单点突变的pET28-BaPRS进行进一步突变，引入其它有益突变突变。采用Quick-change的突变方法，以含有E111H、E111M的单点突变的pET28-BaPRS质粒为模板，采用表3中187位点丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺或309位点精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、亮氨酸突变扩增引物进行突变；以含有D187A、D187H、D187T、D187Q的单点突变的pET28-BaPRS质粒为模板，采用表3中309位点精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、亮氨酸突变扩增引物进突变。
表3突变位点氨基酸及引物
将上述突变的质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)后，如实施例1、2和3进行筛选、表达和纯化。E111H/D187Q(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示)，D187A/K309H(其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示)，D187A/K309R(其对应的氨基酸序列如SEQ IDNO.24所示)。结果如图3所示，带有E111H/D187Q二突变BaPRS有着较高的活性，为野生型的3.9倍。
2、三突变
将带有E111H/D187Q的双位点突变的pET-BaPRS进行进一步突变，引入有益突变309位点，包括精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、亮氨酸，采用Quick-change的突变方法，以含有E111H/D187Q的双位点突变的pET-BaPRS质粒为模板，采用表3中309位点精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、亮氨酸突变扩增引物进突变。
将上述突变的质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)后，如实施例1、2和3进行筛选、表达和纯化。结果如图4所示，带有E111H/D187Q/K309D(其对应的氨基酸序列如SEQ IDNO.26所示，其编码对应的氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示)的三位点突变BaPRS活力显著提高，是野生型纯酶的9.8倍，而带有E111H/D187Q/K309R、E111H/D187Q/K309H、E111H/D187Q/K309L的三位点突变BaPRS酶活较单点或双突变变化不明显。
实施例7：突变体BaPRS的特性分析
我们比较了底物浓度、抑制物ADP浓度对野生型BaPRS和突变型BaPRS/E111H/D187Q/K309D活性的影响。
1、ATP浓度
将实施例1和6方法构建的工程菌E.coli BL21(DE3)-BaPRS和E.coli BL21(DE3)-BaPRS/E111H/D187Q/K309D采用实施例2方法制备纯酶。采用实施例3方法测酶活，并将ATP浓度分别改为0.25mM、0.50mM、1.00mM、1.50mM、2.00mM、3.00mM、5.00mM、7.00mM、10.00mM。
结果见图5所示，野生型BaPRS和突变型BaPRS/E111H/D187Q/K309D在ATP浓度为4.0-6.0mM时达到了最高的相对活性。
2、R5P浓度
将实施例1和6方法构建的工程菌E.coli BL21(DE3)-BaPRS和E.coli BL21(DE3)-BaPRS/E111H/D187Q/K309D采用实施例2方法制备纯酶。采用实施例3方法测酶活，并将R5P浓度分别改为1.00mM、2.00mM、4.00mM、7.50mM、10.00mM、12.00mM、15.00mM、20.00mM。
结果见图6所示，野生型BaPRS的最佳R5P浓度为7.50mM，而突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D在R5P 12.00mM浓度下表现出最高的相对活性，且随着R5P浓度上升，酶活下降较少，表明突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D对R5P具有更高的耐受性。
3、ADP浓度将实施例1和6方法构建的工程菌E.coli BL21(DE3)-BaPRS和E.coliBL21(DE3)-BaPRS/E111H/D187Q/K309D采用实施例2方法制备纯酶。采用实施例3方法测酶活，并额外添加ADP，浓度分别为0.00mM、0.25mM、0.50mM、1.00mM、3.00mM、5.00mM、10.00mM、12.00mM、15.00mM、20.00mM。
结果见图7所示，野生型BaPRS受抑制物ADP影响很大，对ADP的难受能力差，ADP的半抑制浓度约1mM/L,而突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D在1mM/LADP浓度下，活性基本不受到抑制，其半抑制浓度在5mM/L左右，表明突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D提高了对于ADP的耐受性。
实施例8：用纯酶测定野生型BaPRS和突变型BaPRS/E111H/D187Q/K309D的动力学参数。
将实施例1构建的野生型Ecoli.BL21(DE3)-BaPRS和实施例6方法构建的工程菌Ecoli.BL21(DE3)-BaPRS/E111H/D187Q/K309D，采用实施例2方法分别制备野生型BaPRS和突变型BaPRS的纯酶。采用pseudo-one-substrate动力学模型计算Km值与Kcat值。为了分别计算酶对双底物的动力学，采用实施例3方法测试酶活，但反应在固定ATP浓度(10mM)的条件下调整R5P浓度(0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、12.0mM)或在固定R5P浓度(12mM)的条件下调整ATP浓度(0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、7.5、10.0mM)条件下进行。
突变型BaPRS/E111H/D187Q/K309D对ATP和R5P的Km值较野生型BaPRS的Km值显著提高(表4和表5)，说明突变体对底物ATP和R5P的亲和力下降。突变型BaPRS/E111H/D187Q/K309D的酶活性的提高可以解释为其对ATP和R5P的周转数(Kcat值)的增加。突变型BaPRS/E111H/D187Q/K309D对ATP和R5P的周转数(Kcat值)分别是野生型BaPRS的7.1倍和6.8倍。
表4野生型BaPRS和突变型BaPRS/E111H/D187Q/K309D对底物ATP的动力学参数
表5野生型BaPRS和突变型BaPRS/E111H/D187Q/K309D对底物R5P的动力学参数
实施例9：突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D在NAD生物合成中的应用
1、烟酰胺磷酸核糖基转移酶粗酶液由磷酸核糖焦磷酸合成酶、烟酰胺磷酸核糖基转移酶可以催化5-磷酸核糖(R5P)生物合成中间底物烟酰胺单核苷酸(NMN)，因此以来自松树噬几丁质菌(Chitinophagapinensis)的烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt，GenBank号：WP_012788281.1)氨基酸序列为模板，人工合成针对大肠杆菌密码子优化了的烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
将针对大肠杆菌密码子优化了的重组基因Nampt(SEQ ID NO.3所示)插入到pET-28a(+)的T7启动子下，得到表达质粒pET28-Nampt。将该表达质粒转化至大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，挑取阳性克隆，即为野生型E.coli BL21(DE3)-Nampt，用于表达重组Nampt。与实施例2中相同条件制备粗酶液，其中的Nampt的使用量以对应破碎前菌体量计。
同时为降低成本，减少ATP的使用量，引入了ATP循环系统，多聚磷酸激酶(Polyphosphate Kinase,PPK),因此以来自哈氏嗜纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)的多聚磷酸激酶(PPK，GenBank号：ABG57400.1)氨基酸序列为模板，人工合成针对大肠杆菌密码子优化了的多聚磷酸激酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
将针对大肠杆菌密码子优化了的重组基因PPK(SEQ ID NO.5所示)插入到pET-28a(+)的T7启动子下，得到表达质粒pET28-PPK。将该表达质粒转化至大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，挑取阳性克隆，即为野生型E.coli BL21(DE3)-PPK，用于表达重组PPK。与实施例2中相同条件制备粗酶液，其中的PPK的使用量以对应破碎前菌体量计。
由烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶可以催化NMN和ATP生物合成NAD，因此以来自蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT，GenBank号：XM_046087277.1)氨基酸序列为模板，人工合成针对大肠杆菌密码子优化了的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
将针对大肠杆菌密码子优化了的重组基因NMNAT(SEQ ID NO.7所示)插入到pET-28a(+)的T7启动子下，得到表达质粒pET28-NMNAT。将该表达质粒转化至大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，挑取阳性克隆，即为野生型E.coli BL21(DE3)-NMNAT，用于表达重组NMNAT。与实施例2中相同条件制备粗酶液，其中的NMNAT的使用量以对应破碎前菌体量计。
2、酶法合成NAD
反应1(野生型BaPRS)：在0.5mL磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.5)中加入终浓度90mM的R5P、70Mm的Nam、终浓度80mM的ATP、终浓度35mM氯化镁、终浓度55mMPolyp、5mg/mL的PRS粗酶液、20mg/mL的Nampt粗酶液、10mg/mL的PPK粗酶液、25mg/mL的NMNAT粗酶液，在37℃反应12h，在0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h取样进行HPLC分析。
HPLC检测NAD的仪器为Agilent 1260InfinityⅡ(安捷伦科技有限公司，美国)，配置Dionex ED40 detector检测器。Agilent 1525泵，Agilent 717进样器，色谱柱为XBridgeC18column(C18,5μm,4.6×250mm,Waters,California,USA)。流动相速率为0.6mL/min，紫外检测波长为254nm，流动相为10％甲醇:90％磷酸二氢钠(50mM),进样量为10μL，检测时间为9min。NAD浓度与峰面积标准曲线获得方法：以不同浓度的NAD水溶液(0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM和5.0mM)进样得到的峰面积数据，得到NAD浓度与峰面积标准曲线，曲线方程为y＝(x-6.436)/123.07(R2＝0.9998)，其中y为NAD的浓度(mM)，x为NAD的峰面积。用该标准曲线计算多酶级联催化生成NAD产量。如图8所示，12小时后NAD产量达到31mM。
反应2(突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D)：在反应1中加入5mg/mL的实施例6方法制备的突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D粗酶液，其他操作相同，结果见图8所示，当高活性突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D被引入NAD合成，12小时后NAD的产量提升到52mM，较野生型提高1.7倍。
实施例10：突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D在NADP酶法合成中的应用1、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶粗酶液由于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶可以催化ATP和NAD生物合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，因此以来自大肠杆菌K-12MG1655(scherichia colistr.K-12substr.MG1655)的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(NADK，GenBank号：NC_000913.3)氨基酸序列为模板，人工合成针对大肠杆菌密码子优化了的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
将针对大肠杆菌密码子优化了的重组基因NADK(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)插入到pET-28a(+)的T7启动子下，得到表达质粒pET28-NADK。将该表达质粒转化至大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，挑取阳性克隆，即为野生型E.coli BL21(DE3)-NADK，用于表达重组NADK。与实施例2中相同条件制备粗酶液，其中NADK粗酶液的使用量以对应破碎前菌体量计。
2、酶法合成NADP
反应1(野生型BaPRS)：在10mL磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.5)中加入终浓度100mMATP、终浓度90mMR5P、终浓度70mM烟酰胺、终浓度55mM氯化镁、终浓度70mM Polyp、终浓度8mg/mL的PRS粗酶液、25mg/mL的Nampt粗酶液、20mg/mL的PPK粗酶液、25mg/mL的NMNAT粗酶液和30mg/mL的NADK粗酶液，在37℃反应12h。采用实例9中HPLC方法检测(NADP保留时间为7.5分钟)。NADP浓度与峰面积标准曲线获得方法：以不同浓度的NADP水溶液(0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM和5.0mM)进样得到的峰面积数据，得到NADP浓度与峰面积标准曲线，曲线方程为y＝(x-7.634)/113.56(R2＝0.997)，其中y为NADP的浓度(mM)，x为NADP的峰面积。用该标准曲线计算多酶级联催化生成NADP产量。如图9所示，12小时后NADP产量达到28mM。
反应2(突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D)：在反应1中加入8mg/mL的实施例6方法制备的突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D粗酶液，其他操作相同，结果见图9所示，当高活性突变体BaPRS/E111H/D187Q/K309D被引入NADP合成，12小时后NADP的产量提升到62mM，较野生型提高2.2倍。
Claims (10)
1.一种磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第111位、第187位、第309位进行单突变或多点联合突变后获得。
2.如权利要求1所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列突变为下列之一：(1)第111位谷氨酸突变变为天冬氨酸、组氨酸或甲硫氨酸；(2)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、组氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺；(3)第309位赖氨酸突变为精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、亮氨酸；(4)第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；(5)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、第309位赖氨酸突变为组氨酸；(6)第187位天冬氨酸突变为丙氨酸、第309位赖氨酸突变为精氨酸；(7)第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第309位赖氨酸突变为天冬氨酸。
3.如权利要求1或2所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第111位谷氨酸突变为组氨酸、第187位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第309位赖氨酸突变为天冬氨酸。
4.如权利要求3所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。
5.如权利要求4所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体，其特征在于，编码所述磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
6.一种含有编码如权利要求1～5中任意一项所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的基因的重组载体。
7.一种含有编码如权利要求1～5中任意一项所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体的基因的基因工程菌。
8.权利要求1～5中任意一项所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体在合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用。
9.权利要求1～5中任意一项所述的磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体在合成磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，以磷酸核糖焦磷酸合成酶突变体、烟酰胺磷酸核糖基转移酶、多聚磷酸激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶为催化剂，以5-磷酸核糖、腺苷三磷酸和烟酰胺为底物，加入氯化镁和多聚磷酸盐，以pH7.5的缓冲液为反应介质，在37℃下反应，获得磷酸化物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311370776.8A CN117417915A (zh) | 2023-10-23 | 2023-10-23 | Prpp合成酶突变体及其在高效合成nad及nadp辅酶中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311370776.8A CN117417915A (zh) | 2023-10-23 | 2023-10-23 | Prpp合成酶突变体及其在高效合成nad及nadp辅酶中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117417915A true CN117417915A (zh) | 2024-01-19 |
Family
ID=89524201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311370776.8A Pending CN117417915A (zh) | 2023-10-23 | 2023-10-23 | Prpp合成酶突变体及其在高效合成nad及nadp辅酶中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117417915A (zh) |
-
2023
- 2023-10-23 CN CN202311370776.8A patent/CN117417915A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7388396B2 (ja) | ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法およびその方法に用いる形質転換体 | |
| CN111718915B (zh) | 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体、包含该突变体的重组表达载体和重组菌及应用 | |
| CN112795606B (zh) | 一种β-烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法 | |
| KR102621632B1 (ko) | Ｎａｄｐｈ 의존성 아세톨 리덕타제 및 개선된 ｎａｄｐｈ 공급에 기반한 １,２-프로판디올의 생산을 위한 신규한 미생물 및 방법 | |
| KR20150127034A (ko) | 대사 공학을 통한 에르고티오네인 생성 | |
| CN109609474A (zh) | 一种氨基酸脱氢酶突变体及其在合成l-草铵膦中的应用 | |
| CN113186142B (zh) | 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株 | |
| CN114606213B (zh) | 一种多聚磷酸激酶突变体、工程菌及其应用 | |
| CN113265382B (zh) | 多聚磷酸激酶突变体 | |
| Wang et al. | Semi-rationally engineered variants of S-adenosylmethionine synthetase from Escherichia coli with reduced product inhibition and improved catalytic activity | |
| CN112980906B (zh) | 一种用于制备β-烟酰胺单核苷酸的酶组合物及其应用 | |
| CN111218430A (zh) | 一种nadh类似物依赖型的细胞色素p450还原酶及其应用 | |
| CN117417915A (zh) | Prpp合成酶突变体及其在高效合成nad及nadp辅酶中的应用 | |
| CN106318917B (zh) | 天冬氨酸-β-半醛脱氢酶突变体及其应用 | |
| CN112831532B (zh) | 一种酶促合成d-亮氨酸的方法 | |
| CN112458073B (zh) | 一种h-蛋白突变体及其应用 | |
| KR20230006803A (ko) | 미생물 공정을 통한 nmn 및 이의 유도체 생산 | |
| CN114164161A (zh) | 一种生产新橙皮苷的双酶共表达菌株及其构建方法和应用 | |
| KR102681025B1 (ko) | 니코틴아미드모노뉴클레오티드의 제조 방법 및 그 방법에 사용하는 형질 전환체 | |
| CN116411038A (zh) | 一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法 | |
| Tan et al. | Biosynthesis of β-nicotinamide mononucleotide from glucose via a new pathway in Bacillus subtilis | |
| CN117431284A (zh) | 一种合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法、突变体及其应用 | |
| CN116555378A (zh) | 制备核糖核苷或其衍生物的方法、生物酶制剂及其应用 | |
| CN114107413A (zh) | 一种酶催化胞嘧啶生产胞苷的方法及应用 | |
| CN115896062A (zh) | 一种烟酰胺核糖苷激酶突变体及其相关产品和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |