CN115820682A - 过氧化氢酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种过氧化氢酶基因及其应用。本发明通过基因工程的手段，构建了过氧化氢酶的表达盒，并将其导入重组表达宿主菌，实现了过氧化氢酶的高效分泌表达，获得了高产过氧化氢酶重组菌株表达菌株，相对于优化前的过氧化氢酶基因，其过氧化氢酶活显著提高，可达8907U/ml。使用本发明的发酵工艺，在7L发酵罐发酵培养，过氧化氢酶酶活可达到368900U/mL。所得的过氧化氢酶最适合温度为40℃，在pH5‑pH9，相对酶活大于80％，在75℃下经历3min后仍能保持70％的酶活，酶活比较稳定，耐热效果好，可广泛用于食品、纺织、医疗、工业、造纸上。

Description

过氧化氢酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种过氧化氢酶基因及其应用。

背景技术

过氧化氢酶(Hydrogen peroxide oxidoreductase，catalase EC 1.11.1.6.)是一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。该酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，并在食品、医药、纺织、造纸、环保等行业具有重要的应用。

不同来源的过氧化氢酶在细胞中的位置有所不同。动物红细胞、肝脏以及细菌的过氧化氢酶存在于细胞质中，必须将细胞破碎才能提取到过氧化氢酶，因此酶的分离、提纯较为复杂。细菌过氧化氢酶的热、碱稳定性虽然可随来源不同而不同，但因为是胞内酶，实现高产和提取均不方便。酵母的过氧化氢酶主要积累于胞内，而一些丝状真菌的过氧化氢酶则主要分泌于胞外，胞内也含有一定量的过氧化氢酶。因此选用丝状真菌来生产过氧化氢酶在应用和产品提取方面具有较大优势。此外也有研究通过构建基因工程菌来生产过氧化氢酶。

目前市面销售的过氧化氢酶主要是通过微生物发酵的方法获得，目前，一些文献及专利报道的过氧化氢酶产酶菌株，发酵酶活相对较低，例如专利文献CN107384886B中公开了利用曲霉(Aspergillus sp.)的过氧化氢酶序列构建高效重组表达的黑曲霉工程菌株，摇瓶发酵酶活高达3150U/mL。专利文献CN106520575B中提供了一株高产过氧化氢酶的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)，利用该菌株进行工业化发酵生产，190h后得到发酵酶活水平可达到152000U/mL以上。

进一步提高工业化发酵生产的发酵酶活，有利于降低成本，有利于酶制剂更广泛的应用，贡献节能减排的力量。因此，利用基因工程技术手段开发出活性高的过氧化氢酶菌株具有重要的应用价值。

已知丝状真菌的蛋白质分泌能力极高，适合作为生产酶等重组蛋白质的宿主。因此，将过氧化氢酶基因转化到丝状真菌中以重组蛋白质的形式进行大量表达，过氧化氢酶的表达量将会显著的提升。

发明内容

本发明的目的在于通过基因工程的手段，构建获得了高产过氧化氢酶重组表达的菌株，实现过氧化氢酶的高效分泌表达。本发明提供了一种高酶活的经密码子优化的过氧化氢酶基因。本发明人从环境筛选到产过氧化氢酶的烟曲霉菌株(Aspergillusfumigatus)，并从其基因组DNA中克隆了编码过氧化氢酶的基因CatO，测定了其碱基序列。经密码子优化后通过黑曲霉(Aspergillus niger)工程菌株VT-002实现了高效表达过氧化氢酶。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种过氧化氢酶CatR基因，所述过氧化氢酶CatR基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面，提供一种表达盒，所述表达盒包含本发明第一方面所述的过氧化氢酶CatR基因。

本发明的第三方面，提供一种表达载体，所述表达载体包含本发明第一方面所述的过氧化氢酶CatR基因或本发明第二方面所述的表达盒。

在本发明的一些实施方式中，所述表达载体还包括启动子、终止子、筛选标记的基因片段。

在本发明的一些实施方式中，所述启动子包括黑曲霉表达质粒的启动子。

在本发明的一些优选实施方式中，所述启动子选自黑曲霉糖化酶启动子、中性淀粉酶启动子、酸性淀粉酶启动子，米曲霉中性淀粉酶启动子、米根霉糖化酶启动子中的一种或多种。

在本发明的一些优选实施方式中，所述启动子为黑曲霉糖化酶启动子和/或中性淀粉酶启动子。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述启动子为黑曲霉糖化酶启动子。

在本发明的一些实施方式中，所述的筛选标记选自乙酰胺酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、潮霉素磷酸转移酶、硝酸还原酶、乳清酸核昔-5'-磷酸脱羧酶、硫酸腺酰转移酶和邻氨基苯甲酸合酶以及它们的等同物中的一种或多种；优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉乙酰胺酶和潮霉素磷酸转移酶；更优选为潮霉素磷酸转移酶。

本发明的第四方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞包含本发明第三方面所述的表达载体。

在本发明的一些实施方式中，所述重组细胞包含多个拷贝的SEQ ID NO.2核苷酸序列。

在本发明的一些实施方式中，所述细胞为丝状真菌。

在本发明的一些实施方式中，所述丝状真菌选自曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、顶孢霉属(Acremonium)中的一种或多种；优选为曲霉属(Aspergillus)和/或木霉属(Trichoderma)。

在本发明的一些实施方式中，所述细胞为黑曲霉。

在本发明的一些实施方式中，所述细胞非植物或动物新品种。

本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述基因或本发明第二方面所述表达盒或本发明第三方面所述表达载体或本发明第四方面所述的重组细胞在生产过氧化氢酶中的应用。

本发明的第六方面，提供一种制备过氧化氢酶的方法，包括以下步骤：培养本发明第四方面所述的重组细胞制备过氧化氢酶。

本发明的第七方面，提供本发明第一方面所述基因或本发明第二方面所述表达盒或本发明第三方面所述表达载体或本发明第四方面所述的重组细胞或本发明第六方面所述的方法制备的过氧化氢酶在清除过氧化氢中的应用。

本发明的第八方面，提供本发明第一方面所述基因或本发明第二方面所述表达盒或本发明第三方面所述表达载体或本发明第四方面所述的重组细胞或本发明第六方面所述的方法制备的过氧化氢酶在食品、纺织、医疗、造纸领域中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种密码子优化的过氧化氢酶CatR基因，通过基因工程的手段，构建了过氧化氢酶的表达盒，并将其导入重组表达宿主菌，实现了过氧化氢酶的高效分泌表达，获得了高产过氧化氢酶重组菌株表达菌株，相对于优化前的过氧化氢酶基因，其过氧化氢酶活显著提高，可达8907U/ml。使用本发明的发酵工艺，过氧化氢酶酶活可达到368900U/mL。所得的过氧化氢酶最适合温度为40℃，在pH 5-9，相对酶活大于80％，在75℃下经历3min后仍能保持70％的酶活，酶活比较稳定，耐热效果好，可广泛用于食品、纺织、医疗、工业、造纸上的应用，如葡萄糖酸钠和葡萄糖酸钙等生产。

附图说明

图1：本发明的重组表达载体pAN-EXP图谱。

图2：本发明的重组表达过氧化氢酶载体pAN-EXP-AFP-Cat图谱。

图3：本发明的重组表达过氧化氢酶菌株摇瓶发酵筛选酶活测定。

图4：本发明的重组表达过氧化氢酶菌株发酵罐发酵酶活测定。

图5：本发明重组表达过氧化氢酶的最适反应温度曲线。

图6：本发明重组表达过氧化氢酶最适反应pH曲线。

图7：本发明重组表达过氧化氢酶耐热性结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明的载体构建的规程和方法，使用基因工程领域惯用的规程和方法。

定义：

“基因”指在产生多肽中涉及的DNA片段，包括在编码区之前和之后的区域，以及在单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

在本说明书中，“表达载体”指含有与一个或多个合适的控制序列有效连接的DNA编码序列的DNA构建体，所述控制序列能够实现编码序列在宿主中的表达。此类控制序列包括实现转录的启动子，控制此类转录的任选的操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或单纯的是潜在的基因组插入序列。一旦转化到合适的宿主中，载体就可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在一些情况下，可以自身整合到基因组中。质粒是最常使用的表达载体形式。然而，本发明意在包括发挥等同功能的其它形式的表达载体，所述表达载体是或者将是本领域已知的。

“启动子”指涉及结合RNA聚合酶以起始基因转录中的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。可用于本发明的诱导型启动子的非限制性实例是糖化酶启动子，该启动子是诱导型启动子。

术语“宿主细胞”指细胞或细胞系，用于多肽生产的重组表达载体可以转染到所述细胞或细胞系中以表达多肽。

真菌细胞能以本身已知的方式的通过涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及细胞壁的再生的过程进行转化。

根据发明，将包含编码过氧化氢酶的多核苷酸序列的载体引入宿主细胞。从包含编码多肽的多核苷酸和包含与过氧化氢酶编码序列有效连接的调控序列的表达载体表达包含过氧化氢酶活性的多肽。

术语“重组菌株”当用于指细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示通过引入异源的核酸或蛋白质，或者改变天然的核酸或蛋白质而修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体，或者所述细胞源自这样修饰的细胞。

术语“选择性标记”或“选择标记”指能够在宿主细胞中表达的基因，使那些含有引入的核酸或载体的宿主易于选择。

如本文中使用的，术语“转化”指具有非天然核酸序列的细胞，所述核酸序列整合到其基因组中，或者作为附加体质粒在多个世代中维持。可以使用任何本领域普遍已知的多种技术实施将载体引入到黑曲霉宿主细胞中，所述载体包含编码过氧化氢酶多肽的多核苷酸序列，例如，转化、电穿孔、核微注射、转导、转染、用磷酸钙DNA沉淀孵育、用DNA包被的微粒高速轰击或原生质体融合。

丝状真菌具有强大的蛋白分泌能力，某些丝状菌分泌的胞外总蛋白量达到40g/L，这种高效的蛋白分泌能力是细菌等原核表达宿主所不能比拟的。丝状真菌还具备各种基因翻译后加工能力，如糖基化修饰，信号肽切割及二硫键的形成等。米曲霉，黑曲霉及里氏木霉等丝状真菌都是食品安全级菌株，被美国食品与药品管理局认定为GRAS(Generallyrecognized as safe)菌株。在工业用酶的生产中丝状菌发酵占据核心的地位，国际市场的酶制剂将近40％的酶类生产来自于丝状真菌发酵。

用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。

本发明提供一种高产过氧化氢酶的丝状真菌表达宿主菌。丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞；优选地是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。

宿主细胞是在适于使用本领域中已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下，通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。

实验材料和试剂：

菌种：黑曲霉(Aspergillus niger)VT-002菌株、表达质粒pAN-EXP均已在中国发明专利申请CN 202011514714.6中公开。

仪器及设备：

恒温培养箱：上海一恒恒温培养箱LHS-150SC；恒温摇床：华利达恒温摇床HZ2410K6；超净台：苏州净化超净台SW-CJ2FD；上海搅拌式生物反应器：百伦生化装备有限公司。

培养基的配置和试剂：

TZ固体培养基：牛肉浸膏(广东环凯微生物科技有限公司)8g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2g/L，淀粉10g/L.琼脂17g/L.pH 5.8。

CD培养基：蔗糖30g/L，NaNO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO₄0.01g/L，或加15g/L琼脂，pH 7.3。

再生培养基平板：营养汁粉8g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2g/L，淀粉10g/L，琼脂17g/L，pH 5.8，再加0.8M KCl(g/L)或者山梨醇1M。

摇瓶发酵培养基：麦芽糖糊精80g/L，豆饼粉20g/L，玉米浆30mL/L，pH5.5，三角瓶装液量100mL/500mL，115℃灭菌20min。

种子罐培养基：麦芽糖糊精80g/L，豆饼粉40g/L，玉米浆10mL g/L，pH5.5，121℃灭菌30min。

发酵罐培养基：麦芽糖糊精40g/L，豆饼粉20g/L，玉米浆20mL/L，(NH₄)2SO₄ 4g/L，氯化钙：2g/L，磷酸氢二钠：2g/L，磷酸二氢钾：3g/L，消泡剂，控制发酵罐pH5.2-pH5.5，121℃灭菌35min。

裂解酶液：1％溶壁酶，用1M山梨醇溶解。

KCl溶液：0.6M KCl溶液。

山梨醇溶液：1M山梨醇。

S/C溶液：1M山梨醇，50mM CaCl₂。

PEG溶液：25％PEG8000，50mM CaCl₂，10mM Tris-Hcl，pH 7.5。

实施例1真菌Aspergillus fumigatus过氧化氢酶CatR基因克隆

1、真菌Aspergillus fumigatus过氧化氢酶CatO基因克隆

提取Aspergillus fumigatus的基因组总DNA。然后以基因组总DNA为模板，利用上下游引物进行扩增。

CatO-F(5’→3’)：ATGCGTCTCACGTTCATCCC(SEQ ID NO:4)；

CatO-R(5’←3’)：CTAGTGATCCACGGGAAACCG(SEQ ID NO:5)。

PCR扩增条件为98℃2min；98℃10S；55℃15S，72℃1.5min 30个循环；72℃5min。凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，送至上海生工进行测序分析。结果显示，扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

SEQ ID NO.1

MRLTFIPSLIGVANAVCPYMTGELNRRDEISDGDAAAATEEFLSQYYLNDNDAFMTSDVGGPIEDQNSLSAGERGPTLLEDFIFRQKIQRFDHERVPERAVHARGAGAHGVFTSYGDFSNITAASFLAKEGKQTPVFVRFSTVAGSRGSSDLARDVHGFATRFYTDEGNFDIVGNNIPVFFIQDAILFPDLIHAVKPRGDNEIPQAATAHDSAWDFFSQQPSTMHTLLWAMSGHGIPRSFRHVDGFGVHTFRFVTDDGASKLVKFHWKSLQGKASMVWEEAQQTSGKNPDFMRQDLHDAIEAGRYPEWELGVQIMDEEDQLRFGFDLLDPTKIVPEEFVPITKLGKMQLNRNPRNYFAETEQVMFQPGHIVRGVDFTEDPLLQGRLFSYLDTQLNRHGGPNFEQLPINQPRVPVHNNNRDGAGQMFIPLNPHAYSPKTSVNGSPKQANQTVGDGFFTAPGRTTSGKLVRAVSSSFEDVWSQPRLFYNSLVPAEKQFVIDAIRFENANVKSPVVKNNVIIQLNRIDNDLARRVARAIGVAEPEPDPTFYHNNKTADVGTFGTKLKKLDGLKVGVLGSVQHPGSVEGASTLRDRLKDDGVDVVLVAERLADGVDQTYSTSDAIQFDAVVVAAGAESLFAASSFTGGSANSASGASSLYPTGRPLQILIDGFRFGKTVGALGSGTAALRNAGIATSRDGVYVAQSVTDDFANDLKEGLRTFKFLDRFPVDH。

SEQ ID NO.3

ATGCGTCTCACGTTCATCCCCAGCCTCATTGGCGTTGCCAATGCGGTATGTCCCTATATGACCGGCGAGCTCAACCGTCGTGATGAGATATCCGATGGCGACGCTGCCGCAGCCACAGAGGAATTCTTGTCCCAGTATTATCTCAACGACAATGATGCCTTCATGACGTCCGACGTGGGCGGCCCTATCGAAGATCAGAATAGTCTCAGTGCCGGAGAGCGTGGTCCCACCCTGCTCGAAGATTTCATTTTCCGTCAAAAGATACAGCGTTTCGACCATGAACGGGTCCCCGAGCGTGCGGTCCATGCCCGTGGTGCCGGCGCCCATGGAGTCTTCACTTCATATGGCGACTTCTCGAACATCACTGCGGCTTCTTTCCTGGCCAAGGAAGGCAAGCAAACCCCTGTATTTGTCCGCTTCTCGACGGTCGCAGGAAGCAGAGGTAGTTCGGATCTGGCCCGTGATGTTCACGGTTTTGCCACTCGTTTCTATACCGACGAGGGCAATTTCGATATCGTTGGAAACAATATCCCTGTATTCTTCATCCAGGATGCTATCCTCTTCCCCGATCTGATCCACGCCGTCAAGCCCAGAGGTGACAACGAGATCCCTCAGGCTGCCACTGCTCATGACTCGGCCTGGGACTTCTTCAGCCAGCAGCCAAGCACGATGCACACACTGCTCTGGGCTATGTCTGGGCATGGCATTCCTCGTTCTTTCCGACATGTTGATGGGTTCGGTGTGCATACCTTCCGATTCGTGACAGATGACGGTGCATCCAAGCTCGTCAAATTTCACTGGAAGTCTTTGCAGGGCAAGGCCAGCATGGTCTGGGAAGAGGCCCAGCAGACCTCTGGCAAGAATCCTGACTTCATGCGTCAGGATTTGCACGATGCAATCGAGGCTGGACGCTATCCGGAGTGGGAACTCGGTGTTCAAATCATGGATGAGGAGGACCAACTGCGGTTCGGTTTTGACCTCTTGGACCCCACAAAGATCGTGCCAGAGGAATTCGTGCCCATCACCAAGTTGGGCAAGATGCAACTGAACCGCAACCCTCGCAACTATTTCGCTGAGACCGAACAAGTTATGTTCCAACCTGGTCACATTGTCCGTGGTGTTGACTTCACTGAAGACCCTCTCCTGCAAGGCCGTCTGTTTTCGTACCTGGACACTCAGCTGAACCGTCACGGTGGCCCCAACTTTGAACAACTCCCCATCAACCAACCTCGCGTTCCCGTGCACAACAACAACCGCGATGGAGCAGGCCAAATGTTCATTCCCCTCAACCCTCACGCGTACTCGCCCAAGACCTCCGTCAACGGTTCCCCAAAACAAGCCAACCAGACCGTCGGCGATGGCTTCTTCACAGCTCCTGGACGTACCACCAGTGGCAAGCTTGTCCGTGCGGTCAGCTCAAGCTTTGAGGATGTCTGGTCTCAGCCACGGCTCTTCTACAATTCTTTGGTTCCTGCCGAGAAGCAGTTCGTTATTGACGCCATCCGCTTCGAAAATGCAAACGTTAAATCTCCCGTGGTGAAGAACAACGTCATCATTCAGTTGAACCGCATCGATAACGACCTTGCACGACGCGTTGCGCGCGCTATTGGTGTCGCCGAGCCTGAGCCCGACCCGACCTTCTATCACAACAACAAGACTGCCGATGTCGGCACTTTTGGAACCAAGCTGAAGAAGCTTGATGGCCTCAAGGTCGGCGTCCTGGGTTCTGTCCAGCACCCGGGCTCGGTTGAGGGAGCTTCCACCCTCCGCGACCGTCTGAAGGACGACGGTGTCGACGTGGTTCTTGTCGCAGAGCGTCTGGCCGACGGTGTTGACCAGACCTATTCTACTTCAGATGCAATCCAATTTGACGCTGTGGTCGTTGCCGCCGGTGCAGAGAGTCTCTTCGCGGCATCCTCGTTTACCGGTGGGTCCGCCAACTCAGCTAGTGGTGCAAGCTCTCTGTACCCCACCGGTCGGCCCCTGCAGATTCTCATTGACGGATTCCGGTTCGGCAAGACTGTTGGGGCGCTGGGAAGCGGCACAGCTGCTCTCCGCAACGCGGGGATTGCAACGTCTCGGGACGGCGTGTATGTGGCTCAGTCAGTCACTGATGACTTTGCCAATGATCTTAAGGAGGGCCTTAGAACTTTTAAGTTTTTGGACCGGTTTCCCGTGGATCACTAG。

2、密码子优化真菌Aspergillus fumigatus过氧化氢酶基因CatR

根据真菌Aspergillus fumigatus过氧化氢酶CatO基因和黑曲霉密码子优化原则，人工合成密码子优化后的真菌Aspergillus fumigatus过氧化氢酶基因CatR，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其可编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO.2

ATGCGCCTGACCTTCATCCCCTCCCTCATCGGCGTCGCCAACGCCGTGTGCCCTTACATGACCGGCGAGCTCAACCGCCGCGATGAGATCAGCGATGGCGACGCCGCCGCCGCTACCGAAGAGTTCCTCTCCCAGTACTACCTCAACGACAACGACGCCTTCATGACCTCCGACGTCGGCGGCCCCATCGAGGACCAGAACTCCCTGTCCGCCGGCGAGCGCGGTCCTACTCTGCTGGAGGATTTCATCTTCCGCCAGAAGATCCAGCGCTTCGACCATGAGCGCGTCCCTGAGCGCGCCGTCCATGCTCGTGGCGCTGGTGCTCACGGCGTCTTTACCAGCTACGGCGATTTCTCCAACATCACCGCCGCCAGCTTCCTCGCCAAGGAGGGCAAGCAGACCCCTGTCTTTGTCCGCTTCTCCACCGTGGCCGGCAGCCGTGGTAGCTCCGACCTCGCTCGCGATGTCCACGGCTTCGCCACCCGCTTCTACACCGACGAGGGCAACTTCGATATTGTCGGCAACAACATCCCTGTCTTTTTCATCCAGGATGCCATCCTGTTCCCCGATCTCATCCATGCCGTCAAGCCCCGCGGCGATAACGAGATCCCCCAGGCCGCCACCGCCCATGATTCCGCTTGGGATTTCTTCAGCCAGCAGCCCTCCACCATGCACACCCTGCTCTGGGCCATGTCCGGCCACGGCATCCCCCGTTCCTTCCGCCATGTCGATGGCTTCGGCGTCCACACCTTCCGCTTCGTCACCGATGACGGCGCCAGCAAGCTCGTGAAGTTCCACTGGAAGAGCCTCCAGGGCAAGGCCAGCATGGTGTGGGAGGAGGCCCAGCAGACCAGCGGCAAGAACCCTGACTTCATGCGCCAGGACCTCCATGACGCCATCGAGGCCGGCCGCTACCCTGAGTGGGAGCTGGGTGTGCAGATCATGGATGAGGAGGATCAGCTCCGCTTCGGCTTCGATCTGCTGGATCCCACCAAGATCGTCCCCGAGGAGTTCGTCCCTATCACCAAGCTGGGCAAGATGCAGCTCAACCGCAACCCTCGCAACTACTTCGCCGAGACTGAGCAGGTCATGTTCCAGCCTGGCCATATCGTGCGCGGCGTGGATTTCACCGAGGATCCCCTGCTGCAGGGCCGCCTGTTCTCCTACCTGGATACCCAGCTGAACCGCCACGGCGGCCCCAACTTCGAGCAGCTGCCTATCAACCAGCCCCGCGTGCCCGTCCATAACAACAACCGCGATGGCGCCGGCCAGATGTTCATCCCCCTGAACCCTCATGCCTACTCCCCCAAGACCTCCGTGAACGGCAGCCCCAAGCAGGCCAACCAGACCGTGGGCGACGGCTTCTTCACCGCCCCCGGTCGTACCACCAGCGGCAAACTCGTGCGCGCCGTCAGCTCCTCCTTCGAGGATGTGTGGAGCCAGCCTCGCCTGTTCTACAACAGCCTGGTCCCCGCCGAGAAGCAGTTCGTGATCGATGCCATCCGCTTCGAGAACGCCAACGTGAAGTCCCCCGTCGTGAAGAACAACGTCATCATCCAGCTCAACCGGATCGATAACGATCTGGCCCGCCGCGTGGCCCGCGCTATTGGTGTTGCCGAGCCCGAGCCCGACCCTACCTTCTACCATAACAACAAGACCGCCGATGTCGGCACCTTCGGCACCAAGCTCAAGAAGCTCGATGGCCTGAAGGTGGGCGTCCTGGGCAGCGTCCAGCATCCCGGTAGCGTCGAGGGCGCCTCCACCTTGCGCGATCGCCTCAAGGACGACGGCGTCGATGTGGTCCTGGTCGCCGAGCGCCTGGCCGATGGTGTGGACCAGACCTACAGCACCAGCGATGCCATCCAGTTCGACGCCGTGGTCGTCGCCGCCGGTGCTGAATCCCTGTTCGCCGCCTCCTCCTTCACCGGCGGCAGCGCTAACTCCGCCTCCGGTGCTTCCAGCCTGTACCCCACCGGCCGCCCTCTGCAGATCCTGATCGATGGCTTCCGCTTCGGCAAGACCGTGGGCGCCCTGGGTTCCGGTACTGCCGCTCTCCGCAACGCCGGCATCGCCACTTCCCGCGACGGCGTTTACGTGGCCCAGTCCGTCACCGATGATTTCGCCAACGACCTCAAGGAGGGCCTCCGCACCTTCAAGTTCCTGGACCGCTTCCCCGTGGACCACTGA。

PCR扩增反应条件：98℃2min；98℃10S；55℃15S，72℃1.5min30个循环；72℃5min。

CatR-F(5’→3’)：ATGCGCCTGACCTTCATCCC(SEQ ID NO:6)；

CatR-R(5’←3’)：TCAGTGGTCCACGGGGAAGCGG(SEQ ID NO:7)。

PCR扩增获得大小约为2.2kb的DNA条带，回收目的片段。

实施例2 重组载体的构建

以上述扩增后回收的两个过氧化氢酶基因片段作为模板，上游引物引入NotI(GCGGCCGC)酶切位点，下游引物引入PmeI(GAATTTC)酶切位点。引物序列如下：

NotI-CatR-F(5’→3’)：

ACGGCGGCCGCATGCGCCTGACCTTCATCCCCTCCCTCATC(SEQ ID NO.8)；

Pmei-CatR-R(5’←3’)：

GCGAAATTTCTCAGTGGTCCACGGGGAAGCGGTCCAGGAACTTG(SEQ ID NO.9)。

反应条件：98℃2min；98℃10S；55℃15S，72℃1.5min 30个循环；72℃5min。

用上述引物进行PCR扩增，获得大小约为2.2kb的DNA条带，回收带有酶切位点的过氧化氢酶基因目的片段。

将上述扩增的带有酶切位点基因片段和黑曲霉表达质粒pAN-EXP分别进行限制性内切酶NotI和PmeI酶切。其中pAN-EXP图谱见图1。

酶切条件如下所示：

目的片段酶切条件：37℃，反应30分钟；反应体系见表1。

表1

反应体系(50ul)	加量
		PCR片段	25ul
反应缓冲液	5ul
		NotI	1ul
PmeI	1ul
		水	18ul

黑曲霉表达质粒pAN-EXP酶切条件：37℃，反应60分钟，酶切体系见表2；

表2

反应体系(50ul)	加量
		PCR片段	15ul
10*反应缓冲液	5ul
		NotI	1ul
PmeI	1ul
		水	28ul

酶切目的片段和黑曲霉表达质粒pAN-EXP后，电泳分别回收这两个片段，用T4DNA连接酶将这两个片段进行酶连反应。具体连接条件如下：酶切体系见表3，16℃酶连过夜。

表3

酶连体系(50ul)	加量
		酶切目的片段	2ul
酶切质粒片段	1ul
		T4连接酶	1ul
10*Buffer	1ul
		水	5ul

酶连反应后，进行大肠杆菌Top10感受态细胞转化。取100ul大肠杆菌感受态细胞，在无菌条件下，加入到连接液的Eppendorf管，混匀，置冰浴中30分钟。冰浴后，将正在转化反应的细胞悬浮液加入已调好42℃的恒温水浴槽内，保温2分种，迅速倒入LB培养液1毫升，置37℃摇床1小时。然后，涂布到LB氨苄青霉素培养皿，放置在室温下15分钟左右，使涂布上的菌液干燥不会流动。接着，倒置放于恒温箱中37℃培养过夜。第二天取出培养皿，挑取单菌落。菌落PCR验证连接正确的转化子送去测序，测序正确后，提取正确转化子的质粒，从而获得表达原始过氧化氢酶的黑曲霉表达载体pAN-EXP-AFP-CatO和表达密码子优化过氧化氢酶的黑曲霉表达载体pAN-EXP-AFP-CatR，重组表达载体pAN-EXP-AFP-CatR图谱见图2。

实施例3重组表达过氧化氢酶菌株的构建

1、黑曲霉原生质体制备

黑曲霉菌株VT-002在TZ培养基上32℃培养4天，挑选标准菌落划线于CD固体培养基上，32℃培养4天，从CD平板上取4立方厘米琼脂块放入60ml CD液的三角瓶中，34℃培养4天。收集菌丝体，用1M山梨醇清洗一次，称取湿重，按质量体积比1：25加入裂解酶液，30℃，80r/min酶解2.5小时到3小时。将原生质体液过滤，回收滤液。4000r/min离心10min，弃上清。用预冷的0.6M KCl溶液离心。原生质体沉淀重悬于适量0.6M KCl溶液中，菌体浓度达到(1-3)*10⁶个/ml，置冰浴备用。原生质体再生用渗透压稳定剂将纯化的原生质体稀释并涂布原生质体再生培养基平板，32℃培养，4～5d后观察原生质体的再生情况。同时用无菌水涨破原生质体后作为对照，消除非原生质体所形成的菌落带来的误差。

2、黑曲霉原生质体转化

取制备好的200ul原生质体悬液，分别加入约5ug的pAN-EXP-AFP-CatO质粒和pAN-EXP-AFP-CatR质粒，用枪头轻轻混匀。加入50ul PEG溶液，轻轻颠倒混匀，冰浴20-30min,缓慢加入1mL PEG缓冲液，室温放置20min后加入2ml S/C溶液，轻轻混匀，涂布于100ug/ml潮霉素的再生培养基平板，34℃培养5-6天。

3、黑曲霉转化子筛选和摇瓶培养

在潮霉素抗性板上分别生长了249个和281个转化子，分别挑取16菌落较大的单菌落到装有摇瓶发酵培养基三角瓶进行培养，32℃摇床培养5天。

实施例4高酶活菌株筛选

过氧化氢酶能把过氧化氢分解成水和氧，其活力大小以一定时间内一定量的酶所分解的过氧化氢量来表示。被分解的过氧化氢量可用碘量法间接测定。当酶促反应进行一定时间后，终止反应，然后以钼酸铵作催化剂，使未被分解的过氧化氢与碘化钾反应放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘。其反应为：

取三个100mL三角瓶编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10.0ml，随即在3号瓶中加入1.8mol/L硫酸5.0ml以终止酶的活力，作为空白溶液。各瓶均加入5.0mL0.01mol/L过氧化氢溶液，每加一瓶即摇匀并开始记时。5min后立即向1、2号瓶各加5.0mL 1.8mol/L硫酸溶液。

各瓶分别加入1.0mL 20％的碘化钾溶液和3滴钼酸铵溶液，然后依次用0.02mol/L的硫代硫酸钠滴定，滴定至溶液淡黄色后加入5滴1％的淀粉溶液，再继续滴定至蓝色消失即到终点，记下各瓶消耗的硫代硫酸钠的体积。

反应完后，以样品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的过氧化氢量，即可计算出酶的活力。

被分解的过氧化氢量(μmol)＝1/2×V_Na2S2O3(空白滴定值-样品测定值)(mL)×10-³×0.02×10⁶。

过氧化氢酶酶活检测显示结果见表4，16个pAN-EXP-AFP-CatR转化子中AF11摇瓶酶活最高，酶活为8907U/ml。将32个转化子制成图3，可见经密码子优化后制备的转化子转化黑曲霉所制备的重组工程菌比原始转化子制备的重组工程菌，发酵酶活总体显著提高。

表4

实施例5过氧化氢酶菌株发酵

本研究采用7L搅拌式生物反应器(上海百伦生化装备有限公司)，初始装液量为4L，接种量为500mL，移种条件：菌体浓度增大，镜检菌体染色深、视野清晰无杂菌，酶活力在3000u/ml左右；30℃，发酵过程中pH降至5.0时开始通氨，通过流加氨水控制pH为5.0～5.2，通风量7.8-8.5L/min，转速：500～1000rpm，补料DE值控制在10；56小时至放罐补料DE值控制在30。后期转速逐渐加大，培养183h，定时取样测定酶活。离心菌体获得发酵上清液即为粗酶液，进行蛋白电泳SDS-PAGE检测和酶学性质检测。利用发酵培养基对pAN-EXP-AFP-CatR重组工程菌进行7L发酵罐发酵培养，其中重组菌株AF11的过氧化氢酶总酶活达到368900U/mL，是目前可查询资料中，发酵酶活最高的。发酵罐发酵数据如图4所示。

进一步检测过氧化氢酶酶学性质。

(1)重组过氧化氢酶的最适反应温度

在25℃～50℃下，以5℃为间隔，分别测定过氧化氢酶的活力，以30℃的酶活力为对照，测定不同温度下的相对酶活。结果如图5，过氧化氢酶作用的最适合温度为40℃。

(2)重组过氧化氢酶的最适反应pH

在不同pH(2.5～10.0)的缓冲液体系中分别测定过氧化氢酶的酶活，以pH值7.0的酶活为对照，测定不同pH值下的相对酶活。结果如图6所示：该过氧化氢酶作用的最适pH值为7.0。在pH 5.0-9.0，相对酶活大于80％，应用范围广。

(3)重组过氧化氢酶的耐温特性

为了研究过氧化氢酶在不同温度下的热稳定性，分别将上清液在70℃、75℃、80℃，静置3min，以未热处理的样品的相对酶活性为100％，结果如图7所示，在75℃下经历3min后仍能保持70％的酶活，耐热性能稳定。

实施例6过氧化氢酶在葡萄糖酸钠/钙生产中的应用

在葡萄糖酸钠/钙生产过程中，在氧气存在的条件下，葡萄糖氧化酶高效地将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和过氧化氢，但过氧化氢的存在对葡萄糖氧化酶产生毒害作用，限制反应的继续进行，而过氧化氢酶能高效地将葡萄糖氧化生成的过氧化氢分解为氧气和水，消除过氧化氢对葡萄糖氧化酶活力的影响，促进葡萄糖酸钠/钙生产过程的进行。本发明中的过氧化氢酶发酵总酶活高，温度和pH适用范围广，与葡萄糖氧化酶兼容性好，在pH5.0-9.0,温度27-50℃的条件下适用于葡萄糖酸钠/钙的生产。

具体操作实例如下：

(1)在20L发酵罐中，加入浓度为35％的葡萄糖溶液10L，按1500U/g葡萄糖加入实施例5所得的过氧化氢酶，30U/g葡萄糖氧化酶，在pH5.2，温度40℃，罐压0.1MPa，转速500r/min的条件下反应20h，反应过程中用10M氢氧化钠溶液进行中和维持pH稳定，反应结束后反应液体积为12.1L，获得的葡萄糖酸钠浓度为34.85g/L。

(2)在20L发酵罐中，加入葡萄糖2000g，碳酸钙590g，加水混匀后，加水定容至10L，按800U/g葡萄糖加入实施例5所得的过氧化氢酶，10U/g葡萄糖氧化酶，在温度45℃，罐压：0.1MPa，转速：500r/min的条件下反应10h，反应结束后补水至10L，葡萄糖酸钙浓度为240g/L。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种过氧化氢酶CatR基因，其特征在于，所述过氧化氢酶CatR基因序列如SEQIDNO.2所示。

2.一种表达盒，其特征在于，含有权利要求1所述的过氧化氢酶CatR基因。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的过氧化氢酶CatR基因或权利要求2所述的表达盒。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括启动子、终止子、筛选标记的基因片段；优选地，所述启动子选自黑曲霉糖化酶启动子、中性淀粉酶启动子、酸性淀粉酶启动子，米曲霉中性淀粉酶启动子、米根霉糖化酶启动子中的至少一种。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的过氧化氢酶CatR基因、权利要求2所述的表达盒、权利要求3～4任一项所述表达载体中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞为丝状真菌。

7.权利要求1所述基因或权利要求2所述的表达盒或权利要求3～4任一项所述的表达载体或权利要求5～6任一项所述的重组细胞在生产过氧化氢酶中的应用。

8.一种制备过氧化氢酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养权利要求5～6任一项所述的重组细胞制备过氧化氢酶。

9.权利要求1所述基因或权利要求2所述的表达盒或权利要求3～4任一项所述的表达载体或权利要求5～6任一项所述的重组细胞或权利要求8所述的方法制备的过氧化氢酶在清除过氧化氢中的应用。

10.权利要求1所述基因或权利要求2所述的表达盒或权利要求3～4任一项所述的表达载体或权利要求5～6任一项所述的重组细胞或权利要求8所述的方法制备的过氧化氢酶在食品、纺织、医疗、工业、造纸领域中的应用。

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