JP2000508883A - バシラス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を用いたセルラーゼ及びキシラナーゼの生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 好アルカリ性セルラーゼ遺伝子を発現するためにBacillus licheniformis ATCC 53926プロテアーゼプロモーターとシグナル配列を含む遺伝子構成物でBacillus subtilis及びBacillus licheniformisを形質転換することによって、非相同のセルラーゼの生産増加が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】 バシラス・サチルス(Bacillus subtilis)を用いたセルラーゼ及びキシラナーゼ の生成物35U.S.C. §119（e）の下での前出願日の利益 本出願は、1995年8月10日に出願された、仮出願シリアル番号60/002,106の利 益を得るものである。発明の背景 1. 発明の分野 本発明は、Bacillus種によるセルラーゼの生産を高めることに関する。特に、 本発明は、好アルカリ性セルラーゼ遺伝子を発現するためにBacillus lichenifo rmis ATCC 53926プロテアーゼプロモーターとシグナル配列を含む遺伝子構成物 で形質転換したBacillus subtilis及びBacillus licheniformisに関する。 発明の要約 天然又は修飾P300プロモーター、リボゾーム結合部位、開始コドン及びシグナ ル配列を含む発現システムを用いると、Bacillusをホストにして非相同のセルラ ーゼの生産を増進できることが知られている。 図の簡単な説明 図1は、発明によるすべての構成物に対するMLBSP培養液でのセルラーゼ生産の 比較を示す。 図2及び図3は、MLBSP及び2XYT培養液で生育したB.subtilisのC1〜C4 KAN構成 物のセルラーゼ生産の比較を示す。 図4及び図5は、C4TET構成物が他の構成物よりはるかに多くのセルラーゼを生 産したことを示す。 図6は、ATCC53962プロテアーゼ及びCelBセルラーゼ遺伝子の融合したものの描 写である。 図7は、P300-CelB融合構成物＃1のDNA配列である。 図8は、P300-CelB融合構成物＃2のDNA配列である。 図9は、P300-CelB融合構成物＃３のDNA配列である。 図10は、P300-Celb融合構成物＃4のDNA配列である。 好ましい実施例の説明 請求項や実施例以外では、また、特に指定される場合を除き、ここに述べられ る成分の量や反応条件を表す全ての数は、“約”という言葉で修飾されているも のと理解されたい。 本明細書で使用される、P300という用語はB.licheniformis ATCC 53926と同意 語である。P300種とBacillus lentusアルカリ性プロテアーゼ（BLAP）遺伝子と は来国特許番号5,352,604に記載されており、その全内容がここにレファレンス として取り込まれる。 本発明は、好アルカリ性セルラーゼ遺伝子をBacillus種内に発現するためにBa cillus licheniformis ATCC 53926プロテアーゼプロモーターとシグナル配列を 用いる。天然又は修飾P300プロモーター、リボゾーム結合部位、開始コドン及び シグナル配列を含む発現システムを用いると、Bacillusをホストにして非相同の セルラーゼの生産を増進可能である。本発明の主たる利点は、フラスコ レベル やパイロット醗酵槽スケール、さらに大量工業生産スケールで、Bacillus種によ るセルラーゼの生産を高めることである。天然セルラーゼ遺伝子及びその制御エ レメントによる収量よりもはるかに高いセルラーゼの収量が得られる他に、醗酵 工程の早期にセルラーゼの生産が起きる。Bacillus subtilis及びBacillus lich eniformisのセルラーゼ生産の改善が図（1〜５）に示される。この図では、2種 の典型的生育培養液、2XYT又はMLBSPの何れかを用いてフラスコシェイカーレベ ルでのセルラーゼの生産が比較されている。ここで記述される形質転換微生物を 生育するためには、いかなる適当な醗酵培養液をも使用できる。図1にすべての 構成物に対するMLBSP培養液でのセルラーゼ生産が比較されている。この結果か ら分かるように、C5TET及びC6KANに存在する天然CelBセルラーゼ遺伝子と比較し て、一種の構成物を除きすべての構成物に対し異なるけれどセルラーゼ収量の増 加が観察された。図2及び図３には、MLBSP及び2XYT培養液で生育 したB.subtilisのC1からC4KAN構成物でのセルラーゼの生産が比較されている。M LBSP及び2XYTの両培養液で、C4及びC3構成物が最も高いセルラーゼの収量を示し た。C5TET又はC6KANのいずれかにクローンされた天然CelB遺伝子を持つコントロ ールのホスト種Bacillus subtilisDB104と比較して、ある良好な構成物の場合は セルラーゼの収量が10〜40倍増加する事を示した。図2及び3に示すように、B.su btilisDB104ホスト種では実験期間中のどのアッセイ時に於いてもセルラーゼの 生産が検出されなかった。Bacillus licheniformisではTET改造体構成物のみセ ルラーゼの生産が調べられた。図4と5の実験結果は、C4TET構成物が他の構成物 よりはるかに高いセルラーゼを生産し、構成物C5TETに存在する天然CelB遺伝子 と比較して7から8倍のセルラーゼを生産した事を示す。これらの結果は、天然又 は修飾P300プロモーター、リボゾーム結合部位、開始コドン及びシグナル配列を 含む発現システムを用いると、Bacillusをホストにして非相同のセルラーゼの生 産を増進する事が出来る事を明確に示す。 Bacillus SP.N4（ATCC21833）からCelBアルカリ性セルラーゼ遺伝子をクローン 化し、過剰発現する手順 1．構成物＃1：P300とCelBルラーゼ間のハイブリッドシグナル Ａ．部位特異的遺伝子変異法を用い、Aval部位とNhel部位間（P300シグナル配 列内）でpMc13CにSphI部位を導入する。新しいSphI部位を有するPCRフラグ メントがAval/NhelフラグメントとしてpMc13Cにクローンバックされるであ ろう。この新しいプラスミッドはpMc13Sphとラベルされる。 Ｂ．PCR法でSphI/SstIフラグメントとして部分的CdlBシグナル配列及び成熟配 列を増幅する。 Ｃ．pMc13SphlDNAを調製し、SphIとSstIでプラスミッドを消化し、さらに、 HPLCで大きいフラグメント（ベクター）を精製する。 化し、E.coli WK6に形質転換する。この新しいクローンをP300NK2C1とラベ ルする。 Ｅ．P300NK2C1 DNAを調製し、AvaI/SstIでプラスミドを消化し、HPLCを用いてP 300-CdlB融合を含む小フラグメント（インサート）を精製する。 Ｆ．pC51及びpH70 ＤＮＡを調製し、AvaI及びSstIで各プラスミドを消化し、 HPLCを用いて各プラスミドから大フラグメント（ベクター）を精製する。 Ｇ．FのベクターにEのP300-CelB融合をクローン化しなさい。Tc構成物はC1TET と、構成物はC1KANとラベルされる。C1TETとC1KANをB.subtilisDB104とB.l icheniformis ATCC 53926に形質転換する。 2． 構成物＃2：P300とCelBセルラーゼ間のハイブリッドシグナル（大抵のCelB セルラーゼシグナル配列を含む） Ａ．部位特異的遺伝子変異法を用い、AvaI部位とNheI部位間（P300シグナル配 列内）でpMc13CにBglII部位を導入する。新しいBglII部位を有するPCRフラ グメントがAvaI/NheIフラグメントとしてpMc13Cにクローンバックされるで あろう。この新しいプラスミッドはpMc13Bglとラベルされる。 Ｂ．PCR法でBglII/SstIフラグメントとして部分的CelBシグナル配列及び成熟配 列を増幅する。 Ｃ．pMc13Bgl DNAを調製し、BglIIとSstIでプラスミッドを消化し、さらに、 HPLCで大フラグメント（ベクター）を精製する。 化し、E.coli WK6に形質転換する。この新しいクローンをP300NK2C2とラベ ルする。 Ｅ．P300NK2C2 DNAを調製し、AvaIとSstIでプラスミドを消化し、HPLCを用いて P300-CelB融合を含む小フラグメント（インサート）を精製する。 Ｆ．pC51及びpH70 ＤＮＡを調製し、AvaI及びSstIで各プラスミドを消化し、 HPLCを用いて各プラスミドから大フラグメント（ベクター）を精製する。 Ｇ．FのベクターにEのP300-CelB融合をクローン化しする。Tc構成物はC2TETと 、構成物はC2KANとラベルされる。C1TETとC1KANをB.subtilisDB104とB.lic heniformis ATCC 53926に形質転換する。 3． 構成物＃3：P300シグナル及びCelB成熟セルラーゼ配列間のハイブリッド Ａ．部位特異的遺伝子変異法を用い、AvaI部位とHindIII部位間でpC51のP300前 部領域の末端にPstI部位を導入する。新しいPstI部位を有するPCRフラグメ ントがAvaI/HindIIIフラグメントとしてpC51にクローンバックされるであ ろう。この新しいブラスミッドはpC51Pstとラベルされる。 Ｂ．PCR法でPstI/SstIフラグメントとしてCelB成熟セルラーゼを増幅する。 Ｃ．pC51PstDNAを調製し、PstIとSstIでプラスミッドを消化し、さらに、HPLC で大フラグメント（ベクター）を精製する。 し、B.subtihsDB104とB.licheniformis ATCC 53926に形質転換する。この 新しい構成物をC3ＴＥＴとラベルする。 Ｅ．pH70とC3TETDNAを調製し、AvaIとSstIで各プラスミドを消化し、HPLCを用 いて、ｐＨ70から大フラグメント（ベクター）を、C3TETから小フラグメン ト（インサート）を精製する。 Ｆ．Ｅのインサートをベクターにクローン化し、B．subtilisDB104とB.licheni formis ATCC 53926に形質転換する。この構成物をC3KANとラベルする。 4． 構成物＃4：P300BLAP Cla融合シグナルとCelB成熟セルラーゼ配列間のハイ ブリッド Ａ．部位特異的遺伝子変異法を用い、AvaI部位とNheI部位間でpCB56P3のP300前 部領域の末端にPstI部位を導入する。 新しいPstI部位を有するPCRフラグ メントがAvaI/NheIフラグメントとしてpC51にクローンバックされるであろ う。この新しいプラスミッドは56P3Pstとラベルされる。 Ｂ．56P3Pst DNAを調製し、PstIとSstIでプラスミッドを消化し、さらに、HPLC で大フラグメント（ベクター）を精製する。 Ｃ．3BのPstI/SstIとして増幅されたCelB成熟セルラーゼを、PstI/SstIフラグ メントとしてBのベクターにクローン化し、B.subtilisDB104とB.lichenifo rmis ATCC 53926に形質転換する。この新しい構成物をC4ＴＥＴとラベルす る。 Ｄ．C4TETとｐＨ70 DNAを調製し、AvaIとSstIで各プラスミドを消化し、HPLCを 用いて、ｐＨ70から大フラグメント（ベクター）を、C4TETから小フラグメ ント（インサート）を精製する。 Ｅ．Dのインサートをベクターにクローン化し、B．subtilisDB104とB.lichenif ormis ATCC 53926に形質転換する。この新しい構成物をC4KANとラベルする 。 5． 構成物５：全CelBセルラーゼ遺伝子をSphI/XbaIフラグメントとしてpBC16 にクローニング Ａ．pBC16 DNAを調製し、SphI及びXbaIでプラスミドを消化し、HPLCで大フラグ メント（ベクター）を精製する。 Ｂ．PCR法（インサート）により、全CelBセルラーゼ遺伝子をSphI/XbaIフラグ メントとして増幅する。 Ｃ．Bの増幅したフラグメントを逆時計方向にAのベクターにクローン化し、B. subtilisDB104とB.licheniformis ATCC 53926に形質転換する。この新しい 構成物をC5TETとラベルする。 6． 構成物＃6：全pNK2セルラーゼ遺伝子をSphI/XbaIフラグメントとして pUB110にクローニング Ａ． pUB110 DNAを調製し、SphI及びXbalでプラスミドを消化し、HPLCで大フラ グメント（ベクター）を精製する。 Ｂ．5Bの増幅したフラグメントを逆時計方向にAのベクターにクローン化し、B. subtilisDB104とB.licheniformis ATCC 53926に形質転換しする。この新し い構成物をC6KANとラベルする。 実施例1 1. ｐＮＫ２アルカリ性セルラーゼ遺伝子をプラスミドｐＴＺ18Ｒに EcoRI/HindIIIフラグメントとしてクローン化し、E.coli BCE101に形質転換 した。この新しいクローンをpCelBN4（Duesseldorfから受け取った）とラべ ルした。ｐＮＫ2アルカリ性セルラーゼ遺伝子はBacillus sp.N4（ATCC＃ 21833）由来のCelB遺伝子として文献に記載されている。 2. 参考文献“好アルカリ性Bacillus sp.株N-4由来の2種のセルラーゼ遺伝子の 塩基配列とその高い相同性”、Fukumoriら、(1986年)Journal of Bactriolo gy,11月号、479から485頁。 3. すべての構成物の塩基及びアミノ酸配列がノートブック＃7557にコピーされ ている。 セルラーゼの生産培養液 1.MLBSP培養液の組成 培養液にNaOHを加えてpH7.2にし、容量を水を加えて815mlに調整する。121℃ 、15psi、 15分間オートクレーブする。以下の無菌原液を添加する前に培養液を 冷却する。 注1；ピペラジン-N,N'ビス（2-エタンスルフォン酸） 注２；充分量の1.5Ｍ K2HPO₄を200mlの1.5MKH₂PO₄に加えてpHを6.0に調整した 。最終ｐＨを4M KOHを用いて7.0に調節した。 カナマイシン又はテトラサイクリン抗生物質原液を使用直前に培養液に加えて 、最終濃度をそれぞれ20μｇ/ｍｌと１５μｇ/ｍｌとした。 2.2ＸＹＴ培養液 1.6％Difco Bactopeptone 1．0％酵母抽出物 0．5％食塩 実施例2 シェイカーフラスコ法によるセルラーゼ生産の評価 40mlのLuria Brothを入れた予備培養フラスコにBacillus subtilisDB104及び 以下のpUB110カナマイシン抵抗性Bacilluss ubtilisDB104構成物：C1Kan、C2Kan 、C3Kan、 C4Kanを接種する。DB104以外のすべてのフラスコに20μｇ/ｍｌのカ ナマイシンを加える。すべてのフラスコを37℃、250rpm、9時間、ベンチトップ シェイカーでインキュベートする。 各培養に対しMLBSP（グルコースのない）及び2xYT養液を入れた2個のシェイカ ーフラスコに接種する。バッフルした500mlのシェイカーフラスコに入れた20μ ｇのカナマイシン（DB１０４を除き）を含む100mlの各培養液に5％接種を行う。 各フラスコを37℃、250rpmのフロアシェイカーに置く。各フラスコから7mlのサ ンプルを12、19、34.5及び42時間後に抜き取りなさい。上清と菌体を分離するた めにSA-600ローターを用い10分間12,000rpmでサンプルを遠心する。コーニング の遠心管に上清を注ぎ、セルラーゼアッセイの準備ができるまで4℃で 貯蔵する。 実施例3 試薬：0 ．5M NaOH ： 20.0gのNaOHを蒸留水に溶かし、最終容量を1Lにする。50 ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ＝9.0： 3.75gグリシン 800ml蒸留水 2M NaOHでｐＨ＝9.0に調整する。 蒸留水を加えて1Lにする。１％PABAH溶液（１ｍＭビスマスを含む）/NaOH： 1gPABAH 100ml0.5M NaOH 100μlビスマス原液基質溶液2.5％カルボキシメチルセルロース（CMC）ｐＨ＝9.0： 2.5gのカルボキシメチルセルロース（低粘度）を 最終100mlのグリシン緩衝液ｐＨ＝9.0に溶解する。ビスマス原液： 1M硝酸ビスマス 1M酒石酸カリウム・ナトリウム 3M NaOH 最終100mlの蒸留水に溶解する。酵素溶液 50mMグリシン緩衝液pH9.0で必要なほどシェイカーフラスコ実験から採取した 上清サンプル。手順 正に置換するピペットを用いて、2.2mlのキャップ付き試験管に250μｌの2.5 ％CMC基質溶液を加える。CMC基質溶液を含む試験管に250μlの酵素溶液を加え、 ボルテックスにて攪拌する。酵素溶液のサンプルを三重にアッセイしなさい。三 重のサンプルの各セットに対し、ブランク用に250μlの2.5％CMC溶液を含む試験 管をさらに準備する。すべての試験管を水浴中40℃で30分間インキュベートしな さい。試験管を水浴から取り出し、酵素溶液を含む各サンプルからブランクに至 るまで500μlの1％PAHBAH溶液を加える。250μlの酵素溶液を各ブランクに加え る。すべての試験管を水浴中70℃で10分間インキュベートする。試験管を10から 15℃の水浴に1から2分間漬けて冷却する。ただちに分光光度計で410ｎｍのサン プルの値を読み取る。計算 アッセイで放出されるグルコース nmol/ml/minを計算するためには、以下の 式を用いる。吸収の差（サンプル吸収の平均−ブランク）＊アッセイ容量＊希釈因子 0．065ml/nmol＊0.25ml＊30min 微生物の供託 ATCC呼称69878とされた、プラスミドc4TEtを含むBacillus subtilisの生培養 液の供託が、微生物供託の国際的承認に関するブタペスト条約の下に特許手続き を目的としてAmerican Type Culture Collection（12301 Parklawn Drive、Rock ville、MD20852）に受理された。 図1. MLBSP培養液を用いたBacillus subtisDB104のC1からC6構成物によるセルラーゼ 生産の比較（シェイカーフラスコ実験1） 図2. MLBSP培養液を用いたBacillus subtilis DB104のC1KanからC4Kan構成物によるセ ルラーゼ生産の比較（シェイカーフラスコ実験＃II） 図3. 2ＸＹＴ培養液を用いたBacillus subtilis DB104のC1KanからC4Kan構成物による セルラーゼ生産の比較（シェイカーフラスコ実験III） 図4. MLBSP培養液を用いたBacillus licheniformisのC3Tet、C4Tet、C4TetKpn、C5Tet 成物によるセルラーゼ生産の比較（シェイカーフラスコ実験IV） 図5. MLBSP培養液を用いたBacillus licheniformisのC1Tet、 C2Tet、C3TetKpn、C4T etKpn構成物によるセルラーゼ生産の比較（シェイカーフラスコ実験＃Ｖ） 図6. ATCC＃53926プロテアーゼとCelBセルラーゼの遺伝子融合 図7. P300-CelB融合構成物＃1 図8. P300-CelB融合構成物＃2 図9. P300-CelB融合構成物＃3 図10. P300-CelB融合構成物＃4

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ (72)発明者 タング，マリア，アール. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94533，フェアフィールド，クリフウッド ドライブ 2043 (72)発明者 クリスチャンソン，テリー アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94954，ペタルマ，エリー ロード 504 (72)発明者 マウラー，カールハインツ ドイツ連邦共和国，エアクラース デー− 40699，デッヒェンシュトラーセ ５ (72)発明者 ヴァイス，アルブレヒト ドイツ連邦共和国，ランゲンフェルト デ ー−40764，フォーレンヴェーク 37

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】請求項１ 転写方向にプロモーターエレメントと、リボゾーム結合部位と、開始コドンと 、セルラーゼ又はキシラナーゼ酵素の成熟配列をコードするDNA配列に機能的に リンクするBaciluus.licheniformis ATCC 53926のアルカリ性プロテアーゼ遺伝 子のすべてのシグナル配列とを有するDNA配列を含み、本明細書でC3と名づけら れている発現システム。請求項２ 転写方向にプロモーターエレメントと、リボゾーム結合部位と、開始コドンと 、約14のアミノ酸のシグナル配列とセルラーゼ又はキシラナーゼ酵素の成熟配列 のすべてをコードするDNA配列に機能的にリンクするBaciluus.licheniformis AT CC 53926のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子の最初の12のアミノ酸のシグナル配列 とを有するDNA配列を含み、本明細書でC1と名づけられている発現システム。請求項３ 転写方向にプロモーターエレメントと、リボゾーム結合部位と、開始コドンと 、セルラーゼ又はキシラナーゼ酵素のシグナル配列と成熟配列の両方をコードす るDNA配列に機能的にリンクするBaciluus.licheniformis ATCC 53926のアルカリ 性プロテアーゼ遺伝子の配列とを有するDNA配列を含み、本明細書でC2と名づけ られている発現システム。請求項4 転写方向に修飾ATCC53926アルカリ性プロテアーゼプロモーターエレメントと 、リボゾーム結合部位と、開始コドンと、BLAPシグナル配列の最後の5アミノ酸 とセルラーゼ又はキシラナーゼ酵素のすべての成熟配列をコードするDNA配列に 機能的にリンクするBaciluus.licheniformis ATCC 53926のアルカリ性プロテア ーゼ遺伝子の最初の21個のアミノ酸のシグナル配列とを有するDNA配列を含み、 本 明細書でC4と名づけられている発現システム。請求項5 転写方向にプロモーターエレメントと、リボゾーム結合部位と、セルラーゼ又 はキシラナーゼ酵素のシグナル配列及び成熟配列のすべてをコードするDNA配列 に機能的にリンクするBaciluus.licheniformis ATCC 53926のアルカリ性プロテ アーゼ遺伝子の開始コドンとを有するDNA配列を含み、本明細書でC5又はC6と名 づけられている発現システム。請求項6 請求項1に記載の発現系を含み、Bacillus sp.で複製可能なプラスミド。請求項7 請求項2に記載の発現系を含み、Bacillus sp.で複製可能なプラスミド。請求項8 請求項3に記載の発現系を含み、Bacillus sp.で複製可能なプラスミド。請求項9 請求項4に記載の発現系を含み、Bacillus sp.で複製可能なプラスミド。請求項10 請求項5に記載の発現系を含み、Bacillus sp.で複製可能なプラスミド。請求項11 請求項1に記載の発現系を有するプラスミドを含む、形質転換Bacillusホスト 。請求項12 請求項2に記載の発現系を有するプラスミドを含む、形質転換Bacillusホスト 。請求項13 請求項3に記載の発現系を有するプラスミドを含む、形質転換Bacillusホスト 。請求項14 請求項4に記載の発現系を有するプラスミドを含む、形質転換Bacillusホスト 。請求項15 請求項5に記載の発現系を有するプラスミドを含む、形質転換Bacillusホスト 。