CZ289553B6 - Způsob výroby bílkovin s účinností protilátek - Google Patents

Abstract

Zp sob v²roby b lkovin s · innost protil tek spo v v tom, e se jeden nebo v t po et °et zc DNA, kter jsou k dem pro tuto b lkovinu a jsou prost cizorod²ch bakteri ln ch °et zc v len pomoc mikroinjekce do sam ho pronukleu oplodn n vaje n bu ky vep°e nebo kr l ka, vaje n bu ka se implantuje do vejcovodu vep°e nebo kr l ka, ml ata se p stuj a z sk v se b lkovina s · innost protil tky s lehk²m a t k²m °et zcem, pro ni je k dem ulo en² °et zec DNA.\

Description

Způsob výroby bílkovin s účinností protilátek

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby bílkovin s účinností protilátek, které je možno použít pro získání transgenních živočichů.

Dosavadní stav techniky

K expresi cizorodých řetězců DNA u zvířat je možno vstříknout DNA do samičího pronukleu oplodněného vajíčka mikroinjekcí a pak implantovat tato vajíčka do vejcovodů odpovídajících živočichů a tak vypěstovat potomstvo, u nějž dochází k expresi vstříknutého biologického materiálu. U myší bylo možno získat transgenní potomstvo také infekcí zárodků retrovirem nebo přenosem geneticky pozměněných kmenových buněk do blastocytů, jak bylo popsáno v publikacích Jánisch R.: Science 240, 1468 (1988), Palmiter R. D. a Brinster, Ann. Rev. Genet. 20, 465 (1986), R. L. Brinster a R. D. Palmiter, Harvey Lectures, serie 80 (Liss, New York, 1986), str. 1-38.

Mimoto již bylo popsáno uložení cizorodé genetické informace v řadě živočišných druhů, například u kuřat podle publikace Bosselman a další, Science 243, 533 (1989), ryb v publikaci Brém G., Brenig B., Hoersthen-Schwark, G. a Winnacker E. L.: Aquaculture 68, 209 (1988), králíků podle publikací R. E. Hammer a další, Nátuře 315, 680(1985), G. Brém a další, Zuchthygiene 20, 251 (1985), ovcí podle publikace A. J. Clark a další, Bio/Technology 7, 487 (1989), J. Simons a další, Bio/Technology 6, 179 (1988), C. E. Rexroad, Jr., a další, Mol. Reprod. Dev. 1, 164(1989) a u vepřů podle publikace G. Brém a další, Zuchthygiene 20, 251 (1985), K. M. Ebert a další, Mol. Endocrinol. 2, 277 (1988), Brém G., Brenig B., Můller M., Krausslich H. a Winnacker E. L.: Occ. Publ. Br. Soc. Anim. Prod. 12 (1988) 15-31.

U králíků bylo dosaženo exprese králičího genu c-myc pod řízením řídicích řetězců genu pro imunoglobulin, což mělo za následek indukci leukemie u transgenních králíků, jak bylo popsáno v publikaci Knight K. L., Spicker-Polat H., Kazdin D., Oi V. T.: Proč. Natr. Acad. Sci. USA 85 (1988)3130-3134.

Byly získány také transgenní králíci, u nichž docházelo k expresi genu pro lidský somatotropin, jak bylo popsáno v publikaci Enikopolov a další, Dokl. Acad. Nauk SSSR, 299 (1988) 1 2461 249. Mimoto byla popsána exprese „faktoru, uvolňujícího lidský růstový hormon“ u transgenních králíků v publikaci Gataryan a další, Dokl. Acad. Nauk SSSR 305 (1989) 726728.

Bylo dosaženo také exprese růstového hormonu skotu u transgenních vepřů a byl sledován účinek na růst transgenních zvířat podle publikace J. Amin. Sci. 66 (doplněk 1) 267 (1988).

Byli také získáni transgenní vepři, u nichž docházelo k expresi povrchového antigenu viru lidské hepatitidy B podle publikace Dokl. Akad. Nauk SSSR 306 (1989) 206-209.

Geny pro lehké a těžké řetězce protilátek s definovanou specifičností (proti nitrofenolu, trinitrofenolu nebo fosforylcholinu) byly izolovány z příslušných linií hybridomu a vneseny do myších zárodků. Došlo k expresi lehkých i těžkých řetězců u transgenních myší ve formě rekombinantních protilátek, jak bylo popsáno v publikacích Rusconi S. a Kohler G.: Nátuře 314, 330 (1985), Grosschedl R., Weaver D., Baltimore D. a Constantini F.: Cell 38 (1984) 647, Ritchie K. A., Brinster R. L. a Storb U.: Nátuře 312, 517 (1984), U. Storb a další, J. Exp. Med. 164(1986) 627, Weaver D., Constantini T., Imanishi-Kari T. a Baltimore D.: Cell 42,

-1 CZ 289553 B6

117(1985), Iglesias A., Lamers M. a Kohler G.: Nátuře 330, 482(1987), Neuberger M. S., Caskey Η. M., Peterson M., Williams T., Surani M. A.: Nátuře 338, 350 (1989).

V některých svrchu uvedených publikacích byly přenášeny pouze lehké nebo pouze těžké řetězce protilátek do zárodků myší. Při uvedených sledováních se ukázalo, že přestavěný trasgen způsobuje inhibici přestavby endogenního genu pro imunoglobulin. Bylo také dosaženo jen poměrně malé exprese nového genu u transgenních myší, přibližně 5 až 10 pg v ml séra. U jiných druhů živočichů nebyla dosud popsána exprese genu pro imunoglobulin po vnesení do zárodků.

Vynález si klade za úkol navrhnout postup, jímž by bylo možno získat z transgenních živočichů protilátky ve vyšším výtěžku.

Podstata vynálezu

Podstata vynálezu tedy spočívá ve způsobu výroby bílkovin s účinností protilátek. Postup se provádí tak, že se jeden nebo větší počet řetězců DNA, které jsou kódem pro tuto bílkovinu a jsou prosté cizorodých bakteriálních řetězců včlení pomocí mikroinjekce do samčího pronukleu oplodněné vaječné buňky vepře nebo králíka, vaječná buňka se implantuje do vejcovodu vepře nebo králíka, mláďata se pěstují a získává se bílkovina s účinností protilátky s lehkým a těžkým řetězcem, pro niž je kódem uložený řetězec DNA.

K expresi uvedené bílkoviny s účinností protilátek v lymfoidních buňkách se s výhodou užijí imunoglobulinové promotory a zesilovače transkripce. Geny, kjejichž expresi má dojít, se obvyklým způsobem podrobí subklonování v prokaryotickém vektoru a pak se pomnoží ve vhodných produkčních buňkách. Odpovídající geny se po rozštěpení vektoru vhodnými restrikčními nukleázami izolují od prokaryotických řetězců a pak vstříknou do oplodněných vajíček. K tomuto účelu je možno užít cirkularizovanou nebo s výhodou Iinearizovanou DNA. K expresi vtransgenním živočichu by mělo dojít také po vypuštění intronových řetězců genu, k jehož expresi má dojít mutaganezí in vitro. V případě, že se k expresi lehkých a těžkých řetězců protilátky užije komplementární DNA (cDNA), je možno klonovat imunoglobulinový promotor a zesilovače transkripce ve vektoru pro expresi před řetězcem cDNA, k jehož expresi má dojít. Je také možná fůze fragmentů genomu s cDNA podle publikace Gillies S. D. a další, Bio/technology 7(1989) 799-804, Orlandi a další, Proč. Nat. Acad. of Sci. USA 86(1989) 3 833-3 837. Další zlepšení exprese genu pro protilátku je popřípadě také možné při použití řídicích prvků z nekódové oblasti genu pro protilátku. Byl popsán například pro lidský gen K (krátký řetězec) příslušný zesilovač transkripce, který je uložen ve 3'-nepřenášené oblasti, v publikaci Meyer K. B. a Neuberger M. S. EMBO J. 8 (1989) 1 959-1 965, pro myší řetězce lambda-1 byl popsán rovněž zesilovač transkripce ve 3'-nepřenášené oblasti podle publikace Bich-Thuy L. a Queen C., Nucl. Acids. Res. 17 (1989) 5 307-5 321.

Pod pojmem „bílkovina s účinností protilátky“ spadají následující látky:

a) Úplné protilátky z různých druhů živočichů

Exprese je možná včleněnín úplného genu pro lehké a těžké řetězce protilátky do oplodněných vaječných buněk vepře nebo králíka, přičemž všechny izotypy protilátek mohou být produkovány. Výhodný je z těžkých řetězců řetězec gama a z lehkých řetězců řetězec K.

Protilátky mohou pocházet z myši, krysy a při použití oplodněných vaječných buněk vepře také z králíků. Zvláště výhodná je však exprese lidských protilátek.

Lidské protilátky jsou velmi důležité pro diagnostické a pro léčebné účely. K. léčebným účelům je vhodné užít myší protilátky nebo chimémí nebo humanizované protilátky, získané genetickou technologií vzhledem ktomu, že tyto látky nevyvolávají při léčebném podání imunologickou

-2CZ 289553 B6 odpověď organismu. Konstrukce stálých linií lidských buněk B s dobrou produkcí nebo hybridomů je však prakticky spojena s velkými problémy.

Kódové řetězce nebo cDNA pro lehké a těžké řetězce lidských protilátek je možno získat běžnými postupy z buněk lidských hybridomů.

Získávání lidských protilátek a jejich léčebné použití je popsáno v následujících publikacích: James H. a Bell G. T., (1987), Human monoclonal antibody produktion. Current status and fúture prospects. J. Immunol. Methods 100, 5 - 40.

Boy j. E. a James K., (1988), Human monoclonal antibodies: Their potential, problertis and prospects. In: Advances in Biotechnological Processes. sv. Π. Mizraki, A, (Ed.) A. R. Liss, lne., New York.

Larrick J. W. a Bourla J. M., (1986), The prospects for the therapeutic use of human monoclonal antibodies. J. Biol. Res. Mod. 5 (1986) 379-393.

b) Chimerizované a humanizované protilátky

Pod pojmem chimerizovaných protilátek se rozumí molekuly s variabilními oblastmi z myši nebo jiných živočišných druhů včetně segmentů pro D (diverzitu) a J (spojovací segmenty) a konstantních oblastí jiného druhu, zejména člověka. Tyto materiály je možno získat genetickou technologií, stejně jako humanizované protilátky, u nichž se užívá v genu pro lehké a těžké řetězce lidských protilátek hypervariabilních oblastí CDR (oblasti, stanovující komplementaritucomplementarity determining regions), například zodpovídající protilátky myši nebo krysy (dochází tedy k výměně lidských CDR-oblastí za odpovídající oblastí myši nebo krysy).

Tento postup se také označuje jako roubování oblastí CDR. Tyto oblasti jsou částí molekuly protilátky, která určuje afinitu k odpovídajícímu antigenu.

Při provádění způsobu podle vynálezu je možné dosáhnout exprese všech možných izotypů chimerizovaných protilátek u transgenních vepřů nebo králíků.

Získání chimerizovaných protilátek roubováním CDR-oblastí bylo popsáno v publikaci Jones P. T., Dear P. H., Foote J., Neuberger M. S. a Winter G., (1986), Replacing the complementarydetermining regions in a human antibody with those from a mouše antibody, Nátuře 321 (1986) 522 až 525.

Chimerizované protilátky jsou účinné při léčbě zhoubných onemocnění. Při této léčbě rozeznávají protilátky epitopy na antigenech, specifických pro nádorové buňky, jak bylo popsáno v publikaci Sun a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 214-218, Nishimura Y. a další, Cancer Res. 47 (1987), 999-1 005.

c) Heterobispecifické protilátky

Heterobispecifické protilátky mají velký léčebný potenciál, například při eliminaci buněk, infikovaných virem. Heterobispecifická protilátka například rozezná epitop antigenu na povrchu buňky a na cytotoxických buňkách T, jak bylo popsáno v publikacích Gilliland L. K., Clark M. R. a Waldmann H„ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988) 7 719-7 723. Staerz U. D., Yewdel J. W., a Bevan M.: a Bevan M.: Eur. J. Immunol. 17 (1987) 571-574. V evropském patentovém spisu č. 388 964 byl popsán způsob výroby heterobispecifických protilátek genetickou technologií. Exprese vtransgenním vepři nebo králíku předpokládá izolaci genu pro lehký a těžký řetězec obou protilátek a následující vstříknutí do oplodněných vaječných buněk. K tomuto účelu nemusí být obě protilátky bezpodmínečně téhož izotypu (například IgGl). Způsobem podle vynálezu je možno získat heterobispecifické protilátky různých izotypů

-3CZ 289553 B6 z transgenních vepřů nebo králíků a prozkoumat jejich vlastnosti, pokud jde o CDC (cytotoxicita, závislá na komplementu) a ADCC (buněčně zprostředkovaná cytotoxicita, závislá na protilátce).

d) Fragmenty protilátek

Pro expresi u transgenních vepřů padají v úvahu také části protilátek, například F(ab')2, fragmenty Fab, část Fc nebo fragmenty Fv. Fragmenty protilátek tohoto typuje možno získat tak, že se místo úplných řetězců DNA, které jsou kódem pro molekulu protilátky, vstříknou do vaječných buněk pouze části řetězců, které jsou kódem pro odpovídající fragment protilátky. 10 Definice jednotlivých fragmentů byly uvedeny v publikaci Roitt I., Brostoff J. a Male D.:

Immunology. Gowem Medical Publishing, Londýn, New York, 1985. Fragmenty F(ab')₂ nebo Fab mají význam pro diagnostické účely, například k zobrazení nádoru.

e) Složené bílkoviny s doménami molekuly protilátky

Pod tímto pojmem se rozumí složené bílkoviny, které obsahují část protilátky, která váže antigen a signální a převodní oblast (transmembránovou oblast a cytoplazmatickou oblast) všech členů, tvořících skupinu imunoglobulinů (například receptor buněk T nebo receptory Fc). Takové molekuly by mohly mít velký význam jako prakticky použitelná biologická čidla. Také exprese 20 heterologních složených bílkovin je způsobem podle vynálezu možná mikroinjekcí odpovídajícího řetězce DNA do vaječné buňky nebo králíka. Je například možno spojit oblast protilátky, která se váže na antigen a oblast, která po vazbě antigenu zprostředkovává enzymatickou funkci, například doménu inzulínového receptorů pro tyrosinkinázu nebo doménu receptorů EGF pro tentýž enzym nebo může jít o oblast receptorů ANF pro enzym guanylátcyk25 lázu.

Také léčebně použitelné složené bílkoviny, například s obsahem oblastí z antigenu CD4, receptorů pro HIV lidských lymfocytů T a oblastí protilátky, které zprostředkují důležité efektorové funkce, například vazbu komplementu nebo rozrušení buněk, je možno včlenit do 30 tansgenních vepřů a pak dosáhnout exprese těchto látek ve vysokém výtěžku.

f) Mutované protilátky

Jde o protilátky, které mají v důsledku zásahů genetické technologie lepší afinitu k antigenu než 35 výchozí protilátky. Do této skupiny náleží také protilátky, které se v důsledku genetického zásahu váží na komplement odlišným způsobem nebo které mají jiné vazné schopnosti, pokud jde o receptory Fc, makrofágy a monocyty, nebo mohou mít protilátky pozměněné cytolytické vlastnosti. Také u této skupiny protilátek je možno dosáhnout způsobem podle vynálezu exprese u transgenních vepřů nebo králíků.

Kromě získání protilátek ze séra je způsobem podle vynálezu také možné dosáhnout imunizace u transgenních vepřů nebo králíků. Geny pro protilátky proti určitým antigenům, zejména takovým, které u uvedených živočichů vyvolávají nebezpečné onemocnění, například chřipku nebo mor vepřů, je možno způsobem podle vynálezu vnést do zárodků těchto živočichů 45 s vysokou účinností. Tímto způsobem je možno získat živočichy, kteří jsou odolní proti určitým druhům infekcí.

Dále je možno docílit také sekrece léčebně použitelných bílkovin do mléka uvedených živočichů v důsledku exprese, dosažené způsobem podle vynálezu.

Molekula protilátky ze skupiny IgA může být vylučována do mléka (sekretorická protilátka IgA = slgA). Spojením s IgA je možno dosáhnout také vylučování jiných bílkovin, například koagulačních faktorů, jako faktorů VIII nebo faktoru IX nebo také enzymů, například lidského aktivátoru plazminogenu tkáňového typu do mléka transgenních zvířat. Vestavbou 55 odpovídajících štěpných míst pro enzym mezi sekretonickou protilátkou a ostatními částmi

-4CZ 289553 B6 složené bílkoviny, například kolagenázou nebo faktorem Xa je možno získat po izolaci z mléka a po následném enzymatickém štěpení autentickou molekulou protilátky.

Z toho, co bylo uvedeno, je zřejmé, že způsobem podle vynálezu je možno získat také transgenní živočichy tak, že se do samčího pronukleu oplodněné buňky vepře nebo králíka vnese řetězec DNA, který je kódem pro jednu nebo větší počet bílkovin s účinností protilátek, řetězec musí být prostý cizorodých bakteriálních řetězců, vaječné buňky se implantují do vejcovodu samice a potomstvo se pěstuje. Je možno užít například řetězce DNA, které jsou kódem pro bílkoviny s účinností protilátek, zaměřeným proti antigenů, vyvolávajícímu u uvedeného živočišného druhu nebezpečné onemocnění. Podobná onemocnění jsou v oboru známa stejně jako antigeny, které je vyvolávají. Pomocí těchto známých antigenů je možno získat obvyklým způsobem protilátky, z nichž je možno známým způsobem získat řetězce DNA, například z genové banky. Pak je možno užít řetězce DNA, které jsou kódem pro tyto protilátky k získání transgenních zvířat způsobem podle vynálezu. Tímto způsobem je například možno získat transgenní živočichy, kteří jsou imunní proti určitým onemocněním.

Vynález se rovněž týká transgenních živočichů, například králíků nebo vepřů, získaných způsobem podle vynálezu. Příkladem těchto živočichů mohou být ty typy, které produkují protilátku A20/44 antiidiotypického druhu, tak jak bylo popsáno v evropském patentovém spisu č. 388 964.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady v souvislosti s tabulkou, na níž jsou uvedeny geny pro protilátky, užité k mikroinjekci.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba řetězců DNA pro protilátky

Výchozími vektory jsou plazmidy pBMSl (DSM 5229) a pBMS2 (DSM 5230), které byly popsány v evropském patentovém spisu č. 388 964 jako způsob výroby heterobispecifických protilátek. Vektory obsahují gen K a gama 1 pro myší protilátku v různých vzájemných orientacích. Tyto geny byly izolovány z buněčné linie hybridomu, která vylučovala protilátku IgGl s označením A20/44 podle publikace Sablitzky F., Wildner G. a Rajewsky K.: EMBO J. 4 (1985) 345-350, Sablitzky F., Weisbaum D. a Rajewsky K.: EMBO J. 4 (1985) 3 435-3 438, Kocks C. a Rajewsky K.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988) 8 206-8 210. Protilátka A20/44 je antiidiotypická protilátka, která je namířena specificky proti haptenu NP, tj. 4-hydroxy-3nitrofenylacetátu. Tato protilátka má řetězec lambda jako lehký řetězec a řetězec gama 2a jako těžký řetězec (IgG2a).

Vektoiy, popsané v evropském patentovém spisu č. 388 964 obsahují gen K jako fragment Sáli o 5,5 kb, gen gama-1 jako fragment Sáli o 9,25 kb. Dále obsahují vektory kazety pro expresi fosfotransferázy neo a myší dihydrofolátreduktázy pod řízením promotoru z SV40.

Plazmidy pBMSl a pBMS2, které obsahují vždy tři místa pro štěpení Sáli, se částečně rozštěpí uvedeným enzymem, pak se zpracují působením nukleázy SI (1 pg částčně rozštěpené DNA působením Sáli se inkubuje 60 minut s 10jednotkami Sl-nukleázy při teplotě 30 °C v 50 mmol/1 octanu sodného o pH 4,5 s 1 mmol/1 ZnSO₄ a 0,5 % hmotnostních glycerolu), linearizovaný plazmid se izoluje na agarózovém gelu s nízkou teplotou tání a konce se spojí působením T4-ligázy. Vazná směs se pak užije ktransfekci kmene E. coli HB101 a kolonie, odolné proti 50 pg/ml ampicilinu se izolují na agarových plotnách. Pomocí analýzy restrikčními endonukleázami se získají plazmidy, u nichž je svrchu uvedenou manipulací vypuštěného místo

-5CZ 289553 B6 štěpení Sáli mezi geny K a gama-1. Získané plazmidy byly označeny jako pBMSl (lambda Sal) apBMS2.

Oba tyto plazmidy byly rozštěpeny enzymem Sáli a fragmenty s obsahem genů K a gama-1 pro protilátku byly izolovány na agarovém gelu s nízkou teplotou tání a pak rozpuštěny v 10 mM tris.HCl o pH 7,5 a 0,25 mM EDTA.

Tímto způsobem byly izolovány protilátky, prosté řetězců použitého vektoru a vhodné pro pokusy s následujícími mikroinjekcemi (tabulka 1).

Příklad 2

Získávání transgenních savců

Nejprve je nutno vyrobit roztok DNA, vhodný pro mikroinjekci, získat oplodněná vajíčka a embrya a provést mikroinjekci roztoku DNA do prekurzorů jader nebo do jader, zygoty je pak zapotřebí přenést do synchronizovaných živočichů a pak je nutno vyšetřit získané živočichy, aby bylo možno prokázat integraci genů do jejich genomu. Přitom je nutno pro jednotlivé druhy savců, například myš, králíka a vepře brát ohled na rozdíly v případě dárce a příjemce, na získání a přenos zárodků i ne rozdíly v provedení mikroinjekce.

1. Výroba roztoku DNA, vhodného pro mikroinjekci

Po izolaci fragmentu DNA a po stanovení obsahu DNA se roztok zředí tris-pufrem tak, aby v pikolitru roztoku bylo obsaženo až 1 000 kopií konstruovaného genu. Všechny roztoky, užité pro mikroinjekci DNA musí být prosté nečistot částicové povahy, aby nedošlo k ucpání mikropipet, užívaných při mikroinjekcích.

2. Získávání zárodků

Aby bylo možno zvýšit výtěžek zárodků, je nutno dosáhnout u všech dárců superovulace.

Myši

Myší samice ve stáří alespoň 6 týdnů jsou ošetřeny k vyvolání superovulace podáním 5 až 10IE (mezinárodní jednotka) PMSG (sérový gonadotropin březích kobyl). Po 48 hodinách se podá ještě 5 až 10 IE HCG (lidský choriogonodotropin) a myši se uvedou do styku s fertilními samci a nechají se zabřeznout. Následujícího rána se plakpozitivní myši usmrtí a po otevření břišní dutiny se vyjmou vejcovody. Pomocí jemné pinzety se otevře ampule vejcovodu a vypláchnutím vejcovodu se získají zárodky, které se přenesou do živného prostředí s přísadou hyaluronidázy. Vajíčka se po odstranění buněčných shluků promyjí a dále pěstují až do provedení mikroinjecí.

Králíci

Zralé samice obdrží k vyvolání superovulace jednorázovou dávku 10 až 40 IE PMSG na 1 kg hmotnosti. Superovulace vyžaduje uložení samic v jednotlivých klecích po 21 dnů nebo předběžné synchronizaci podáním 120 IE HCG nebo 0,8 pg GnRH (faktoru, uvolňujícího gonadotropin). Po 72 až 76 hodinách po injekci PMSG se králíci dvakrát v rozmezí 1 hodiny uměle oplodní nebo se nechají zabřednout běžným způsobem. Bezprostředně potom se vyvolá ovulace podáním 120 až 180 IE HCG nitrožilně. Po 19 až 21 hodinách se dárci usmrtí. Zárodky se získají vypláchnutím vejcovodů živným prostředím pro králičí embrya (BMS + 20%FKS nebo PBS + 20 % FKS) směrem od fímbrií do dělohy. V případě potřeby se ještě odstraní cumulus oophorus působením hyaluroidázy. Zárodky se promyjí a pěstují až do provedení mikroinjekci.

-6CZ 289553 B6

Vepř

V případě vepřů je možno užít také prepubertální samce s hmotností 60 až 90 kg k získání embryí. V den O se samicím podá 1250 IE PSMG. Po 72 hodinách se vyvolá ovulace podáním 750IEHCG. 24 a 36 hodin po podání HCG se zvířata oplodní. Po 24 až 27 hodinách po oplodnění se odeberou zárodky. K chirurgickému odebrání zárodků se zvířata narkotizují podáním 160 mg azaperonu (Stressnil) a 400 mg metomidáthydrochloridu (Hypnodie). Po přípravě operačního pole se kůže otevře ve střední čáře ve výšce posledních dvou bradavek, řez je dlouhý přibližně 10 cm, čímž se získá přístup k děloze, vaječníkům a vejcovodům. Uterus se otevře přibližně 5 cm pod ústím vejcovodů, do otvoru se zavede skleněná kanila, která se fixuje. Do vejcovodu se směrem od fimbrií zavede 8 cm dlouhá zahnutá oční kanyla, spojená s přibližně 30 cm dlouhou pryžovou hadičkou a rovněž se fixuje. Pak se vejcovod vypláchne 50 ml roztoku PBS. Kapalina se vede do Petriho misky a vyšetří se na přítomnost zárodku. Jinak je možno zárodky získat také usmrcením zvířat.

3. Mikroinjekce roztoku DNA

K mikroinjekcím se užije inverzní mikroskop (Zeiss, ICM 405), dva mikromanipulátory (Leitz) a vstřikovací přístroj (Eppendorf). Jeden z manipulátorů je opatřen pipetou, jíž je možno fixovat zárodek za současného podtlaku. Na druhém mikromanipulátoru je fixována injekční pipeta, naplněná roztokem DNA se stupnicí v nl. Tato pipeta je spojena s injekčním zařízením. Šipka injekční pipety má průměr 1 až 2 pm. K mikroinjekci se špička pipety vsune do zóna pellucida, do buněčné membrány a jaderné membrány do prostoru jádra a vstříkne se přibližně 1 až 2 pl roztoku DNA. Prekurzor jádra zvětší svůj objem, což je důkazem úspěšné mikroinjekce. Je také možno provést mikroinjekci do jádra zárodků ve dvoubuněčném stadiu.

Na rozdíl od myši nebo králíka je zapotřebí u většiny hospodářských zvířat, jako jsou vepři nebo skot, vaječné buňky a embrya předem zpracovat ke zviditelnění prekurzorů jader a samotných jader, například odstraněním 3 až 5 minut při 15 000 g. Mikroinjekce se pak provádí z kapky prostředí na krycím sklíčku nebo v tak zvané injekční komůrce, o mikroinjekci se vaječné buňky nebo zárodky pěstuji až do provedení jejich přenosu.

4. Přenos vaječných buněk po mikroinjekci

Myš

Příjemci se k vyvolání zdánlivé březosti nechají pářit přes noc se samci s podvázanými chámovody. Pozitivní myši se pak narkotizují k provedení přenosu. Bursa ovarica se otevře jemnou pinzetou a zárodky, zachycené pipetou pro přenos v množství 10 až 15 na jedné straně se přenesou do obou vejcovodů. K vrhu mláďat dojde 20 až 21 dnů po přenosu.

Králíci

Králičí samice, vybrané pro příjem zárodků se uloží 21 dnů přenosem k synchronizaci cyklu jednotlivě do klecí a k vyvolání zdánlivé březosti se jim podá 120 IE HCG 0,8 pg GnRH nitrosvalově. Den před přenosem se příjemcům podá k vyvolání ovulace nitrožilně 120 IE HCG. K provedení přenosu se králíci narkotizují 0,4 ml 2 % Rompunu na 1 kg hmotnosti a 0,8 ml 10 % Ketaminu na 1 kg hmotnosti. Po přípravě operačního pole a vyprázdnění močového měchýře tlakem na břišní stěnu se králíci uloží na hřbet a fixují. Pak se bezprostředně pod pupkem otevře břišní dutina v délce 4 až 5 cm tak, aby byl získán přístup k vaječníkům, vejcovodům a horní části děložního rohu a po kontrole reakce vaječníků se pozměněná embrya přenesou pomocí pipety do hloubky 2 až 2,5 cm do ampule vejcovodu. Po uzavření břišní dutiny se operační rána zašije. Pak se chrání krycím obvazem. K vrhu mláďat dojde 25 až 31 dnů po přenosu zárodku.

-7CZ 289553 B6

Vepř

Také u vepřů je možno použít jako příjemce prepubertální zvířata. 12 hodin po dárcích se podá příjemcům 750IE PMSG a po dalších 72 hodinách ještě 750IE HCG. Tato dvanáctihodinová asynchronika mezi dárcem a příjemcem zlepšuje šance zárodků na přežití po jejich přenosu. Současně s oplodněním dárců se u příjemců pozoruje říje. 135 až 136 hodin po začátku programu, v němž se jako hodina O považuje injekce PMSG u dárců je proveden přenos. Všechny zpracované zárodky v množství 35 až 45zárodků se chirurgicky přenesou do vejcovodů 10 příjemců. Zárodky se rozmístí rovnoměrně do obou děložních rohů. Nový postup je možno provádět také nekrvavým přenosem zárodků do dělohy vepře. Kvrhu mláďat dochází 113 až 116 dní po přenosu.

5. Sledování integrace

K průkazu integrace vstříknuté DNA je nutno získat vzorky tkáně novorozených zvířat, například tkáň ocasu, krevní vzorek nebo bioptický vzorek. Z těchto vzorků se izoluje vysokomolekulámí DNA genomu. K provedení analýzy se užije slot blot, dot blot nebo southem blot.

Pozitivní zvířata, tj. zvířata s integrovaným konstruovaným genem se oddělí a po dosažení pohlavní zralosti se nechají pářit s netransgenním partnerem. Mláďata se pak zkoumají na skutečnost, zda získala od rodičů transgen. Pářením hemizygotních transgenních zvířat je pak možno vypěstovat homozygotní transgenní F2-potomstvo.

K zajištění exprese se z transgenních zvířat získá po odběru krve krevní sérum. Krev se odebírá punkcí z retrobulbámího žilního plexu u myši, z žíly na okraji ucha u králíka, z véna jugularis u vepře nebo z jiné přístupné žíly nebo po usmrcení zvířete.

Příklad 3

Stanovení titru protilátek v séru transgenních zvířat

Stanovení je popsáno v evropském patentovém spisu č. 388 964. Mikrotitrační plotny se převrství 35 protilátkami proti haptenu NP, tj. 4-hydroxy-3-nitrofenylacetátu. Tyto protilátky jsou typu IgG

2a, to znamená, že krátký řetězec je řetězec lambda a dlouhý řetězec gama 2a. Užije se pufru s obsahem 0,2 mmol/litr směsi uhličitanu a hydrogenuhličitanu o pH 9,2. Po 2 hodinách se desky inkubují při použití pufru s obsahem 50 mml/1 Hepes, 0,15 mol/1 NaCl, 1 % Kroteinu C o pH 7,0. Všechny reakce se provádějí při teplotě místnosti za protřepávání. Kalibrační křivka se získá při 40 použití známého roztoku protilátky A20/44 (IgGl) při použití zřeďovací řady. Kalibrační vzorky a séra se zředí pufrem pro inkubaci, který obsahuje 50 mmol/1 Hepes, 0,15 mol/1 chloridu sodného, 1 % kroteinu C o pH 7,0, dále pufr obsahuje 0,2 mol/1 disodné soli kyseliny vinné, 0,75 % polyethylenglykolu (PEG), 0,5 % Pluronic F 68, 0,75 % PEG 40 000 a 0,01 % fenolu a směs se inkubuje 2 hodiny při teplotě místnosti. Pak se materiál z vyhloubení odsaje a plotny se 45 dvakrát promyjí pufrem pro inkubaci, načež se 1 hodinu inkubují skonjugátem (konjugát fragmentů Fab protilátky proti NP a peroxidázy (POD)). K tomuto účelu se konjugát zředí pufrem pro inkubaci na 150mU/ml účinnosti POD. Po odsátí materiálu z vyhloubení a trojnásobném promytí vyhloubení promývacím pufrem s obsahem 50 mmol/1 Hepes, 0,15 mmol/1 NaCl a 0,1 % Pluronic F 68 o pH7,0 se substrát uvede do reakce na 60 minut 50 sABTS^(R), tj. 2,2'-azino-di-[3-ethylbenzthiazolin sulfonátem]. Extinkce se měří ve fotometru (Elisa) při 405 nm proti 490 nm. Koncentrace vzorku se odečítá ze standardní kalibrovací křivky. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

-8CZ 289553 B6

Tabulka

Titr protilátek v séru transgenních zvířat

myš č.	pg/ml	králík č.	pg/ml	vepř. č.	pg/ml
970-28	3	2644	200	5814	1000
970-29	7			kontrola	0
970-31	18	kontrola	0
970-32	10
970-33	18
970-54	30
970-55	3
970-56	18
970-59	3
974-1	27
974-2	29
974-3	18
974-4	4
974-8	18
974-9	100
974-10	45
974-11	20
974-12	120
974-13	60
974-14	15
kontrola	0

Vyšetřované myši jsou potomstvem dvou séropozitivních myší 970 a 974. Část potomstva byla séronegativní, pokud jde o specifičnost protilátky. Tato část potomstva není v tabulce uvedena. Po mikroinjekci bylo všech 39 králíků vyšetřováno na expresi protilátky. Jeden z králíků obsahoval požadovanou specifickou protilátku v krevním séru. Pokud jde o vepře, byla získána dvě transgenní zvířata, jedno z nich bylo mrtvé. U živého vepře docházelo neočekávaně k expresi požadované protilátky v séru ve velmi vysoké koncentraci 1 000 pg/ml.

Příklad 4

Charakterizace produkované protilátky v séru vepřů

a) Zjištění izoelektrického bodu a imunologická fixace

Zkouška IEF byla prováděna v systému s obsahem gelu pro rychlý průchod vzorku (Pharmacia) podle doporučení výrobce. Séra transgenních a kontrolních vepřů byla zředěna v poměru 1 : 1 000 a za nedenaturačních podmínek nanesena na gel. Gradient pH na gelu v rozmezí 5 až 8 byl vizualizován kalibračními bílkovinami (Pharmacia). průchod gelem trval 30 minut. Pak byl materiál inkubován 45 minut se 100 pg polyklonální protilátky (ovčí protilátka Fcgama proti myši) v objemu 150 μΐ a překryje se proužkem acetátu celulózy. Nezreagované bílkoviny se odstraní protřepáváním přes noc spufrem, obsahující 50mmol/l fosforečnanu draselného, 0,15 mol/1 NaCl, a 0,05 % Tween o Ph7,2. Pak byly imunologické komplexy vizualizovány barvením pomocí stříbra (Pharmacia). Jako kontrola se udržují čištěné protilátky A20/44 ascitického původu.

Bylo prokázáno, že v séru transgenních vepřů je možno zjistit tytéž charakteristické identifikační pásy jako v čištěné protilátce A20/44, sérum kontrolních zvířat bylo těchto pásů prosté.

-9CZ 289553 B6

b) Čištění protilátky A20/44 ze séra transgenních vepřů

Protilátka A20/44 je antiidiotypická protilátka proti protilátce IgG2a, která je namířena proti haptenu NP. Tato protilátka byla čištěna z ascitu a byla navázána podle doporučení výrobce (Pharmacia), na Sepharosu, aktivovanou bromkyanem. Protilátka A20/44 byla vázána imunoadsorpcí na takto získaný afinitní sloupec nanesením 100 ml séra transgenních vepřů, pak byl sloupec vymýván a nakonec byly chemicky charakterizovány bílkoviny. Byla prokázána úplná shoda s protilátkou A20/44, která byla získána čištěním z ascitické tekutiny.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby bílkovin súčinností protilátek, vyznačující se tím, že se jeden nebo větší počet řetězců DNA, které jsou kódem pro tuto bílkovinu a jsou prosté cizorodých bakteriálních řetězců včlení pomocí mikroinjekce do samčího pronukleu oplodněné vaječné buňky vepře nebo králíka, vaječná buňka se implantuje do vejcovodu vepře nebo králíka, mláďata se pěstují a získává se bílkovina s účinností protilátky s lehkým a těžkým řetězcem, pro niž je kódem uložený řetězec DNA.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se užije řetězec DNA s promotorem pro imunoglobulin a zesilovačem transkripce.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tí m, že se pro mikroinjekci užije řetězec DNA v lineární formě.
4. 4. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že bílkovina súčinností protilátky je úplná nativní protilátka.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že protilátka je tvořena těžkým řetězcem gama a lehkým řetězcem K.
6. 6. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že bílkovinou s účinností protilátky je chimerizovaná protilátka.
7. 7. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že bílkovinou súčinností protilátky je heterobispecifická protilátka.
8. 8. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že bílkovinou súčinností protilátky je fragment protilátky.
9. 9. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že bílkovinou súčinností protilátky je protilátka nebo fragment protilátky, tvořící s dalším polypeptidem složenou bílkovinu.
10. 10. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že bílkovinou súčinností protilátky je mutovaná protilátka.