CZ289553B6 - Způsob výroby bílkovin s účinností protilátek - Google Patents
Způsob výroby bílkovin s účinností protilátek Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289553B6 CZ289553B6 CS199165A CS6591A CZ289553B6 CZ 289553 B6 CZ289553 B6 CZ 289553B6 CS 199165 A CS199165 A CS 199165A CS 6591 A CS6591 A CS 6591A CZ 289553 B6 CZ289553 B6 CZ 289553B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibody
- protein
- antibodies
- rabbit
- microinjection
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 34
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims abstract description 25
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 5
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 abstract 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 abstract 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 abstract 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 38
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 12
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- QBHBHOSRLDPIHG-UHFFFAOYSA-N (4-hydroxy-3-nitrophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 QBHBHOSRLDPIHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N GnRH Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- RSGQDAUWSVMQCN-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid;sodium Chemical compound [Na].[Na].OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O RSGQDAUWSVMQCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IITIZHOBOIBGBW-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 IITIZHOBOIBGBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 108010006835 Atrial Natriuretic Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- -1 Fc portion Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 108010078321 Guanylate Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000014469 Guanylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108010083930 HIV Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006481 HIV Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 1
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 1
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 101150042441 K gene Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 101100010166 Mus musculus Dok3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- XTKDAFGWCDAMPY-UHFFFAOYSA-N azaperone Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(=O)CCCN1CCN(C=2N=CC=CC=2)CC1 XTKDAFGWCDAMPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950003616 azaperone Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- NZEDTZKNEKPBGR-UHFFFAOYSA-N methyl 3-(1-phenylethyl)imidazole-4-carboxylate;hydrochloride Chemical compound Cl.COC(=O)C1=CN=CN1C(C)C1=CC=CC=C1 NZEDTZKNEKPBGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 101150063569 slgA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 101150069263 tra gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 229950002929 trinitrophenol Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000001177 vas deferen Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/107—Rabbit
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/108—Swine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Zp sob v²roby b lkovin s · innost protil tek spo v v tom, e se jeden nebo v t po et °et zc DNA, kter jsou k dem pro tuto b lkovinu a jsou prost cizorod²ch bakteri ln ch °et zc v len pomoc mikroinjekce do sam ho pronukleu oplodn n vaje n bu ky vep°e nebo kr l ka, vaje n bu ka se implantuje do vejcovodu vep°e nebo kr l ka, ml ata se p stuj a z sk v se b lkovina s · innost protil tky s lehk²m a t k²m °et zcem, pro ni je k dem ulo en² °et zec DNA.\
Description
Způsob výroby bílkovin s účinností protilátek
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby bílkovin s účinností protilátek, které je možno použít pro získání transgenních živočichů.
Dosavadní stav techniky
K expresi cizorodých řetězců DNA u zvířat je možno vstříknout DNA do samičího pronukleu oplodněného vajíčka mikroinjekcí a pak implantovat tato vajíčka do vejcovodů odpovídajících živočichů a tak vypěstovat potomstvo, u nějž dochází k expresi vstříknutého biologického materiálu. U myší bylo možno získat transgenní potomstvo také infekcí zárodků retrovirem nebo přenosem geneticky pozměněných kmenových buněk do blastocytů, jak bylo popsáno v publikacích Jánisch R.: Science 240, 1468 (1988), Palmiter R. D. a Brinster, Ann. Rev. Genet. 20, 465 (1986), R. L. Brinster a R. D. Palmiter, Harvey Lectures, serie 80 (Liss, New York, 1986), str. 1-38.
Mimoto již bylo popsáno uložení cizorodé genetické informace v řadě živočišných druhů, například u kuřat podle publikace Bosselman a další, Science 243, 533 (1989), ryb v publikaci Brém G., Brenig B., Hoersthen-Schwark, G. a Winnacker E. L.: Aquaculture 68, 209 (1988), králíků podle publikací R. E. Hammer a další, Nátuře 315, 680(1985), G. Brém a další, Zuchthygiene 20, 251 (1985), ovcí podle publikace A. J. Clark a další, Bio/Technology 7, 487 (1989), J. Simons a další, Bio/Technology 6, 179 (1988), C. E. Rexroad, Jr., a další, Mol. Reprod. Dev. 1, 164(1989) a u vepřů podle publikace G. Brém a další, Zuchthygiene 20, 251 (1985), K. M. Ebert a další, Mol. Endocrinol. 2, 277 (1988), Brém G., Brenig B., Můller M., Krausslich H. a Winnacker E. L.: Occ. Publ. Br. Soc. Anim. Prod. 12 (1988) 15-31.
U králíků bylo dosaženo exprese králičího genu c-myc pod řízením řídicích řetězců genu pro imunoglobulin, což mělo za následek indukci leukemie u transgenních králíků, jak bylo popsáno v publikaci Knight K. L., Spicker-Polat H., Kazdin D., Oi V. T.: Proč. Natr. Acad. Sci. USA 85 (1988)3130-3134.
Byly získány také transgenní králíci, u nichž docházelo k expresi genu pro lidský somatotropin, jak bylo popsáno v publikaci Enikopolov a další, Dokl. Acad. Nauk SSSR, 299 (1988) 1 2461 249. Mimoto byla popsána exprese „faktoru, uvolňujícího lidský růstový hormon“ u transgenních králíků v publikaci Gataryan a další, Dokl. Acad. Nauk SSSR 305 (1989) 726728.
Bylo dosaženo také exprese růstového hormonu skotu u transgenních vepřů a byl sledován účinek na růst transgenních zvířat podle publikace J. Amin. Sci. 66 (doplněk 1) 267 (1988).
Byli také získáni transgenní vepři, u nichž docházelo k expresi povrchového antigenu viru lidské hepatitidy B podle publikace Dokl. Akad. Nauk SSSR 306 (1989) 206-209.
Geny pro lehké a těžké řetězce protilátek s definovanou specifičností (proti nitrofenolu, trinitrofenolu nebo fosforylcholinu) byly izolovány z příslušných linií hybridomu a vneseny do myších zárodků. Došlo k expresi lehkých i těžkých řetězců u transgenních myší ve formě rekombinantních protilátek, jak bylo popsáno v publikacích Rusconi S. a Kohler G.: Nátuře 314, 330 (1985), Grosschedl R., Weaver D., Baltimore D. a Constantini F.: Cell 38 (1984) 647, Ritchie K. A., Brinster R. L. a Storb U.: Nátuře 312, 517 (1984), U. Storb a další, J. Exp. Med. 164(1986) 627, Weaver D., Constantini T., Imanishi-Kari T. a Baltimore D.: Cell 42,
-1 CZ 289553 B6
117(1985), Iglesias A., Lamers M. a Kohler G.: Nátuře 330, 482(1987), Neuberger M. S., Caskey Η. M., Peterson M., Williams T., Surani M. A.: Nátuře 338, 350 (1989).
V některých svrchu uvedených publikacích byly přenášeny pouze lehké nebo pouze těžké řetězce protilátek do zárodků myší. Při uvedených sledováních se ukázalo, že přestavěný trasgen způsobuje inhibici přestavby endogenního genu pro imunoglobulin. Bylo také dosaženo jen poměrně malé exprese nového genu u transgenních myší, přibližně 5 až 10 pg v ml séra. U jiných druhů živočichů nebyla dosud popsána exprese genu pro imunoglobulin po vnesení do zárodků.
Vynález si klade za úkol navrhnout postup, jímž by bylo možno získat z transgenních živočichů protilátky ve vyšším výtěžku.
Podstata vynálezu
Podstata vynálezu tedy spočívá ve způsobu výroby bílkovin s účinností protilátek. Postup se provádí tak, že se jeden nebo větší počet řetězců DNA, které jsou kódem pro tuto bílkovinu a jsou prosté cizorodých bakteriálních řetězců včlení pomocí mikroinjekce do samčího pronukleu oplodněné vaječné buňky vepře nebo králíka, vaječná buňka se implantuje do vejcovodu vepře nebo králíka, mláďata se pěstují a získává se bílkovina s účinností protilátky s lehkým a těžkým řetězcem, pro niž je kódem uložený řetězec DNA.
K expresi uvedené bílkoviny s účinností protilátek v lymfoidních buňkách se s výhodou užijí imunoglobulinové promotory a zesilovače transkripce. Geny, kjejichž expresi má dojít, se obvyklým způsobem podrobí subklonování v prokaryotickém vektoru a pak se pomnoží ve vhodných produkčních buňkách. Odpovídající geny se po rozštěpení vektoru vhodnými restrikčními nukleázami izolují od prokaryotických řetězců a pak vstříknou do oplodněných vajíček. K tomuto účelu je možno užít cirkularizovanou nebo s výhodou Iinearizovanou DNA. K expresi vtransgenním živočichu by mělo dojít také po vypuštění intronových řetězců genu, k jehož expresi má dojít mutaganezí in vitro. V případě, že se k expresi lehkých a těžkých řetězců protilátky užije komplementární DNA (cDNA), je možno klonovat imunoglobulinový promotor a zesilovače transkripce ve vektoru pro expresi před řetězcem cDNA, k jehož expresi má dojít. Je také možná fůze fragmentů genomu s cDNA podle publikace Gillies S. D. a další, Bio/technology 7(1989) 799-804, Orlandi a další, Proč. Nat. Acad. of Sci. USA 86(1989) 3 833-3 837. Další zlepšení exprese genu pro protilátku je popřípadě také možné při použití řídicích prvků z nekódové oblasti genu pro protilátku. Byl popsán například pro lidský gen K (krátký řetězec) příslušný zesilovač transkripce, který je uložen ve 3'-nepřenášené oblasti, v publikaci Meyer K. B. a Neuberger M. S. EMBO J. 8 (1989) 1 959-1 965, pro myší řetězce lambda-1 byl popsán rovněž zesilovač transkripce ve 3'-nepřenášené oblasti podle publikace Bich-Thuy L. a Queen C., Nucl. Acids. Res. 17 (1989) 5 307-5 321.
Pod pojmem „bílkovina s účinností protilátky“ spadají následující látky:
a) Úplné protilátky z různých druhů živočichů
Exprese je možná včleněnín úplného genu pro lehké a těžké řetězce protilátky do oplodněných vaječných buněk vepře nebo králíka, přičemž všechny izotypy protilátek mohou být produkovány. Výhodný je z těžkých řetězců řetězec gama a z lehkých řetězců řetězec K.
Protilátky mohou pocházet z myši, krysy a při použití oplodněných vaječných buněk vepře také z králíků. Zvláště výhodná je však exprese lidských protilátek.
Lidské protilátky jsou velmi důležité pro diagnostické a pro léčebné účely. K. léčebným účelům je vhodné užít myší protilátky nebo chimémí nebo humanizované protilátky, získané genetickou technologií vzhledem ktomu, že tyto látky nevyvolávají při léčebném podání imunologickou
-2CZ 289553 B6 odpověď organismu. Konstrukce stálých linií lidských buněk B s dobrou produkcí nebo hybridomů je však prakticky spojena s velkými problémy.
Kódové řetězce nebo cDNA pro lehké a těžké řetězce lidských protilátek je možno získat běžnými postupy z buněk lidských hybridomů.
Získávání lidských protilátek a jejich léčebné použití je popsáno v následujících publikacích: James H. a Bell G. T., (1987), Human monoclonal antibody produktion. Current status and fúture prospects. J. Immunol. Methods 100, 5 - 40.
Boy j. E. a James K., (1988), Human monoclonal antibodies: Their potential, problertis and prospects. In: Advances in Biotechnological Processes. sv. Π. Mizraki, A, (Ed.) A. R. Liss, lne., New York.
Larrick J. W. a Bourla J. M., (1986), The prospects for the therapeutic use of human monoclonal antibodies. J. Biol. Res. Mod. 5 (1986) 379-393.
b) Chimerizované a humanizované protilátky
Pod pojmem chimerizovaných protilátek se rozumí molekuly s variabilními oblastmi z myši nebo jiných živočišných druhů včetně segmentů pro D (diverzitu) a J (spojovací segmenty) a konstantních oblastí jiného druhu, zejména člověka. Tyto materiály je možno získat genetickou technologií, stejně jako humanizované protilátky, u nichž se užívá v genu pro lehké a těžké řetězce lidských protilátek hypervariabilních oblastí CDR (oblasti, stanovující komplementaritucomplementarity determining regions), například zodpovídající protilátky myši nebo krysy (dochází tedy k výměně lidských CDR-oblastí za odpovídající oblastí myši nebo krysy).
Tento postup se také označuje jako roubování oblastí CDR. Tyto oblasti jsou částí molekuly protilátky, která určuje afinitu k odpovídajícímu antigenu.
Při provádění způsobu podle vynálezu je možné dosáhnout exprese všech možných izotypů chimerizovaných protilátek u transgenních vepřů nebo králíků.
Získání chimerizovaných protilátek roubováním CDR-oblastí bylo popsáno v publikaci Jones P. T., Dear P. H., Foote J., Neuberger M. S. a Winter G., (1986), Replacing the complementarydetermining regions in a human antibody with those from a mouše antibody, Nátuře 321 (1986) 522 až 525.
Chimerizované protilátky jsou účinné při léčbě zhoubných onemocnění. Při této léčbě rozeznávají protilátky epitopy na antigenech, specifických pro nádorové buňky, jak bylo popsáno v publikaci Sun a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 214-218, Nishimura Y. a další, Cancer Res. 47 (1987), 999-1 005.
c) Heterobispecifické protilátky
Heterobispecifické protilátky mají velký léčebný potenciál, například při eliminaci buněk, infikovaných virem. Heterobispecifická protilátka například rozezná epitop antigenu na povrchu buňky a na cytotoxických buňkách T, jak bylo popsáno v publikacích Gilliland L. K., Clark M. R. a Waldmann H„ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988) 7 719-7 723. Staerz U. D., Yewdel J. W., a Bevan M.: a Bevan M.: Eur. J. Immunol. 17 (1987) 571-574. V evropském patentovém spisu č. 388 964 byl popsán způsob výroby heterobispecifických protilátek genetickou technologií. Exprese vtransgenním vepři nebo králíku předpokládá izolaci genu pro lehký a těžký řetězec obou protilátek a následující vstříknutí do oplodněných vaječných buněk. K tomuto účelu nemusí být obě protilátky bezpodmínečně téhož izotypu (například IgGl). Způsobem podle vynálezu je možno získat heterobispecifické protilátky různých izotypů
-3CZ 289553 B6 z transgenních vepřů nebo králíků a prozkoumat jejich vlastnosti, pokud jde o CDC (cytotoxicita, závislá na komplementu) a ADCC (buněčně zprostředkovaná cytotoxicita, závislá na protilátce).
d) Fragmenty protilátek
Pro expresi u transgenních vepřů padají v úvahu také části protilátek, například F(ab')2, fragmenty Fab, část Fc nebo fragmenty Fv. Fragmenty protilátek tohoto typuje možno získat tak, že se místo úplných řetězců DNA, které jsou kódem pro molekulu protilátky, vstříknou do vaječných buněk pouze části řetězců, které jsou kódem pro odpovídající fragment protilátky. 10 Definice jednotlivých fragmentů byly uvedeny v publikaci Roitt I., Brostoff J. a Male D.:
Immunology. Gowem Medical Publishing, Londýn, New York, 1985. Fragmenty F(ab')2 nebo Fab mají význam pro diagnostické účely, například k zobrazení nádoru.
e) Složené bílkoviny s doménami molekuly protilátky
Pod tímto pojmem se rozumí složené bílkoviny, které obsahují část protilátky, která váže antigen a signální a převodní oblast (transmembránovou oblast a cytoplazmatickou oblast) všech členů, tvořících skupinu imunoglobulinů (například receptor buněk T nebo receptory Fc). Takové molekuly by mohly mít velký význam jako prakticky použitelná biologická čidla. Také exprese 20 heterologních složených bílkovin je způsobem podle vynálezu možná mikroinjekcí odpovídajícího řetězce DNA do vaječné buňky nebo králíka. Je například možno spojit oblast protilátky, která se váže na antigen a oblast, která po vazbě antigenu zprostředkovává enzymatickou funkci, například doménu inzulínového receptorů pro tyrosinkinázu nebo doménu receptorů EGF pro tentýž enzym nebo může jít o oblast receptorů ANF pro enzym guanylátcyk25 lázu.
Také léčebně použitelné složené bílkoviny, například s obsahem oblastí z antigenu CD4, receptorů pro HIV lidských lymfocytů T a oblastí protilátky, které zprostředkují důležité efektorové funkce, například vazbu komplementu nebo rozrušení buněk, je možno včlenit do 30 tansgenních vepřů a pak dosáhnout exprese těchto látek ve vysokém výtěžku.
f) Mutované protilátky
Jde o protilátky, které mají v důsledku zásahů genetické technologie lepší afinitu k antigenu než 35 výchozí protilátky. Do této skupiny náleží také protilátky, které se v důsledku genetického zásahu váží na komplement odlišným způsobem nebo které mají jiné vazné schopnosti, pokud jde o receptory Fc, makrofágy a monocyty, nebo mohou mít protilátky pozměněné cytolytické vlastnosti. Také u této skupiny protilátek je možno dosáhnout způsobem podle vynálezu exprese u transgenních vepřů nebo králíků.
Kromě získání protilátek ze séra je způsobem podle vynálezu také možné dosáhnout imunizace u transgenních vepřů nebo králíků. Geny pro protilátky proti určitým antigenům, zejména takovým, které u uvedených živočichů vyvolávají nebezpečné onemocnění, například chřipku nebo mor vepřů, je možno způsobem podle vynálezu vnést do zárodků těchto živočichů 45 s vysokou účinností. Tímto způsobem je možno získat živočichy, kteří jsou odolní proti určitým druhům infekcí.
Dále je možno docílit také sekrece léčebně použitelných bílkovin do mléka uvedených živočichů v důsledku exprese, dosažené způsobem podle vynálezu.
Molekula protilátky ze skupiny IgA může být vylučována do mléka (sekretorická protilátka IgA = slgA). Spojením s IgA je možno dosáhnout také vylučování jiných bílkovin, například koagulačních faktorů, jako faktorů VIII nebo faktoru IX nebo také enzymů, například lidského aktivátoru plazminogenu tkáňového typu do mléka transgenních zvířat. Vestavbou 55 odpovídajících štěpných míst pro enzym mezi sekretonickou protilátkou a ostatními částmi
-4CZ 289553 B6 složené bílkoviny, například kolagenázou nebo faktorem Xa je možno získat po izolaci z mléka a po následném enzymatickém štěpení autentickou molekulou protilátky.
Z toho, co bylo uvedeno, je zřejmé, že způsobem podle vynálezu je možno získat také transgenní živočichy tak, že se do samčího pronukleu oplodněné buňky vepře nebo králíka vnese řetězec DNA, který je kódem pro jednu nebo větší počet bílkovin s účinností protilátek, řetězec musí být prostý cizorodých bakteriálních řetězců, vaječné buňky se implantují do vejcovodu samice a potomstvo se pěstuje. Je možno užít například řetězce DNA, které jsou kódem pro bílkoviny s účinností protilátek, zaměřeným proti antigenů, vyvolávajícímu u uvedeného živočišného druhu nebezpečné onemocnění. Podobná onemocnění jsou v oboru známa stejně jako antigeny, které je vyvolávají. Pomocí těchto známých antigenů je možno získat obvyklým způsobem protilátky, z nichž je možno známým způsobem získat řetězce DNA, například z genové banky. Pak je možno užít řetězce DNA, které jsou kódem pro tyto protilátky k získání transgenních zvířat způsobem podle vynálezu. Tímto způsobem je například možno získat transgenní živočichy, kteří jsou imunní proti určitým onemocněním.
Vynález se rovněž týká transgenních živočichů, například králíků nebo vepřů, získaných způsobem podle vynálezu. Příkladem těchto živočichů mohou být ty typy, které produkují protilátku A20/44 antiidiotypického druhu, tak jak bylo popsáno v evropském patentovém spisu č. 388 964.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady v souvislosti s tabulkou, na níž jsou uvedeny geny pro protilátky, užité k mikroinjekci.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Výroba řetězců DNA pro protilátky
Výchozími vektory jsou plazmidy pBMSl (DSM 5229) a pBMS2 (DSM 5230), které byly popsány v evropském patentovém spisu č. 388 964 jako způsob výroby heterobispecifických protilátek. Vektory obsahují gen K a gama 1 pro myší protilátku v různých vzájemných orientacích. Tyto geny byly izolovány z buněčné linie hybridomu, která vylučovala protilátku IgGl s označením A20/44 podle publikace Sablitzky F., Wildner G. a Rajewsky K.: EMBO J. 4 (1985) 345-350, Sablitzky F., Weisbaum D. a Rajewsky K.: EMBO J. 4 (1985) 3 435-3 438, Kocks C. a Rajewsky K.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988) 8 206-8 210. Protilátka A20/44 je antiidiotypická protilátka, která je namířena specificky proti haptenu NP, tj. 4-hydroxy-3nitrofenylacetátu. Tato protilátka má řetězec lambda jako lehký řetězec a řetězec gama 2a jako těžký řetězec (IgG2a).
Vektoiy, popsané v evropském patentovém spisu č. 388 964 obsahují gen K jako fragment Sáli o 5,5 kb, gen gama-1 jako fragment Sáli o 9,25 kb. Dále obsahují vektory kazety pro expresi fosfotransferázy neo a myší dihydrofolátreduktázy pod řízením promotoru z SV40.
Plazmidy pBMSl a pBMS2, které obsahují vždy tři místa pro štěpení Sáli, se částečně rozštěpí uvedeným enzymem, pak se zpracují působením nukleázy SI (1 pg částčně rozštěpené DNA působením Sáli se inkubuje 60 minut s 10jednotkami Sl-nukleázy při teplotě 30 °C v 50 mmol/1 octanu sodného o pH 4,5 s 1 mmol/1 ZnSO4 a 0,5 % hmotnostních glycerolu), linearizovaný plazmid se izoluje na agarózovém gelu s nízkou teplotou tání a konce se spojí působením T4-ligázy. Vazná směs se pak užije ktransfekci kmene E. coli HB101 a kolonie, odolné proti 50 pg/ml ampicilinu se izolují na agarových plotnách. Pomocí analýzy restrikčními endonukleázami se získají plazmidy, u nichž je svrchu uvedenou manipulací vypuštěného místo
-5CZ 289553 B6 štěpení Sáli mezi geny K a gama-1. Získané plazmidy byly označeny jako pBMSl (lambda Sal) apBMS2.
Oba tyto plazmidy byly rozštěpeny enzymem Sáli a fragmenty s obsahem genů K a gama-1 pro protilátku byly izolovány na agarovém gelu s nízkou teplotou tání a pak rozpuštěny v 10 mM tris.HCl o pH 7,5 a 0,25 mM EDTA.
Tímto způsobem byly izolovány protilátky, prosté řetězců použitého vektoru a vhodné pro pokusy s následujícími mikroinjekcemi (tabulka 1).
Příklad 2
Získávání transgenních savců
Nejprve je nutno vyrobit roztok DNA, vhodný pro mikroinjekci, získat oplodněná vajíčka a embrya a provést mikroinjekci roztoku DNA do prekurzorů jader nebo do jader, zygoty je pak zapotřebí přenést do synchronizovaných živočichů a pak je nutno vyšetřit získané živočichy, aby bylo možno prokázat integraci genů do jejich genomu. Přitom je nutno pro jednotlivé druhy savců, například myš, králíka a vepře brát ohled na rozdíly v případě dárce a příjemce, na získání a přenos zárodků i ne rozdíly v provedení mikroinjekce.
1. Výroba roztoku DNA, vhodného pro mikroinjekci
Po izolaci fragmentu DNA a po stanovení obsahu DNA se roztok zředí tris-pufrem tak, aby v pikolitru roztoku bylo obsaženo až 1 000 kopií konstruovaného genu. Všechny roztoky, užité pro mikroinjekci DNA musí být prosté nečistot částicové povahy, aby nedošlo k ucpání mikropipet, užívaných při mikroinjekcích.
2. Získávání zárodků
Aby bylo možno zvýšit výtěžek zárodků, je nutno dosáhnout u všech dárců superovulace.
Myši
Myší samice ve stáří alespoň 6 týdnů jsou ošetřeny k vyvolání superovulace podáním 5 až 10IE (mezinárodní jednotka) PMSG (sérový gonadotropin březích kobyl). Po 48 hodinách se podá ještě 5 až 10 IE HCG (lidský choriogonodotropin) a myši se uvedou do styku s fertilními samci a nechají se zabřeznout. Následujícího rána se plakpozitivní myši usmrtí a po otevření břišní dutiny se vyjmou vejcovody. Pomocí jemné pinzety se otevře ampule vejcovodu a vypláchnutím vejcovodu se získají zárodky, které se přenesou do živného prostředí s přísadou hyaluronidázy. Vajíčka se po odstranění buněčných shluků promyjí a dále pěstují až do provedení mikroinjecí.
Králíci
Zralé samice obdrží k vyvolání superovulace jednorázovou dávku 10 až 40 IE PMSG na 1 kg hmotnosti. Superovulace vyžaduje uložení samic v jednotlivých klecích po 21 dnů nebo předběžné synchronizaci podáním 120 IE HCG nebo 0,8 pg GnRH (faktoru, uvolňujícího gonadotropin). Po 72 až 76 hodinách po injekci PMSG se králíci dvakrát v rozmezí 1 hodiny uměle oplodní nebo se nechají zabřednout běžným způsobem. Bezprostředně potom se vyvolá ovulace podáním 120 až 180 IE HCG nitrožilně. Po 19 až 21 hodinách se dárci usmrtí. Zárodky se získají vypláchnutím vejcovodů živným prostředím pro králičí embrya (BMS + 20%FKS nebo PBS + 20 % FKS) směrem od fímbrií do dělohy. V případě potřeby se ještě odstraní cumulus oophorus působením hyaluroidázy. Zárodky se promyjí a pěstují až do provedení mikroinjekci.
-6CZ 289553 B6
Vepř
V případě vepřů je možno užít také prepubertální samce s hmotností 60 až 90 kg k získání embryí. V den O se samicím podá 1250 IE PSMG. Po 72 hodinách se vyvolá ovulace podáním 750IEHCG. 24 a 36 hodin po podání HCG se zvířata oplodní. Po 24 až 27 hodinách po oplodnění se odeberou zárodky. K chirurgickému odebrání zárodků se zvířata narkotizují podáním 160 mg azaperonu (Stressnil) a 400 mg metomidáthydrochloridu (Hypnodie). Po přípravě operačního pole se kůže otevře ve střední čáře ve výšce posledních dvou bradavek, řez je dlouhý přibližně 10 cm, čímž se získá přístup k děloze, vaječníkům a vejcovodům. Uterus se otevře přibližně 5 cm pod ústím vejcovodů, do otvoru se zavede skleněná kanila, která se fixuje. Do vejcovodu se směrem od fimbrií zavede 8 cm dlouhá zahnutá oční kanyla, spojená s přibližně 30 cm dlouhou pryžovou hadičkou a rovněž se fixuje. Pak se vejcovod vypláchne 50 ml roztoku PBS. Kapalina se vede do Petriho misky a vyšetří se na přítomnost zárodku. Jinak je možno zárodky získat také usmrcením zvířat.
3. Mikroinjekce roztoku DNA
K mikroinjekcím se užije inverzní mikroskop (Zeiss, ICM 405), dva mikromanipulátory (Leitz) a vstřikovací přístroj (Eppendorf). Jeden z manipulátorů je opatřen pipetou, jíž je možno fixovat zárodek za současného podtlaku. Na druhém mikromanipulátoru je fixována injekční pipeta, naplněná roztokem DNA se stupnicí v nl. Tato pipeta je spojena s injekčním zařízením. Šipka injekční pipety má průměr 1 až 2 pm. K mikroinjekci se špička pipety vsune do zóna pellucida, do buněčné membrány a jaderné membrány do prostoru jádra a vstříkne se přibližně 1 až 2 pl roztoku DNA. Prekurzor jádra zvětší svůj objem, což je důkazem úspěšné mikroinjekce. Je také možno provést mikroinjekci do jádra zárodků ve dvoubuněčném stadiu.
Na rozdíl od myši nebo králíka je zapotřebí u většiny hospodářských zvířat, jako jsou vepři nebo skot, vaječné buňky a embrya předem zpracovat ke zviditelnění prekurzorů jader a samotných jader, například odstraněním 3 až 5 minut při 15 000 g. Mikroinjekce se pak provádí z kapky prostředí na krycím sklíčku nebo v tak zvané injekční komůrce, o mikroinjekci se vaječné buňky nebo zárodky pěstuji až do provedení jejich přenosu.
4. Přenos vaječných buněk po mikroinjekci
Myš
Příjemci se k vyvolání zdánlivé březosti nechají pářit přes noc se samci s podvázanými chámovody. Pozitivní myši se pak narkotizují k provedení přenosu. Bursa ovarica se otevře jemnou pinzetou a zárodky, zachycené pipetou pro přenos v množství 10 až 15 na jedné straně se přenesou do obou vejcovodů. K vrhu mláďat dojde 20 až 21 dnů po přenosu.
Králíci
Králičí samice, vybrané pro příjem zárodků se uloží 21 dnů přenosem k synchronizaci cyklu jednotlivě do klecí a k vyvolání zdánlivé březosti se jim podá 120 IE HCG 0,8 pg GnRH nitrosvalově. Den před přenosem se příjemcům podá k vyvolání ovulace nitrožilně 120 IE HCG. K provedení přenosu se králíci narkotizují 0,4 ml 2 % Rompunu na 1 kg hmotnosti a 0,8 ml 10 % Ketaminu na 1 kg hmotnosti. Po přípravě operačního pole a vyprázdnění močového měchýře tlakem na břišní stěnu se králíci uloží na hřbet a fixují. Pak se bezprostředně pod pupkem otevře břišní dutina v délce 4 až 5 cm tak, aby byl získán přístup k vaječníkům, vejcovodům a horní části děložního rohu a po kontrole reakce vaječníků se pozměněná embrya přenesou pomocí pipety do hloubky 2 až 2,5 cm do ampule vejcovodu. Po uzavření břišní dutiny se operační rána zašije. Pak se chrání krycím obvazem. K vrhu mláďat dojde 25 až 31 dnů po přenosu zárodku.
-7CZ 289553 B6
Vepř
Také u vepřů je možno použít jako příjemce prepubertální zvířata. 12 hodin po dárcích se podá příjemcům 750IE PMSG a po dalších 72 hodinách ještě 750IE HCG. Tato dvanáctihodinová asynchronika mezi dárcem a příjemcem zlepšuje šance zárodků na přežití po jejich přenosu. Současně s oplodněním dárců se u příjemců pozoruje říje. 135 až 136 hodin po začátku programu, v němž se jako hodina O považuje injekce PMSG u dárců je proveden přenos. Všechny zpracované zárodky v množství 35 až 45zárodků se chirurgicky přenesou do vejcovodů 10 příjemců. Zárodky se rozmístí rovnoměrně do obou děložních rohů. Nový postup je možno provádět také nekrvavým přenosem zárodků do dělohy vepře. Kvrhu mláďat dochází 113 až 116 dní po přenosu.
5. Sledování integrace
K průkazu integrace vstříknuté DNA je nutno získat vzorky tkáně novorozených zvířat, například tkáň ocasu, krevní vzorek nebo bioptický vzorek. Z těchto vzorků se izoluje vysokomolekulámí DNA genomu. K provedení analýzy se užije slot blot, dot blot nebo southem blot.
Pozitivní zvířata, tj. zvířata s integrovaným konstruovaným genem se oddělí a po dosažení pohlavní zralosti se nechají pářit s netransgenním partnerem. Mláďata se pak zkoumají na skutečnost, zda získala od rodičů transgen. Pářením hemizygotních transgenních zvířat je pak možno vypěstovat homozygotní transgenní F2-potomstvo.
K zajištění exprese se z transgenních zvířat získá po odběru krve krevní sérum. Krev se odebírá punkcí z retrobulbámího žilního plexu u myši, z žíly na okraji ucha u králíka, z véna jugularis u vepře nebo z jiné přístupné žíly nebo po usmrcení zvířete.
Příklad 3
Stanovení titru protilátek v séru transgenních zvířat
Stanovení je popsáno v evropském patentovém spisu č. 388 964. Mikrotitrační plotny se převrství 35 protilátkami proti haptenu NP, tj. 4-hydroxy-3-nitrofenylacetátu. Tyto protilátky jsou typu IgG
2a, to znamená, že krátký řetězec je řetězec lambda a dlouhý řetězec gama 2a. Užije se pufru s obsahem 0,2 mmol/litr směsi uhličitanu a hydrogenuhličitanu o pH 9,2. Po 2 hodinách se desky inkubují při použití pufru s obsahem 50 mml/1 Hepes, 0,15 mol/1 NaCl, 1 % Kroteinu C o pH 7,0. Všechny reakce se provádějí při teplotě místnosti za protřepávání. Kalibrační křivka se získá při 40 použití známého roztoku protilátky A20/44 (IgGl) při použití zřeďovací řady. Kalibrační vzorky a séra se zředí pufrem pro inkubaci, který obsahuje 50 mmol/1 Hepes, 0,15 mol/1 chloridu sodného, 1 % kroteinu C o pH 7,0, dále pufr obsahuje 0,2 mol/1 disodné soli kyseliny vinné, 0,75 % polyethylenglykolu (PEG), 0,5 % Pluronic F 68, 0,75 % PEG 40 000 a 0,01 % fenolu a směs se inkubuje 2 hodiny při teplotě místnosti. Pak se materiál z vyhloubení odsaje a plotny se 45 dvakrát promyjí pufrem pro inkubaci, načež se 1 hodinu inkubují skonjugátem (konjugát fragmentů Fab protilátky proti NP a peroxidázy (POD)). K tomuto účelu se konjugát zředí pufrem pro inkubaci na 150mU/ml účinnosti POD. Po odsátí materiálu z vyhloubení a trojnásobném promytí vyhloubení promývacím pufrem s obsahem 50 mmol/1 Hepes, 0,15 mmol/1 NaCl a 0,1 % Pluronic F 68 o pH7,0 se substrát uvede do reakce na 60 minut 50 sABTS(R), tj. 2,2'-azino-di-[3-ethylbenzthiazolin sulfonátem]. Extinkce se měří ve fotometru (Elisa) při 405 nm proti 490 nm. Koncentrace vzorku se odečítá ze standardní kalibrovací křivky. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:
-8CZ 289553 B6
Tabulka
Titr protilátek v séru transgenních zvířat
myš č. | pg/ml | králík č. | pg/ml | vepř. č. | pg/ml |
970-28 | 3 | 2644 | 200 | 5814 | 1000 |
970-29 | 7 | kontrola | 0 | ||
970-31 | 18 | kontrola | 0 | ||
970-32 | 10 | ||||
970-33 | 18 | ||||
970-54 | 30 | ||||
970-55 | 3 | ||||
970-56 | 18 | ||||
970-59 | 3 | ||||
974-1 | 27 | ||||
974-2 | 29 | ||||
974-3 | 18 | ||||
974-4 | 4 | ||||
974-8 | 18 | ||||
974-9 | 100 | ||||
974-10 | 45 | ||||
974-11 | 20 | ||||
974-12 | 120 | ||||
974-13 | 60 | ||||
974-14 | 15 | ||||
kontrola | 0 |
Vyšetřované myši jsou potomstvem dvou séropozitivních myší 970 a 974. Část potomstva byla séronegativní, pokud jde o specifičnost protilátky. Tato část potomstva není v tabulce uvedena. Po mikroinjekci bylo všech 39 králíků vyšetřováno na expresi protilátky. Jeden z králíků obsahoval požadovanou specifickou protilátku v krevním séru. Pokud jde o vepře, byla získána dvě transgenní zvířata, jedno z nich bylo mrtvé. U živého vepře docházelo neočekávaně k expresi požadované protilátky v séru ve velmi vysoké koncentraci 1 000 pg/ml.
Příklad 4
Charakterizace produkované protilátky v séru vepřů
a) Zjištění izoelektrického bodu a imunologická fixace
Zkouška IEF byla prováděna v systému s obsahem gelu pro rychlý průchod vzorku (Pharmacia) podle doporučení výrobce. Séra transgenních a kontrolních vepřů byla zředěna v poměru 1 : 1 000 a za nedenaturačních podmínek nanesena na gel. Gradient pH na gelu v rozmezí 5 až 8 byl vizualizován kalibračními bílkovinami (Pharmacia). průchod gelem trval 30 minut. Pak byl materiál inkubován 45 minut se 100 pg polyklonální protilátky (ovčí protilátka Fcgama proti myši) v objemu 150 μΐ a překryje se proužkem acetátu celulózy. Nezreagované bílkoviny se odstraní protřepáváním přes noc spufrem, obsahující 50mmol/l fosforečnanu draselného, 0,15 mol/1 NaCl, a 0,05 % Tween o Ph7,2. Pak byly imunologické komplexy vizualizovány barvením pomocí stříbra (Pharmacia). Jako kontrola se udržují čištěné protilátky A20/44 ascitického původu.
Bylo prokázáno, že v séru transgenních vepřů je možno zjistit tytéž charakteristické identifikační pásy jako v čištěné protilátce A20/44, sérum kontrolních zvířat bylo těchto pásů prosté.
-9CZ 289553 B6
b) Čištění protilátky A20/44 ze séra transgenních vepřů
Protilátka A20/44 je antiidiotypická protilátka proti protilátce IgG2a, která je namířena proti haptenu NP. Tato protilátka byla čištěna z ascitu a byla navázána podle doporučení výrobce (Pharmacia), na Sepharosu, aktivovanou bromkyanem. Protilátka A20/44 byla vázána imunoadsorpcí na takto získaný afinitní sloupec nanesením 100 ml séra transgenních vepřů, pak byl sloupec vymýván a nakonec byly chemicky charakterizovány bílkoviny. Byla prokázána úplná shoda s protilátkou A20/44, která byla získána čištěním z ascitické tekutiny.
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob výroby bílkovin súčinností protilátek, vyznačující se tím, že se jeden nebo větší počet řetězců DNA, které jsou kódem pro tuto bílkovinu a jsou prosté cizorodých bakteriálních řetězců včlení pomocí mikroinjekce do samčího pronukleu oplodněné vaječné buňky vepře nebo králíka, vaječná buňka se implantuje do vejcovodu vepře nebo králíka, mláďata se pěstují a získává se bílkovina s účinností protilátky s lehkým a těžkým řetězcem, pro niž je kódem uložený řetězec DNA.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se užije řetězec DNA s promotorem pro imunoglobulin a zesilovačem transkripce.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tí m, že se pro mikroinjekci užije řetězec DNA v lineární formě.
- 4. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že bílkovina súčinností protilátky je úplná nativní protilátka.
- 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že protilátka je tvořena těžkým řetězcem gama a lehkým řetězcem K.
- 6. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že bílkovinou s účinností protilátky je chimerizovaná protilátka.
- 7. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že bílkovinou súčinností protilátky je heterobispecifická protilátka.
- 8. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že bílkovinou súčinností protilátky je fragment protilátky.
- 9. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že bílkovinou súčinností protilátky je protilátka nebo fragment protilátky, tvořící s dalším polypeptidem složenou bílkovinu.
- 10. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že bílkovinou súčinností protilátky je mutovaná protilátka.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4000939A DE4000939A1 (de) | 1990-01-15 | 1990-01-15 | Verfahren zur antikoerpergewinnung |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CS6591A3 CS6591A3 (en) | 1991-09-15 |
CZ289553B6 true CZ289553B6 (cs) | 2002-02-13 |
Family
ID=6398081
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CS199165A CZ289553B6 (cs) | 1990-01-15 | 1991-01-14 | Způsob výroby bílkovin s účinností protilátek |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5639457A (cs) |
EP (1) | EP0438102B1 (cs) |
JP (1) | JPH0570499A (cs) |
AT (1) | ATE244761T1 (cs) |
AU (1) | AU627099B2 (cs) |
CA (1) | CA2034034C (cs) |
CZ (1) | CZ289553B6 (cs) |
DE (2) | DE4000939A1 (cs) |
HU (1) | HU218047B (cs) |
LV (1) | LV10790B (cs) |
PL (2) | PL170647B1 (cs) |
RU (1) | RU2095412C1 (cs) |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU633698B2 (en) * | 1990-01-12 | 1993-02-04 | Amgen Fremont Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US5827690A (en) * | 1993-12-20 | 1998-10-27 | Genzyme Transgenics Corporatiion | Transgenic production of antibodies in milk |
US6335160B1 (en) * | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US20040054593A1 (en) * | 1997-03-21 | 2004-03-18 | Van Luchen Andrew S. | Method and apparatus for facilitating the play of fractional lottery tickets utilizing point-of -sale terminals |
US7820878B2 (en) * | 1999-11-19 | 2010-10-26 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
US7074983B2 (en) * | 1999-11-19 | 2006-07-11 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovine comprising human immunoglobulin loci and producing human immunoglobulin |
US7414170B2 (en) * | 1999-11-19 | 2008-08-19 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovines capable of human antibody production |
WO2001035735A1 (en) * | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Hematech, Llc | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
US8030537B1 (en) | 2000-07-27 | 2011-10-04 | Apogene Gmbh & Co. Kg | Somatic cloning gene transfer for the production of recombinant proteins, cells and organs |
NZ524523A (en) * | 2000-08-03 | 2006-02-24 | Therapeutic Human Polyclonals | Production of humanized antibodies in transgenic animals |
US20020142397A1 (en) * | 2000-12-22 | 2002-10-03 | Philippe Collas | Methods for altering cell fate |
US7491534B2 (en) * | 2000-12-22 | 2009-02-17 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Methods for altering cell fate to generate T-cells specific for an antigen of interest |
AU2002232858B2 (en) | 2000-12-22 | 2007-01-11 | Sab, Llc | Methods for cloning mammals using reprogrammed donor chromatin or donor cells |
JP2006505291A (ja) | 2002-11-08 | 2006-02-16 | ヘマテック,エルエルシー | プリオンタンパク質活性が低減されたトランスジェニック有蹄動物及びその用途 |
US7514593B2 (en) * | 2003-05-30 | 2009-04-07 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Animal model for chronic obstructive pulmonary disease and cystic fibrosis |
JP2007533328A (ja) | 2004-04-22 | 2007-11-22 | キリンホールディングス株式会社 | トランスジェニック動物及びその用途 |
CA2568201C (en) | 2004-05-24 | 2013-07-30 | Universitat Zu Koln | Identification of ergothioneine transporter and therapeutic uses thereof |
US8124831B2 (en) * | 2006-07-06 | 2012-02-28 | Duke University | Transgenic mice carrying functional single nucleotide polymorphisms in brain-specific tryptophan hydroxylase |
PE20081216A1 (es) | 2006-09-01 | 2008-09-04 | Therapeutic Human Polyclonals Inc | Expresion mejorada de la inmunoglobulina humana o humanizada en animales transgenicos no humanos |
US9493545B2 (en) | 2009-02-11 | 2016-11-15 | Albumedix A/S | Albumin variants and conjugates |
EP3421491A3 (en) | 2009-10-30 | 2019-03-27 | Albumedix Ltd | Albumin variants |
JP5969458B2 (ja) | 2010-04-09 | 2016-08-17 | アルブミディクス アクティーゼルスカブ | アルブミン誘導体及び変異体 |
EP2780364A2 (en) | 2011-11-18 | 2014-09-24 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Proteins with improved half-life and other properties |
BR112014018679A2 (pt) | 2012-03-16 | 2017-07-04 | Novozymes Biopharma Dk As | variantes de albumina |
BR112015010318A2 (pt) | 2012-11-08 | 2017-08-22 | Albumedix As | Variantes de albumina |
EP2956480B1 (en) | 2013-02-13 | 2019-09-04 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Highly galactosylated anti-tnf-alpha antibodies and uses thereof |
EP2956003A2 (en) | 2013-02-13 | 2015-12-23 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Proteins with modified glycosylation and methods of production thereof |
AU2014217831A1 (en) * | 2013-02-16 | 2015-07-16 | Albumedix Ltd. | Pharmacokinetic animal model |
CN108137674B (zh) | 2015-08-20 | 2022-12-06 | 阿尔布梅迪克斯医疗有限公司 | 白蛋白变体和缀合物 |
AU2019473345A1 (en) | 2019-11-05 | 2022-05-05 | Versiti Blood Research Institute Foundation, Inc. | A murine model of fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia |
US11266129B2 (en) | 2019-11-05 | 2022-03-08 | Versiti Blood Research Institute Foundation, Inc. | Murine model of fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3382317D1 (de) * | 1982-03-15 | 1991-07-25 | Schering Corp | Hybride dns, damit hergestellte bindungszusammensetzung und verfahren dafuer. |
US4870009A (en) * | 1982-11-22 | 1989-09-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals |
JPS6242933A (ja) * | 1985-04-10 | 1987-02-24 | Teijin Ltd | 水痘帯状疱疹ウイルスに対するヒト型モノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
GB8823869D0 (en) * | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
-
1990
- 1990-01-15 DE DE4000939A patent/DE4000939A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-01-07 AU AU68674/91A patent/AU627099B2/en not_active Ceased
- 1991-01-10 JP JP3001559A patent/JPH0570499A/ja active Pending
- 1991-01-11 CA CA002034034A patent/CA2034034C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-14 CZ CS199165A patent/CZ289553B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-01-14 PL PL91288697A patent/PL170647B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-01-14 DE DE59109255T patent/DE59109255D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-14 HU HU4/91A patent/HU218047B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-01-14 PL PL91314595A patent/PL171474B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-01-14 EP EP91100376A patent/EP0438102B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-14 AT AT91100376T patent/ATE244761T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-14 RU SU914894393A patent/RU2095412C1/ru not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-06-08 LV LVP-93-499A patent/LV10790B/lv unknown
-
1994
- 1994-11-15 US US08/341,888 patent/US5639457A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HU218047B (hu) | 2000-05-28 |
RU2095412C1 (ru) | 1997-11-10 |
CA2034034A1 (en) | 1991-07-16 |
AU627099B2 (en) | 1992-08-13 |
JPH0570499A (ja) | 1993-03-23 |
PL171474B1 (pl) | 1997-05-30 |
LV10790A (lv) | 1995-08-20 |
HUT58819A (en) | 1992-03-30 |
DE59109255D1 (de) | 2003-08-14 |
PL170647B1 (pl) | 1997-01-31 |
EP0438102B1 (de) | 2003-07-09 |
US5639457A (en) | 1997-06-17 |
HU910094D0 (en) | 1991-08-28 |
AU6867491A (en) | 1991-11-14 |
EP0438102A1 (de) | 1991-07-24 |
LV10790B (en) | 1996-06-20 |
ATE244761T1 (de) | 2003-07-15 |
CA2034034C (en) | 2004-06-01 |
CS6591A3 (en) | 1991-09-15 |
DE4000939A1 (de) | 1991-07-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5639457A (en) | Process for the production of antibodies | |
AU2017251797B2 (en) | Humanized light chain mice | |
US8084024B2 (en) | Method for producing antibodies | |
CA2181433C (en) | Materials and methods for management of hyperacute rejection in human xenotransplantation | |
CN105861548B (zh) | Adam6小鼠 | |
JP3523245B1 (ja) | ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物 | |
JP6641379B2 (ja) | トランスジェニックマウス | |
JP2003501103A (ja) | 非同種スイッチ領域を介して、ヒト抗体の特定のアイソタイプを産生するためのトランスジェニック動物 | |
JP2013198489A (ja) | ヒトIgλ軽鎖遺伝子を保有するトランスジェニック動物 | |
JP2001527386A (ja) | 異種抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物 | |
WO1995020661A1 (en) | Materials and methods for management of hyperacute rejection in human xenotransplantation | |
JPH04365487A (ja) | 組換dna−構造体、組換ベクター、トランスゲン動物の乳からの蛋白質の取得法、トランスゲン動物の製法及びトランスゲン動物の乳 | |
US10717991B2 (en) | Transgenic pig which simultaneously expresses HO-1 gene and TNFR1-Fc gene, and comprises knocked-out GGTA1 gene, and use thereof | |
AU711144B2 (en) | Materials and methods for management of hyperacute rejection in human xenotransplantation | |
Brem | Generation of recombinant antibody transgenic farm animals | |
NZ627211B2 (en) | Humanized light chain mice | |
NZ612643B2 (en) | Adam6 mice |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20050114 |