JPH0570499A - 抗体活性を有する蛋白質の取得法、診断法及び形質転換した動物の製法 - Google Patents

抗体活性を有する蛋白質の取得法、診断法及び形質転換した動物の製法

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JPH0570499A
JPH0570499A JP3001559A JP155991A JPH0570499A JP H0570499 A JPH0570499 A JP H0570499A JP 3001559 A JP3001559 A JP 3001559A JP 155991 A JP155991 A JP 155991A JP H0570499 A JPH0570499 A JP H0570499A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗体活性を有する蛋白質の取得法、抗体活性
を有する蛋白質、診断法、形質転換した動物の製法及び
形質転換した動物。 【構成】 本発明による、抗体活性を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列１種又は数種を豚又は兎の受精卵細
胞の雄性前核中にマイクロインジェクションにより導入
し、該卵細胞を豚又は兎の卵管中にインプランテーショ
ンし、子孫を繁殖させかつ常法で該子孫から抗体活性を
有する蛋白質を取得し、その際にマイクロインジェクシ
ョンで使用するＤＮＡ配列が細菌性外来配列を含まず、
殊にイムノグロブリンプロモータ及びエンハンサー配列
を有する配列を使用する、抗体活性を有する蛋白質の取
得法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は抗体活性を有する蛋白質
の取得法、抗体活性を有する蛋白質、診断法、形質転換
した動物の製法及び形質転換した動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】外来ＤＮＡ配列を動物中で発現するに当
り、該ＤＮＡを受精卵細胞の雄性前核中にマイクロイン
ジェクションにより注入し、該卵細胞を相応する動物の
卵管中にインプランテーションし、かつマイクロインジ
ェクションされた遺伝物質を発現する子孫を繁殖させる
ことができる。マウスの場合は、形質転換した動物を胚
のレトロウイルス感染により又は遺伝子操作された菌株
細胞を原始細胞中に転移させることによっても製造した
［Ｒ． Ｊａｅｎｉｓｃｈ 著、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４
０，１４６８頁（１９８８年）；Ｒ．Ｄ．Ｐａｌｍｉｔ
ｅｒ 及び Ｂｒｉｎｓｔｅｒ 共著、 Ａｎｎ． Ｒ
ｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．，２０，４６５頁（１９８６
年）；Ｒ．Ｌ．Ｂｒｉｎｓｔｅｒ 及び Ｒ．Ｄ．Ｐａ
ｌｍｉｔｅｒ共著、Ｈａｒｖｅｙ Ｌｅｃｔｕｒｅｓ，
シリーズ８０，１〜３８頁以下（１９８６年），Ｌｉｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ在］。
【０００３】その間に、一連の動物種に関して、外来遺
伝情報を生殖系列中に導入することが報告された。たと
えばニワトリ［Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ及びその他共著、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２４３，５３３頁（１９８９年）］、魚
［Ｇ．Ｂｒｅｍ，Ｂ．Ｂｒｅｎｉｇ，Ｇ．Ｈｏｅｒｓｔ
ｇｅｎ−Ｓｃｈｗａｒｋ及びＥ．Ｌ．Ｗｉｎｎａｃｋｅ
ｒ共著、Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ６８，２０９頁（１９
８８年）］、兎［Ｒ．Ｅ．Ｈａｍｍｅｒ及びその他共
著、Ｎａｔｕｒｅ３１５，６８０頁（１９８５年）；
Ｇ．Ｂｒｅｍ及びその他共著、Ｚｕｃｈｔｈｙｇｉｅｎ
ｅ２０，２５１頁（１９８５年）］、羊［Ａ．Ｊ．Ｃｌ
ａｒｋ及びその他共著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
７，４８７頁（１９８９年）；Ｊ．Ｓｉｍｏｎｓ及びそ
の他共著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６，１７９頁
（１９８８年）；Ｃ．Ｅ．Ｒｅｘｒｏａｄ Ｊｒ．及び
その他共著、Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ．１，
１６４頁（１９８９年）］及び豚［Ｇ．Ｂｒｅｍ及びそ
の他共著、Ｚｕｃｈｔｈｙｇｉｅｎｅ２０，２５１頁
（１９８５年）；Ｋ．Ｍ．Ｅｂｅｒｔ及びその他共著、
Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２，２７７頁（１９８
８年）；Ｇ．Ｂｒｅｍ，Ｂ．Ｂｒｅｎｉｇ，Ｍ．Ｍｕｅ
ｌｌｅｒ，Ｈ．Ｋｒａｅｕｓｓｌｉｃｈ及びＥ．Ｌ．Ｗ
ｉｎｎａｃｋｅｒ共著、Ｏｃｃ． Ｐｕｂｌ． Ｂｒ．
Ｓｏｃ．Ａｎｉｍ． Ｐｒｏｄ． １２，１５〜３１
頁（１９８８年）］である。
【０００４】兎では兎はｃ−ｍｙｃ遺伝子をイムノグロ
ブリン遺伝子の調節配列の制御下に発現した。これは形
質転換した兎で白血病を誘導した［Ｋ．Ｌ．Ｋｎｉｇｈ
ｔ，Ｈ．Ｓｐｉｃｋｅｒ−Ｐｏｌａｔ，Ｄ．Ｋａｚｄｉ
ｎ，Ｖ．Ｔ．Ｏｉ共著，“Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，３１３０〜３１３４頁
（１９８８年）］。
【０００５】ヒトソマトトロピン遺伝子を発現する形質
転換した兎も生産された［Ｅｎｉｋｏｌｏｐｏｖ及びそ
の他共著，Ｄｏｋｌ．Ａｃａｄ．Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ２
９９，１２４６〜１２４９頁（１９８９年）］。同様
に、“ヒト成長ホルモン放出因子”を形質転換した兎中
で発現させることが報告された［Ｇａｔａｒｙａｎ及び
その他共著，Ｄｏｋｌ．Ａｃａｄ．Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ
３０５，７２６〜７２８頁（１９８９年）］。
【０００６】牛成長ホルモンを形質転換した豚中で発現
させかつこの形質転換した動物の成長に対する作用が試
験された［Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６６補遺１，２６７
頁（１９８８年）］。
【０００７】ヒトＢ型肝炎ウイルスの細胞表面抗原を発
現する形質転換した豚も生産された［Ｄｏｋｌ．Ａｋａ
ｄ．Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ３０６，２０６〜２０９頁（１
９８９年）］。
【０００８】規定した特異性（ニトロフェノール、トリ
ニトロフェノール、ホスホリルコリンに対して作用す
る）を有する抗体の軽鎖及び重鎖の遺伝子はその都度の
ハイブリドーマ系統から単離しかつマウスの生殖系列中
に導入した。軽鎖及び重鎖の遺伝子はその都度形質転換
したマウス中で組換え抗体の形で発現した［Ｓ．Ｒｕｓ
ｃｏｎｉ及びＧ．Ｋｏｅｈｌｅｒ共著，Ｎａｔｕｒｅ３
１４，３３０頁（１９８５年）；Ｒ．Ｇｒｏｓｓｃｈｅ
ｄｌ，Ｄ．Ｗｅａｖｅｒ，Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ及び
Ｆ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ共著，Ｃｅｌｌ３８，６４
７頁（１９８４年）；Ｕ．Ｓｔｏｒｂ及びその他共著，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４，６２７頁（１９８６
年）；Ｋ．Ａ．Ｒｉｔｃｈｉｅ，Ｒ．Ｌ．Ｂｒｉｎｓｔ
ｅｒ及びＵ．Ｓｔｏｒｂ共著，Ｎａｔｕｒｅ３１２，５
１７頁（１９８４年）；Ｄ．Ｗｅａｖｅｒ，Ｔ．Ｃｏｎ
ｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｔ．Ｉｍａｎｉｓｈｉ−Ｋａｒｉ及
びＤ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ共著，Ｃｅｌｌ４２，１１７
頁（１９８５年）；Ａ．Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ｍ．Ｌａｍ
ｅｒｓ及びＧ．Ｋｏｅｈｌｅｒ共著，Ｎａｔｕｒｅ３３
０，４８２頁（１９８７年）；Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇ
ｅｒ，Ｈ．Ｍ．Ｃａｓｋｅｙ，Ｍ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏ
ｎ，Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ａ．Ｓｕｒａｎｉ，Ｎ
ａｔｕｒｅ３３８，３５０頁（１９８９年）］。
【０００９】前記の文献のいくつかにおいては抗体の軽
鎖だけか又は重鎖だけの遺伝子をマウスの生殖系列中に
導入した。これらの実験では、再配列した形質転換遺伝
子が内生イムノグロブリン遺伝子の再配列を阻止するこ
とが明らかになった。形質転換したマウス中で導入抗体
遺伝子の発現が相対的に低い（約５〜１０μｇ／血清ｍ
ｌまで）ことも明らかになった。他の動物種では、生殖
系列中への導入後のイムノグロブリン遺伝子の発現は従
来報告されていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、抗体
を高収率で、形質転換した動物から取得することのでき
る方法を開示することであった。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の課題は、抗体活
性を有する蛋白質をコードする、細菌性外来配列を含ま
ないＤＮＡ配列１種又は数種を豚又は兎の受精卵細胞の
雄性前核中にマイクロインジェクションにより導入し、
該卵細胞を豚又は兎の卵管中にインプランテーション
し、子孫を繁殖させかつ常法で該子孫から抗体活性を有
する蛋白質を取得する、抗体活性を有する蛋白質の取得
法により解決される。
【００１２】本発明により抗体活性を有する蛋白質をリ
ンパ系細胞中で発現するために、イムノグロブリンプロ
モータ及びエンハンサーを利用すると優れている。発現
させるべき遺伝子を常法で原核生物のベクター中にサブ
クローン化しかつ好適な宿主細胞中で増殖させる。相応
する遺伝子を、原核生物の配列を含まないように好適な
制限ヌクレアーゼを用いてベクターを切断した後で単離
しかつ受精卵細胞中に注入する。その際に、環状かつ又
は有利に線状のＤＮＡを使用することができる。試験管
内突然変異により、発現させるべき遺伝子上でイントロ
ン配列（１個又は数個）が欠失した後でも形質転換動物
で発現が行なわれるべきである。抗体の軽鎖と重鎖を発
現させるために相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を使用する場
合、免疫グロブリンプロモータ及びエンハンサー配列を
発現ベクター上で発現すべきｃＤＮＡの前にクローン化
することができる。ゲノムのフラグメントとｃＤＮＡと
の融合もまた可能である［Ｓ．Ｄ．Ｇｉｌｌｉｅｓ及び
その他共著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７，７９９
〜８０４頁（１９８９年）；Ｏｒｌａｎｄｉ及びその他
共著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．ｏｆ Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ８６，３８３３〜３８３７（１９８９年）］。場合
により、抗体遺伝子の非コード領域中に達している調節
部を使用することにより、抗体遺伝子の発現を更に改良
することができる。ヒトＫ遺伝子（軽鎖）に関しては最
近３′−未翻訳領域に延びているエンハンサーが報告さ
れ［Ｋ．Ｂ．Ｍｅｙｅｒ及びＭ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅ
ｒ共著、ＥＭＢＯ Ｊ．８，１９５９〜１９６５頁（１
９８９年）］、マウスλ１鎖に関しても同様に３′−未
翻訳領域中のエンハンサーが報告された［Ｌ．Ｂｉｃｈ
−Ｔｈｕｙ及びＣ．Ｑｕｅｅｎ共著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１７，５３０７〜５３２１頁（１９８９
年）］。
【００１３】“抗体活性を有する蛋白質”には次のａ）
〜ｆ）が包含される： ａ） 異なる種の完全抗体：発現は、抗体の軽鎖及び重
鎖の完全遺伝子を豚又は兎の受精卵細胞中に導入するこ
とにより可能であり、その際に原則的にすべての抗体ア
イソタイプが発現可能である。重鎖がγ鎖でありかつ軽
鎖がＫ鎖であると優れている。
【００１４】抗体はマウス、ラットあるいは豚の卵細胞
を使用する際には兎から由来するものであってよい。し
かしヒト抗体の発現が特に優れている。
【００１５】ヒト抗体は診断及び治療上の大きな可能性
を有する。治療に使用する場合、ヒト抗体はマウス抗体
又は遺伝子工学的に製造したキメラ又はヒト抗体よりも
優先される。それというのもこれらの抗体では治療投与
後に生体の免疫応答が期待され得ないからである。しか
し、安定で、良好に生産性であるヒトＢ細胞系列又はハ
イブリドーマの構造は実際的には大きな問題を伴なう。
【００１６】ヒト抗体をコードする軽鎖及び重鎖の遺伝
子又はｃＤＮＡは常法でヒトハイブリドーマから得られ
る。
【００１７】ヒト抗体の取得及びそれらの治療上の適用
範囲は次の文献に記載されている：Ｈ．Ｊａｍｅｓ 及
び Ｇ．Ｔ．Ｂｅｌｌ 共著、Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔ
ｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １００，５−４０頁（１９８７
年）；Ｊ．Ｅ．Ｂｏｙｄ 及び Ｋ．Ｊａｍｅｓ 共
著、Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ｔｈｅｉｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｐｒｏｂ
ｌｅｍｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．：Ａｄｖａｎ
ｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐ
ｒｏｃｅｓｓｅｓ． Ｖｏｌ． ＩＩ．中 Ａ．Ｍｉｚ
ｒａｋｉ（編集）（１９８８年） Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，
Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ在；Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃ
ｋ 及び Ｊ．Ｍ．Ｂｏｕｒｌａ（共著）、Ｔｈｅ ｐ
ｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ ｕｓｅ ｏｆｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．
Ｍｏｄ． ５（１９８６），３７９−３９３頁。
【００１８】ｂ） キメラ及びヒト抗体：キメラ抗体と
は、マウス又は他の動物種の可変部（Ｄ＝多様性及びＪ
＝Ｊセグメントを含む）と他の種、特にヒトの不変部を
含む分子である。この抗体はヒト抗体と同様に遺伝子工
学的に製造する。ヒト抗体ではヒトの軽鎖及び重鎖の遺
伝子中で例えば相応するマウス−又はラット抗体の超可
変ＣＤＲ部（相補性決定部：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒ
ｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）を使用す
る（＝ヒトＣＤＲ部を相応するマウス−又はラット抗体
のそれと交換）。この技術はＣＤＲ移植と表わされる。
ＣＤＲ部は、その都度の抗原に対する親和性を決定する
抗体分子のドメインである。
【００１９】本発明方法により、形質転換した豚又は兎
中でキメラ抗体の該当する全アイソタイプを発現させる
ことができる。
【００２０】ＣＤＲ移植によるキメラ抗体の取得につい
ても記載されている［Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｈ．Ｄ
ｅａｒ，Ｊ．Ｆｏｏｔｅ，Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ
及びＧ．Ｗｉｎｔｅｒ共著、Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈ
ｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉ
ｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｍ
ｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｎａｔｕｒｅ３２１，５
２２〜５２５頁（１９８６年）］。
【００２１】キメラ抗体は悪性疾患を治療する際に大き
な可能性を有する。その際に、抗体は腫瘍細胞特異性抗
原上の抗原決定因子を認識する［Ｓｕｎ及びその他共
著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ８４，２１４〜２１８頁（１９８７年）；Ｙ．＝シム
ラ及びその他共著、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７，９９
９〜１００５頁（１９８７年）］。
【００２２】ｃ） ヘテロビスペシフィック（ｈｅｔｅ
ｒｏｂｉｓｐｅｚｉｆｉｓｃｈｅｒ）抗体：ヘテロビス
ペシフィック抗体は、例えばウイルス感染細胞を除去す
る際に大きな治療上の可能性を有する。ヘテロビスペシ
フィック抗体は例えば細胞表面上に存在する抗原及び細
胞毒性Ｔ−細胞上の抗原決定因子を認識する［Ｌ．Ｋ．
Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｍ．Ｒ．Ｃｌａｒｋ及びＨ．Ｗａ
ｌｄｍａｎｎ共著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８５，７７１９〜７７２３頁（１９８８
年）；Ｕ．Ｄ．Ｓｔａｅｒｚ，Ｊ．Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌ
及びＭ．Ｂｅｖａｎ共著、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１７，５７１〜５７４頁（１９８７年）］。ヨー
ロッパ特許公開第０３８８９６４号明細書にはヘテロビ
スペシフィック抗体の遺伝子工学的製法が記載されてい
る。形質転換した豚又は兎中での発現は両方の抗体の軽
鎖及び重鎖の遺伝子を単離し、かつ引続いて受精卵細胞
中に注入することを前提とする。その際に、両方の抗体
が無条件に同じアイソタイプ（例えばＩｇＧ１）を有す
る必要はない。本発明方法により、異なるアイソタイプ
を有するヘテロビスペシフィック抗体を形質転換した豚
又は兎から取得し、かつＣＤＤ（補体依存性細胞毒性）
及びＡＤＣＣ（抗体依存性細胞仲介細胞毒性）に関する
それらの性質を試験することができる。
【００２３】ｄ） 抗体フラグメント：形質転換した豚
で発現させるのに、例えばＦ（ａｂ′）2，Ｆａｂフラ
グメント、Ｆｃ部又はＦｖフラグメントのような抗体の
抗体ドメインも該当する。この種の抗体フラグメント
は、抗体分子をコードする完全なＤＮＡ配列の代りに、
それぞれの抗体フラグメントをコードする部分配列を形
質転換の豚又は兎中にマイクロインジェクションにより
導入すると得られる［個々のフラグメントの定義に関し
ては、Ｉ．Ｒｏｉｔｔ，Ｊ．Ｂｒｏｓｔｏｆｆ及びＤ．
Ｍａｌｅ共著、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｏｗｅｒ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｎｄｏｎ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ在（１９８５年）参照］。Ｆ（ａ
ｂ′）2又はＦａｂフラグメントは、例えば腫瘍画像診
断の場合のように診断に使用するのに重要である。
【００２４】ｅ） 抗体分子のドメインを有する融合蛋
白質：これは、抗体の抗原結合部と免疫グロブリンの超
科（例えばＴ細胞レセプター又はＦｃレセプター）の他
の構成員のシグナル形質導入部（膜間ドメイン及び細胞
質ドメイン）からの融合である。このような分子は可能
なバイオセンサーとして実際上の大きな重要性を有する
はずである。異種融合蛋白質の発現も本発明方法によ
り、相応するＤＮＡ配列を豚又は兎の卵細胞中にマイク
ロインジェクションすることにより可能である。例え
ば、抗体の抗原結合ドメインと、抗原結合後に酵素的機
能を仲介するドメイン（例えばチロシンキナーゼ、イン
シュリン又はＥＧＦレセプターのドメインもしくはＡＮ
Ｆレセプターのグアニル酸シクラーゼドメイン）との融
合を行なうことができる。
【００２５】治療に重要な融合蛋白質、例えばＣＤ４抗
原のドメイン、ヒトＴリンパ球上のＨＩＶウイルスのレ
セプター及び重要なエフェクター作用を仲介する（例え
ば補体結合、細胞溶解）抗体分子のドメインからの融合
も、本発明方法により高い収率で形質転換した豚中で発
現させることができる。
【００２６】ｆ） 突然変異抗体：この抗体には、遺伝
子工学的操作により抗原に対して出発抗体よりも改良さ
れた親和性を有する抗体が含まれる。また、（遺伝子工
学的操作により）変化した補体結合挙動、マクロファー
ジ及び単核細胞上のＦｃレセプターに対して変化した結
合挙動並びに変化した細胞溶解性を有する抗体も含まれ
る。この群類の抗体分子も本発明方法により形質転換豚
又は兎中で発現させることができる。
【００２７】血清から抗体を取得すると共に本発明方法
により、形質転換した豚又は兎を免疫化することもでき
る。特定の抗原、特にこれらの動物にとって危険な病
気、例えばインフルエンザ又は豚ペストを誘発する抗原
に対する抗体の遺伝子を本発明方法によりこれらの動物
の生殖系列中に高い効率で導入することができる。この
ようにして、特定の感染に対して耐性である動物を繁殖
させることができる。
【００２８】更に、本発明方法により治療上重要な蛋白
質を乳汁中に分泌させることもできる。
【００２９】クラスＩｇＡの抗体分子を乳汁中に分泌さ
せることができる（分泌ＩｇＡ＝ｓＩｇＡ）。ＩｇＡと
融合させることにより、他の蛋白質、例えば因子ＶＩＩ
Ｉ又は因子ＩＸのような凝固因子又は酵素、例えば組織
性のヒトプラスミノーゲンアクチベータを形質転換した
動物の乳汁中に分泌させることもできる。分泌抗体と融
合パートナー（例えばコラゲナーゼ、因子Ｘａ）との間
に相応する酵素切断部位を導入することにより真正分子
は乳汁からの単離及び引続いて行なう酵素切断後に得ら
れる。
【００３０】以上の説明から、本発明が形質転換した動
物の製法も包含することが明らかであり、その際豚又は
兎の受精卵細胞の雄性前核中に、抗体活性を有する蛋白
質をコードする、細菌性外来配列を含まないＤＮＡ配列
１個又は数個を導入し、その卵細胞を雌性動物の卵管中
にインプランテーションしかつ子孫を繁殖させる。例え
ばこのために抗体活性を有する蛋白質をコードし、該当
する動物種（豚又は兎）にとって危険な病気をもたらす
抗原に対して作用するＤＮＡ配列を使用することができ
る。このような動物の病気も、またその病気を誘発する
抗原も当業者に知られている。この公知の抗原を用いて
常法で抗体を生成し、そのＤＮＡ配列は公知方法で（例
えば遺伝子バンクのスクリーニングにより）得られる。
引続いて、この抗体をコードするＤＮＡ配列を本発明方
法による形質転換した動物の製造に使用することができ
る。このようにして、例えば特定の病気に対する免疫性
を有する形質転換した動物を産生することができる。更
に、本発明の目的は、本発明方法により得られる形質転
換した動物（即ち兎又は豚）である。本発明による形質
転換動物の例はヨーロッパ特許公開第０３８８９６４号
明細書に記載されている抗イディオタイプ抗体である抗
体Ａ２０／４４を生産するものである。
【００３１】
【実施例】次に本発明を添付した図１により詳説する。
【００３２】例 １ 抗体−ＤＮＡ配列の製造 出発ベクターはヨーロッパ特許公開第０３８８９６４号
明細書（ヘテロビスペシフィック抗体の製法）に記載さ
れているｐＢＭＳ１（ＤＳＭ５２２９）及びｐＢＭＳ２
（ＤＳＭ５２３０）である。このベクターはマウス抗体
のＫ及びγ１遺伝子を相互に異なる配向で含有する。こ
れらの遺伝子は、ＩｇＧ１抗体Ａ２０／４４を分泌する
ハイブリドーマ細胞系から単離した［Ｆ．Ｓａｂｌｉｔ
ｚｋｙ，Ｇ．Ｗｉｌｄｎｅｒ及びＫ．Ｒａｊｅｗｓｋｙ
共著、ＥＭＢＯ Ｊ．４，３４５〜３５０頁（１９８５
年）；Ｆ．Ｓａｂｌｉｔｚｋｙ，Ｄ．Ｗｅｉｓｂａｕｍ
及びＫ．Ｒａｊｅｗｓｋｙ共著、ＥＭＢＯ Ｊ．４，３
４３５〜３４３７頁（１９８５年）；Ｃ．Ｋｏｃｋｓ及
びＫ．Ｒａｊｅｗｓｋｙ共著、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８５，８２０６〜８２
１０頁（１９８８年）］。Ａ２０／４４は、ハプテンＮ
Ｐ（４−ヒドロキシ−３−ニトロ−フェニルアセテー
ト）に特異的な抗体に対して作用する抗イディオタイプ
抗体である。最後の抗体は軽鎖としてのλ鎖及び重鎖と
してのγ2a鎖を有する（ＩｇＧ２ａ）。
【００３３】ヨーロッパ特許公開第０３８８９６４号明
細書に記載のベクターは５．５ｋｂのＳａｌＩフラグメ
ントとしてのＫ遺伝子、９．２５ｋｂのＳａｌＩフラグ
メントとしてのγ１遺伝子を含有する。更に、ベクター
はホスホトランスフェラーゼｎｅｏ及びマウス−ジヒド
ロ葉酸リダクターゼの発現カセットをＳＶ４０の早期プ
ロモータの制御下に含有する。
【００３４】ｐＢＭＳ１及びｐＢＭＳ２（それぞれ３個
のＳａｌＩ部位を含有する）をＳａｌＩで部分切断し、
ヌクレアーゼＳ１で処理し（ＳａｌＩで部分切断したＤ
ＮＡ１μｇを５０ミリモル／ｌ 酢酸ナトリウム、ｐＨ
４．５、１ミリモル／ｌＺｎＳＯ4及び０．５重量％グ
リセリン中で３０℃、６０分間Ｓ１ヌクレアーゼ１０単
位と一緒に恒温保持する）、線状プラスミドを低温溶融
アガロースゲル上で単離し、かつ引続いて末端をＴ４リ
ガーゼで連結する。連結バッチをＥ．コリ菌株ＨＢ１０
１中にトランスフェクションしかつ寒天板上のアンピシ
リン耐性コロニー（５０μｇ／ｍｌ）を単離した。制限
エンドヌクレアーゼで分析することにより、前記の操作
によりＫ遺伝子とγ１遺伝子との間のＳａｌＩ部位が欠
失した。得られたプラスミドはｐＢＭＳ１（ΔＳａｌ）
及びｐＢＭＳ２（ΔＳａｌ）と表わされる。
【００３５】ｐＢＭＳ１（ΔＳａｌ）及びｐＢＭＳ２
（ΔＳａｌ）をＳａｌＩで切断し、かつ抗体のＫ及びγ
１遺伝子を含有するＳａｌＩフラグメントを低融点アガ
ロースゲル上で単離し、引続いて１０ｍＭ ＴＲＩＳ・
ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解
した。
【００３６】これによりベクター配列を含まない抗体遺
伝子を次のマイクロインジェクション実験のために単離
した（図１参照） 例 ２ 形質転換した哺乳動物の製造 形質転換した哺乳動物の製造は、注入可能なＤＮＡ溶液
の製造、受精した卵細胞及び胚の取得、前核又は核中へ
のＤＮＡ溶液のマイクロインジェクション、同調受容動
物への注入した接合体の転移及び生まれた動物の組込み
についての試験を包含する。その際に、マウス、兎及び
豚のようなそれぞれの哺乳動物種に関して種に規定され
る差異を供給動物及び受容動物の調製、胚の取得及び転
移並びにマイクロインジェクションの際に注意すべきで
ある。
【００３７】１．注入可能なＤＮＡ溶液の製造 ＤＮＡフラグメントの単離及びＤＮＡ含量の測定後、Ｄ
ＮＡ溶液をトリス緩衝液を用いて、溶液１ｐｌ当り遺伝
子構成物のコピー数１０００までを含有するように稀釈
する。ＤＮＡマイクロインジェクション溶液の製造に使
用したすべての溶液は、注入用ピペットの閉塞を回避す
るために粒状の不純物を含まないようにすべきである。
【００３８】２．胚の取得 胚の収率を高めるために、提供動物はすべて過剰排卵さ
せる。
【００３９】−マウス 少なくとも生後６週間の雌マウスに、過剰排卵を誘発す
るためにＰＭＳＧ（妊馬血清生殖腺刺激ホルモン）５〜
１０ＩＵを注入する。４８時間後にＨＣＧ（ヒト絨毛膜
性生殖腺刺激ホルモン）５〜１０ＩＵを与えかつ受胎力
のある雄と交配させる。翌朝プラーク陽性マウスを殺
し、かつ腹腔を開いた後で卵管を取り出す。アンプルを
精密なピンセットで開放するか又は卵管を洗浄すること
により胚は得られ、かつ胚をヒアルロニダーゼを添加し
た胚培地に移す。卵細胞を卵丘細胞の除去後に洗浄しか
つマイクロインジェクションまで培養する。
【００４０】−兎 性成熟した提供兎に過剰排卵させるために体重１ｋｇ当
りＰＭＳＧ（妊馬血清生殖腺刺激ホルモン）１０〜４０
ＩＵを投与する。この過剰排卵に先立って２１日間独立
保持するか又は予備同期化（ＨＣＧ１２０ＩＵ又はＧｎ
ＲＨ：性腺刺激ホルモン放出因子０．８μｇ）を行なっ
た。ＰＭＳＧ注入して７２〜７６時間後に、兎に１時間
間隔で２回人工注精するか又は自然交尾させる。その直
後にＨＣＧ１２０〜１２８ＩＵを与えて排卵誘発させ
る。交尾して１９〜２１時間後に提供兎を殺して胚を取
得する。胚は卵管を兎胚の培地（ＢＭＳ＋２０％ＦＫＳ
又はＰＢＳ＋２０％ＦＫＳ）で洗浄することにより房状
漏斗から子宮角端（Ｕｔｅｒｕｓｈｏｒｎｅｎｄｅ）の
方向で得られる。必要な場合には、存在する卵丘をヒア
ルロニダーゼ処理により除去する。胚を洗いかつマイク
ロインジェクションまで培養する。
【００４１】−豚 豚では体重６０〜９０ｋｇの青春前期の若い雌豚を胚の
取得に使用することもできる。ゼロ日目に提供動物を小
屋変えし、夕方ＰＭＳＧ１２５０ＩＵを投与する。その
７２時間後にＨＣＧ７５０ＩＵで排卵させる。ＨＣＧ投
与して２４〜３６時間後に動物に注精する。胚の取得は
注精して２４〜２７時間後である。胚を外科的に取得す
るために、動物をアザペロン（Ｓｔｒｅｓｓｎｉｌ）１
６０ｍｇ及びメトミデーゼヒドロクロリド４００ｍｇ
（Ｈｙｐｎｏｄｉｅ）で麻酔処理する。手術の場を用意
した後で、正中の皮膚を最後の２対の乳頭の高さで約１
０ｃｍ切断して開腹し、かつ子宮、卵管及び卵巣を剔出
する。子宮を子宮卵管移行部の約５ｃｍの尾部で子宮を
鈍に穿孔して、約５ｃｍのガラスカニューレを孔中に挿
入しかつ固定する。卵管中に房状漏斗を通して、約３０
ｃｍの長さのゴム管と連結している長さ８ｃｍの折曲げ
られているアイカニューレを挿入しかつ固定する。卵管
をＰＢＳ溶液５０ｍｌで洗浄する。洗浄液をペトリ皿中
に取りかつ胚について検査する。胚は提供動物を殺した
後でも行なうことができる。
【００４２】３．ＤＮＡ溶液のマイクロインジェクショ
ン マイクロインジェクションには逆顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ
社、ＩＣＭ４０５）、２つのライツマイクロマニピュレ
ータ及び注入装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用する。
一方のマニピュレータは、胚を負圧により固定すること
のできる保持ピペットを備えている。第２のマイクロマ
ニピュレータ上にはＤＮＡ溶液が充填されている注入ピ
ペットがナノステッパー（Ｎａｎｏｓｔｅｐｐｅｒ）中
に固定されかつ注入装置と連結している。注入ピペット
は直径１〜２μｍである。マイクロインジェクションに
当り、ピペットの尖端を透明帯、細胞膜及び核膜を通し
て核孔中に押込みかつＤＮＡ溶液約１〜２ｐｌを装入す
る。前核の容積の増加が効果的なマイクロインジェクシ
ョンを信号する。場合により、２細胞期（Ｚｗｅｉｚｅ
ｌｌｓｔａｄｉｕｍ）の胚の核のマイクロインジェクシ
ョンも行なわれる。
【００４３】マウス又は兎とは反対に多くの有用動物種
（豚、牛）では卵細胞及び胚を前核及び核を見えるよう
に前処理する（１５０００ｇで３〜５分間遠心分離す
る）。マイクロインジェクションはカバーガラス上の培
地の１液滴中又は所謂注入室中で行なう。マイクロイン
ジェクション後に卵細胞又は胚を転移するまで培養す
る。
【００４４】４．マイクロインジェクション処理した卵
細胞の転移 −マウス 受容マウスを脈管切除した雄ヤギとの偽妊娠を行なわせ
るために１晩つがいにした。プラーク陽性マウスを取り
出しかつ転移させるために麻酔処理する。前に置いた卵
巣嚢を精密なピンセットで開きかつ転移ピペット中で発
育させた胚（片方当り１０〜１５個）を両方の卵管中に
移入する。マウスの出産は転移して２０〜２１日後であ
る。
【００４５】−兎 受容兎を可能な期間より２１日前に周期同調化のために
単独で小屋に入れかつ偽妊娠を誘発するためにＨＣＧ１
２０ＩＵ又はＧｎＲＨ０．８μｇを筋肉内に投与する。
転移の前日、受容兎に排卵のためにＨＣＧ１２０ＩＵを
静脈内に投与する。転移のため、兎を体重１ｋｇ当り２
％ロンパン（Ｒｏｍｐｕｎ）０．４ｍｌ及び体重１ｋｇ
当りケタミン０．８ｍｌで麻酔処理する。手術の場を用
意しかつ腹内圧により膀胱を空にした後で、兎を背位で
拘束しかつ傾斜させて固定する。臍の直接尾側で腹腔を
４〜５ｃｍ開腹する。卵巣、卵管及び頭部子宮角を外置
し、かつ卵巣反応の制御後にマイクロインジェクション
した胚を転移ピペットを用いて卵管アンプル中、約２〜
２．５０ｃｍの深さに転移させる。一方の卵管当り胚８
〜１５個を転移させる。腹腔を閉じた後で、手術の創口
は皮膚ヒダ被覆縫合により保護する。転移して２９〜３
１日後に若兎が生まれる。
【００４６】−豚 受容豚としても青春前期の雌豚を使用することができ
る。提供豚の１２時間後に受容豚にＰＭＳＧ７５０ＩＵ
及び更に７２時間後にＨＣＧ７５０ＩＵを投与する。提
供豚と受容豚との間のこの１２時間の非等時性は転移後
の胚の生残の機会を改良する。提供動物の注精に平行し
て受容動物で発情観察を実施する。プログラムの開始後
１３５〜１３６時間で（時間ゼロ：提供動物のＰＭＳＧ
注入）胚の転移を行なう。注入されたすべての胚（３５
〜４５個）を外科的転移により受容豚の卵管中に転移さ
せる。胚は面間隔により均一に両方の子宮角上に分布し
ている。新規方法は胚を豚の子宮中に無血転移すること
も可能にする。転移して１１３〜１１６日後に誕生す
る。
【００４７】５．組込み試験 注入されたＤＮＡの組込みについて実験するに当り、生
まれた動物から組織試料（尾組織、血液又は生検）を取
得しなければならない。これらの試料から高分子ゲノム
ＤＮＡを単離する。組込みを立証するには、スロット・
ブロット、ドット・ブロット又はサザン・ブロット分析
を実施する。
【００４８】陽性の動物（遺伝子構造物を組込まれた動
物）を飼育しかつ成熟したら形質転換していないパート
ナーと交配させる。交配から発生する子孫を、該子孫が
その形質転換した片方の親の転移遺伝子を遺伝したかど
うかについて調べる。ヘミ接合で形質転換した動物の交
配によりホモ接合で形質転換したＦ２子孫が繁殖する。
【００４９】発現試験に当っては形質転換動物から採血
して血清を取得する。採血は球後視神経叢（マウス）、
耳の縁（兎）又は頚静脈（豚）あるいは他の静脈の穿刺
によりないしは殺して行なう。
【００５０】例 ３ 形質転換動物の血清中の抗体価の測定 抗体価の測定法はヨーロッパ特許公開第０３８８９６４
号明細書に記載されている。マイクロ力価プレートをハ
プテンＮＰ（４−ヒドロキシ−３−ニトロ−フェニル酢
酸）に対する抗体で塗布した。この抗体はＩｇＧ２ａ
（軽鎖はλ鎖であり、重鎖はλ２ａ鎖である）である。
塗布緩衝液は０．２ｍｍｏｌ／ｌ 炭酸塩／重炭酸塩ｐ
Ｈ９．４より成っていた。２時間後に、プレートを後塗
布緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ、０．１５ｍ
ｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１％クロテインＣ、ｐＨ７．０）
で恒温保持した。全反応を室温で振盪下に実施した。検
量曲線は抗体Ａ２０／４４（ＩｇＧ１）を含有する菌株
溶液（稀釈列）により作成した。検定試料及び血清を恒
温保持緩衝液で稀釈し（５０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥ
Ｓ、０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１％クロテイン
Ｃ、ｐＨ７．０、０．２ｍｏｌ／ｌ 酒石酸二ナトリウ
ム、０．７５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
０．５％の登録商標プルロニックＦ６８、０．７５％Ｐ
ＥＧ４００００、０．０１％フェノール）、かつ室温で
２時間恒温保持した。凹部の吸引濾取及び恒温保持緩衝
液で２回洗浄後、接合体との恒温保持を１時間行なった
（ＮＰに対して作用する抗体のＦａｂフラグメントとペ
ルオキシダーゼ（ＰＯＤ）とからの接合体）。更に、恒
温保持緩衝液中の接合体をＰＯＤ活性１５０ｍＵ／ｍｌ
に稀釈した。凹部の吸引濾取及び洗浄緩衝液（５０ｍｍ
ｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ、０．１５ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣ
ｌ、０．１％の登録商標プルロニックＦ６８、ｐＨ７．
０）による３回の洗浄後、基質としての登録商標ＡＢＴ
Ｓ（２，２′−アジノ−ジ−［３−エチル−ベンゾチア
ゾリン−スルホネート（６）］と６０分間反応させる。
吸光度を光度計（ＥＬＩＳＡ−Ｒｅａｄｅｒ）中４９０
ｎｍに対して４０５ｎｍで測定した。試料の濃度は標準
検量曲線により測定した。
【００５１】 表 形質転換動物の血清中の抗体価 兎 豚マウスＮo． μg／ml Ｎo． μg／ml Ｎo． μg／ml ９７０−２８ ３ ２６４４ ２００ ５８１４ １０００ ９７０−２９ ７ 対 照 ０ ９７０−３１ １８ 対 照 ０ ９７０−３２ １０ ９７０−３３ １８ ９７０−５４ ３０ ９７０−５５ ３ ９７０−５６ １８ ９７０−５９ ３ ９７４−１ ２７ ９７４−２ ２９ ９７４−３ １８ ９７４−４ ４ ９７４−８ １８ ９７４−９ １００ ９７４−１０ ４５ ９７４−１１ ２０ ９７４−１２ １２０ ９７４−１３ ６０ ９７４−１４ １５ 対 照 ０ 試験したマウスは血清陽性マウス９７０及び９７４の子
孫である。一連の子孫は導入した抗体特異性に関して血
清陰性であった。これらについては表に記載しなかっ
た。マイクロインジェクション後に、全３９匹の兎を発
現について試験した。１匹は血清中で所望の抗体特異性
を発現した。形質転換した豚２頭（１頭は死産）が得ら
れた。生残した豚は所望の抗体を予想外にも血清中で非
常に高い濃度（１０００μｇ／ｍｌ）で発現した。
【００５２】例 ４ 豚血清中の発現抗体の特性 ａ）等電点電気泳動及び免疫固定 ＩＥＦはファスト・ゲル系（Ｐｈａｓｔ−Ｇｅｌ−Ｓｙ
ｓｔｅｍ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で製造者の指示によ
り実施した。形質転換豚及び対照豚の血清を１：１００
０に稀釈しかつ非変性条件下にゲル上にプロットした。
ゲル上でのｐＨ勾配（ｐＨ５〜８）を較正蛋白質（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）により可視化した。ゲルの展開時間は
３０分間であった。引続いて、４５分間ポリクロナール
抗体（羊抗マウスＦｃγ）１００μｇと容量１５０μｌ
で恒温保持しかつ酢酸セルロース帯状物で覆った。未反
応蛋白質は５０ｍｍｏｌ／ｌ リン酸カリウム緩衝液、
０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、０．０５％の登録商標
ツイーン、ｐＨ７．２で洗浄し、一晩振盪することによ
り除去した。引続いて、免疫複合体を銀色着色（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａのキット）により可視化した。対照として
は腹水から精製した抗体Ａ２０／４４をプロットした。
【００５３】形質転換した豚の血清中の特徴的なバンド
が精製した抗体Ａ２０／４４と同じであると固定するこ
とができた。対照動物の血清中ではこの特徴的なバンド
を検出することができなかった。
【００５４】ｂ）形質転換した豚の血清からの抗体Ａ２
０／４４の精製 Ａ２０／４４はハプテンＮＰに対して作用する抗体（Ｉ
ｇＧ２ａ）に対する抗イディオタイプ抗体である。これ
を腹水から精製しかつブロムシアン活性化セファロース
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に製造者の規定により結合させ
た。抗体Ａ２０／４４をこのように製造した親和性カラ
ムで、形質転換した豚の血清１００ｍｌを注いで免疫吸
着させ、溶離し、引続いて蛋白質化学的に特徴付けた。
その性質は傷水から精製した抗体Ａ２０／４４と一致し
た。
【図面の簡単な説明】
【図１】マイクロインジェクションに使用したフラグメ
ントを示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年４月９日
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 抗体活性を有する蛋白質の取得法、診
断法及び形質転換した動物の製法
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１１】 診断−及び／又は治療法に請求項１か
ら１０までのいずれか１項記載の方法により得られた抗
体活性を有する蛋白質を使用する診断法。
【請求項１２】 抗体活性を有する蛋白質をコードす
る、細菌性外来配列を含まないＤＮＡ配列１種又は数種
を豚又は兎の受精卵細胞の雄性前核中に導入し、該卵細
胞を雌性動物の卵管中にインプランテーションし、かつ
子孫を繁殖させることを特徴とする、形質転換した動物
の製法。
【請求項１３】 抗体活性を有する蛋白質をコードする
ＤＮＡ配列を使用し、その際に抗体特異性が、該当する
動物種にとって危険な病気を誘発する抗原に対して作用
する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】 抗体Ａ２０／４４を産生する形質転換
した動物の製造に適用する請求項１２又は１３記載の方
法。
【請求項１５】 病気に対する免疫性を有する形質転換
した動物の製造に適用する請求項１２又は１３記載の方
法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は抗体活性を有する蛋白質
の取得法、診断法及び形質転換した動物の製法に関す
る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】以上の説明から、本発明が形質転換した動
物の製法も包含することが明らかであり、その際豚又は
兎の受精卵細胞の雄性前核中に、抗体活性を有する蛋白
質をコードする、細菌性外来配列を含まないＤＮＡ配列
１個又は数個を導入し、その卵細胞を雌性動物の卵管中
にインプランテーションしかつ子孫を繁殖させる。例え
ばこのために抗体活性を有する蛋白質をコードし、該当
する動物種（豚又は兎）にとって危険な病気をもたらす
抗原に対して作用するＤＮＡ配列を使用することができ
る。このような動物の病気も、またその病気を誘発する
抗原も当業者に知られている。この公知の抗原を用いて
常法で抗体を生成し、そのＤＮＡ配列は公知方法で（例
えば遺伝子バンクのスクリーニングにより）得られる。
引続いて、この抗体をコードするＤＮＡ配列を本発明方
法による形質転換した動物の製造に使用することができ
る。このようにして、例えば特定の病気に対する免疫性
を有する形質転換した動物を産生することができる。本
発明方法により形質転換した動物（即ち兎又は豚）が得
られる。本発明による形質転換動物の例はヨーロッパ特
許公開第０３８８９６４号明細書に記載されている抗イ
ディオタイプ抗体である抗体Ａ２０／４４を生産するも
のである。

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 抗体活性を有する蛋白質をコードする、
    細菌性外来配列を含まないＤＮＡ配列１種又は数種を豚
    又は兎の受精卵細胞の雄性前核中にマイクロインジェク
    ションにより導入し、該卵細胞を豚又は兎の卵管中にイ
    ンプランテーションし、子孫を繁殖させかつ常法で該子
    孫から抗体活性を有する蛋白質を取得することを特徴と
    する、抗体活性を有する蛋白質の取得法。
  2. 【請求項２】 イムノグロブリンプロモータ及びエンハ
    ンサー配列を有するＤＮＡ配列を使用する請求項１記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 マイクロインジェクションで使用するＤ
    ＮＡ配列を線状形で使用する請求項１又は２記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 抗体活性を有する蛋白質が完全な未変性
    抗体である請求項１から３までのいずれか１項記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 抗体がγ重鎖及びＫ軽鎖を有する請求項
    ４記載の方法。
  6. 【請求項６】 抗体活性を有する蛋白質がキメラ抗体で
    ある請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 抗体活性を有する蛋白質がヘテロビスペ
    シフィック抗体である請求項１又は２記載の方法。
  8. 【請求項８】 抗体活性を有する蛋白質が抗体フラグメ
    ントである請求項１又は２記載の方法。
  9. 【請求項９】 抗体活性を有する蛋白質が他のポリペプ
    チドと融合した抗体又は抗体フラグメントである請求項
    １から３までのいずれか１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 抗体活性を有する蛋白質が突然変異抗
    体である請求項１から３までのいずれか１項記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 請求項１から１０までのいずれか１項
    記載の方法により得られた抗体活性を有する蛋白質。
  12. 【請求項１２】 診断−及び／又は治療法に請求項１１
    記載の抗体活性を有する蛋白質を使用する診断法。
  13. 【請求項１３】 抗体活性を有する蛋白質をコードす
    る、細菌性外来配列を含まないＤＮＡ配列１種又は数種
    を豚又は兎の受精卵細胞の雄性前核中に導入し、該卵細
    胞を雌性動物の卵管中にインプランテーションし、かつ
    子孫を繁殖させることを特徴とする、形質転換した動物
    の製法。
  14. 【請求項１４】 抗体活性を有する蛋白質をコードする
    ＤＮＡ配列を使用し、その際に抗体特異性が、該当する
    動物種にとって危険な病気を誘発する抗原に対して作用
    する請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１３又は１４記載の方法により
    得られた形質転換した動物。
  16. 【請求項１６】 抗体Ａ２０／４４を産生する請求項１
    ５記載の形質転換した動物。
  17. 【請求項１７】 病気に対する免疫性を有する請求項１
    ５記載の形質転換した動物。
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