HU218047B - Eljárás antitestek előállítására és transzgén sertések vagy nyulak előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás teljes, heterológ antitestek előállítására.A találmány értelmében úgy járnak el, hogy egy vagy több darabbólálló, ezt az antitestet kódoló, bakteriális idegen szekvenciáktólmentes DNS-szekvenciát sertés vagy nyúl megtermékenyítettpetesejtjének hím pronukleuszába visznek be mikroinjektálás útján, apetesejteket egy sertés vagy nyúl petevezetékébe ültetik be, ésutódokat hordatnak ki, amelyekből ezután szokásos módon a teljes,heterológ antitesteket kinyerik. A találmány kiterjed transzgénsertések vagy nyulak előállítási eljárására is. ŕ

Description

A találmány antitestek előállítására alkalmas eljárásra vonatkozik; a találmány kiterjed továbbá transzgén sertések vagy nyulak előállítására is.

Idegen DNS-szekvenciák kifejezésére állatokban a DNS-t megtermékenyített petesejtek hím pronukleuszába fecskendezik mikroinjektálással, a petesejteket ezután megfelelő állatok petevezetékébe ültetik be, utána olyan utódokat tenyésztenek, amelyek a mikroinjektált genetikai anyagot expresszálják. Egereknél transzgén állatokat embrióknak egy retrovírus-fertőzése vagy genetikusán manipulált őssejtek útján hoztak létre blasztocitákban [Jánisch, R.: Science 240., 1468. (1988); Palmiter, R. D. és Brinster, Ann. Rév. Génét. 20., 465. (1986); R. L. Brinster és R. D. Palmiter, Harey Lectures, Series 80 (Liss, New York), (1986) 1-38.].

Időközben idegen genetikai információknak az ivarvezetékbe történt bevitelét írták le egy sor állatfaj esetében, így például tyúkoknál [Bosselman és munkatársai, Science 243., 533. (1989)], halaknál [Brem, G., Brenig, B., Hoerstgen-Schwark, G., és Winnacker, E. L.: Aquaculture 68., 209. (1988)], nyulaknál [R. E. Hammer és munkatársai, Natúré 315., 680. (1985); G. Brem és munkatársai, Zuchthygiene 20., 251. (1985)], juhoknál [A. J. Clark és munkatársai, Bio/Technology 7., 487. (1989);

J. Simons és munkatársai Bio/Technology 6., 179. (1988); C. E. Rexroad Jr. és munkatársai, Mól. Repród. Dev. 1., 164. (1989)] és sertéseknél (G. Brem és munkatársai, Zuchthygiene 20., 251. (1985); K. M. Ebért és munkatársai Mól. Endocrinol. 2., 277. (1988); Brem G., Brenig, B., Müller, M., Kráusslich, H. és Winnacker, E. L.: Occ. Publ. Br. Soc. Anim. Prod. 12. (1988) 15-31.].

Nyulakban a nyúl c-myc gént egy immunglobulingén regulációs szekvenciáinak a szabályozása mellett expresszálták, ami leukémiát indukált transzgén nyulakban [Knight, K. L., Spicker-Polat, H., Kazdin, D., Oi, V. T.: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85. (1988) 3130-3134.].

Olyan transzgén nyulakat is tenyésztettek már ki, amelyek az emberi szomatotropingént expresszálják [Enikolopov és munkatársai, Doki. Acad. Nauk. SSSR, 299. (1988) 1246-1249.]. Ugyancsak leírták már a humán növekedési hormon releasing factor kifejezését transzgén nyulakban [Gataryan és munkatársai, Doki. Acad. Nauk SSSR 305. (1989) 726-728.].

Szarvasmarha-növekedésihormon kifejeződését mutatták ki transzgén sertésekben, és megvizsgálták transzgén állatok növekedésére gyakorolt hatását [J. Anim. Sei. 66. (Suppl 1.)267. (1988)].

Kitenyésztettek már olyan transzgén sertéseket is, amelyek az emberi hepatitisz B vírus felületi antigénjeit expresszálják [Doki. Acad. Nauk SSSR 306. (1989) 206-209.].

Meghatározott fajlagosságot (nitro-fenol, trinitro-fenol, foszforil-kolin ellen) mutató antitestek könnyű- és nehézláncainak génjeit izolálták a megfelelő hibridómavonalakból, és bevitték egerek ivarvezetékébe. A könnyű- és nehézlánc génjeit a transzgén egerekben rekombináns antitestek formájában expresszálták [Rusconi. S. és Köhler, G.: Natúré 314., 330. (1985);

Grosschedl, R., Weaver, D., Baltimore, D. és Constantini, T.: Cell 38. (1984), 647.; U. Storb és munkatársai J Rxp. Med. 164. (1986) 627.; Ritchie, K. A., Brinster,

R. L. és Storb, U.: Natúré 312., 517. (1984); Weaver, D., Constantini, T., Imanishi-Kari, T. és Baltimore, D.: Cell 42., 117. (1985); Iglesias, A., Lamers M. és Köhler, G.: Natúré 330., 482. (1987); Neuberger, M.

S. , Caskey, Η. M., Petersson, M., Williams, T., Surani, M.A.: Natúré 338., 350.(1989)].

Néhány fenti irodalmi hely szerint az egerek ivarvezetékébe csak az antitest könnyűláncának génjeit vagy csak nehézláncának génjeit vitték be. Ezeknél a vizsgálatoknál megmutatkozott, hogy az átrendezett transzgén az endogén immunglobulingének átrendezését gátolja, Ezenkívül a bevitt antitestgéneknek csak viszonylag csekély (5-10 pg/ml) szérumig terjedő mennyiségű kifejeződése volt észlelhető a transzgén egerekben. Más állatfajoknál az immunglobulingének kifejeződését az ivarvezetékbe való bevitel után eddig még nem írták le.

Az ez idáig megjelent közlemények továbbá csak monomer polipeptidek kifejezését hozták nyilvánosságra. Egy komplett, több alegységből álló antitestmolekula kifejezéséhez szükséges lenne, hogy mindegyik gén közel azonos mértékben íródjon át, és az így külön-külön képződött polipeptid alegységek az egyes láncok között szükséges diszulfidhidak képződésével teljes, funkcionális proteinné álljanak össze. Idáig ezt senkinek nem sikerült megoldania.

Mivel továbbá a transzgén állatban a mikroinjekcióval bevitt heterológ immunglobulingének mellett a fajtaazonos immunglobulingének is kifejeződnek, várható volt, hogy nem komplett heterológ antitestek, hanem heterológ és homológ alegységek kombinációját tartalmazó antitestek expresszálódnak.

Feladatunk olyan eljárás kidolgozása volt, amellyel komplett heterológ antitesteket nagyobb kitermeléssel nyerhetünk ki transzgén állatokból.

A találmány szerinti feladatot teljes, heterológ antitestek előállítására alkalmas olyan eljárás kidolgozásával oldottuk meg, amelynek során egy vagy több darabból álló, ezt az antitestet kódoló, bakteriális idegen szekvenciáktól mentes DNS-szekvenciát sertés vagy nyúl megtermékenyített petesejtjének hím pronukleuszába viszünk be mikroinjektálás útján, a petesejteket egy sertés vagy nyúl petevezetékébe ültetjük be, és utódokat hordatunk ki, amelyekből ezután szokásos módon a teljes, heterológ antitesteket kinyerjük.

Meglepő módon azt találtuk, hogy ez az eljárás teljes, működőképes heterológ antitesteket eredményez igen jó kitermeléssel.

A limfoid sejtekben lévő antitesthatású proteinek találmány szerinti kifejezésére előnyösen immunglobulinpromotert és erősítő- (enhancer) elemeket alkalmazunk. Az expresszálandó géneket szokásos módon egy prokariótavektorba szubklónozzuk és alkalmas gazdasejtekben szaporítjuk. A megfelelő géneket a vektor megfelelő restrikciós endonukleázokkal végzett hasítása után prokariótaszekvenciáktól mentesen izoláljuk, és megtermékenyített petesejtekbe fecskendezzük be. Ennek során körkörö2

HU 218 047 Β sített vagy előnyösen linearizált DNS-t alkalmazhatunk. Az expresszálandó géneken lévő (egy vagy több) intronszekvencia in vitro mutagenezissel végzett deléciója után a kifejeződésnek is végbe kell mennie a transzgén állatban. Abban az esetben, ha valamely antitest könnyűvagy nehézláncának kifejezésére komplementer DNS-t (cDNS = complementary DNS) alkalmazunk, akkor immunglobulin-promotert és erősítőszekvenciákat klónozhatunk az expressziós vektorba az expresszálandó cDNS elé. Genomiális ffagmenseknek cDNS-sel való fúziója is lehetséges [Gillies, S. D. és munkatársai Bio/Technology 7. (1989) 799-804.; Orlandi és munkatársai, Proc. Nat. Acad. of Sci. USA 86. (1989) 3833-3837.]. Az antitestgének kifejezésének egy további javítása lehetséges oly módon, hogy adott esetben antitestgének nem kódoló körzeteiben lévő szabályozóelemeket alkalmazunk. így az emberi kappa-génekre (könnyűlánc) röviddel ezelőtt egy, a 3’-nemtranszlatált régióban lévő erősítőelemet írtak le [Meyer, K. B. és Neuberger, M. S. EMBO J. 8. (1989) 1959-1965.], egér λΐ láncokra, a 3’-nemtranszlatált régióban ugyancsak leírtak egy erősítőelemet [Bich-Thuy, L. és Queen, C., Nucl. Acids Rés.

17.(1989) 5307-5321.].

A „teljes heterológ antitest” fogalomkörébe a következők tartoznak:

a) Különböző fajok teljes antitestjei

A kifejezés lehetséges az antitest könnyű- és nehézlánca komplett génjeinek bevitelével sertés vagy nyúl megtermékenyített petesejtjeibe, mimellett minden antitestizotípus elvileg expresszálható. Előnyösen a nehézlánc egy γ-lánc, a könnyűlánc pedig egy kappalánc.

Az antitestek származhatnak egérből, patkányból vagy sertés petesejtjeinek alkalmazása esetén nyulakból. Különösen előnyös azonban emberi antitestek kifejezése.

Az emberi antitestek nagymértékű diagnosztikai és terápiás képességgel rendelkeznek. Ezek terápiás célokra való alkalmazásnál előnyösebbek, mint az egérantitestek vagy a géntechnológiailag előállított, kimerizált vagy humanizált antitestek, mivel terápiás alkalmazásuknál a szervezet immunreakciója nem várható. Stabilis, jól termelő humán B sejtvonalak vagy hibridómák felépítéséhez azonban a gyakorlatban súlyos problémák társulnak.

Emberi antitesteket kódoló gének vagy könnyű- és nehézláncok cDNS-ei szokásos eljárások szerint kaphatók emberi hibridómasejtekből.

Emberi antitestek kinyerése és terápiás alkalmazási területei a következő irodalmi helyeken vannak leírva:

James, H. és Bell, G. T., (1987), Humán monoclonal antibody production. Current status and future prospects. J. Immunoi. Methods 100., 5-40.;

Boyd, J. E. és James, K. (1988), Humán monoclonal antibodies: Their potential, problems and prospects. In: Avances in Biotechnological Processes. Vol. II. Mizraki, A. (Ed.) A. R. Liss, Inc., New York;

Larrick, J. W. and Bourla, J. M. (1986), The prospects fór the therapeutic use of humán monoclonal antibodies, J. Bioi. Med. 5. (1986) 379-393.

b) Kimerizált és humanizált antitestek

Kimerizált antitesteken itt egér vagy más állatfajok variábilis régióját (ideszámítva D=diversity és J =joining szegmenseket) és egy más állatfaj, különösen az ember konstans régióit tartalmazó molekulákat éltünk. Ezeknek az antitesteknek az előállítása géntechnológiai úton történik, ahogy a humanizált antitesteké, amelyeknél az emberi könnyű- és nehézláncok génjeibe hipervariábilis CDR-régiókat (CDR=complementarity determining regions), például megfelelő egérvagy patkányantitesteket építenek be (=CDR-régiók kicserélése a megfelelő egér- vagy patkányantitestek régiója ellenében). Ez a technika CDR-beültetés (CDRgrafting) néven ismert. A CDR-régiók az antitestmolekuláknak azok a területei, amelyek meghatározzák a mindenkori antigénekhez való affinitást.

A találmány szerinti eljárással a kimerizált antitestek valamennyi szóba jöhető izotípusa expresszálható transzgén sertésekben vagy nyulakban.

A kimerizált antitestek CDR-grafting technikával való kinyerését a következő irodalmi helyen ismertetik: Jons, P. T., Dear, P. H., Foote, J., Neuberger, M. S., Winter, G. (1986) Replacing the complementary-determining regions in a humán antibody with those from a mouse antibody, Natúré, 321. (1986), 522-525.

A kimerizált antitesteknek nagy a terápiás képessege rosszindulatú betegségek kezelésében. Ennek során az antitestek epitópokat ismernek fel daganatsejtspecifikus antigéneken [Sun és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84., (1987), 214-218.; Nishimura, Y. és munkatársai CancerRes. 47., (1987), 999-1005.]. c i Heterobispecifikus antitestek

A heterobispecifikus antitesteknek nagy a terápiás képessége, például vírussal fertőzött sejtek elpusztításánál. Egy heterobispecifikus antitest felismeri például a sejtfelületen lévő antigének és a citotoxikus T-sejtek epitópját [Gilliland, L. K., Clark, M. R. és Waldmann, H.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85. (1988) 7719-7723.; Staerz, U. D., Yewdell, J. W. és Bevan, M.: Eur. J. Immunoi. 17. (1987) 571-574.]. Az EP-A 0 388 964 számú európai közzétételi iratban eljárást ismertetnek heterobispecifikus antitestek géntechnológiai előállítására. A kifejezés transzgén sertésben vagy nyúlban feltételezi mindkét antitest könnyű- és nehézlánca génjeinek izolálását és az ezt követő befecskendezést a megtermékenyített petesejtekbe. Emellett a két antitestnek nem kell feltétlenül ugyanannak az izotípusnak lennie (például IgGl). A találmány szerinti eljárással lehetséges különböző izotípusú heterobispecifikus antitestek kinyerése transzgén sertésekből vagy nyulakból, és lehetőség van CDC (complement dependent cytotoxicity) és ADCC (antibody dependent cellmediated cytotoxicity) vizsgálatukra.

d) Fúziós proteinek antitestmolekula-területekkel

Ezen a megjelölésen valamely antitest antigénkapcsoló részéből és az immunglobulin-szupercsalád (például T-sejt-receptor vagy Fc-receptorok) más tagjainak a jelátadó régiójából (transzmembránterületből és citoplazmaterületből) származó fúziókat kell érteni.

HU 218 047 Β

Ilyen molekulák lehetséges bioszenzorokként nagy gyakorlati jelentőséget érhetnének el. Heterogén fúziós proteinek kifejezése is lehetséges a találmány szerinti eljárással a megfelelő DNS-szekvenciáknak sertés vagy nyúl petesejtjébe történő mikroinjektálása útján. így például fúzió jöhet létre az antitest egy antigénkapcsoló területéből és egy olyan területből, amely antigénkapcsolás után enzimes fünkciót gyakorol (például az inzulinreceptor vagy az EGF-receptor tirozin-kináz-területe, vagy az ANF-receptor guanilát-cikláz-területe).

Terápiásán fontos fúziós proteinek - így azok a fúziók, amelyek a CD4-antigén területeiből, a HIV-vírus számára az emberi T-limfocitákon lévő receptorból és az antitestmolekulák fontos effektorműködéseket (például komplementkapcsolás, sejtlízis) közvetítő területeiből képződnek - szintén nagy kitermeléssel expresszálhatók transzgén sertésekben a találmány szerinti eljárással.

e) Mutált antitestek

Idetartoznak azok az antitestek, amelyek géntechnológiai manipuláció következtében jobb affinitást mutatnak az antigénhez, mint a kiindulási antitestek. Idetartoznak azok az antitestek is (géntechnológiai manipuláció útján), amelyek megváltozott komplementkapcsolási tulajdonságokkal rendelkeznek, és megváltozott kötési tulajdonságokat mutatnak Fc-receptorok vonatkozásában makrofágokon és monocitákon, valamint azok is, amelyek megváltozott citolitikus tulajdonságokkal rendelkeznek. Az antitestmolekuláknak ez a csoportja is expresszálható a találmány szerinti eljárással transzgén sertésekben vagy nyulakban.

Antitesteknek a szérumból való kinyerése mellett a találmány szerinti eljárással lehetőség nyílik transzgén sertések vagy nyulak immunizálására is. Bizonyos antigének - különösen olyan antigének, amelyek ezeknél az állatoknál veszélyes betegségeket idéznek elő, például influenzát vagy sertéspestist okoznak - antitestjeit kódoló géneket igen hatásosan vihetünk be a találmány szerinti eljárással ezeknek az állatoknak az ivarvezetékébe. Ily módon olyan állatokat hozhatunk létre, amelyek rezisztensek bizonyos fertőzésekkel szemben.

Terápiásán fontos proteineknek a kiválasztása tejbe szintén lehetséges a találmány szerinti eljárással.

Az IgA osztály antitestmolekuláit kiválaszthatjuk a tejbe (szekréciós IgA=sIgA). IgA-val való fúzió útján lehetővé válik más proteinek, például koagulációs faktorok, így a VIII. faktor vagy a IX. faktor, vagy enzimek, így például a szövet típusú emberi plazminogénaktivátor kiválasztása a transzgén állatok tejébe. Megfelelő enzimhasító helyeknek a kiválasztóantitestek és a fúziós partnerek (például kollagenáz, Xa faktor) közé történő beépítése által kinyerhetjük a megfelelő molekulát a tejből való elkülönítés után és ezt követő enzimes hasítással.

Az előzőekben elmondottakból látható, hogy a találmány transzgén állatok előállítási eljárását is magában foglalja. Ennek során valamely sertés vagy nyúl megtermékenyített petesejtjének hím pronukleuszába egy vagy több darabból álló, teljes, heterológ antitestet kódoló DNS-szekvenciát viszünk be, amely mentes bakteriális idegen szekvenciáktól, a petesejteket egy nőstény állat petevezetékébe ültetjük be, és az utódokat kihordatjuk. Erre a célra például olyan DNS-szekvenciákat alkalmazhatunk, amelyek teljes, heterológ antitesteket kódolnak; az antitesthatás olyan antigén ellen irányul, amely egy, a szóban forgó állatfajta (sertés vagy nyúl) számára veszélyes betegséget okoz. Ilyenfajta állatbetegségek a szakember számára ismertek, és ugyancsak ismertek az ezeket okozó antigének is. Ezeknek az ismert antigéneknek a segítségével önmagában ismert módon olyan antitestek hozhatók létre, amelyeknek a DNS-szekvenciáit ezután ismert módon (például génbank screenelése útján) megkaphatjuk. Ezt követően ezek az antitesteket kódoló DNS-szekvenciák transzgén állatok létrehozására alkalmazhatók a találmány szerinti eljárással. Ily módon például olyan transzgén állatok hozhatók létre, amelyek immunitást mutatnak bizonyos betegségekkel szemben.

A találmány szerint előállított transzgén állatok például azok, amelyek A20/44 antitestet termelnek, amely antiidiotipikus antitest, és amely az EP-A-0 388 964 számú európai közzétételi iratban van leírva.

A következő példák az 1. ábrához kapcsolódva a találmány közelebbi bemutatására szolgálnak.

Az 1. ábra a mikroinjekcióhoz alkalmazott antitestgéneket szemlélteti.

példa

Antitest-DNS-szekvenciák előállítása

A kiindulási vektorok a pBMSl (DSM5229) és a pBMS2 (DSM5230) plazmidok, amelyeket az EP-A 0 388 964 számú európai közzétételi iratban (Eljárás heterobispecifikus antitestek előállítására) ismertetnek. A vektorok egy egérantitest kappa- és Yj-génjét tartalmazzák egymáshoz viszonyítva különböző orientációkban. Ezeket a géneket egy hibridóma-sejtvonalból izolálták, amely egy A20/44 jelű IgGl antitestet választ ki [Sablitzky, F., Wildner, G. és Rajewsky, K.: EMBO J., 4. (1985) 345-350.; Sablitzky, F„ Weisbaum, D. és Rajewsky, K.: EMBO J., 4. (1985) 3435-3437.; Kocks, C. és Rajewsky, K.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85. (1988) 8206-8210.]. Az A20/44 egy antiidiotipikus antitest, amely egy, az NP-hapténre (4-hidroxi-3-nitro-fenil-acetát) specifikus antitest ellen irányul. Az utóbbi antitest egy λ-láncot foglal magában könnyűláncként és egy X_2a-láncot nehézláncként (IgG2a).

Az EP-A 0 388 964 számú európai közzétételi iratban ismertetett vektorok a kappa-gént tartalmazzák 5,5 kb Sall-fragmensként és a γΐ-gént 9,25 kb Sallfragmensként. A vektorok tartalmaznak továbbá expressziós kazettákat a foszfotranszferáz neo és az egérdihidrofolát-reduktáz számára a korábbi SV40 promoter szabályozása mellett.

A pBMl-et és a pBMS2-t (mindenkor 3 Sall-helyet foglalnak magukban) Sall-gyel részlegesen hasítjuk, nukleáz Sl-lel kezeljük (1 pg Sall-gyel részlegesen hasított DNS-t 10 egység Sl-nukleázzal 60 percig 30 °C-on

HU 218 047 Β mmol/1 nátrium-acetátban, 4,5 pH; 0 mmol/1 ZnSO₄ és 0,5 tömeg% glicerin, inkubálunk), a linearizált (kiegyenesített) plazmidot egy alacsony hőmérsékleten olvadó agarózgélen elkülönítjük, és a végeket ezt követően T₄-ligázzal összekötjük (ligáljuk). A ligáit anyagokat a HB101 E. coli törzsbe transzfektáljuk, és az 50 pg/ml ampicillinnel szemben rezisztens kolóniákat agarlapokon izoláljuk. A restikciós endonukleázokkal való elemzéssel meghatározzuk mindazokat a plazmidokat, amelyeknél a fent leírt műveletek útján a kappaés a λ _rgén között lévő AslI-helyek delécióját elvégeztük. A kapott plazmidokat pBmSl (ASal) és a pBMS2 (ASal) jelzéssel látjuk el. A pBMSl (ASal)-t és a pBMS2 (ASal)-t Sall-gyel hasítjuk, és a Sall-fragmenst, amely az antitest kappa- és γ,-génjét tartalmazza, egy alacsony hőmérsékleten olvadó agarózgélen elkülönítjük, és ezt követően oldjuk 10 mmol-os triszHCl-ban (7,5 pH, 0,25 mmol EDTA).

Ezzel a vektorszekvenciáktól mentes antitestgéneket izoláltuk az ezt követő mikroinjekciós kísérlet számára (1. ábra).

2. példa

Transzgén emlősök létrehozása

Transzgén emlősállatok létrehozása abban áll, hogy injektálható DNS-oldatot készítünk, a megtermékenyített petesejteket és embriókat kinyerjük, a DNS-oldatot mikroinjektáljuk a pronukleuszba vagy a sejtmagba, a beinjekciózott zigótákat bevisszük a szinkronizált fogadóállatokba, és a született állatokat megvizsgáljuk a DNS beépülése (integrálódása) vonatkozásában. Ennek során az egyes emlősállatfajokra, így egérre, nyálra és sertésre néhány fajtól függő különbség figyelhető meg az adó- és fogadóállatok előkészítésénél, az embriók kinyerésénél és átvitelénél, valamint a mikroinjektálásnál.

1. Injektálható DNS-oldat előállítása

A DNS-ffagmens elkülönítése és a DNS-tartalom meghatározása után a DNS-oldatot oly mértékben hígítjuk trisz-pufferrel, hogy egy pikoliter oldatra számítva a génszerkezet 1000-ig terjedő számú másolatát kapjuk. Valamennyi - a DNS-mikroinjekciós oldat előállításához használt - oldatnak mentesnek kell lennie szemcsés szennyezésektől annak érdekében, hogy elkerüljük az injekciós pipetták eldugulását.

2. Az embriók kinyerése

Az embriótermelés növelése érdekében a donorállatokat szabályszerűen szuperovuláltatjuk.

- Egér

Olyan nőstény egerekbe, amelyek legalább 6 hetesek, a szuperovuláció megindítására 5-10 IE PMSG-t (pregnant maré serum gonadotropin) fecskendezünk be, majd 48 óra múlva az állatok 5-10 IE HCG-t (humán choriongonadotropin) kapnak, és termékeny hímekkel pároztatjuk azokat. A következő reggelen a Plaque-pozitív egereket leöljük, és a hasüreg felnyitása után a petevezetéket kivesszük. A korsószerű tágulatnak (ampullának) finom csipesszel való felnyitása vagy a petevezeték öblítése útján az embriókat kinyerjük és embriótenyészközegbe helyezzük át, amelyhez hialuronidázt adunk. A petesejteket a kumuluszsejtek eltávolítása után mossuk és a mikroinjektálásig tenyésztjük.

- Nyúl

Nemileg érett donomyúlnak szuperovuláció létesítésere egy adagban beadunk 10-40 IE PMSG-t (pregnant maré serum gonadotropin) testtömeg-kilogrammonként. A szuperovulációt meg kell előznie egy 21 napos külön tartásnak vagy előszinkronizálásnak [120 IE HCG vagy 0,8 pg GnRH (gonadotropin-releasing factor)]. A PMSG-injekció beadása után 72-76 órával a nyulakat egyórás időközben kétszer megtermékenyítjük mesterségesen, vagy természetes módon befedeztetjük. Közvetlenül ez után az ovuláció megindításához 120-180 IE HCG-t kapnak intravénásán. Az embriókivetel 19-21 órával a megtermékenyítés után történik a donomyúl leölése útján. Az embriókat a petevezetékből a nyúlembriók tenyészközegével (BMS+20% FKS vagy PBS+20% FKS) kiöblítjük a fimbriatölcsérből az uteruskürt irányába. Szükség esetén a még jelen lévő cumulus oophorust hialuronidázzal való kezelés útján eltávolítjuk. Az embriókat mossuk és a mikroinjektálásig tenyésztjük.

- Sertés

Sertéseknél serdülőkorú, 60-90 kg tömegű fiatal kocákat is használhatunk embriónyerésre. A 0. napon a donorállatokat más ólba költöztetjük, és este 1250 IE PSMG-t adunk be nekik. Az ovulációt 72 óra múlva megindítjuk 750 IE PMSG-t adunk be nekik. Az ovulációt 72 óra múlva megindítjuk 750 IE HCG segítségével, majd 24 és 36 órával a HCG alkalmazása után az állatokat megtermékenyítjük. Az embriók kivételét 24-27 órával a megtermékenyítés után végezzük. Sebészeti embriókivételhez az állatokat 160 mg Azaperon (Stressnil) és 400 mg Metomidat-hidroklorid (Hypnodie) segítségéve 1 narkotizáljuk. Az operációs terület előkészítése után a bőrt a középső részen az utolsó két csecsbimbópár magasságában körülbelül 10 cm hosszú vágással kinyitjuk, és a méhet, a petevezetéket és a petefészket előrehelyezzük. A méhet körülbelül 5 cm-re a méhkürtátmenethez képest kaudálisan (farok felőli részen) lekerekítve perforáljuk úgy, hogy körülbelül 5 cm üvegkanült be tudjunk vezetni a szervbe és ott rögzíteni tudjuk. A petevezetékbe a fimbriatölcséren keresztül egy 8 cm hosszú, hajlított szemkanült vezetünk be, amely körülbelül 30 cm hosszú gumicsővel van összekötve, és azt rögzítjük. A petevezetéket 50 ml PBS-oldattal öblítjük. Az öblítőfolyadékot egy Petri-csészében felfogjuk, és az embriókat megkeressük. Az embriókat elkülöníthetjük úgy is, hogy a donorállatokat leöljük.

3. A DNS-oldat mikroinjektálása

A mikroinjektáláshoz egy inverzmikroszkópot (Zeiss. ICM 405), két Leitz mikromanipulátort és egy injekciós készüléket (Eppendorf) alkalmazunk. Az egyik manipulátor egy tartópipettát hord, amellyel az embriót vákuumban rögzíthetjük. A másik mikromanipulátoron a DNS-oldattal töltött injekciós pipetta egy nanostepperben van rögzítve, és össze van kötve az injekciós készülékkel. Az injekciós pipetta hegyének az átmérője 1-2 pm. A mikroinjektáláshoz a pipettahegyet a zóna pellucidán, a sejthártyán és a maghártyán át a magüreg5

HU 218 047 Β be előretoljuk, és körülbelül 1 -2 pl DNS-oldatot ott leadunk. A pronukleusz térfogat-növekedése eredményes mikroinjektálást jelez. Részben sikeres az embriók mikroinjektálása a kétsejtes állapotban is.

Az egérrel vagy a nyállal szemben a legtöbb haszonállatfajnál (sertés, szarvasmarha) a petesejteket és az embriókat a pronukleuszok és a sejtmagok láthatóvá tétele érdekében elő kell kezelni (centrifugálás 15 000 g-nél 3-5 percig). A mikroinjektálás egy közegcseppben egy tárgylemezen vagy egy úgynevezett injekciós kamrában történik. A mikroinjektálás után a petesejteket vagy az embriókat az átvitelig tenyésztjük.

4. A mikroinjektált petesejtek átvitele

- Egér

A befogadóegereket látszatterhesség kiváltása érdekében az ondó vezetéküktől megfosztott hímekkel éjszakán át pároztatjuk. Plaque-pozitív egereket keresünk, és az átvitelhez narkotizáljuk azokat. Az előrehelyezett petefészket (bursa ovarica) finom csipesszel felnyitjuk, és az átvivőpipettába felszívott embriókat (10-15 oldalanként) átvisszük a két petevezetékbe. A kölykök születése 20-21 nappal az átvitel után történik.

- Nyúl

A befogadónyulakat 21 nappal a valószínű határidő előtt ciklusszinkronizálásra külön-külön ólba helyezzük, és látszatterhesség beindítása céljából 120 IE HCG-t vagy 0,8 pg GnRH-t adunk be nekik intramuszkulárisan. Az átvitel előtti napon a fogadónyulak az ovuláció megindulásához 120 IE HCG-t kapnak intravénásán. Átvitelhez a nyulakat 0,4 ml/kg testtömeg 2%-os Rompunnal és 0,8 ml/kg testtömeg 10%-os Ketaminnal narkotizáljuk. Az operációs terület előkészítése és a húgyhólyag hasi nyomással való kiürítése után a nyulakat háti fekvésben lekötözzük, és ferde helyzetben rögzítjük. Közvetlenül a köldöktől a farok irányába a hasüreget megnyitjuk körülbelül 4-5 cm hosszúságban. A petefészket, a petevezetéket és a fejfekvésű méhkürtöt előrehelyezzük, majd a petefészek-reakció ellenőrzése után a mikroinjektált embriókat egy átvivőpipetta segítségével körülbelül 2-2,5 cm mélyen bevisszük a petevezeték korsószerű tágulatába. Oldalanként 8 és 15 közötti embriót viszünk át. A hasüreg lezárása után az operáció által okozott sebet egy bőrráncfedő varrással védjük. A fiatal kölykök születése 29-31 nappal az átvitel után történik meg.

- Sertés

Befogadóállatokként a sertésnél is serdülőkor előtti fiatal kocákat alkalmazhatunk. A donorállatok után 12 órával a befogadóállatok 750 IE PMSG-t és további 72 óra elteltével 750 IE HCG-t kapnak. Ez a 12 órás időeltolódás a donor- és a fogadóállat között javítja az embriók túlélési esélyeit az átvitel után. Párhuzamosan a donorállatok által történő magleadással a fogadóállatok izgalmi állapotát megfigyeljük. A program kezdete után 135-136 órával (0 óra=PMSG-injekció beadása a donorállatoknál) történik az embrióátvitel. Valamennyi injektált embriót (35-45 darab) sebészeti átvitel útján valamely fogadósertés petefészkébe visszük. Az embriók térközökben egyenletesen eloszlanak a két méhkürtben. Egy új eljárás lehetővé teszi az embriók vérmentes átvitelét a sertésméhbe. A fiatal malacok születése az átvitel után 113-116 nappal következik be.

5. Az integrálódásra irányuló vizsgálat

Nt. injektált DNS integrálódásának vizsgálatához a megszületett állatoktól szövetpróbát (farokszövet, vér vagy próbakimetszés) kell venni. Ezekből a szövetpróbákból nagy molekulájú genomiális DNS-t különítünk el. Az integrálódás bizonyításához Slot Biot, Dót Biot vagy Southem-Blot elemzést végzünk.

A pozitív állatokat (génszerkezet integrálódásával rendelkező állatok) felneveljük, és a tenyészetre érés elérése után nem transzgén párosodó partnerrel párosítjuk. Az ezekből a párosításokból származó utódokat megvizsgáljuk arra nézve, hogy ezek a transzgént örökölték-e a transzgén szülőktől. Hemizigóta transzgén állatok párosítása útján azután homozigóta transzgén F₂ utódokat tenyésztünk.

A kifejeződés vizsgálatához a transzgén állatoktól vérvétel után szérumot nyerünk. A vérvétel a szemgolyó mögötti (retrobulbáris) szemérfonat (egér), fülkarima (nyúl) vagy a nyaki véna (sertés) pungálása útján vagy más hozzáférhető vénából, illetve az állatok leölése után történik.

példa

Az antitesttiter meghatározása a transzgén állatok szérumában

Az antitesttiter meghatározásának módját az EP-A 0 388 964 számú európai közzétételi iratban ismertetik. A mikrotiterlapokat NP-hapténnel (4-hidroxi3-nitro-fenil-acetát) szembeni antitesttel rétegezzük. Ez az antitest IgG 2a típusú (a könnyűlánc egy λ-lánc, a nehézlánc pedig egy y2a lánc). A rétegezőpuffer 0,2 mmol/1 karbonátból/hidrokarbonátból áll, amelynek a pH-ja 9,4. A lapokat 2 óra múlva egy utánrétegező pufferrel (50 mmol/1 HEPES, 0,15 ml/1 NaCl, 0% C rőtéin C, pH=7,0) inkubáljuk. Valamennyi reakciót szobahőmérsékleten rázás közben végezzük. A kalibrációs görbét egy A20/44 (IgGl)-et tartalmazó antitesttörzsoldattal (hígítási sor) készítjük. A kalibrációs próbákat és a szérumokat inkubációs pufferrel (50 mmol/1 HEPES, 0,15 mol/1 NaCl, 1% Crotein C, pH = 7,0, 0,2 mol/1 dinátrium-tartarát, 0,75% polietilénglikol (PEG), 0,5% Pluronic F68, 0,75% PEG 40 000, 0,1% fenol) hígítjuk, és 2 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk. A mélyedések kiszívása és inkubációs pufferrel való kétszeri mosás után egy óra hosszat tartó inkubálás következik konjugátummal [konjugátum: olyan antitest Fab-fragmenseiből, amely NP ellen irányul, és peroxidázból (POD)]. Ehhez a konjugátumot az inkubációs pufferben 150 mU/ml POD-aktivitásra hígítjuk. A mélyedések kiszívása és mosópufferrel (50 mmol/1 HEPES, 0,15 mmol/1 NaCl, 0,1% Pluronic F68, pH = 7,0) történő háromszori mosás után 60 percig reagáltatjuk ABTS-sel (2,2’-azino-di[3-etil-benztiazolinszulfát (6)] mint szubsztrátummal. Az extinciót fotométerben (ELISA-Reader) 405 nm-nél mérjük 490 nm ellenében. A próbák koncentrációját szabványos kalibrác ós görbe útján határozzuk meg, és az eredményeket az alábbi táblázatban adjuk meg.

HU 218 047 Β

Táblázat

Antitesttiter transzgén állatok szérumában

Eger száma	ng/ml	Nyúl száma	ng/ml	Sertés száma	ng/ml
970-28	3	2644	200	5814	1000
970-29	7			kontroll	0
970-31	18	kontroll	0
970-32	10
970-33	18
970-54	30
970-55	3
970-56	18
970-59	3
974-1	27
974-2	29
974-3	18
974-4	4
974-8	18
974-9	100
974-10	45
974-11	20
974-12	120
974-13	60
974-14	15
Kontroll	0

A vizsgált egerek a két 970 és 974 számú szeropozitív egér utódai. Egy sor utód szeronegatívnak bizonyult a bevitt antitestspecifikusság vonatkozásában. Ezek a fenti táblázatban nincsenek feltüntetve. Mikroinjektálás után mind a 39 állatot megvizsgáltuk génkifejeződés szempontjából. Egy állat a kívánt antitestspecifikusságát expresszálta a szérumban. Két transzgén sertést (1 halva született) kaptunk. Az élve született állat a kívánt antitestet meglepő módon nagyon nagy koncentrációban (1000 pg/ml) expresszálta a szérumban.

4. példa

A sertésszérumban expresszált antitest jellemzése a) Izoelektromos fokuszálás és immunrögzítés Izoelektromos fokuszálást (IEF) egy Phast-Gelrendszeren (Pharmacia) végeztünk az előállító útmutatása szerint. A transzgén és a kontrolisertés szérumát 1:1000 arányban hígítottuk, és nem denaturáló körülmények között felvittük a gélre. A pH-gradienst a gélen (pH = 5-8) kalibrálóproteinek (Pharmacia) útján szemléltettük. A gél futásideje 30 perc volt. Ezt követően azt 45 percre 100 pg poliklonális antitesttel (juh antiegér Fc γ) 150 pl térfogatban inkubáltuk, és egy cellulóz-acetát-csíkkal letakartuk. A nem reagáló proteint 50 mmol/1 kálium-foszfát-pufferrel, 0,15 mol/1 NaCldal, 0,05% Tweennel 7,2 pH-η való mosással eltávolítottuk éjszakán át történt rázás közben. Ezt követően az immunkomplexeket ezüstszínezéssel (Pharmacia-Kit) láthatóvá tettük. Kontrollként ascitesből tisztított A20/44 antitestet vittünk fel.

Megállapítottuk, hogy a transzgén sertés szérumában ugyanazok a jellemző sávok azonosíthatók, mint a tisztított A20/44 antitestéi. A kontrollállatok szérumában ezek a jellemző sávok nem voltak kimutathatók.

b) Az A20/44 antitest tisztítása transzgén sertés szérumából

Az A20/44 egy antiidiotipikus antitest olyan antitesttel (IgG2a) szemben, amely az NP-haptén ellen irányul. Ez utóbbit ascitesből tisztítottuk és bróm-ciánnal aktivált szefarózhoz (Pharmacia, Sepharose) kapcsoltuk az előállító útmutatása szerint. Az A20/44 antitestet ily módon előállított affinitásoszlopon a transzgén sertés 100 ml-nyi szérumának a felvitele után immunadszorbeáltuk, eluáltuk, és ezt követően proteinkémiailag jellemeztük.

Az eredmény azt mutatja, hogy az ascitesfolyadékból tisztított A20/44 antitesttel egyezik tulajdonságait tekintve.

Claims (13)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás teljes, heterológ antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy vagy több darabból álló, ezt az antitestet kódoló, bakteriális idegen szekvenciáktól mentes DNS-szekvenciát sertés vagy nyúl megterméke7

   HU 218 047 Β nyített petesejtjének hím pronukleuszába viszünk be mikroinjektálás útján, a petesejteket egy sertés vagy nyúl petevezetékébe ültetjük be, és utódokat hordatunk ki, amelyekből ezután szokásos módon a teljes, heterológ antitesteket kinyerjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciákat immunglobulin-promoterrel és erősítő- (enhancer) szekvenciákkal együtt visszük be.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroinjektálásnál alkalmazott DNSszekvenciákat lineáris formában használjuk.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest teljes, natív antitest.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest egy γ-nehézlánccal és egy kappakönnyűlánccal rendelkezik.
6. 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest egy kimerizált antitest.
7. 7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest egy heterobispecifikus antitest.
8. 8. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest olyan antitest, amely egy további polipeptiddel van fuzionálva.
9. 9. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest egy mutáns antitest.
10. 10. Eljárás transzgén sertés vagy nyúl előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely sertés vagy nyúl megtermékenyített petesejtjének hím pronukleuszába egy vagy több darabból álló, teljes, heterológ antitestet kódoló, bakteriális, idegen szekvenciáktól mentes DNSszekvenciát viszünk be, a petesejteket egy nőstény állat petevezetékébe ültetjük be, és az utódokat kihordatjuk.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestet - mely antitest fajlagos hatása olyan antigén ellen irányul, amely egy, a szóban forgó állatfajta számára veszélyes betegséget okoz - kódoló DNSszekvenciákat viszünk be.
12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A20/44 antitestet termelő transzgén nyulat vagy sertést állítunk elő.
13. 13. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan transzgén állatokat állítunk elő, amelyek immunitást mutatnak betegségekkel szemben.