PL170647B1 - Sposób otrzymywania bialek o aktywnosci przeciwcial PL - Google Patents
Sposób otrzymywania bialek o aktywnosci przeciwcial PLInfo
- Publication number
- PL170647B1 PL170647B1 PL91288697A PL28869791A PL170647B1 PL 170647 B1 PL170647 B1 PL 170647B1 PL 91288697 A PL91288697 A PL 91288697A PL 28869791 A PL28869791 A PL 28869791A PL 170647 B1 PL170647 B1 PL 170647B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibody
- dna sequences
- antibodies
- microinjection
- activity
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 35
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 34
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 32
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 12
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 5
- 101150042441 K gene Proteins 0.000 description 4
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 3
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 210000005132 reproductive cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- QBHBHOSRLDPIHG-UHFFFAOYSA-N (4-hydroxy-3-nitrophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 QBHBHOSRLDPIHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N GnRH Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 2
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTJPVVKEZMOHNU-UHFFFAOYSA-N 6-(oxan-4-yl)-1h-indazole Chemical compound C1COCCC1C1=CC=C(C=NN2)C2=C1 NTJPVVKEZMOHNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 108010006835 Atrial Natriuretic Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- FHFZEKYDSVTYLL-UHFFFAOYSA-N Methomidate Chemical compound COC(=O)C1=CN=CN1C(C)C1=CC=CC=C1 FHFZEKYDSVTYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241001591005 Siga Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- XTKDAFGWCDAMPY-UHFFFAOYSA-N azaperone Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(=O)CCCN1CCN(C=2N=CC=CC=2)CC1 XTKDAFGWCDAMPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950003616 azaperone Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 108010042209 insulin receptor tyrosine kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000019321 monosodium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940119126 sodium bitartrate Drugs 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 229950002929 trinitrophenol Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000001177 vas deferen Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150001275 yl gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/107—Rabbit
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/108—Swine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
1. Sposób otrzymywania bialek o aktywnosci przeciwcial, znamienny tym, ze sekwencje DNA kodujace lekkie i ciezkie lancuchy przeciwciala, które sa wolne od obcych sekwencji bakteryjnych, wprowadza sie przez mikroinjekcje do projadra meskie- go zaplodnionej komórki jajowej swini lub królika, komórki jajowe nastepnie implantuje sie do jajowodu swini lub królika, hoduje sie potomostwo i z niego w zwykly sposób otrzymuje sie bialko o aktywnosci przeciwciala, które jest zlozone z wytworzonych lekkich i ciezkich lancuchów przeciwciala. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania białek o aktywności przeciwciał. Białka te mogą być stosowane do celów diagnostycznych i/lub terapeutycznych.
Dla uzyskania ekspresji obcych sekwencji DNA u zwierząt, DNA można wprowadzić drogą mikroiniekcji do projądra męskiego zapłodnionej komórki jajowej a następnie komórki jajowe implantować do jajowodu odpowiednich zwierząt i wyhodować potomstwo u którego następuje ekspresja wprowadzonego materiału genetycznego. U myszy wyhodowano osobniki transgeniczne także przez zakażenie zarodków retrowirusem albo przez transfer komórek poddanych manipulacjom genetycznym do blastocytów (Janisch R.: Science 240, 1468 /1988/; Palmiter R.D. i Brinster, Ann.Rev.Genet. 20,465 /1986/ R.L.Brinster i R.D. i R.D.Palmiter, Harvey Lcctures, Scries 80 /Liss, New York, 1986, str. 1-38).
Tymczasem opisano wprowadzenie obcej informacji genetycznej do komórek rozrodczych szeregu gatunków zwierząt, tak na przykład u kur (Bosselman i wsp., Science 243, 533 /1989/), u ryb (Bram G., BrenigB, Hoerstgen-Schwark Gi WinnackerE.L., Aquaculture 68,209,/1988/), u królików (R.E.Hammer i wsp. Nature 315, 680, /1985/, G. Brom i wsp., Zuchthygine 20, 251, 1985/), u owiec (A.J.Clark i wsp. Bio/Technology 7,487, /1989/, J.Simons i wsp. Bio/Technology 6, 179 /1988/, C.E.Rexroad, Jr. i wsp. Mol. Reprod. Dev. 1, 164 /1989/) oraz u świń (G. Brem i wsp. Zuchthygiene 20, 251 /1985/, K.M. Ebert i wsp. Mol. Endocrinol. 2, 277, /1988/, Brem G, Brenig B·, Muller M, Krauslich H i Winnacker E.L.Occ. Publ. Brit. Soc. Aram Prod. 12, /1988/, 15-31).
170 647
U królików ekspresja genu króliczego c-myc odbywała się pod kontrolą sekwencji regulatorowych genu immunoglobuliny, co pociągnęło za sobą indukcję białaczki u transgenicznych królików (Knight K,L, Spicker-Polat H, Kazdin D, Oi V,T. Proc.Natl. Acad. Sci USA 85 /1988/ 3130-3134).
Otrzymano również transgeniczne króliki u których występowała ekspresja genu somatotropiny ludzkiej (Enikolopov i wsp., Dokl.Acad.Nauk SSSR, 299 /1988/1246-1249). Opisano także ekspresję human growth hormone releasing factor (czynnik uwalniający ludzki hormon wzrostu) u transgenicznych królików (Gataryan i wsp., Dokl.Acad.Nauk SSSR 305 /1989/726-728).
Wykazano ekspresję bydlęcego hormonu wzrostu u transgenicznych świń i badano jego wpływ na rozwój zwierząt transgenicznych (J. Anim. Sci. 66, Suppl. 1, 267 /1988/).
Wyhodowano także transgeniczne świnie u których występowała ekspresja antygenu powierzchniowego ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B (Dokl. Akad. Nauk SSSR 306 /1989/206-209).
Geny łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciał o określonej swoistości (dla nitrofenolu, trinitrofenolu, fosforylocholiny) izolowano z poszczególnych linii hybrydoma i wprowadzono do komórek rozrodczych myszy. U poszczególnych transgenicznych myszy ekspresja genów łańcucha lekkiego i ciężkiego następowała w postaci rekombinowanego przeciwciała (Rusconi S, i Kohler G, Nature 314, 330 /1985/, Grosschedl R, Weaver D, Baltimore D i Constantini F. Cell 38 /1984/ 647, U. Storb i wsp. J.Exp.Med. 164 /1986/, 627, Ritchie K.A, Brinster R.L. i Storb U. Nature 312,517 /1984/, Weaver D, Constantini T, Imanishi-Kari T. i Baltimore D. Cell 42,117/1985/, Iglesias A. Lamers M i Kohler GNature 330, 482/1987/, Neuberger M.S. Caskey H.M. Peterson M, Williams T, Surani M.A, Nature 338, 350 /1989/.
W niektórych z wyżej cytowanych prac wprowadzono do komórek rozrodczych myszy geny tylko lekkiego lub tylko ciężkiego łańcucha przeciwciała. Okazało się w tych badaniach, że przekształcony transgen hamuje przekształcenie się endogennego genu immunoglobuliny. U transgenicznych myszy stwierdzono tylko względnie niską ekspresję wprowadzonego genu przeciwciała (do około 5 do 10 μ g/ml surowicy). U innych gatunków zwierząt jak dotąd nie opisano ekspresji genów immunoglobulin po wprowadzeniu do komórek rozrodczych.
Zadaniem obecnego wynalazku było opracowanie sposobu otrzymywania z większą wydajnością przeciwciał od zwierząt transgenicznych.
Zadanie według wynalazku rozwiązano opracowując sposób otrzymywania białek o aktywności przeciwciał, który charakteryzuje się tym, że sekwencje DNA kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciała, które są wolne od obcych sekwencji bakteryjnych wprowadza się przez mikroinjekcję do projądra męskiego zapłodnionej komórki jajowej świni lub królika, komórki jajowe implantuje się następnie do jajowodu świni lub królika, hoduje się potomstwo i z niego otrzymuje się w zwykły sposób białko o aktywności przeciwciała, które jest złożone z wytworzonych lekkich i ciężkich łańcuchów przeciwciała.
Dla ekspresji białek o aktywności przeciwciał według wynalazku w komórkach limfoidalnych stosuje się sekwencje DNA z promotorem i sekwencje wzmacniające. Geny, które mają być poddane ekspresji klonuje się w zwykły sposób w wektorze prokariotycznym i namnaża się w odpowiednich komórkach gospodarza. Właściwe geny, po rozszczepieniu wektora każdorazowo odpowiednimi nukleazami restrykcyjnymi, uwalnia się od sekwencji prokariotycznych i wstrzykuje do zapłodnionych komórek jajowych. Można przy tym użyć DNA kolistego lub linearnego korzystnie linearnego. Również po delecji sekwencji intron (jednej lub więcej) w geneach przez mutagenezę in vitro ekspresja powinna wystąpić u transgenicznych zwierząt.
W przypadku zastosowania komplementarnego DNA (cDNA) do ekspresji łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciała można klonować promotor immunoglobulin i sekwencje wzmacniające na wektorach ekspresji przed cDNA przeznaczonym do ekspresji. Możliwa jest również fuzja fragmentów genomu z cDNA (Gillies S.D. i wsp. Bio/Technology 7 (1989) 799-804, Orlandi i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86 /1989/ 3833-3837). Dalszym ulepszeniem ekspresji genu przeciwciała jest ewentualnie możliwe użycie elementów regulatorowych umiejscowionych w niekodujących odcinkach genu przeciwciała. I tak niedawno opisano dla ludzkiego genu K (łańcuch lekki) element wzmacniający umiejscowiony w odcinku 3' nie ulegającym translacji
170 647 (Meyer K.B. i Neuberger M.S., EMBO J.S /1989/ 1959-1965), a dla mysich łańcuchów λ.1 również element wzmacniający w odcinku 3' nie ulegającym translacji (Bich-Thuy L. i Queen C. Nucl. Acids Res. 17 /1989/ 5307-5321).
Sposobem według wynalazku wytwarza się białka o aktywności przeciwciał, przy czym pojęcie białko o aktywności przeciwciała obejmuje:
a) kompletne przeciwciała różnych gatunków
Ekspresja jest możliwa przez wprowadzenie kompletnego genu łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała do zapłodnionych komórek jajowych świni lub królika, przy czym zasadniczo mogą ulegać ekspresji wszystkie izotopy przeciwciała. Jako łańcuch ciężki wyróżnia się łańcuch γ, a jako łańcuch lekki łańcuch K.
Przeciwciała mogą pochodzić od myszy, szczura lub przy użyciu komórek jajowych świni również z królika. Szczególnie wyróżnia się jednak ekspresja przeciwciał ludzkich.
Przeciwciała ludzkie mają duży potencjał diagnostyczny i terapeutyczny. Przy użyciu do celów terapeutycznych są one przeciwciałami z myszy albo otrzymanymi techniką inżynierii genetycznej chimerami lub przeciwciałami humanizowanymi i w tym przypadku po zastosowaniu terapeutycznym nie powinna wystąpić odpowiedź immunologiczna organizmu. Skonstruowanie trwałych linii ludzkich komórek B lub hybrydom dobrze produkujących przeciwciała jest jednak ograniczone dużymi problemami praktycznymi.
Geny kodujące ludzkie przeciwciała lub cDNA łańcuchów lekkich i ciężkich otrzymuje się zwykłym sposobem z ludzkich komórek hybrydoma.
Otrzymywanie ludzkich przeciwciał i zakres ich stosowania terapeutycznego są opisane w następujących pozycjach literatury -.James H. i Bell G.T. (1987). Human monoclonal antibody production. Current status and future prospects. J. Immunol. Methods 100, 5-40; Boyd J.E. i James K. (1988), Human monoclonal antibodies:their potential, problems and prospects. W: Advances in Biotechnological processes. Tom II, Mizraki A (red) A.R. Liss, Inc. New York; Larrick J.W. i Bourla J.M. (1986), The prospects for the therapeutic use of human monoclonal antibodies. J. Biol. Res.Mod. 5 (1986) 379-393.
b) Przeciwciała humanizowane i chimery.
Jako przeciwciała chimery rozumie się tu cząsteczki o zmiennych regionach pochodzące od myszy lub innego gatunku zwierząt (włączając D = diversity i J =joining segmenten, segmenty zmienne i łączące) oraz regionach stałych innego gatunku, w szczególności człowieka. Przeciwciała te wytwarza się techniką inżynierii genetycznej, podobnie jak przeciwciała humanizowane gdzie w genie ludzkiego łańcucha lekkiego i ciężkiego hyperzmienne regiony CDR (complementarity determining regions - regiony determinujące komplementamość) zostają wymienione na takież regiony odpowiednich przeciwciał myszy lub szczura. Technika a jest określana jako CDR-grafting (wszczepienie CDR). Regiony cDr są to te odcinki cząsteczki przeciwciała, które determinują powinowactwo do danego antygenu.
Sposobem według wynalazku jest możliwe u transgenicznych świń lub królików otrzymać ekspresję wszystkich wchodzących w grę izotypów przeciwciała chimery.
Otrzymywanie przeciwciał chimer techniką CDR-grafting opisali Jones P.T, Dear P.H, Foote J, Neuberger M.S. i Winter G. (1986), Replacing the complementary-determining regions in a human antibody with those from a mouse antibody, Nature 321, 522-525.
Przeciwciała chimery mają duży potencjał w leczeniu chorób złośliwych. Przeciwciała te rozpoznają epitopy antygenów swoistych dla komórek nowotworowych (Sun i wsp. Proc.Nad.Acad.Sci. USA 84 /1987/ 214-218; Nishimura Y. i wsp. Cancer Res. 47 /1987/ 999-1005).
c) Przeciwciała heterobispecyficzne.
Przeciwciała heterobispecyficzne mają duży potencjał terapeutyczny, na przykład przy eliminacji komórek zakażonych wirusem. Przeciwciało heterobispecyficzne rozpoznaje naprzykład epitop antygenów na powierzchni komórki i na komórkach cytotoksycznych T (Gilliland L.K, Clark M.R, i Waldmann H, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85 /1988/ 7719-7723; StaerzU.D, Yewdell, J.W. i Bevan M, Eur.J.Immunol. 17 /1987/ 571-574). W opisie patentowym EP-A nr 0 388 964 podano sposób wytwarzania przeciwciał heterobispecyficznych techniką inżynierii genetycznej. Ekspresja u transgenicznej świni lub królika wymaga izolacji genów lekkich i ciężkich łańcuchów obu przeciw170 647 ciał i wstrzyknięcia do zapłodnionej komórki jajowej. Oba przeciwciała nie muszą koniecznie posiadać ten sam izotyp (np. IgG1). Sposobem według wynalazku można otrzymywać heterobispecyficzne przeciwciała o różnych izotypach z transgenicznych świń lub królików oraz badać ich właściwości odnośnie CDC (complement dependent cyioroxicii:y - cytotoksyczność zależna od przeciwciał) oraz ADCC (antibodydependent cell-mediated cytotoxicity - cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał).
d) Fragmenty przeciwciał.
Dla ekspresji u transgenicznych świń wchodzą także w grę częściowe odcinki przeciwciał, jak na przykład F(ab’)2’ fragmenty Fab, część Fc lub fragmenty Fv. T akie fragmenty przeciwciał można otrzymać, jeśli zamiast pełnej sekwencji DNA kodującej cząsteczkę przeciwciała transgeniczna Świnia lub królik otrzyma mikroinjekcję sekwencji częściowej kodującej odpowiedni fragment przeciwciała.Definicja poszczególnych fragmentów jest podana w: Roitt I, Brostoff J. i Male D. Immunology, Gower Medical Publishing, London New York, 1985. Fragmenty F(ab’ )2 lub Fab mają znaczenie diagnostyczne, jak na przykład przy obrazowaniu guzów.
e) Białka powstałe w wyniku fuzji z odcinkami cząsteczek przeciwciał.
Pod tym pojęciem należy rozumieć fuzję odcinka przeciwciała wiążącego antygen i regionu przenoszącego sygnał (transmembranowy i cytoplazmatyczny) z innego członka rodziny immunoglobulin (np. receptor komórek T lub receptory Fc). Takie cząsteczki mogą, jako potencjalne biosensory, uzyskać duże znaczenie praktyczne. Również ekspresja heterologicznych białek po fuzji jest możliwa sposobem według wynalazku, przez mikroinjekcję odpowiednich sekwencji DNA do komórki jajowej świni lub królika. Na przykład może nastąpić fuzja odcinka przeciwciała wiążącego antygen z innym odcinkiem który po związaniu antygenu pośredniczy w aktywności enzymatycznej (np. aktywność kinazy tyrozynowej receptora insuliny albo receptora EGF, albo aktywność cyklazy guanylowej receptora ANF).
Również dla ważnych terapeutycznych białek po fuzji, jak fuzje z fragmentów antygonu CD4, receptora dla wirusa HIV na ludzkich limfocytach T, i odcinków cząsteczek przeciwciała, które warunkują ważne funkcje efektorowe (np. wiązanie dopełniacza, liza komórek) można sposobem według wynalazku uzyskać ekspresję z wyższą wydajnością u transgenicznych świń.
f) Przeciwciała zmutowane.
Należą tu przeciwciała, które po manimulacji genetycznych mają wyższe powinowactwo do antygenu niż przeciwciała wyjściowe. Należą tu także przeciwciała (po manipulacjach genetycznych) wykazujące zmienione zachowanie się wiązania dopełniacza, zmienione zachowanie się przy wiązaniu receptorów Fc na makrofagach i monocytach, oraz takie które wykazują zmienione właściwości cytolityczne. Również dla tej grupy cząsteczek przeciwciał można sposobem według wynalazku uzyskać ekspresję u transgenicznych świń lub królików.
Obok otrzymywania przeciwciał z surowicy, sposobem według wynalazku można także wywołać immunizację transgenicznych świń lub królików. Geny przeciwciał przeciw określonym antygenom, zwłaszcza antygenom które wywołują choroby niebezpieczne dla tych zwierząt, np. grypa lub pomór świń, można sposobem według wynalazku z wysoką skutecznością wprowadzić do komórek rozrodczych tych zwierząt. W ten sposób można hodować zwierzęta odporne na określone zakażenia.
Dalej można sposobem według wynalazku uzyskać wydzielanie do mleka ważnych terapeutycznych białek.
Przeciwciała klasy IgA mogą być wydzielane do mleka (sekrecyjna IgA = sIgA). Drogą fuzji z IgA można uzyskać wydzielanie do mleka zwierząt transgenicznych również innych białek, na przykład czynników krzepnienia jak czynnik VIII lub czynnik IX, albo enzymów jak np. ludzkiego aktywatora plazminogenu typu tkankowego. Wbudowując odpowiednie wiązania rozszczepiane przez enzym między przeciwciało sekwencyjne i partnera fuzji (na przykład kolagenaza, czynnik Xa) można otrzymać automatyczną cząsteczkę po izolacji z mleka i rozszczepieniu enzymatycznym.
Następujące przykłady wyjaśniają bliżej wynalazek, wraz z figuirą, która obrazuje geny przeciwciał użyte do mikroiniekcji.
170 647
Przykład I. Otrzymywanie sekwencji DNA kodującej przeciwciało.
Wektorami wyjściowymi są plazmidy pBMSI (DSM5229) i pBSM2 (DSM5230), podane w opisie patentowym' EP-A 0388 964 (Sposób wytwarzania przeciwciał heterobispecyficznych). Wektory zawierają gen K i γι przeciwciała myszy w położeniach dających się odróżnić. Geny te izolowano z linii komórek hybrydoma produkującej przeciwciało IgG1 oznaczone A20/44. (Sablitzky F. Wildner G. i Rajewsky K., EMBO J. 4 /1985/ 345-350; Sablitzky F, Weisbaum D. i Rajewsky K., EMBO J. 4 /1985/ 3435-3437; Kocks C i Rajewsky K., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 85 /1988/ 8206-8210). A20/44 jest przeciwciałem anty-idiotypowym skierowanym przeciw przeciwciału swoistemu dlahaptenu NP (octan 4-hydroksy-3-nitrofenylu). To ostatnie przeciwciało na łańcuch X jako łańcuch lekki i łańcuch Y2a jako łańcuch ciężki (IgG2a).
Wektory podane w opisie patentowym EP-A nr 0 388 964 zawierają gen K jako fragment
5,5 kb Sali gen Yl jako fragment 9,25 kb Sali. Wektory zawierają dalej miejsca ekspresji dla fosfotransferazy neo i mysiej reduktazy dihydrofolanowej pod kontrolą wczesnego promotora SV40.
pBMS 1 i pBMS2 (zawierają każdorazowo miejsca 3 Sali) zostały częściowo rozszczepione Sali, traktowane nukleazą S1 (1 pg DNA częściowo rozszczepionego Sali inkubowano z 10 jednostkami nukleazy S1 przez 60 minut w 30°C w 50 mmol/l octanu sodu pH 4,5 1 mmol/l ZnSO.r i 0,5 wagowo-objętościowo % gliceryny). Linearny plazmid izolowano na żelu agarozowym o niskiej topliwości i końce łączono ligazą T4. Fragmenty po ligacji wprowadzono przez transfekcję do E. Coli szczep HB101 i na płytkach agarowych izolowano kolonie oporne na ampicylinę (50 pml). Przy pomocy analizy endonukleazami retrykcyjnymi wykrywano te plazmidy w których przez powyższe manipulacje miejsca Sali między genem K i genem Yl uległy delecji. Otrzymane plazmidy oznaczono pBMS1 (Δ Sal) i pBMS2 (Δ Sal).
pBMS1 (Δ Sal) i pBMS2 (Δ Sal) rozszczepiono Sali i fragment Sali zawierający geny K i Yl przeciwciał izolowano na żelu agarozowym o niskiej topliwości i na koniec rozpuszczono wlO mM R TiS-HCl, pH 7,5, 0,25 mM EDTA.
W ten sposób izolowano geny przeciwciał wolne od sekwencji wektora do zastosowania w końcowym doświadczeniu z mikroiniekcją.(patrz fig. 1 - fragmenty użyte do mikroiniekcji).
Przykład ii. Wytworzenie ssaków transgenicznych.
Wytworzenie transgenicznych ssaków obejmuje przygotowanie roztworu DNA do iniekcji, otrzymanie zapłodnionych komórek jajowych i zarodków, mikroiniekcję roztworu DNA do projąder lub jąder, transfer zygot po iniekcji do synchronizowanych zwierząt biorców i badanie potomstwa na integrację. Przy tym u poszczególnych gatunków ssaków jak mysz, królik i Świnia należy przestrzegać pewnych zależnych od gatunku różnic w przygotowaniu zwierząt dawców i biorców, otrzymywaniu i transferze zarodków oraz mikroiniekcji.
1. Wytworzenie roztworu DNA do iniekcji.
Po izolacji fragmentów DNA i oznaczeniu zawartości DNA, roztwór DNA rozcieńcza się buforem Tris tak, aby na picoliter roztworu przypadała zawartość do 1000 kopii genu. Wszystkie roztwory stosowane do przygotowania roztworu DNA do mikroiniekcji muszą być wolne od zanieczyszczeń cząsteczkowych dla uniknięcia zatkania pipety iniekcyjnej.
2. Otrzymywanie zarodków.
Aby podwyższyć wydajność zarodków, u zwierząt dawców z reguły wywołuje się superowulację.
Mysz.
Samicom myszy, w wieku co najmniej 6 tygodni, celem wywołania superowulacji wstrzykuje się 5 -10 JM PMSG (pregnant marę serum gonadotropin - gonadotropina surowicy ciężarnej klaczy).
W 48 godzin później myszy otrzymują 5-10 JM HCG (human choriongonadotropin ludzka gonadotropina kosmówkowa) i łączy się je w pary z płodnymi samcami. Następnego dnia rano myszy dodatnie pod względem łysinek zabija się i po otwarciu jamy brzusznej wyjmuje się jajowody. Przez rozerwanie cienkimi pincetkami lub przez przepłukanie jajowodu uzyskuje się zarodki przenosi się je do podłoża do kultur zarodkowych z dodatkiem hialuronidazy. Po
170 647 usunięciu komórek warstwy ochronnej, komórki jajowe przemywa się i hoduje do momentu mikroiniekcji.
Królik.
Dojrzałym płciowo królikom-dawcom dla wywołania superowulacji podaje się jednorazowo 10- 40 JM PMSG (pregnant mare serum gonadotropin) na kg wagi ciała. Tę superowulację powinno poprzedzać 21-dniowe odosobnienie lub wstępna synchronizacja (120 JM HCG albo 0,8 ug GnRH - gonadotropin-releasing factor). W 72 do 76 godzin po wstrzyknięciu PMSG króliki unasienia się sztucznie lub pokrywa naturalnie dwukrotnie w odstępie godziny. Bezpośrednio potem dla wywołania owulacji otrzymują one dożylnie 120 - 180 JM HCG. Zarodki pobiera się 19 do 21 godzin po pokryciu, zabijając króliki-dawców. Zarodki uzyskuje się przez przepłukiwanie jajowodu podłożem do hodowli zarodków króliczych (BMS + 20% fKS lub PBS + 20% FKS) od strzępków i lejka w kierunku końca rogu macicy. W razie potrzeby pozostałości cumulus cophorus usuwa się przez traktowanie hialuronidazą. Zarodki przemywa się i hoduje do momentu mikroiniekcji.
Świnia.
Dla otrzymania zarodków można użyć niedojrzałe płciowo zwierzęta o wadze 60 do 90 kg. W dniu 0 zwierzęta-dawców przenosi się do innego pomieszczenia i wieczorem podaje się im 1250 JM PMSG. W 72 godziny później indukuje się owulację przy pomocy 750 JM HCG. W 24 i 36 godzin po podaniu HCG zwierzęta zostają unasienione. Zarodki pobiera się 24 do 27 godzin po unasienieniu. Do chirurgicznego pobrania zarodków zwierzęta poddaje się narkozie 160 mg azaperonu (Stressnil) i 400 mg chlorowodorku metomidanu (Hypnodie). Po przygotowaniu pola operacyjnego powłoki przecina się w linii środkowej na wysokości ostatnich dwu par sutków cięciem około 10 cm, odsłaniając macicę, jajowód i jajnik. Około 5 cm w kierunku ogonowym od ujścia jajowodu macicę perforuje się tępym narzędziem tak aby ok. 5-cm kaniulę szklaną można było wprowadzić do światła macicy i umocować. Do jajowodu od strony lejka prowadzi się i umocowuje wygiętą kaniulę oczną długości 8 cm, połączoną z 30-cm wężem gumowym. Jajowód przepłukuje się 50 ml roztworu PBS. Płyn przepłukujący zbiera się w szalce Petriego i sprowadza na obecność zarodków. Zarodki można pobierać także po zabiciu zwierzęcia-dawcy.
3. Mikroiniekcja roztworu DNA.
Do mikroiniekcji używa się odwrócony mikroskop (Zeiss ICM 405), dwa mikromanipulatory Leitza i przyrząd do iniekcji (Eppendorf). W jednym mikromanipulatorze umocowana jest pipeta przy pomocy której zarodek może być unieruchomiony przez podciśnienie. W drugim mikromanipulatorze umocowanajest w śrubie nanometrycznej pipeta iniekcyjna napełniona roztworem DNA i połączona z urządzeniem do iniekcji, Końcówka pipety iniekcyjnej ma średnicę 1 do 2 μm. Do mikroiniekcji końcówkę pipetki wprowadza się przez warstwę przejrzystą, błonę komórkową i błonę j ądrową do wnętrzaj ądra i tam umieszcza się ok. 1do 2 pl roztworu dNa. Przyrost objętości projądra sygnalizuje udaną mikroiniekcję. Czasem mikroiniekcja następuje do jądra zarodka w stadium dwukomórkowym.
W przeciwieństwie do myszy i królika, u większości gatunków zwierząt domowych (swinia, bydło), komórki jajowe i zarodki muszą ulec wstępnej obróbce (wirowanie przez 3 do 5 minut przy 15000 g) aby projądra i jądra stały się widoczne. Mikroiniekcja następuje w kropli podłoża na szkiełku natryskowym lub w tak zwanej komorze iniekcyjnej, Po mikroiniekcji komórki jajowe lub zarodki hoduje się do momentu transferu.
4. Transfer komórek jajowych po mikroiniekcji.
Mysz.
Celem wywołania ciąży rzekomej, myszy-biorcy pozostają przez noc połączone w pary z samicami po wasektomii (usunięcie nasieniowodów). Myszy dodatnie pod względem łysinek wybiera się i natryskuje do transferu. Odsłoniętą bursa ovarica (torebkę jajnika) otwiera się cienkimi pincetkami i z pipetki w której znajdują się zarodki wprowadza się je do obu jajowodów (10 - 15 z każdej strony). Młode rodzą się 20 do 21 dni po transferze.
170 647
Królik.
Króliki-biorcyna21 dni przed przewidywanym terminem zostają odosobnione pojedynczo dla synchronizacji cyklu i otrzymują 120 JM HCG lub 0,8 μg GnRH domięśniowo celem wywołania ciąży rzekomej. W dniu poprzedzającym transfer króliki-biorcy otrzymują 120 JM HCG dożylnie celem wywołania owulacji. Do transferu króliki poddaje się narkozie 0,4 ml Rompun 2% na kg wagi ciała i 0,8 ml Ketamin 10% na kg wagi ciała. Po przygotowaniu pola operacyjnego i opróżnieniu pęcherza moczowego przez nacisk na powłoki brzuszne zwierzę zostaje umocowane na grzbiecie w pozycji ukośnej. Bezpośrednio pod pępkiem w kierunku ogonowym otwiera się jamę brzuszną na długość ok. 4-5 cm. Odsłania się jajnik, jajowód i dogłowowy róg macicy i po kontroli reakcji jajnika wprowadza się przy pomocy pipety zarodki po iniekcji do bańki jajowodu na głębokość 2-2,5 cm. Transferuje się po 8 do 15 zarodków z każdej strony. Po zamknięciu jamy brzusznej ranę pooperacyjną zabezpiecza się krytym szwem skórnym. Młode rodzą się 29 do 31 dni po transferze.
Świnia.
Również jako biorcy mogą być użyte prosięta przed osiągnięciem dojrzałości płciowej. W 12 godzin po dawkach zwierzęta-biorcy otrzymują 750 JM PMSG i po dalszych 72 godzinach 750 JM HCG. Ta 12-godzinna asynchroniczność między dawcami i biorcami poprawia szanse przeżycia zarodków po transferze. Równolegle z unasienieniem dawców przeprowadza się obserwację rui u biorców. 135 do 136 godzin po rozpoczęciu programu (godzina 0 = podanie PMSG dawcom) następuje transfer zarodków. Wszystkie zarodki po iniekcji (35 - 45 sztuk) wprowadza się chirurgicznie do jednego jajowodu biorcy. Zarodniki rozmieszczają się równomiernie w obu rogach macicy. Nowy sposób pozwala także na bezkrwawy transfer zarodków do macicy świni. Młode rodzą się 113 do 116 dni po transferze.
5. Badanie integracji.
Dla zbadania integracji wstrzykniętego DNA musi się pobrać od nowonarodzonych zwierząt próbki tkanek (tkanka ogona, krew, biopsja). Z tych próbek tkankowych izoluje się wysokocząsteczkowy DNA genomu. Celem zbadania integracji wykonuje się analizy Slot Blot, Dot Biot lub Southern Blot.
Zwierzęta dodatnie (te u których nastąpiła integracja genu) wybiera się i po osiągnięciu przez nie dojrzałości do rozrodu łączy się je w pary z partnerami nie transgenicznymi. Potomstwo tych par bada się stwierdzając czy dziedziczy ono transgen od transgenicznego rodzica. Przez kojarzenie hemizygotyczne transgenicznych zwierząt hoduje się homozygotycznie transgeniczne pokolenie F2.
Dla zbadania ekspresji od transgenicznych zwierząt pobiera się krew i otrzymuje surowicę. Pobranie krwi wykonuje się przez nakłucie pozagałkowego splotu żylnego (mysz), żyły brzeżnej ucha (królik) lub żyły szyjnej (świnią) albo innych dostępnych żył, względnie przy zabiciu zwierzęcia.
Przykład BI. Oznaczanie mian, przeciwciał w surowicy zwierząt transgenicznych.
Metoda oznaczania mian przeciwciał jest podana w opisie patentowym EP-A 0,388 964. Płytki mikrotitracyjne powleka się przeciwciałem przeciw haptenowi NP (octan 4-hydroksy-3nitrofenylu). Przeciwciało to jest typu IgG 2a (łańcuch lekki jest łańcuchem X, łańcuch ciężki jest łańcuchem y 2a). Bufor do powlekania składa się z 0,2 mmol/1 węglanu/dwuwęglanu, pH 9,4. Po 2 godzinach płytki inkubuje się z następnym buforem (50 mmol/ HEPES, 0,15 mol/l NaCl, 1% kroteina C, pH 7,0). Wszystkie reakcje przeprowadza się w temperaturze pokojowej, wstrząsając. Krzywą wzorcową ustala się z roztworu wyjściowego zawierającego przeciwciało A20/44 (IgG 1) stosując szereg rozcieńczeń. Próbki wzorcowe i surowice rozcieńczasię buforem inkubacyjnym (50 ramol/1 HEPES, 0,15 mol/l NaCl, 1 % kroteina C, pH 7,0,0,2 mol/l diwinianu sodu, 0,75% glikolu polietylenowego (PEG), 0,5% pluronicRF 68, 0,75% PEG 40 000, 0,01% fenol) i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po odessaniu dołków i dwukrotnym przemyciu buforem inkubacyjnym następuje jednogodzinna inkubacja z konjugatem (koniugat fragmentów Fab przeciwciała przeciw Np i peroksydazy - POD). Koniugat rozcieńcza się w buforze inkubacyjnym tak aby aktywność pOd wynosiła 150 mJ/ml. Po odessaniu dołków i trzykrotnym przemyciu buforem do płukania (50 mmol/1 HEPES, 0,15 mol/l NaCl, 0,1%
170 647
PluronicRF 68, pH 7,0), inkubuje się przez 60 minut z ABTSR (sulfonian 2,2'-azyno-di-(3-etylobenzotiazoliny)) (6) jako substratem. Ekstynkcję mierzy się fotometrycznie (czytnik ELISA) przy 405 nm wobec 490 nm. Stężenie próbek oznacza się z krzywej wzorcowej.
Tabela
Miana przeciwciał w surowicy zwierząt transgenicznych
| Mysz Nr | gg/ml | Królik Nr | gg/ml | Świnia Nr | gg/ml |
| 970-28 | 3 | 2644 | 200 | 5814 | 1000 |
| 970-29 | 7 | kontrola | 0 | kontrola | 0 |
| 970-31 | 18 | ||||
| 970-32 | 10 | ||||
| 970-33 | 18 | ||||
| 970-54 | 30 | ||||
| 970-55 | 3 | ||||
| 970-56 | 18 | ||||
| 970-59 | 3 | ||||
| 974-1 | 27 | ||||
| 974-2 | 29 | ||||
| 974-3 | 18 | ||||
| 974-4 | 4 | ||||
| 974-8 | 18 | ||||
| 974-9 | 100 | ||||
| 974-10 | 45 | ||||
| 974-11 | 20 | ||||
| 974-12 | 120 | ||||
| 974-13 | 60 | ||||
| 974-14 | 15 | ||||
| kontrola | 0 |
Badane myszy są potomstwem dwu seropozytywnych myszy 970 i 974. Szereg zwierząt potomnych było seronegatywnych pod względem swoistości wprowadzonych przeciwciał. Nie są one umieszczone w tabeli. Po mikroiniekcji badano na ekspresję wszystkie 39 królików. Jedno zwierzę wykazało ekspresję pożądanej swoistości przeciwciała w surowicy. Otrzymano dwa transgeniczne świnie (1 urodziła się martwa). Żywo urodzone zwierzę wykazało ekspresję pożądanego przeciwciała w surowicy w zaskakująco bardzo wysokim stężeniu (1000 gg/ml).
Przykład IV. Charakterystyka przeciwciała w surowicy świni otrzymanego przez ekspresję.
a) fokusowanie izoelektryczne i immunofiksacja.
IEF przeprowadzono w systemie Phast-Gel (Pharmacia) według instrukcji producenta. Surowice świń transgenicznych i kontrolnych rozcieńczono 1:1000 i w warunkach niedenaturujących naniesiono na żel. Gradient pH żelu (pH 5-8) uwidoczniono przy pomocy białka wzorcowego (Pharmacia). Rozdział w żelu trwał 30 minut. Na koniec inkubowano przez 45 minut z 100 gg poliklonalnego przeciwciała (owca anty-mysz Fc γ) w objętości 150 gl i prążki wykrywano na paskach octanu celulozy. Białka które nie reagowały usunięto przemywaniem. 50 mmol/l buforu z fosforanu potasu, 0,15 mol/l NaCl, 0,55% TweenR, pH 7,2, przez wytrząsanie przez noc. Kompleksy immunologiczne uwidoczniono barwieniem srebrowym (Pharmacia Kit). Jako kontrolę zastosowano przeciwciało A20/44 oczyszczone z płynu wysiękowego.
Okazało się, że w surowicy świni transgenicznej można było zidentyfikować te same charakterystyczne prążki jak w oczyszczonym przeciwciale A20/44. W surowicy zwierzęcia kontrolnego te charakterystyczne prążki nie wystąpiły.
b) Oczyszczanie przeciwciała A20/44 z surowicy świni transgenicznej.
A20/44 jest przeciwciałem anty-idiotypowym przeciw przeciwciału (IgG 2a) które jest skierowane przeciw haptenowi NP. To ostatnie oczyszczono z płynu wysiękowego i sprzężono z cyjanobromowaną Sepharozą (Pharmacia) według przepisu producenta. Na tak przygotowanej kolumnie powiniowactwa adsorbowano przeciwciało A20/44 po naniesieniu 100 ml surowicy świni transgenicznej, po czym eluowano i analizowano metodami chemii białek. Przeciwciało to wykazało zgodność cech z przeciwciałem A20/44 oczyszczonym z płynu wysiękowego.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł
Claims (10)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób otrzymywania białek o aktywności przeciwciał, znamienny tym, ze sekwencje DNA kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciała, które są wolne od obcych sekwencji bakteryjnych, wprowadza się przez mikroinjekcję do projądra męskiego zapłodnionej komórki jajowej świni lub królika, komórki jajowe następnie implantuje się do jajowodu świni lub królika, hoduje się potomostwo i z niego w zwykły sposób otrzymuje się białko o aktywności przeciwciała, które jest złożone z wytworzonych lekkich i ciężkich łańcuchów przeciwciała.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA z promotorem immunoglobulin oraz sekwencje wzmacniające.
- 3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że do mikroiniekcji stosuje się sekwencje DNA w postaci linearnej.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA kodujące pełne natywne białko o aktywności przeciwciała.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się sekwenje DNA kodujące łańcuch ciężki y i łańcuch lekki K przeciwciała.
- 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA kodujące przeciwciało chimerę.
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwenje DNA kodujące przeciwciało heterobispecyficzne.
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA kodujące fragment przeciwciała.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA kodujące przeciwciało lub fragment przeciwciała, sprzężone z dalszym polipeptydem.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA kodujące przeciwciało zmutowane.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4000939A DE4000939A1 (de) | 1990-01-15 | 1990-01-15 | Verfahren zur antikoerpergewinnung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL170647B1 true PL170647B1 (pl) | 1997-01-31 |
Family
ID=6398081
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL91314595A PL171474B1 (pl) | 1990-01-15 | 1991-01-14 | Sposób wytwarzania transgenicznych zwierzat PL |
| PL91288697A PL170647B1 (pl) | 1990-01-15 | 1991-01-14 | Sposób otrzymywania bialek o aktywnosci przeciwcial PL |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL91314595A PL171474B1 (pl) | 1990-01-15 | 1991-01-14 | Sposób wytwarzania transgenicznych zwierzat PL |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5639457A (pl) |
| EP (1) | EP0438102B1 (pl) |
| JP (1) | JPH0570499A (pl) |
| AT (1) | ATE244761T1 (pl) |
| AU (1) | AU627099B2 (pl) |
| CA (1) | CA2034034C (pl) |
| CZ (1) | CZ289553B6 (pl) |
| DE (2) | DE4000939A1 (pl) |
| HU (1) | HU218047B (pl) |
| LV (1) | LV10790B (pl) |
| PL (2) | PL171474B1 (pl) |
| RU (1) | RU2095412C1 (pl) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0463151T3 (da) * | 1990-01-12 | 1996-07-01 | Cell Genesys Inc | Frembringelse af xenogene antistoffer |
| US5827690A (en) * | 1993-12-20 | 1998-10-27 | Genzyme Transgenics Corporatiion | Transgenic production of antibodies in milk |
| US6335160B1 (en) * | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
| US20040054593A1 (en) * | 1997-03-21 | 2004-03-18 | Van Luchen Andrew S. | Method and apparatus for facilitating the play of fractional lottery tickets utilizing point-of -sale terminals |
| WO2001035735A1 (en) * | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Hematech, Llc | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
| US7414170B2 (en) * | 1999-11-19 | 2008-08-19 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovines capable of human antibody production |
| US7820878B2 (en) * | 1999-11-19 | 2010-10-26 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Production of ungulates, preferably bovines that produce human immunoglobulins |
| US7074983B2 (en) * | 1999-11-19 | 2006-07-11 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic bovine comprising human immunoglobulin loci and producing human immunoglobulin |
| AU2000265672A1 (en) | 2000-07-27 | 2002-02-13 | Apogene Gmbh And Co. Kg | Somatic cloning gene transfer for the production of recombinant proteins, cells and organs |
| IL154751A0 (en) | 2000-08-03 | 2003-10-31 | Humanized antibodies, recombination vectors, transgenic vectors and methods for the preparation of humanized antibodies from transgenic animals | |
| US20020142397A1 (en) * | 2000-12-22 | 2002-10-03 | Philippe Collas | Methods for altering cell fate |
| NZ525607A (en) | 2000-12-22 | 2005-05-27 | Aurox Llc | Methods for cloning mammals using reprogrammed donor chromatin or donor cells |
| US7491534B2 (en) * | 2000-12-22 | 2009-02-17 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Methods for altering cell fate to generate T-cells specific for an antigen of interest |
| EP1563084A4 (en) | 2002-11-08 | 2006-03-01 | Hematech Llc | TRANSGENE UNGULATES WITH REDUCED PRION PROTEIN ACTIVITY AND USES THEREOF |
| US7514593B2 (en) * | 2003-05-30 | 2009-04-07 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Animal model for chronic obstructive pulmonary disease and cystic fibrosis |
| CA2563064A1 (en) | 2004-04-22 | 2005-11-10 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transgenic animals and uses thereof |
| CA2568201C (en) | 2004-05-24 | 2013-07-30 | Universitat Zu Koln | Identification of ergothioneine transporter and therapeutic uses thereof |
| RU2303068C1 (ru) * | 2005-10-31 | 2007-07-20 | Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства (ВИЖ) | Способ введения ретровирусных векторов в клетки бластодермы при получении трансгенных кур |
| US8124831B2 (en) * | 2006-07-06 | 2012-02-28 | Duke University | Transgenic mice carrying functional single nucleotide polymorphisms in brain-specific tryptophan hydroxylase |
| ATE536374T1 (de) | 2006-09-01 | 2011-12-15 | Therapeutic Human Polyclonals Inc | Erhöhte expression von humanem oder humanisiertem immunglobulin bei nicht-humanen transgenen tieren |
| KR101722961B1 (ko) | 2009-02-11 | 2017-04-04 | 알부메딕스 에이/에스 | 알부민 변이체 및 접합체 |
| ES2700230T3 (es) | 2009-10-30 | 2019-02-14 | Albumedix Ltd | Variantes de albúmina |
| US10233228B2 (en) | 2010-04-09 | 2019-03-19 | Albumedix Ltd | Albumin derivatives and variants |
| US20140315817A1 (en) | 2011-11-18 | 2014-10-23 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Variant serum albumin with improved half-life and other properties |
| DK2825556T3 (en) | 2012-03-16 | 2018-04-16 | Albumedix As | albumin Variants |
| RU2670063C2 (ru) | 2012-11-08 | 2018-10-17 | Альбумедикс А/С | Варианты альбумина |
| US10034921B2 (en) | 2013-02-13 | 2018-07-31 | Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Proteins with modified glycosylation and methods of production thereof |
| BR112015019341A2 (pt) | 2013-02-13 | 2017-08-22 | Lab Francais Du Fractionnement | Anticorpo anti-tnf-alfa, composição que compreende o anticorpo, método para produzir uma população de anticorpos, células epiteliais da glândula mamária, mamífero não humano transgênico, e, composição de anticorpo anti-tnf monoclonal |
| EP2956002B1 (en) * | 2013-02-16 | 2017-09-06 | Albumedix A/S | Pharmacokinetic animal model |
| FR3038517B1 (fr) | 2015-07-06 | 2020-02-28 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Utilisation de fragments fc modifies en immunotherapie |
| EP3337816B1 (en) | 2015-08-20 | 2024-02-14 | Albumedix Ltd | Albumin variants and conjugates |
| US11266129B2 (en) | 2019-11-05 | 2022-03-08 | Versiti Blood Research Institute Foundation, Inc. | Murine model of fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia |
| JP2023500896A (ja) | 2019-11-05 | 2023-01-11 | ヴァーシティ ブラッド リサーチ インスティテュート ファウンデーション， インコーポレイテッド | 胎児／新生児同種抗体血小板減少症のマウスモデル |
| WO2024261097A1 (en) | 2023-06-20 | 2024-12-26 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | A new relevant non-human animal model of progressive metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (masld) and atherosclerosis development |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0088994B1 (en) * | 1982-03-15 | 1991-06-19 | Schering Corporation | Hybrid dna, binding composition prepared thereby and processes therefor |
| US4870009A (en) * | 1982-11-22 | 1989-09-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals |
| JPS6242933A (ja) * | 1985-04-10 | 1987-02-24 | Teijin Ltd | 水痘帯状疱疹ウイルスに対するヒト型モノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| GB8823869D0 (en) * | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
-
1990
- 1990-01-15 DE DE4000939A patent/DE4000939A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-01-07 AU AU68674/91A patent/AU627099B2/en not_active Ceased
- 1991-01-10 JP JP3001559A patent/JPH0570499A/ja active Pending
- 1991-01-11 CA CA002034034A patent/CA2034034C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-14 RU SU914894393A patent/RU2095412C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-01-14 PL PL91314595A patent/PL171474B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-01-14 HU HU4/91A patent/HU218047B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-01-14 AT AT91100376T patent/ATE244761T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-14 PL PL91288697A patent/PL170647B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-01-14 DE DE59109255T patent/DE59109255D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-14 EP EP91100376A patent/EP0438102B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-14 CZ CS199165A patent/CZ289553B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-06-08 LV LVP-93-499A patent/LV10790B/lv unknown
-
1994
- 1994-11-15 US US08/341,888 patent/US5639457A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT58819A (en) | 1992-03-30 |
| JPH0570499A (ja) | 1993-03-23 |
| DE4000939A1 (de) | 1991-07-18 |
| CA2034034A1 (en) | 1991-07-16 |
| LV10790A (lv) | 1995-08-20 |
| US5639457A (en) | 1997-06-17 |
| RU2095412C1 (ru) | 1997-11-10 |
| AU6867491A (en) | 1991-11-14 |
| DE59109255D1 (de) | 2003-08-14 |
| AU627099B2 (en) | 1992-08-13 |
| CS6591A3 (en) | 1991-09-15 |
| CZ289553B6 (cs) | 2002-02-13 |
| HU218047B (hu) | 2000-05-28 |
| EP0438102A1 (de) | 1991-07-24 |
| EP0438102B1 (de) | 2003-07-09 |
| HU910094D0 (en) | 1991-08-28 |
| PL171474B1 (pl) | 1997-05-30 |
| ATE244761T1 (de) | 2003-07-15 |
| LV10790B (en) | 1996-06-20 |
| CA2034034C (en) | 2004-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5639457A (en) | Process for the production of antibodies | |
| US6030833A (en) | Transgenic swine and swine cells having human HLA genes | |
| CA2181433C (en) | Materials and methods for management of hyperacute rejection in human xenotransplantation | |
| CA2661848C (en) | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals | |
| US8084024B2 (en) | Method for producing antibodies | |
| EP3289869B1 (en) | Transgenic non-human animal expressing human-specific molecules and human fc gamma receptor family | |
| US5670134A (en) | Method for evaluating and modifying biological activity | |
| JP2002510973A (ja) | ヒトＦｃ受容体を発現するトランスジェニック動物 | |
| WO1993005817A1 (en) | Transgenic mhc class i and class ii antigen-deficient mammals | |
| US10370641B2 (en) | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals | |
| HUP0500423A2 (hu) | Transzgenikus úton előállított fúziós fehérjék | |
| US9018439B2 (en) | Transgenic pig in which HO-1 and TNFR1-Fc are simultaneously expressed, and method for producing same | |
| US7196243B2 (en) | Transgenic animal containing CD200 and uses therefor | |
| KR20100113594A (ko) | 영장류 동물의 초기 배아에의 외래 유전자 도입법 및 상기 도입법을 포함하는 트랜스제닉 영장류 동물을 작출하는 방법 | |
| US10717991B2 (en) | Transgenic pig which simultaneously expresses HO-1 gene and TNFR1-Fc gene, and comprises knocked-out GGTA1 gene, and use thereof | |
| KR20020039346A (ko) | 서브유니트가 최적화된 융합 단백질 | |
| US20030044398A1 (en) | Methods for producing antibodies in mammals | |
| Brem | Generation of recombinant antibody transgenic farm animals | |
| JPH09500025A (ja) | 敗血症モデル | |
| JPH0491731A (ja) | ＨＬＡ―Ｂ↓ｗ５２遺伝子転換非ヒト哺乳動物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20050114 |