PL170647B1 - Sposób otrzymywania bialek o aktywnosci przeciwcial PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzymywania bialek o aktywnosci przeciwcial, znamienny tym, ze sekwencje DNA kodujace lekkie i ciezkie lancuchy przeciwciala, które sa wolne od obcych sekwencji bakteryjnych, wprowadza sie przez mikroinjekcje do projadra meskie- go zaplodnionej komórki jajowej swini lub królika, komórki jajowe nastepnie implantuje sie do jajowodu swini lub królika, hoduje sie potomostwo i z niego w zwykly sposób otrzymuje sie bialko o aktywnosci przeciwciala, które jest zlozone z wytworzonych lekkich i ciezkich lancuchów przeciwciala. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania białek o aktywności przeciwciał. Białka te mogą być stosowane do celów diagnostycznych i/lub terapeutycznych.

Dla uzyskania ekspresji obcych sekwencji DNA u zwierząt, DNA można wprowadzić drogą mikroiniekcji do projądra męskiego zapłodnionej komórki jajowej a następnie komórki jajowe implantować do jajowodu odpowiednich zwierząt i wyhodować potomstwo u którego następuje ekspresja wprowadzonego materiału genetycznego. U myszy wyhodowano osobniki transgeniczne także przez zakażenie zarodków retrowirusem albo przez transfer komórek poddanych manipulacjom genetycznym do blastocytów (Janisch R.: Science 240, 1468 /1988/; Palmiter R.D. i Brinster, Ann.Rev.Genet. 20,465 /1986/ R.L.Brinster i R.D. i R.D.Palmiter, Harvey Lcctures, Scries 80 /Liss, New York, 1986, str. 1-38).

Tymczasem opisano wprowadzenie obcej informacji genetycznej do komórek rozrodczych szeregu gatunków zwierząt, tak na przykład u kur (Bosselman i wsp., Science 243, 533 /1989/), u ryb (Bram G., BrenigB, Hoerstgen-Schwark Gi WinnackerE.L., Aquaculture 68,209,/1988/), u królików (R.E.Hammer i wsp. Nature 315, 680, /1985/, G. Brom i wsp., Zuchthygine 20, 251, 1985/), u owiec (A.J.Clark i wsp. Bio/Technology 7,487, /1989/, J.Simons i wsp. Bio/Technology 6, 179 /1988/, C.E.Rexroad, Jr. i wsp. Mol. Reprod. Dev. 1, 164 /1989/) oraz u świń (G. Brem i wsp. Zuchthygiene 20, 251 /1985/, K.M. Ebert i wsp. Mol. Endocrinol. 2, 277, /1988/, Brem G, Brenig B·, Muller M, Krauslich H i Winnacker E.L.Occ. Publ. Brit. Soc. Aram Prod. 12, /1988/, 15-31).

170 647

U królików ekspresja genu króliczego c-myc odbywała się pod kontrolą sekwencji regulatorowych genu immunoglobuliny, co pociągnęło za sobą indukcję białaczki u transgenicznych królików (Knight K,L, Spicker-Polat H, Kazdin D, Oi V,T. Proc.Natl. Acad. Sci USA 85 /1988/ 3130-3134).

Otrzymano również transgeniczne króliki u których występowała ekspresja genu somatotropiny ludzkiej (Enikolopov i wsp., Dokl.Acad.Nauk SSSR, 299 /1988/1246-1249). Opisano także ekspresję human growth hormone releasing factor (czynnik uwalniający ludzki hormon wzrostu) u transgenicznych królików (Gataryan i wsp., Dokl.Acad.Nauk SSSR 305 /1989/726-728).

Wykazano ekspresję bydlęcego hormonu wzrostu u transgenicznych świń i badano jego wpływ na rozwój zwierząt transgenicznych (J. Anim. Sci. 66, Suppl. 1, 267 /1988/).

Wyhodowano także transgeniczne świnie u których występowała ekspresja antygenu powierzchniowego ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B (Dokl. Akad. Nauk SSSR 306 /1989/206-209).

Geny łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciał o określonej swoistości (dla nitrofenolu, trinitrofenolu, fosforylocholiny) izolowano z poszczególnych linii hybrydoma i wprowadzono do komórek rozrodczych myszy. U poszczególnych transgenicznych myszy ekspresja genów łańcucha lekkiego i ciężkiego następowała w postaci rekombinowanego przeciwciała (Rusconi S, i Kohler G, Nature 314, 330 /1985/, Grosschedl R, Weaver D, Baltimore D i Constantini F. Cell 38 /1984/ 647, U. Storb i wsp. J.Exp.Med. 164 /1986/, 627, Ritchie K.A, Brinster R.L. i Storb U. Nature 312,517 /1984/, Weaver D, Constantini T, Imanishi-Kari T. i Baltimore D. Cell 42,117/1985/, Iglesias A. Lamers M i Kohler GNature 330, 482/1987/, Neuberger M.S. Caskey H.M. Peterson M, Williams T, Surani M.A, Nature 338, 350 /1989/.

W niektórych z wyżej cytowanych prac wprowadzono do komórek rozrodczych myszy geny tylko lekkiego lub tylko ciężkiego łańcucha przeciwciała. Okazało się w tych badaniach, że przekształcony transgen hamuje przekształcenie się endogennego genu immunoglobuliny. U transgenicznych myszy stwierdzono tylko względnie niską ekspresję wprowadzonego genu przeciwciała (do około 5 do 10 μ g/ml surowicy). U innych gatunków zwierząt jak dotąd nie opisano ekspresji genów immunoglobulin po wprowadzeniu do komórek rozrodczych.

Zadaniem obecnego wynalazku było opracowanie sposobu otrzymywania z większą wydajnością przeciwciał od zwierząt transgenicznych.

Zadanie według wynalazku rozwiązano opracowując sposób otrzymywania białek o aktywności przeciwciał, który charakteryzuje się tym, że sekwencje DNA kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciała, które są wolne od obcych sekwencji bakteryjnych wprowadza się przez mikroinjekcję do projądra męskiego zapłodnionej komórki jajowej świni lub królika, komórki jajowe implantuje się następnie do jajowodu świni lub królika, hoduje się potomstwo i z niego otrzymuje się w zwykły sposób białko o aktywności przeciwciała, które jest złożone z wytworzonych lekkich i ciężkich łańcuchów przeciwciała.

Dla ekspresji białek o aktywności przeciwciał według wynalazku w komórkach limfoidalnych stosuje się sekwencje DNA z promotorem i sekwencje wzmacniające. Geny, które mają być poddane ekspresji klonuje się w zwykły sposób w wektorze prokariotycznym i namnaża się w odpowiednich komórkach gospodarza. Właściwe geny, po rozszczepieniu wektora każdorazowo odpowiednimi nukleazami restrykcyjnymi, uwalnia się od sekwencji prokariotycznych i wstrzykuje do zapłodnionych komórek jajowych. Można przy tym użyć DNA kolistego lub linearnego korzystnie linearnego. Również po delecji sekwencji intron (jednej lub więcej) w geneach przez mutagenezę in vitro ekspresja powinna wystąpić u transgenicznych zwierząt.

W przypadku zastosowania komplementarnego DNA (cDNA) do ekspresji łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciała można klonować promotor immunoglobulin i sekwencje wzmacniające na wektorach ekspresji przed cDNA przeznaczonym do ekspresji. Możliwa jest również fuzja fragmentów genomu z cDNA (Gillies S.D. i wsp. Bio/Technology 7 (1989) 799-804, Orlandi i wsp. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86 /1989/ 3833-3837). Dalszym ulepszeniem ekspresji genu przeciwciała jest ewentualnie możliwe użycie elementów regulatorowych umiejscowionych w niekodujących odcinkach genu przeciwciała. I tak niedawno opisano dla ludzkiego genu K (łańcuch lekki) element wzmacniający umiejscowiony w odcinku 3' nie ulegającym translacji

170 647 (Meyer K.B. i Neuberger M.S., EMBO J.S /1989/ 1959-1965), a dla mysich łańcuchów λ.1 również element wzmacniający w odcinku 3' nie ulegającym translacji (Bich-Thuy L. i Queen C. Nucl. Acids Res. 17 /1989/ 5307-5321).

Sposobem według wynalazku wytwarza się białka o aktywności przeciwciał, przy czym pojęcie białko o aktywności przeciwciała obejmuje:

a) kompletne przeciwciała różnych gatunków

Ekspresja jest możliwa przez wprowadzenie kompletnego genu łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała do zapłodnionych komórek jajowych świni lub królika, przy czym zasadniczo mogą ulegać ekspresji wszystkie izotopy przeciwciała. Jako łańcuch ciężki wyróżnia się łańcuch γ, a jako łańcuch lekki łańcuch K.

Przeciwciała mogą pochodzić od myszy, szczura lub przy użyciu komórek jajowych świni również z królika. Szczególnie wyróżnia się jednak ekspresja przeciwciał ludzkich.

Przeciwciała ludzkie mają duży potencjał diagnostyczny i terapeutyczny. Przy użyciu do celów terapeutycznych są one przeciwciałami z myszy albo otrzymanymi techniką inżynierii genetycznej chimerami lub przeciwciałami humanizowanymi i w tym przypadku po zastosowaniu terapeutycznym nie powinna wystąpić odpowiedź immunologiczna organizmu. Skonstruowanie trwałych linii ludzkich komórek B lub hybrydom dobrze produkujących przeciwciała jest jednak ograniczone dużymi problemami praktycznymi.

Geny kodujące ludzkie przeciwciała lub cDNA łańcuchów lekkich i ciężkich otrzymuje się zwykłym sposobem z ludzkich komórek hybrydoma.

Otrzymywanie ludzkich przeciwciał i zakres ich stosowania terapeutycznego są opisane w następujących pozycjach literatury -.James H. i Bell G.T. (1987). Human monoclonal antibody production. Current status and future prospects. J. Immunol. Methods 100, 5-40; Boyd J.E. i James K. (1988), Human monoclonal antibodies:their potential, problems and prospects. W: Advances in Biotechnological processes. Tom II, Mizraki A (red) A.R. Liss, Inc. New York; Larrick J.W. i Bourla J.M. (1986), The prospects for the therapeutic use of human monoclonal antibodies. J. Biol. Res.Mod. 5 (1986) 379-393.

b) Przeciwciała humanizowane i chimery.

Jako przeciwciała chimery rozumie się tu cząsteczki o zmiennych regionach pochodzące od myszy lub innego gatunku zwierząt (włączając D = diversity i J =joining segmenten, segmenty zmienne i łączące) oraz regionach stałych innego gatunku, w szczególności człowieka. Przeciwciała te wytwarza się techniką inżynierii genetycznej, podobnie jak przeciwciała humanizowane gdzie w genie ludzkiego łańcucha lekkiego i ciężkiego hyperzmienne regiony CDR (complementarity determining regions - regiony determinujące komplementamość) zostają wymienione na takież regiony odpowiednich przeciwciał myszy lub szczura. Technika a jest określana jako CDR-grafting (wszczepienie CDR). Regiony cDr są to te odcinki cząsteczki przeciwciała, które determinują powinowactwo do danego antygenu.

Sposobem według wynalazku jest możliwe u transgenicznych świń lub królików otrzymać ekspresję wszystkich wchodzących w grę izotypów przeciwciała chimery.

Otrzymywanie przeciwciał chimer techniką CDR-grafting opisali Jones P.T, Dear P.H, Foote J, Neuberger M.S. i Winter G. (1986), Replacing the complementary-determining regions in a human antibody with those from a mouse antibody, Nature 321, 522-525.

Przeciwciała chimery mają duży potencjał w leczeniu chorób złośliwych. Przeciwciała te rozpoznają epitopy antygenów swoistych dla komórek nowotworowych (Sun i wsp. Proc.Nad.Acad.Sci. USA 84 /1987/ 214-218; Nishimura Y. i wsp. Cancer Res. 47 /1987/ 999-1005).

c) Przeciwciała heterobispecyficzne.

Przeciwciała heterobispecyficzne mają duży potencjał terapeutyczny, na przykład przy eliminacji komórek zakażonych wirusem. Przeciwciało heterobispecyficzne rozpoznaje naprzykład epitop antygenów na powierzchni komórki i na komórkach cytotoksycznych T (Gilliland L.K, Clark M.R, i Waldmann H, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85 /1988/ 7719-7723; StaerzU.D, Yewdell, J.W. i Bevan M, Eur.J.Immunol. 17 /1987/ 571-574). W opisie patentowym EP-A nr 0 388 964 podano sposób wytwarzania przeciwciał heterobispecyficznych techniką inżynierii genetycznej. Ekspresja u transgenicznej świni lub królika wymaga izolacji genów lekkich i ciężkich łańcuchów obu przeciw170 647 ciał i wstrzyknięcia do zapłodnionej komórki jajowej. Oba przeciwciała nie muszą koniecznie posiadać ten sam izotyp (np. IgG1). Sposobem według wynalazku można otrzymywać heterobispecyficzne przeciwciała o różnych izotypach z transgenicznych świń lub królików oraz badać ich właściwości odnośnie CDC (complement dependent cyioroxicii:y - cytotoksyczność zależna od przeciwciał) oraz ADCC (antibodydependent cell-mediated cytotoxicity - cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał).

d) Fragmenty przeciwciał.

Dla ekspresji u transgenicznych świń wchodzą także w grę częściowe odcinki przeciwciał, jak na przykład F(ab’)2’ fragmenty Fab, część Fc lub fragmenty Fv. T akie fragmenty przeciwciał można otrzymać, jeśli zamiast pełnej sekwencji DNA kodującej cząsteczkę przeciwciała transgeniczna Świnia lub królik otrzyma mikroinjekcję sekwencji częściowej kodującej odpowiedni fragment przeciwciała.Definicja poszczególnych fragmentów jest podana w: Roitt I, Brostoff J. i Male D. Immunology, Gower Medical Publishing, London New York, 1985. Fragmenty F(ab’ )2 lub Fab mają znaczenie diagnostyczne, jak na przykład przy obrazowaniu guzów.

e) Białka powstałe w wyniku fuzji z odcinkami cząsteczek przeciwciał.

Pod tym pojęciem należy rozumieć fuzję odcinka przeciwciała wiążącego antygen i regionu przenoszącego sygnał (transmembranowy i cytoplazmatyczny) z innego członka rodziny immunoglobulin (np. receptor komórek T lub receptory Fc). Takie cząsteczki mogą, jako potencjalne biosensory, uzyskać duże znaczenie praktyczne. Również ekspresja heterologicznych białek po fuzji jest możliwa sposobem według wynalazku, przez mikroinjekcję odpowiednich sekwencji DNA do komórki jajowej świni lub królika. Na przykład może nastąpić fuzja odcinka przeciwciała wiążącego antygen z innym odcinkiem który po związaniu antygenu pośredniczy w aktywności enzymatycznej (np. aktywność kinazy tyrozynowej receptora insuliny albo receptora EGF, albo aktywność cyklazy guanylowej receptora ANF).

Również dla ważnych terapeutycznych białek po fuzji, jak fuzje z fragmentów antygonu CD4, receptora dla wirusa HIV na ludzkich limfocytach T, i odcinków cząsteczek przeciwciała, które warunkują ważne funkcje efektorowe (np. wiązanie dopełniacza, liza komórek) można sposobem według wynalazku uzyskać ekspresję z wyższą wydajnością u transgenicznych świń.

f) Przeciwciała zmutowane.

Należą tu przeciwciała, które po manimulacji genetycznych mają wyższe powinowactwo do antygenu niż przeciwciała wyjściowe. Należą tu także przeciwciała (po manipulacjach genetycznych) wykazujące zmienione zachowanie się wiązania dopełniacza, zmienione zachowanie się przy wiązaniu receptorów Fc na makrofagach i monocytach, oraz takie które wykazują zmienione właściwości cytolityczne. Również dla tej grupy cząsteczek przeciwciał można sposobem według wynalazku uzyskać ekspresję u transgenicznych świń lub królików.

Obok otrzymywania przeciwciał z surowicy, sposobem według wynalazku można także wywołać immunizację transgenicznych świń lub królików. Geny przeciwciał przeciw określonym antygenom, zwłaszcza antygenom które wywołują choroby niebezpieczne dla tych zwierząt, np. grypa lub pomór świń, można sposobem według wynalazku z wysoką skutecznością wprowadzić do komórek rozrodczych tych zwierząt. W ten sposób można hodować zwierzęta odporne na określone zakażenia.

Dalej można sposobem według wynalazku uzyskać wydzielanie do mleka ważnych terapeutycznych białek.

Przeciwciała klasy IgA mogą być wydzielane do mleka (sekrecyjna IgA = sIgA). Drogą fuzji z IgA można uzyskać wydzielanie do mleka zwierząt transgenicznych również innych białek, na przykład czynników krzepnienia jak czynnik VIII lub czynnik IX, albo enzymów jak np. ludzkiego aktywatora plazminogenu typu tkankowego. Wbudowując odpowiednie wiązania rozszczepiane przez enzym między przeciwciało sekwencyjne i partnera fuzji (na przykład kolagenaza, czynnik Xa) można otrzymać automatyczną cząsteczkę po izolacji z mleka i rozszczepieniu enzymatycznym.

Następujące przykłady wyjaśniają bliżej wynalazek, wraz z figuirą, która obrazuje geny przeciwciał użyte do mikroiniekcji.

170 647

Przykład I. Otrzymywanie sekwencji DNA kodującej przeciwciało.

Wektorami wyjściowymi są plazmidy pBMSI (DSM5229) i pBSM2 (DSM5230), podane w opisie patentowym' EP-A 0388 964 (Sposób wytwarzania przeciwciał heterobispecyficznych). Wektory zawierają gen K i γι przeciwciała myszy w położeniach dających się odróżnić. Geny te izolowano z linii komórek hybrydoma produkującej przeciwciało IgG1 oznaczone A20/44. (Sablitzky F. Wildner G. i Rajewsky K., EMBO J. 4 /1985/ 345-350; Sablitzky F, Weisbaum D. i Rajewsky K., EMBO J. 4 /1985/ 3435-3437; Kocks C i Rajewsky K., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 85 /1988/ 8206-8210). A20/44 jest przeciwciałem anty-idiotypowym skierowanym przeciw przeciwciału swoistemu dlahaptenu NP (octan 4-hydroksy-3-nitrofenylu). To ostatnie przeciwciało na łańcuch X jako łańcuch lekki i łańcuch Y2a jako łańcuch ciężki (IgG2a).

Wektory podane w opisie patentowym EP-A nr 0 388 964 zawierają gen K jako fragment

5,5 kb Sali gen Yl jako fragment 9,25 kb Sali. Wektory zawierają dalej miejsca ekspresji dla fosfotransferazy neo i mysiej reduktazy dihydrofolanowej pod kontrolą wczesnego promotora SV40.

pBMS 1 i pBMS2 (zawierają każdorazowo miejsca 3 Sali) zostały częściowo rozszczepione Sali, traktowane nukleazą S1 (1 pg DNA częściowo rozszczepionego Sali inkubowano z 10 jednostkami nukleazy S1 przez 60 minut w 30°C w 50 mmol/l octanu sodu pH 4,5 1 mmol/l ZnSO.r i 0,5 wagowo-objętościowo % gliceryny). Linearny plazmid izolowano na żelu agarozowym o niskiej topliwości i końce łączono ligazą T4. Fragmenty po ligacji wprowadzono przez transfekcję do E. Coli szczep HB101 i na płytkach agarowych izolowano kolonie oporne na ampicylinę (50 pml). Przy pomocy analizy endonukleazami retrykcyjnymi wykrywano te plazmidy w których przez powyższe manipulacje miejsca Sali między genem K i genem Yl uległy delecji. Otrzymane plazmidy oznaczono pBMS1 (Δ Sal) i pBMS2 (Δ Sal).

pBMS1 (Δ Sal) i pBMS2 (Δ Sal) rozszczepiono Sali i fragment Sali zawierający geny K i Yl przeciwciał izolowano na żelu agarozowym o niskiej topliwości i na koniec rozpuszczono wlO mM R TiS-HCl, pH 7,5, 0,25 mM EDTA.

W ten sposób izolowano geny przeciwciał wolne od sekwencji wektora do zastosowania w końcowym doświadczeniu z mikroiniekcją.(patrz fig. 1 - fragmenty użyte do mikroiniekcji).

Przykład ii. Wytworzenie ssaków transgenicznych.

Wytworzenie transgenicznych ssaków obejmuje przygotowanie roztworu DNA do iniekcji, otrzymanie zapłodnionych komórek jajowych i zarodków, mikroiniekcję roztworu DNA do projąder lub jąder, transfer zygot po iniekcji do synchronizowanych zwierząt biorców i badanie potomstwa na integrację. Przy tym u poszczególnych gatunków ssaków jak mysz, królik i Świnia należy przestrzegać pewnych zależnych od gatunku różnic w przygotowaniu zwierząt dawców i biorców, otrzymywaniu i transferze zarodków oraz mikroiniekcji.

1. Wytworzenie roztworu DNA do iniekcji.

Po izolacji fragmentów DNA i oznaczeniu zawartości DNA, roztwór DNA rozcieńcza się buforem Tris tak, aby na picoliter roztworu przypadała zawartość do 1000 kopii genu. Wszystkie roztwory stosowane do przygotowania roztworu DNA do mikroiniekcji muszą być wolne od zanieczyszczeń cząsteczkowych dla uniknięcia zatkania pipety iniekcyjnej.

2. Otrzymywanie zarodków.

Aby podwyższyć wydajność zarodków, u zwierząt dawców z reguły wywołuje się superowulację.

Mysz.

Samicom myszy, w wieku co najmniej 6 tygodni, celem wywołania superowulacji wstrzykuje się 5 -10 JM PMSG (pregnant marę serum gonadotropin - gonadotropina surowicy ciężarnej klaczy).

W 48 godzin później myszy otrzymują 5-10 JM HCG (human choriongonadotropin ludzka gonadotropina kosmówkowa) i łączy się je w pary z płodnymi samcami. Następnego dnia rano myszy dodatnie pod względem łysinek zabija się i po otwarciu jamy brzusznej wyjmuje się jajowody. Przez rozerwanie cienkimi pincetkami lub przez przepłukanie jajowodu uzyskuje się zarodki przenosi się je do podłoża do kultur zarodkowych z dodatkiem hialuronidazy. Po

170 647 usunięciu komórek warstwy ochronnej, komórki jajowe przemywa się i hoduje do momentu mikroiniekcji.

Królik.

Dojrzałym płciowo królikom-dawcom dla wywołania superowulacji podaje się jednorazowo 10- 40 JM PMSG (pregnant mare serum gonadotropin) na kg wagi ciała. Tę superowulację powinno poprzedzać 21-dniowe odosobnienie lub wstępna synchronizacja (120 JM HCG albo 0,8 ug GnRH - gonadotropin-releasing factor). W 72 do 76 godzin po wstrzyknięciu PMSG króliki unasienia się sztucznie lub pokrywa naturalnie dwukrotnie w odstępie godziny. Bezpośrednio potem dla wywołania owulacji otrzymują one dożylnie 120 - 180 JM HCG. Zarodki pobiera się 19 do 21 godzin po pokryciu, zabijając króliki-dawców. Zarodki uzyskuje się przez przepłukiwanie jajowodu podłożem do hodowli zarodków króliczych (BMS + 20% fKS lub PBS + 20% FKS) od strzępków i lejka w kierunku końca rogu macicy. W razie potrzeby pozostałości cumulus cophorus usuwa się przez traktowanie hialuronidazą. Zarodki przemywa się i hoduje do momentu mikroiniekcji.

Świnia.

Dla otrzymania zarodków można użyć niedojrzałe płciowo zwierzęta o wadze 60 do 90 kg. W dniu 0 zwierzęta-dawców przenosi się do innego pomieszczenia i wieczorem podaje się im 1250 JM PMSG. W 72 godziny później indukuje się owulację przy pomocy 750 JM HCG. W 24 i 36 godzin po podaniu HCG zwierzęta zostają unasienione. Zarodki pobiera się 24 do 27 godzin po unasienieniu. Do chirurgicznego pobrania zarodków zwierzęta poddaje się narkozie 160 mg azaperonu (Stressnil) i 400 mg chlorowodorku metomidanu (Hypnodie). Po przygotowaniu pola operacyjnego powłoki przecina się w linii środkowej na wysokości ostatnich dwu par sutków cięciem około 10 cm, odsłaniając macicę, jajowód i jajnik. Około 5 cm w kierunku ogonowym od ujścia jajowodu macicę perforuje się tępym narzędziem tak aby ok. 5-cm kaniulę szklaną można było wprowadzić do światła macicy i umocować. Do jajowodu od strony lejka prowadzi się i umocowuje wygiętą kaniulę oczną długości 8 cm, połączoną z 30-cm wężem gumowym. Jajowód przepłukuje się 50 ml roztworu PBS. Płyn przepłukujący zbiera się w szalce Petriego i sprowadza na obecność zarodków. Zarodki można pobierać także po zabiciu zwierzęcia-dawcy.

3. Mikroiniekcja roztworu DNA.

Do mikroiniekcji używa się odwrócony mikroskop (Zeiss ICM 405), dwa mikromanipulatory Leitza i przyrząd do iniekcji (Eppendorf). W jednym mikromanipulatorze umocowana jest pipeta przy pomocy której zarodek może być unieruchomiony przez podciśnienie. W drugim mikromanipulatorze umocowanajest w śrubie nanometrycznej pipeta iniekcyjna napełniona roztworem DNA i połączona z urządzeniem do iniekcji, Końcówka pipety iniekcyjnej ma średnicę 1 do 2 μm. Do mikroiniekcji końcówkę pipetki wprowadza się przez warstwę przejrzystą, błonę komórkową i błonę j ądrową do wnętrzaj ądra i tam umieszcza się ok. 1do 2 pl roztworu dNa. Przyrost objętości projądra sygnalizuje udaną mikroiniekcję. Czasem mikroiniekcja następuje do jądra zarodka w stadium dwukomórkowym.

W przeciwieństwie do myszy i królika, u większości gatunków zwierząt domowych (swinia, bydło), komórki jajowe i zarodki muszą ulec wstępnej obróbce (wirowanie przez 3 do 5 minut przy 15000 g) aby projądra i jądra stały się widoczne. Mikroiniekcja następuje w kropli podłoża na szkiełku natryskowym lub w tak zwanej komorze iniekcyjnej, Po mikroiniekcji komórki jajowe lub zarodki hoduje się do momentu transferu.

4. Transfer komórek jajowych po mikroiniekcji.

Mysz.

Celem wywołania ciąży rzekomej, myszy-biorcy pozostają przez noc połączone w pary z samicami po wasektomii (usunięcie nasieniowodów). Myszy dodatnie pod względem łysinek wybiera się i natryskuje do transferu. Odsłoniętą bursa ovarica (torebkę jajnika) otwiera się cienkimi pincetkami i z pipetki w której znajdują się zarodki wprowadza się je do obu jajowodów (10 - 15 z każdej strony). Młode rodzą się 20 do 21 dni po transferze.

170 647

Królik.

Króliki-biorcyna21 dni przed przewidywanym terminem zostają odosobnione pojedynczo dla synchronizacji cyklu i otrzymują 120 JM HCG lub 0,8 μg GnRH domięśniowo celem wywołania ciąży rzekomej. W dniu poprzedzającym transfer króliki-biorcy otrzymują 120 JM HCG dożylnie celem wywołania owulacji. Do transferu króliki poddaje się narkozie 0,4 ml Rompun 2% na kg wagi ciała i 0,8 ml Ketamin 10% na kg wagi ciała. Po przygotowaniu pola operacyjnego i opróżnieniu pęcherza moczowego przez nacisk na powłoki brzuszne zwierzę zostaje umocowane na grzbiecie w pozycji ukośnej. Bezpośrednio pod pępkiem w kierunku ogonowym otwiera się jamę brzuszną na długość ok. 4-5 cm. Odsłania się jajnik, jajowód i dogłowowy róg macicy i po kontroli reakcji jajnika wprowadza się przy pomocy pipety zarodki po iniekcji do bańki jajowodu na głębokość 2-2,5 cm. Transferuje się po 8 do 15 zarodków z każdej strony. Po zamknięciu jamy brzusznej ranę pooperacyjną zabezpiecza się krytym szwem skórnym. Młode rodzą się 29 do 31 dni po transferze.

Świnia.

Również jako biorcy mogą być użyte prosięta przed osiągnięciem dojrzałości płciowej. W 12 godzin po dawkach zwierzęta-biorcy otrzymują 750 JM PMSG i po dalszych 72 godzinach 750 JM HCG. Ta 12-godzinna asynchroniczność między dawcami i biorcami poprawia szanse przeżycia zarodków po transferze. Równolegle z unasienieniem dawców przeprowadza się obserwację rui u biorców. 135 do 136 godzin po rozpoczęciu programu (godzina 0 = podanie PMSG dawcom) następuje transfer zarodków. Wszystkie zarodki po iniekcji (35 - 45 sztuk) wprowadza się chirurgicznie do jednego jajowodu biorcy. Zarodniki rozmieszczają się równomiernie w obu rogach macicy. Nowy sposób pozwala także na bezkrwawy transfer zarodków do macicy świni. Młode rodzą się 113 do 116 dni po transferze.

5. Badanie integracji.

Dla zbadania integracji wstrzykniętego DNA musi się pobrać od nowonarodzonych zwierząt próbki tkanek (tkanka ogona, krew, biopsja). Z tych próbek tkankowych izoluje się wysokocząsteczkowy DNA genomu. Celem zbadania integracji wykonuje się analizy Slot Blot, Dot Biot lub Southern Blot.

Zwierzęta dodatnie (te u których nastąpiła integracja genu) wybiera się i po osiągnięciu przez nie dojrzałości do rozrodu łączy się je w pary z partnerami nie transgenicznymi. Potomstwo tych par bada się stwierdzając czy dziedziczy ono transgen od transgenicznego rodzica. Przez kojarzenie hemizygotyczne transgenicznych zwierząt hoduje się homozygotycznie transgeniczne pokolenie F2.

Dla zbadania ekspresji od transgenicznych zwierząt pobiera się krew i otrzymuje surowicę. Pobranie krwi wykonuje się przez nakłucie pozagałkowego splotu żylnego (mysz), żyły brzeżnej ucha (królik) lub żyły szyjnej (świnią) albo innych dostępnych żył, względnie przy zabiciu zwierzęcia.

Przykład BI. Oznaczanie mian, przeciwciał w surowicy zwierząt transgenicznych.

Metoda oznaczania mian przeciwciał jest podana w opisie patentowym EP-A 0,388 964. Płytki mikrotitracyjne powleka się przeciwciałem przeciw haptenowi NP (octan 4-hydroksy-3nitrofenylu). Przeciwciało to jest typu IgG 2a (łańcuch lekki jest łańcuchem X, łańcuch ciężki jest łańcuchem y 2a). Bufor do powlekania składa się z 0,2 mmol/1 węglanu/dwuwęglanu, pH 9,4. Po 2 godzinach płytki inkubuje się z następnym buforem (50 mmol/ HEPES, 0,15 mol/l NaCl, 1% kroteina C, pH 7,0). Wszystkie reakcje przeprowadza się w temperaturze pokojowej, wstrząsając. Krzywą wzorcową ustala się z roztworu wyjściowego zawierającego przeciwciało A20/44 (IgG 1) stosując szereg rozcieńczeń. Próbki wzorcowe i surowice rozcieńczasię buforem inkubacyjnym (50 ramol/1 HEPES, 0,15 mol/l NaCl, 1 % kroteina C, pH 7,0,0,2 mol/l diwinianu sodu, 0,75% glikolu polietylenowego (PEG), 0,5% pluronic^RF 68, 0,75% PEG 40 000, 0,01% fenol) i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po odessaniu dołków i dwukrotnym przemyciu buforem inkubacyjnym następuje jednogodzinna inkubacja z konjugatem (koniugat fragmentów Fab przeciwciała przeciw Np i peroksydazy - POD). Koniugat rozcieńcza się w buforze inkubacyjnym tak aby aktywność pOd wynosiła 150 mJ/ml. Po odessaniu dołków i trzykrotnym przemyciu buforem do płukania (50 mmol/1 HEPES, 0,15 mol/l NaCl, 0,1%

170 647

Pluronic^RF 68, pH 7,0), inkubuje się przez 60 minut z ABTS^R (sulfonian 2,2'-azyno-di-(3-etylobenzotiazoliny)) (6) jako substratem. Ekstynkcję mierzy się fotometrycznie (czytnik ELISA) przy 405 nm wobec 490 nm. Stężenie próbek oznacza się z krzywej wzorcowej.

Tabela

Miana przeciwciał w surowicy zwierząt transgenicznych

Mysz Nr	gg/ml	Królik Nr	gg/ml	Świnia Nr	gg/ml
970-28	3	2644	200	5814	1000
970-29	7	kontrola	0	kontrola	0
970-31	18
970-32	10
970-33	18
970-54	30
970-55	3
970-56	18
970-59	3
974-1	27
974-2	29
974-3	18
974-4	4
974-8	18
974-9	100
974-10	45
974-11	20
974-12	120
974-13	60
974-14	15
kontrola	0

Badane myszy są potomstwem dwu seropozytywnych myszy 970 i 974. Szereg zwierząt potomnych było seronegatywnych pod względem swoistości wprowadzonych przeciwciał. Nie są one umieszczone w tabeli. Po mikroiniekcji badano na ekspresję wszystkie 39 królików. Jedno zwierzę wykazało ekspresję pożądanej swoistości przeciwciała w surowicy. Otrzymano dwa transgeniczne świnie (1 urodziła się martwa). Żywo urodzone zwierzę wykazało ekspresję pożądanego przeciwciała w surowicy w zaskakująco bardzo wysokim stężeniu (1000 gg/ml).

Przykład IV. Charakterystyka przeciwciała w surowicy świni otrzymanego przez ekspresję.

a) fokusowanie izoelektryczne i immunofiksacja.

IEF przeprowadzono w systemie Phast-Gel (Pharmacia) według instrukcji producenta. Surowice świń transgenicznych i kontrolnych rozcieńczono 1:1000 i w warunkach niedenaturujących naniesiono na żel. Gradient pH żelu (pH 5-8) uwidoczniono przy pomocy białka wzorcowego (Pharmacia). Rozdział w żelu trwał 30 minut. Na koniec inkubowano przez 45 minut z 100 gg poliklonalnego przeciwciała (owca anty-mysz Fc γ) w objętości 150 gl i prążki wykrywano na paskach octanu celulozy. Białka które nie reagowały usunięto przemywaniem. 50 mmol/l buforu z fosforanu potasu, 0,15 mol/l NaCl, 0,55% TweenR, pH 7,2, przez wytrząsanie przez noc. Kompleksy immunologiczne uwidoczniono barwieniem srebrowym (Pharmacia Kit). Jako kontrolę zastosowano przeciwciało A20/44 oczyszczone z płynu wysiękowego.

Okazało się, że w surowicy świni transgenicznej można było zidentyfikować te same charakterystyczne prążki jak w oczyszczonym przeciwciale A20/44. W surowicy zwierzęcia kontrolnego te charakterystyczne prążki nie wystąpiły.

b) Oczyszczanie przeciwciała A20/44 z surowicy świni transgenicznej.

A20/44 jest przeciwciałem anty-idiotypowym przeciw przeciwciału (IgG 2a) które jest skierowane przeciw haptenowi NP. To ostatnie oczyszczono z płynu wysiękowego i sprzężono z cyjanobromowaną Sepharozą (Pharmacia) według przepisu producenta. Na tak przygotowanej kolumnie powiniowactwa adsorbowano przeciwciało A20/44 po naniesieniu 100 ml surowicy świni transgenicznej, po czym eluowano i analizowano metodami chemii białek. Przeciwciało to wykazało zgodność cech z przeciwciałem A20/44 oczyszczonym z płynu wysiękowego.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania białek o aktywności przeciwciał, znamienny tym, ze sekwencje DNA kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy przeciwciała, które są wolne od obcych sekwencji bakteryjnych, wprowadza się przez mikroinjekcję do projądra męskiego zapłodnionej komórki jajowej świni lub królika, komórki jajowe następnie implantuje się do jajowodu świni lub królika, hoduje się potomostwo i z niego w zwykły sposób otrzymuje się białko o aktywności przeciwciała, które jest złożone z wytworzonych lekkich i ciężkich łańcuchów przeciwciała.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA z promotorem immunoglobulin oraz sekwencje wzmacniające.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że do mikroiniekcji stosuje się sekwencje DNA w postaci linearnej.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA kodujące pełne natywne białko o aktywności przeciwciała.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się sekwenje DNA kodujące łańcuch ciężki y i łańcuch lekki K przeciwciała.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA kodujące przeciwciało chimerę.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwenje DNA kodujące przeciwciało heterobispecyficzne.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA kodujące fragment przeciwciała.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA kodujące przeciwciało lub fragment przeciwciała, sprzężone z dalszym polipeptydem.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencje DNA kodujące przeciwciało zmutowane.