CN107106517A - 用于调节癌干细胞的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了用于调节癌干细胞的组合物和方法。更具体地，本发明公开了赖氨酸脱甲基酶(LSD)抑制剂和蛋白激酶Cθ抑制剂(PKC‑θ)用于抑制包括癌干细胞的LSD和/或PKC‑θ过表达细胞的生长、用于增强化疗药物或辐照对癌细胞的生物学效应、用于治疗包括非转移性和转移性癌症的癌症，和/或用于预防癌症复发的用途。

Description

用于调节癌干细胞的组合物及其用途
技术领域
本申请要求2014年8月25日提交的名称为“Compositions for modulatingcancer stem cells and uses therefor”的澳大利亚临时专利申请No.2014903345的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
本发明一般性地涉及用于调节癌干细胞的组合物和方法。更具体地，本发明涉及赖氨酸脱甲基酶(lysine demethylase，LSD)抑制剂和蛋白激酶Cθ抑制剂(protein kinaseC theta，PKC-θ)用于抑制包括癌干细胞的LSD和/或PKC-θ过表达细胞的生长、用于增强化疗药物或辐照对癌细胞的生物学效应、用于治疗包括非转移性和转移性癌症的癌症，和/或用于预防癌症复发的用途。
背景技术
上皮向间充质细胞转变(Epithelial-to-mesenchymal cell transition，EMT)是癌症进展和转移中的关键步骤。然而，只有称为癌干细胞(cancer stem cell，CSC)或“前体”转移细胞的小肿瘤细胞亚群可能对转移性肿瘤的起始和复发起重要作用。CSC通过产生和支持更加分化性的非干细胞后代的复制来起始肿瘤并驱动恶性发展(参见例如Kleffel等，2013.Adv Exp Med Biol.734：145-79；Chen等，2013.Acta Pharmacologica Sinica34：732-740；Páez等，2012，Clin Cancer Res.18(3)：645-53)。CSC已被证明是肿瘤发生、癌症转移、肿瘤复发、耐药性以及化学治疗和放射治疗失败的根本性的原因。不幸的是，CSC造成肿瘤形成和生长的机制以及CSC特定分化可塑性在致瘤性中的潜在作用目前未知。
有趣的是，CSC与正常干细胞共享许多相似的特性。例如，CSC具有自我更新能力，即与分裂次数受限相反，其能够以通常比其他分裂中的肿瘤细胞更慢的速率产生其他致瘤性癌干细胞。CSC也具有分化成多种细胞类型的能力(即它们是多能性的)，这将解释以下组织学证据：不仅许多肿瘤含有宿主器官天然具有的多种细胞类型，而且通常还在肿瘤转移中保留了异质性。
CSC表达例如在下表1中列出的某些细胞表面标志物：
表1
正常体细胞干细胞对化疗剂具有天然抗性，它们具有泵出药物的多种泵(例如多抗药性(multi-drug resistance，MDR)蛋白)和有效的DNA修复机制。此外，它们还具有缓慢的细胞更新速率，而化疗剂靶向快速复制的细胞。作为正常干细胞突变对应物的CSC也可以具有允许它们在药物治疗和放射治疗中存活的类似机制。换句话说，常规化学治疗和放射治疗杀伤已分化或分化中的细胞，其形成不能再生肿瘤的肿瘤块。另一方面，产生已分化和分化中细胞的CSC群可以保持不受影响，并导致疾病的复发。常规抗癌治疗的另一个危险是有这样的可能性：例如化疗的治疗仅留下化疗抗性的CSC，并且随后的复发肿瘤也可能对化疗有抗性。
因此，迫切需要鉴定靶向细胞毒性抗药性的肿瘤起始性CSC，以预防和/或治疗疾病复发和远端转移扩散的新方法。
发明概述
本发明部分地基于以下确定：LSD(例如LSD1和LSD2)和蛋白激酶Cθ(PKC-θ)在CSC和非CSC肿瘤细胞中过表达，并且对于控制EMT以及CSC和非CSC肿瘤细胞的形成和维持是重要的。本发明人还发现可以通过同时抑制这两种酶的活性来抑制CSC和非CSC肿瘤细胞的EMT、形成、存活、生存力和维持，以及诱导间充质向上皮细胞转变(MET)。因此，如下文所述，提出了LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂可用于减少或抑制CSC和非CSC肿瘤细胞的增殖、存活和生存力的组合物和方法，包括抑制EMT、刺激或诱导MET和减少癌症复发。
因此，一方面，本发明提供了包含LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂、由其组成或基本上由其组成的组合物。LSD抑制剂适当地选自LSD1抑制剂和LSD2抑制剂、或其组合。在一些具体实施方案中，LSD抑制剂是LSD1抑制剂。合适的LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂的非限制性实例包括核酸、肽、多肽、肽模拟物、碳水化合物、脂质或其他有机(含碳)或无机分子。在一些具体实施方案中，抑制剂选自小分子抑制剂和核酸分子(例如抑制LSD基因(例如LSD1或LSD2)或PKC-θ基因的转录或翻译或者介导RNA干扰的那些)。
在一些实施方案中，LSD抑制剂降低LSD基因(例如LSD1或LSD2)的表达或LSD抑制剂表达产物的水平或功能活性(例如降低LSD多肽(例如LSD1或LSD2)的水平或降低LSD介导的脱甲基化)至小于在不存在抑制剂时LSD基因表达或者相应的LSD表达产物水平或功能活性的约9/10、4/5、7/10、3/5、1/2、2/5、3/10、1/5、1/10、1/20、1/50、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14或约10-15。在一些实施方案中，LSD抑制剂是选择性LSD抑制剂(例如选择性LSD1抑制剂或选择性LSD2抑制剂)。在另一些实施方案中，LSD抑制剂是Pan-LSD抑制剂。在另一些实施方案中，LSD抑制剂是非选择性LSD抑制剂。
在一些实施方案中，PKC-θ抑制剂降低PKC-θ基因的表达或PKC-θ表达产物的水平或功能活性(例如降低PKC-θ多肽的水平，减少PKC-θ介导的磷酸化，抑制PKC-θ与CD44或uPAR启动子的结合，减少PKC-θ(例如活性PKC-θ)与染色质的结合；减少PKC-θ介导的对鸟嘌呤交换因子GIV/Girdin的抑制，减少PKC-θ介导的对调节性T细胞功能的抑制，或减少PKC-θ介导的EMT)至小于在不存在抑制剂时的PKC-θ基因的表达或者相应的PKC-θ表达产物水平或功能活性的约9/10、4/5、7/10、3/5、1/2、2/5、3/10、1/5、1/10、1/20、1/50、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14或约10-15。在一些实施方案中，PKC-θ抑制剂是选择性PKC-θ抑制剂。在另一些实施方案中，PKC-θ抑制剂是非选择性PKC-θ抑制剂。
在一些实施方案中，组合物还包含可药用载体。
本发明的组合物可用于改变过表达LSD(例如，LSD1或LSD2)和/或PKC-θ(本文也称为“EMT调节基因”)之细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种。因此，在一个相关方面，本发明提供了LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂用于改变EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种的用途。在一些实施方案中，LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂被制备或制造为用于那些应用的药物。
在另一个相关的方面，本发明提供了用于改变EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种的方法。这些方法一般包括以下、由以下组成或基本上由其以下组成：使所述细胞与足以调节所述EMT调节基因过表达细胞之形成、增殖、维持、存活、生存力、EMT或MET的量的LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂相接触。合适地，EMT调节基因过表达细胞选自CSC和非CSC肿瘤细胞，其说明性实例包括乳腺、前列腺、肺、膀胱、胰腺、结肠、黑素瘤、肝或神经胶质瘤CSC和非CSC肿瘤细胞。在一些实施方案中，CSC是乳腺CSC(例如，乳腺上皮CSC，包括乳腺导管上皮CSC)。在一些实施方案中，非CSC肿瘤细胞是乳腺非CSC肿瘤细胞(例如，乳腺上皮非CSC肿瘤细胞，包括乳腺导管上皮非CSC肿瘤细胞)。在一些实施方案中，PKC-θ在EMT调节基因过表达细胞中的过表达包括在EMT调节基因过表达细胞的核中PKC-θ的存在或量的提高。
在一些实施方案中，用于改变EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种的方法还包括在使所述EMT调节基因过表达细胞与所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂相接触之前，检测在所述EMT调节基因过表达细胞中的所述EMT调节基因(例如LSD(例如LSD1和/或LSD2)和/或PKC-θ)的过表达(例如，相对于正常细胞(例如，正常乳腺细胞)中所述EMT调节基因的表达)。在这种类型的一些非限制性实例中，所述方法包括检测CSC中EMT调节基因的过表达。在另一些非限制性实例中，所述方法包括检测非CSC肿瘤细胞中EMT调节基因的过表达。在另一些非限制性实例中，所述方法包括检测CSC和非CSC肿瘤细胞中EMT调节基因的过表达。
在一些实施方案中，用于改变EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种的方法还包括在使所述EMT调节基因过表达细胞与所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂相接触之前，检测在所述PKC-θ过表达细胞的核中PKC-θ的存在或量的提高(例如，相对于正常细胞(例如，正常乳腺细胞)的核中PKC-θ的量)。在这种类型的一些说明性实例中，所述方法包括检测CSC的核中PKC-θ的存在或量的提高。在另一些说明性实例中，所述方法包括检测非CSC肿瘤细胞的核中PKC-θ的存在或量的提高。在另一些说明性实例中，所述方法包括检测CSC和非CSC肿瘤细胞的核中PKC-θ的存在或量的提高。
在一些实施方案中，用于改变EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种的方法还包括在使所述EMT调节基因过表达细胞与所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂相接触之前，检测所述EMT调节基因过表达细胞中PKC-θ与CD44或uPAR启动子的结合。在这种类型的一些代表性实例中，所述方法包括检测在CSC中PKC-θ与CD44或uPAR启动子的结合。在另一些代表性实例中，所述方法包括检测非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与CD44或uPAR启动子的结合。在另一些代表性实例中，所述方法包括检测CSC和非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与CD44或uPAR启动子的结合。
在一些实施方案中，用于改变EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种的方法还包括在使所述EMT调节基因过表达细胞与所述PKC-θ抑制剂相接触之前，检测所述EMT调节基因过表达细胞中PKC-θ与染色质的结合。在这种类型的一些非限制性实例中，所述方法包括检测在CSC中PKC-θ与染色质的结合。在另一些非限制性实例中，所述方法包括检测在非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与染色质的结合。在另一些非限制性实例中，所述方法包括检测在CSC和非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与染色质的结合。
合适地，用于改变EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种的方法还包括对所述EMT调节基因过表达细胞表达一种或更多种CSC标志物进行检测。
在一些实施方案中，其中所述EMT调节基因过表达细胞是CSC，所述CSC表达一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8或更多种)CSC标志物，所述CSC标志物选自：ABCB5、ALDH1、ABCG2、α6整联蛋白、α2β1整联蛋白、β-联蛋白活性(β-catenin activity)、CD15、CD13、CD20、CD24、CD26、CD29、CD44、CD90、CD133、CD166、CD271、c-Met、Hedgehog-Gli、巢蛋白(Nestin)、CXCR4、LGR5、Trop2和Nodal-激活蛋白。在一些实施方案中，所述CSC表达一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8或更多种)选自以下的CSC标志物：ALDH1、CD24、CD44、CD90、CD133、Hedgehog-Gli、α6整联蛋白。在这种类型的一些说明性实例中，CSC表达CD24和CD44(例如，CD44高、CD24低)。在一些实施方案中，CSC选自乳腺、前列腺、肺、膀胱、胰腺、结肠、黑素瘤、肝或神经胶质瘤CSC。在一些具体实施方案中，CSC是乳腺癌CSC。合适地，所述CSC具有受损或终止的多能干细胞标志物Oct4或Sox2的表达，或以小于多能干细胞上那些标志物的水平或功能活性的约1/5、1/10、1/20、1/50、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14或约10-15的水平或功能活性表达这些标志物中的一种或全部两种。
在另一个方面，本发明提供了用于在对象中治疗或预防癌症(例如非转移性癌症或转移性癌症)包括减少癌症复发的方法，其中所述癌症包含至少一种EMT调节基因过表达细胞。这些方法一般包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：以有效量向所述对象共同施用LSD(例如LSD1和/或LSD2)抑制剂和PKC-θ抑制剂，以改变所述EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种。合适地，以有效量向所述对象共同施用所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂，以抑制所述至少一种EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力和/或(vi)EMT，或者刺激或诱导所述至少一种EMT调节基因过表达细胞的(vii)MET。在一些实施方案中，LSD抑制剂是选择性LSD抑制剂(例如选择性LSD1抑制剂或选择性LSD2抑制剂)。在另一些实施方案中，LSD抑制剂是Pan-LSD抑制剂。在另一些实施方案中，LSD抑制剂是非选择性LSD抑制剂。在一些实施方案中，PKC-θ抑制剂是选择性PKC-θ抑制剂。在另一些实施方案中，PKC-θ抑制剂是非选择性PKC-θ抑制剂。合适地，所述至少一种EMT调节基因过表达细胞选自CSC和非CSC肿瘤细胞。
在一些实施方案中，癌症选自乳腺、前列腺、肺、膀胱、胰腺、结肠、黑素瘤、肝或神经胶质瘤癌症。合适地，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，CSC产生具有激素抗性的非CSC肿瘤细胞。在这种类型的一些说明性实例中，非CSC肿瘤细胞的一种或更多种(例如1或2种)激素受体的表达减少或终止，所述激素受体选自雌激素受体(estrogen receptor，ER)和孕酮受体(progesterone receptor，PR)。
在一些实施方案中，用于治疗或预防癌症的方法还包括在向所述对象共同施用所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂之前，检测从所述对象获得的肿瘤样品中EMT调节基因(例如LSD(例如LSD1和/或LSD2)和/或PKC-θ)的过表达(例如，相对于正常或非肿瘤样品中所述EMT调节基因的表达)，其中所述肿瘤样品包含所述至少一种EMT调节基因过表达细胞(例如CSC和/或非CSC肿瘤细胞)。
在一些实施方案中，用于治疗或预防癌症的方法还包括在向所述对象共同施用所述LSD抑制剂和PKC-0抑制剂之前，检测从所述对象获得的肿瘤样品中的一种或更多种如上宽泛所述的CSC标志物的表达，其中所述肿瘤样品包含所述至少一种EMT调节基因过表达细胞。
合适地，以协同有效量施用LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂。
本发明的另一个方面提供了用于在对象中治疗或预防癌症(例如非转移性癌症或转移性癌症)包括减少癌症复发的方法，其中所述癌症包含CSC和非CSC肿瘤细胞。这些方法一般包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：以有效量向所述对象共同施用(1)LSD(例如LSD1和/或LSD2)抑制剂和(2)PKC-θ抑制剂，以抑制所述CSC和/或所述非CSC肿瘤细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活或(v)生存力中的至少一种，和/或抑制所述CSC的(vi)EMT，和/或刺激或诱导所述CSC的(vii)MET，和(3)抑制所述非CSC肿瘤细胞的增殖、存活或生存力的癌症治疗或药剂，从而治疗或预防所述癌症。在一些实施方案中，LSD抑制剂是选择性LSD抑制剂(例如选择性LSD1抑制剂或选择性LSD2抑制剂)。在另一些实施方案中，LSD抑制剂是Pan-LSD抑制剂。在另一些实施方案中，LSD抑制剂是非选择性LSD抑制剂。在一些实施方案中，PKC-θ抑制剂是选择性PKC-θ抑制剂。在另一些实施方案中，PKC-θ抑制剂是非选择性PKC-θ抑制剂。在一些实施方案中，癌症治疗或药剂选自放射治疗、手术、化学治疗、激素剥夺治疗(hormone ablation therapy)、促凋亡治疗和免疫治疗。在这种类型的一些说明性实例中，癌症治疗或药剂靶向快速分裂的细胞，或者破坏细胞周期或细胞分裂。
适当地，所述方法还包括在共同施用之前确定对象患有包含CSC和非CSC肿瘤细胞的癌症或处于发生所述癌症的风险下。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺、前列腺、肺、膀胱、胰腺、结肠、黑素瘤、肝或神经胶质瘤癌症。合适地，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，CSC产生具有激素抗性的非CSC肿瘤细胞。在这种类型的一些说明性实例中，非CSC肿瘤细胞的一种或更多种(例如1或2种)激素受体的表达减少或终止，所述激素受体选自雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)。
在一些实施方案中，用于治疗或预防癌症的方法还包括在共同施用之前检测从所述对象获得的肿瘤样品中EMT调节基因(例如LSD(例如LSD1和/或LSD2)和/或PKC-θ)的过表达(例如，相对于正常或非肿瘤样品中所述EMT调节基因的表达)，其中所述肿瘤样品包含所述CSC或所述非CSC肿瘤细胞或两者。
在一些实施方案中，用于治疗或预防癌症的方法还包括在共同施用之前检测从所述对象获得的肿瘤样品中CSC和/或非CSC肿瘤细胞的核中PKC-θ的存在或量的提高(例如，相对于正常细胞(例如正常乳腺细胞)的核中的PKC-θ的量)，其中所述肿瘤样品包含所述CSC或所述非CSC肿瘤细胞或两者。
在一些实施方案中，用于治疗或预防癌症的方法还包括在共同施用之前检测从所述对象获得的肿瘤样品的CSC和/或非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与CD44或uPAR启动子的结合，其中所述肿瘤样品包含所述CSC或所述非CSC肿瘤细胞或两者。
在一些实施方案中，用于治疗或预防癌症的方法还包括在共同施用之前检测从所述对象获得的肿瘤样品的CSC和/或非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与染色质的结合，其中所述肿瘤样品包含所述CSC或所述非CSC肿瘤细胞或两者。
在一些实施方案中，用于治疗或预防癌症的方法还包括在共同施用之前检测CSC表达如上宽泛所述的一种或更多种CSC标志物。
合适地，以协同有效量施用LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂。
合适地，以协同有效量施用LSD抑制剂、PKC-θ抑制剂和癌症治疗药剂。
通常，根据常规时间表施用LSD抑制剂、PKC-θ抑制剂和癌症治疗或药剂中的至少一种(例如，1种、2种或全部)，所述时间表例如每天，每周至少两次，每周至少三次，每周至少四次，每周至少五次，每周至少六次，每周，每隔一周，每三周，每四周，每个月，每两个月，每三个月，每四个月和每六个月。
在一些实施方案中，癌症治疗可能使对象暴露于病原生物体感染的更高风险中。因此，在这些实施方案中，所述方法还可包括与所述LSD抑制剂和所述PKC-θ抑制剂以及任选地所述癌症治疗/药剂同时、先后或分开地施用至少一种抗感染剂，所述抗感染剂有效对抗由于施用所述癌症治疗或药剂而发生的感染或发生风险提高的感染，其中所述抗感染剂选自抗微生物剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、驱肠虫药(anthelmintics)、抗原虫剂(antiprotozoal)和杀线虫剂。
附图说明
图1是显示(A)人乳腺CSC的关键表面标志物；(B)人乳腺CSC中的CSC诱导型基因；和(C)细胞培养物中乳腺球(mammosphere)的体外测量的图和照片展示。
图2是显示在三个人CSC模型中跨CD44启动子区的H3K4me1和LSD1 ChIP测定之结果的图示。(EC，MCF-7上皮细胞系；BC，MDA-MB 231基底细胞系)。
图3是显示人正常(A)和乳腺癌组织(B)中LSD1以及人正常(C)和乳腺癌组织(D)中表面标志物CD44的核染色的照片展示。
图4是显示在MDA MB-231基底转移模型：转录物分析(A)，FACS分析(B)；MCF-7IM模型：FACS分析(C)，转录物分析(D)以及通过ChIP(E)和FAIRE分析(F)得到的通过siRNA的LSD1敲低抑制了乳腺人CD44高CD24低CSC的发生的图示。
图5是显示使用FACS分析(A和B)和乳腺球测定(C)得到的通过siRNA的LSD2敲低抑制了乳腺人CD44高CD24低CSC的发生的图示。
图6是显示在MCF-IM模型中NCD38抑制CSC形成的图和照片展示。(A)在MCF-IM模型中LSD1特异性抑制剂NCD38抑制了CD44高CD24低CSC样亚群。在PMA(0.65ng/μl，60小时)刺激(ST)之前，将MCF-7细胞与单独的载剂或与NCD38(5μM，17小时)预孵育。随后将细胞用Hoechst 33528、APC-抗-CD44和PE-抗-CD24在冰上染色20分钟，并进行FACS分析。FACS图上的圆圈表示CD44高/CD24低CSC样亚群的适当设门(gate)，并且分别在门上方显示了％CSC样亚群。(B)上图6A中的数据的图示。数据表示三次独立实验的平均值±标准误差(standarderror，SE)。(C)5μM NCD38减少MCF-IM模型中的乳腺球形成。在超低附着6孔板中用4×104个MCF-7细胞/孔进行乳腺球测定。在PMA刺激(0.65ng/ml，6天)(ST)或未经刺激(NS)之前，将MCF-7细胞与单独的载剂或NCD38(5μM，17小时)预孵育。在测定6天后拍摄乳腺球的相差显微镜图像，并且仅计数大于60μm的乳腺球。(D)上图6C的图示。数据表示三次独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图7是显示特异性LSD1抑制剂NCD38抑制人转移性乳腺癌细胞的维持并将细胞转化为上皮形式的图和照片展示。(A)在基底/转移模型中NCD38抑制CD44高CD24低-CSC样亚群。将MDA-MB 231细胞与单独的载剂或与NCD38(5μM)孵育。随后将细胞用Hoechst 33528、APC-抗-CD44和PE-抗-CD24在冰上染色20分钟，并进行FACS分析。CSC样亚群百分比显示在柱状图中。数据表示三次独立实验的平均值±标准误差(SE)。(B)上图7A的图示。数据表示三次独立实验的平均值±标准误差(SE)。(C)在基底/转移模型中LSD1抑制剂NCD38抑制EMT。在没有以LSD1特异性抑制剂预处理(-对照)或以NCD38(5μM)处理(+NCD38)的情况下捕获MDA-MB 231细胞的相差显微镜图像。
图8是显示在体内小鼠异种移植模型中，LSD1抑制剂帕吉林(pargyline)与化疗剂多西他赛组合减少肿瘤尺寸的照片展示。将5×106个MDA-MB-231细胞注射到每只小鼠的乳腺脂肪垫中。在50mm3肿瘤体积时以所述剂量开始处理。(A)处理四周后来自每个处理组的代表性小鼠。(B)在处理的第四周时剥离的肿瘤的每周肿瘤尺寸。
图9是显示在体内小鼠异种移植模型中，在处理开始7周后，帕吉林与多西他赛组合减少肿瘤的体积和重量的图示。将5×106个MDA-MB-231细胞注射到每只小鼠的乳腺脂肪垫中。在50mm3肿瘤体积时以所述剂量开始处理。每周测量肿瘤体积，直到处理7周。(A)处理7周后每个处理组的肿瘤重量(克)。肿瘤重量是三只小鼠的平均值±标准误差(SE)。(B)每周肿瘤体积(mm3)。化疗处理的天数在图上用黑色箭头表示。肿瘤体积是五只或更多只小鼠的平均值±标准误差(SE)。
图10是显示帕吉林与多西他赛组合减少体内小鼠肿瘤的癌干细胞的图示。将5×106个MDA-MB-231细胞注射到每只小鼠的乳腺脂肪垫中。在50mm3肿瘤体积时以所述剂量开始处理。在处理七周时处死小鼠。制备单细胞悬液，随后将细胞用Hoechst 33528、APC-抗CD44和PE-抗CD24在冰上染色20分钟并进行FACS分析。(A)来自每个处理组的CSC亚群百分比。(B)通过实时PCR得到的每组剥离的肿瘤的CD44mRNA表达。数据表示每组中5只小鼠的平均值±标准误差(SE)。
图11A是显示在MCF-IM模型中用PKC诱导物佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激MCF-7细胞导致最大EMT的图示。MCF-7细胞未经刺激(NS)或用TNF-αt(20ng/mL)、EGF(50ng/mL)、IL-6(50ng/mL)、TGF-β(2.5ng/mL)或PMA(20ng/mL)刺激60小时。使用Olympus17X1显微镜针对每个刺激捕获三个或更多个相差图像。在每个图像中计数至少200个细胞，计算经历EMT的细胞的平均百分比(％)，随后绘制图。结果以来自两个独立实验的平均值±标准误差示出。
图11B是显示在MCF-IM模型中，和EMT标志物层粘连蛋白-5的差异细胞内染色模式和形态学EMT变化的照片展示。MCF-7细胞未经刺激(NS)或用PMA(ST)刺激(0.65ng/mL，60小时)，随后通过相差显微术拍摄照片或者分别用抗层粘连蛋白-5抗体(绿色)或DAPI染色(核染色)(蓝色)染色。使用Leica显微镜以60×放大倍数捕获MCF-7的共聚焦显微镜图像。
图11C是显示在MCF-IM模型中较大伤口愈合的照片展示。将MCF-7细胞以(i)PMA(0.65ng/mL)刺激18小时或(ii)未经处理，未经刺激(NS)。随后由Olympus 17X1在时间点0小时(红线)和18小时(绿线)使用10×放大倍数捕获伤口愈合测定的相差图像。使两图像重叠(在一个图像中红色和绿色线在一起)以显示处理的伤口愈合能力。
图11D是显示在MCF-IM和基底/转移模型中较高PKC激酶活性的图示。MCF-7细胞未经刺激(NS)或用PMA(0.65ng/mL)刺激(ST)。对来自NS和ST处理的MCF-7细胞和MDA-MD 231细胞的全细胞裂解物(whole cell lysate，WCL)、细胞质提取物(cytoplasmic extract，CE)或核提取物(nuclear extract，NE)进行基于PKC ELISA的激酶测定。在450nm下测量吸光度。将数据相比于阴性对照以相对激酶活性进行作图。数据代表三个独立实验的平均值±SE，并且通过使用GraphPad Prism 5.03的双尾配对t检验确定统计学显著性。
图11E是显示在MCF-IM模型中用于分选CD44高/CD24低癌干样细胞(CSC)亚群的FACS设门策略的图示。将MCF-7细胞不处理、未经刺激(NS)或用PMA(0.65ng/mL)刺激(ST)60小时。随后用Hoechst、APC-抗-CD44和PE-抗-CD24混合物对细胞进行染色，然后进行FACS分选。癌干样细胞(CSC)群由CD44高/CD24低染色确定。首先对PMA刺激的群进行针对CSC样和NCSC亚群的设门，并且将这些门复制到非刺激群以确认在非刺激的细胞中CSC样群低于0.1％。已经示出了10个独立实验的代表性FACS图，以突出设门策略。
图11F是显示MCF-IM模型导致高百分比的CD44高/CD24低或CSC样亚群的图示。将MCF-7细胞不处理，未经刺激(NS)或用PMA(0.65ng/mL)刺激(ST)60小时。使用图1E中所述的设门策略进行FACS分析，随后从十个独立实验绘制CSC样亚群平均％(误差条是标准误差)。
图11G是显示MCF-IM模型导致产生乳腺球的照片和图示。在超低附着6孔板中用4×104个MCF-7细胞/孔进行乳腺球测定。细胞(A)未经刺激(NS)，或者用(B)PMA(0.65ng/mL)或(C)TNF-α(10ng/mL)刺激。在测定开始6天后使用相差显微术捕获图像以进行乳腺球测定，并绘制图。实验重复进行两次，并且对每个孔中的乳腺球进行平均计数。数据表示两个独立实验的平均值±SE。
图11H是显示在MCF-IM模型中诱导的CSC样亚群具有不同转录谱的图示。对未经刺激(NS)或PMA刺激(0.65ng/mL，60小时)的MCF-7细胞和经FACS分选的亚群-癌干样细胞(CSC样)和非癌干样细胞(NCSC)进行基因CD44、层粘连蛋白-5、uPAR、纤连蛋白和整联蛋白-β的转录物分析。对由从上述三个群分离的总RNA合成的cDNA进行实时PCR。将每个时间点产生的阈值循环(Threshold cycle，Ct)值转换为任意拷贝数并以亲环蛋白A参照水平进行归一化。mRNA水平以任意拷贝数表示，并且与非刺激细胞相比的倍数变化显示在误差条之上。数据表示三次独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图11I是显示在MCF-IM模型中经诱导的CSC样和NCSC亚群导致miR200家族成员的表达降低的图示。通过微RNA(microRNA)实时分析测量来自不处理、未经刺激(NS)或PMA刺激(0.65ng/mL，60小时)的MCF-7细胞、经FACS分选的亚群-癌干样细胞(CSC样)和非癌干样细胞(NCSC)的miR 200b和miR 200c的微RNA cDNA水平。将每个时间点产生的阈值循环(Ct)值转换为任意拷贝数并以RNU6B参照水平进行归一化。将微RNA水平以任意拷贝表示，数据代表三次独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图12A是显示在MCF-IM模型中广谱PKC抑制剂双吲哚基马来酰亚胺-I抑制EMT的照片展示。在没有PKC特异性抑制剂预处理(ST-BIS)，或者在PMA刺激之前用双吲哚基马来酰亚胺(1μM)预处理1小时(ST+BIS)的情况下，捕获未经刺激(NS)和PMA(0.65ng/μL，60小时)刺激(ST)的MCF-7细胞的相差显微术图像。
图12B是显示在MCF-IM模型中，仅非常高浓度的双吲哚基马来酰亚胺-I而非Go6976抑制CD44高CD24低-CSC样亚群的图示。在PMA(0.65ng/μL，60小时)刺激(ST)之前，将MCF-7细胞与单独的载剂或者与双吲哚基马来酰亚胺-I(100nm和1μM)或G06976(1μM)预孵育。随后将细胞用Hoechst 33528、APC-抗-CD44和PE-抗-CD24在冰上染色20分钟，并进行FACS分析。FACS图上的圆圈表示CD44高/CD24低CSC样亚群的适当设门，并且在门上方分别显示了CSC样亚群％。
图12C是图2B中呈现数据的替代图示。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图12D是显示在MCF-IM模型中1μM双吲哚基马来酰亚胺-I减少乳腺球形成的照片展示。在超低附着6孔板中用4×104个MCF-7细胞/孔进行乳腺球测定。在PMA刺激(0.65ng/mL，6天)(ST)或未经刺激(NS)之前，将MCF-7细胞与单独的载剂或双吲哚基马来酰亚胺-I(1μM，1小时)预孵育。在测定6天后拍摄乳腺球的相差显微镜图像，并且仅计数大于60μm的乳腺球。
图12E是图2B中呈现数据的替代图示。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图12F是显示在MCF-IM模型中100nM双吲哚基马来酰亚胺-I处理不能抑制关键诱导型EMT/CSC基因转录的图示。在PMA(0.65ng/μL，60小时)刺激(ST)之前，MCF-7细胞未经处理，未经刺激(NS)或用双吲哚基马来酰亚胺-I(100nM)预处理1小时。对从总RNA合成的cDNA进行EMT/CSC基因层粘连蛋白-5、uPAR和CD44的实时PCR分析。将每个时间点产生的阈值循环(Ct)值转换为任意拷贝数并以亲环蛋白A参照水平进行归一化。将mRNA水平以与未经刺激细胞相比的倍数变化表示。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图12G是显示在MCF-IM模型中，1μM双吲哚基马来酰亚胺-I处理抑制关键诱导型EMT/CSC基因转录的图示。在PMA(0.65ng/μl，60小时)刺激(ST)之前，MCF-7细胞未经处理，未经刺激(NS)或用双吲哚基马来酰亚胺-I(1μM)预处理1小时。对从总RNA合成的cDNA进行EMT/CSC基因层粘连蛋白-5、uPAR和CD44的实时PCR分析。将每个时间点产生的阈值循环(Ct)值转换为任意拷贝数并以亲环蛋白A参照水平进行归一化。将mRNA水平以与未经刺激细胞相比的倍数变化表示。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图12H是显示在MCF-IM模型中1μM Go6976处理不能抑制关键诱导型EMT/CSC基因转录的图示。在PMA(0.65ng/μL，60小时)刺激(ST)之前，MCF-7细胞未经处理，未经刺激(NS)或用Go6976(1μM)预处理1小时。对从总RNA合成的cDNA进行EMT/CSC基因层粘连蛋白-5、uPAR和CD44的实时PCR分析。将每个时间点产生的阈值循环(Ct)值转换为任意拷贝数并以亲环蛋白A参照水平进行归一化。将mRNA水平以与未经刺激细胞相比的倍数变化表示。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图12I是显示在基底/转移模型中广谱PKC抑制剂双吲哚基马来酰亚胺-I抑制EMT的照片展示。在无PKC特异性抑制剂预处理(-BIS)或用双吲哚基马来酰亚胺(4μM)处理(+BIS)的情况下捕获MDA-MB 231细胞的相差显微术图像。
图12J是显示在基底/转移模型中双吲哚基马来酰亚胺-I抑制CD44高CD24低-CSC样亚群的图示。将MDA-MB 231细胞与单独的载剂或与双吲哚基马来酰亚胺-I(4μM)孵育。随后将细胞用Hoechst 33528、APC-抗-CD44和PE-抗-CD24在冰上染色20分钟，并进行FACS分析。CSC样亚群百分比显示在柱状图中。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图12K是显示在基底/转移模型中双吲哚基马来酰亚胺-I处理抑制关键诱导型EMT/CSC基因转录的图示。将MDA-MB 231细胞与单独的载剂或与双吲哚基马来酰亚胺-I(4μM)孵育。对从总RNA合成的cDNA进行EMT/CSC基因层粘连蛋白-5、uPAR和CD44的实时PCR分析。将每个时间点产生的阈值循环(Ct)值转换为任意拷贝数并以亲环蛋白A参照水平进行归一化。将mRNA水平以与未经刺激细胞相比的倍数变化表示。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图13A是显示在MCF-IM模型中极低浓度的PKC-θ肽抑制剂终止EMT的照片展示。在PMA刺激之前无抑制剂预处理或用PKC-θ特异性肽(30μM)预处理24小时的情况下，捕获未经刺激(NS)和PMA(0.65ng/μL，60小时)刺激(ST)的MCF-7细胞的相差显微术图像。
图13B是显示在MCF-IM模型中PKC-θ肽抑制剂抑制CD44高CD24低CSC样亚群的图示。在PMA(0.65ng/μL，60小时)刺激(ST)之前，将MCF-7细胞与单独的载剂或与PKC-θ特异性肽(30μM)预孵育。随后将细胞用Hoechst 33528、APC-抗-CD44和PE-抗-CD24在冰上染色20分钟，并进行FACS分析。进行CD44高/CD24低CSC样亚群的适当设门，并绘制柱状图。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图13C是显示在MCF-IM模型中PKC-θ肽抑制剂处理减少关键诱导型EMT/CSC基因转录的图示。在PMA(0.65ng/μL，60小时)刺激(ST)之前，将MCF-7细胞与单独的载剂或与PKC-θ特异性肽(30μM)预孵育。对从总RNA合成的cDNA进行EMT/CSC基因CD44的实时PCR分析。将每个时间点产生的阈值循环(Ct)值转换为任意拷贝数并以亲环蛋白A参照水平进行归一化。将mRNA水平以与未经刺激细胞相比的倍数变化表示。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图13D是显示在MCF-IM模型中PKC-θ敲低导致了PMA诱导的CSC样亚群的终止而PKC-β敲低增强了PMA诱导的CSC样亚群的图示。用模拟siRNA(模拟物)、PKC-θsiRNA或PKC-βsiRNA转染MCF-7细胞48小时，随后不处理，未经刺激(NS)或用PMA刺激(ST)(0.65ng/mL，60小时)。随后通过用Hoechst、APC-抗-CD44和PE-抗-CD24抗体染色混合物染色细胞进行FACS分析。对CSC样亚群进行适当的设门，并在柱状图中显示CSC样亚群％。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图13E是显示在MCF-IM模型中PKC-θ敲低减少乳腺球形成的图示。在超低附着6孔板中用4×104个MCF-7细胞/孔进行乳腺球测定。用模拟siRNA(模拟物)或PKC-θsiRNA转染MCF-7细胞48小时，然后不处理，未经刺激(NS)或用PMA刺激(ST)(0.65ng/mL，60小时)。在测定6天后拍摄乳腺球的相差显微镜图像，并且仅计数大于60μm的乳腺球，并绘制柱状图。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图13F是显示在MCF-IM模型中PKC-θ敲低导致抑制关键诱导型EMT/CSC基因转录，而在n MCF-IM模型中PKC-β敲低不具有该抑制的图示。用模拟siRNA(模拟物)、PKC-θsiRNA或PKC-βsiRNA转染MCF-7细胞48小时，然后不处理，未经刺激(NS)或用PMA刺激(ST)(0.65ng/mL，60小时)。对从总RNA合成的cDNA进行EMT/CSC基因uPAR和CD44的实时PCR分析。将每个时间点产生的阈值循环(Ct)值转换为任意拷贝数并以亲环蛋白A参照水平进行归一化。将mRNA水平以与未经刺激细胞相比的倍数变化表示。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图13G是显示PKC-θNLS(Nuclear Localization Signal，核定位信号)突变的过表达减少PKC-θ进入核中的照片展示。在共聚焦显微术之前，在MCF-IM模型中进行PKC-θWT(野生型)或PKC-θNLS的过表达72小时。
图13H是显示在MCF-IM模型中PKC-θNLS(核定位信号)突变的过表达降低CSC％的图示。在刺激细胞(0.65ng/mL，60小时)之前，在MCF-IM模型中进行模拟载体、PKC-θWT(野生型)或PKC-θNLS的过表达72小时。随后通过用Hoechst、APC-抗-CD44和PE-抗-CD24抗体染色混合物染色细胞进行FACS分析。进行CSC样亚群的适当设门，计算超过模拟之上的CSC样亚群的％提高，并显示在柱状图中。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图13I是显示在MCF-IM模型中PKC-θNLS(核定位信号)突变的过表达导致抑制关键诱导型EMT/CSC基因转录的图示。在刺激细胞(0.65ng/mL，60小时)之前，在MCF-IM模型中进行模拟载体、PKC-θWT(野生型)或PKC-θNLS的过表达72小时。对从总RNA合成的cDNA进行EMT/CSC基因uPAR和CD44的实时PCR分析。将每个时间点产生的阈值循环(Ct)值转换为任意拷贝数并以亲环蛋白A参照水平进行归一化。将mRNA水平以与未经刺激细胞相比的倍数变化表示。数据表示两个独立实验的平均值±标准误差(SE)。
图14A是显示癌干细胞中PKC-θ与CD44基因的启动子区的染色质缔合的图示。在MCF-IM、HMLE-IM和基底转移模型中使用抗体抗PKC-θ抗体对免疫沉淀的DNA进行ChIP测定。使用CD44启动子引物对这些免疫沉淀的DNA进行实时PCR分析。数据以图解方式作为经免疫沉淀的DNA相对于无(nil)抗体对照的ChIP富集比示出并相对于总输入DNA进行归一化。结果表示三次独立实验之一的ChIP富集比。
图14B和C是显示在MCF-IM模型中PKC-θ的活性形式PKC-θ(磷酸化)在CSC诱导型基因的启动子区高度富集染色质的图示。MCF-7细胞未经刺激(NS)或者用PMA(ST)(0.65ng/μL，60小时)刺激。随后用抗体抗PKC-θ(磷酸化)对经免疫沉淀的DNA进行ChIP测定。使用(B)uPAR和(C)CD44启动子引物对这些经免疫沉淀的DNA进行实时PCR分析。数据以图解方式作为经免疫沉淀的DNA相对于无抗体对照的ChIP富集比示出并相对于总输入DNA进行归一化。结果表示三次独立实验之一的ChIP富集比。
图14D是显示在MCF-IM模型中PKC-θ与Pol II在CSC诱导型基因uPAR上物理相互作用的图示。对未经刺激(NS)或者PMA刺激(ST)(0.65ng/mL，60小时)的MCF-7细胞进行顺序ChIP。首先进行初次染色质免疫沉淀，然后对由初次免疫沉淀回收的染色质进行二次染色质免疫沉淀。所使用的抗体是：初次ChIP为抗Pol II抗体，二次ChIP为抗PKC-θ抗体。使用uPAR启动子定向引物对经免疫沉淀的DNA进行实时PCR分析。数据以图解方式作为经免疫沉淀的DNA相对于无抗体对照的ChIP富集比示出并针对总输入DNA进行归一化。“无抗体”是指没有向交联NDA添加抗体(既没有一抗也没有二抗)的样品。结果表示三次独立实验之一的ChIP富集比。
图14E是显示在MCF-IM模型中PKC-θ的药理学抑制或敲低降低其在uPAR启动子中的染色质缔合的图示。首先使MCF-7细胞与单独的载剂或与双吲哚基马来酰亚胺-I(1μM)预孵育1小时，随后用PMA(0.65ng/μL，60小时)刺激(ST)。在单独的实验中，用模拟siRNA(模拟物)或PKC-θsiRNA转染细胞，随后在转染后48小时进行PMA刺激(ST)(0.65ng/mL，60小时)。随后用抗PKC-θ抗体对经免疫沉淀的DNA进行ChIP测定。通过使用uPAR启动子引物对这些经免疫沉淀的DNA进行实时PCR分析。数据以图解方式作为经免疫沉淀的DNA相对于无抗体对照的ChIP富集比示出并针对总输入DNA进行归一化。结果表示三次独立实验之一的ChIP富集比。
图15是显示人正常和侵袭性乳腺癌组织中活性PKC-θ的核染色的照片展示。使用抗PKC-θ(磷酸化)抗体进行正常和人乳腺癌组织的核染色，并拍摄显微照片。
图16是显示在MCF-IM模型中用LSD1和PKC-θ抑制剂同时处理乳腺球，在这两种抑制剂的剂量比单独的任一抑制剂的剂量更低的情况下减少CSC形成的图示。
发明详述
1.定义
除非另有定义，否则本文所使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似于或等效于本文中所述方法和材料的任何方法和材料可用于实践或测试本发明，但是仅描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。
如本文所使用的未用数量词修饰的名词意指一个/种或多于一个/种(即，意指至少一个/种)的所述名词。举例来说，“要素”意指一个/种或多于一个/种要素。
术语“共同施用”或“共施用”等意指施用包含两种或更多种活性剂的单一组合物，或者作为单独组合物和/或通过单独途径递送的每种活性剂同步或同时或在足够短的时间段内先后施用，以使有效结果与当所有这些活性剂作为单一组合物施用时所获得的有效结果等同。“同时”意指活性剂在基本上相同的时间施用，并且理想地在同一制剂中一起施用。“同步”是指活性剂在接近的时间施用，例如，一种药剂在另一种药剂施用前或施用后约一分钟至约一天内施用。任何同步的时间都是可用的。然而，经常发生的情况是，当不同时施用时，药剂将在约一分钟内至约八小时内，并且适当地在少于约一小时至约四小时内施用。当同步施用时，药剂适当地施用在对象的同一部位处。术语“同一部位”包括确切位置，但也可以是在约0.5cm至约15cm，优选在约0.5cm至约5cm内。如本文所使用的术语“单独”意指所述药剂间隔施用，例如，间隔为约一天至数周或数月。所述活性剂可以以任一顺序施用。如本文所使用的术语“先后(sequentially)”是指所述药剂按顺序施用，例如间隔为分钟、小时、天或周。如果合适的话，活性药剂可以按定期重复周期施用。
术语“药剂”或“调节剂”包括诱导期望药理学和/或生理学作用的化合物。该术语还包括本文具体提及的那些化合物的可药用和药理学活性成分，所述化合物包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。当使用上述术语时，则应理解，其包括活性药剂本身以及可药用的药理学活性的盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。术语“药剂”不应被狭义解释，而应延伸至小分子；蛋白性分子如肽、多肽和蛋白质以及包含其的组合物；以及遗传分子例如RNA、DNA和模拟物及其化学类似物以及细胞制剂(cellular agent)。术语“药剂”包括能够产生和分泌本文所提及的多肽的细胞以及包含编码所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。因此，术语“药剂”延伸至包含载体(例如病毒或非病毒载体、表达载体)的核酸构建体以及用于在一系列细胞内分泌和表达的质粒。
本文使用的关于任何物质和/或现象的水平的术语“改变”和语法等同物是指物质和/或现象的量的提高和/或降低，而无论以客观和/或主观方式确定量。
“抗原结合分子”是指对靶抗原具有结合亲合力的分子。应当理解的是，该术语延伸至呈现抗原结合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白质骨架。
“抗原性或免疫原性活性”是指根据本发明的多肽、片段、变体或衍生物在其施用的动物(适当地哺乳动物)中产生抗原性或免疫原性应答，其中所述应答包括产生特异性结合多肽或其片段的要素。
如本文所用的术语“烷基”是指具有1至10个碳原子的直链、支链或环状饱和烃基。在合适的情况下，烷基可以具有指定数目的碳原子，例如C1-6烷基包括具有以直链或支链排布的1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基。合适的烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、4-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、5-甲基戊基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、庚基、辛基、壬基、癸基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
如本文所使用的术语“烯基”是指在碳原子之间具有一个或更多个双键并具有2至10个碳原子的直链、支链或环状烃基。在合适的情况下，烯基可以具有指定数目的碳原子。例如，在“C2-C6烯基”中的C2-C6包括具有以直链或支链排布的2、3、4、5或6个碳原子的基团。合适的烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、丁二烯基、戊烯基、戊二烯基、己烯基、己二烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、环戊烯基、环己烯基和环己二烯基。
“芳烷基”是指被如上所定义的芳基取代的如上所定义的烷基，例如，-CH2苯基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、-H2CH(CH3)CH2苯基等、及其衍生物。
如本文所使用的“芳族”或“芳基”是指每个环中多至7个原子的任何稳定的单环或二环碳环，其中至少一个环是芳族的。这种芳基要素的实例包括但不限于：苯基、萘基、四氢奈基、茚满基、联苯基、菲基、蒽基或苊基(acenaphthyl)。
在某些情况下，取代基可以用包括零在内的碳数目范围限定，例如(C0-C6)亚烃基-芳基。如果认为芳基是苯基，则该定义将包括苯基本身以及例如-CH2Ph、-CH2CH2Ph、CH(CH3)CH2CH(CH3)Ph。
还应当认识到，本文所述的化合物可以具有不对称中心并因此能够以多于一种的立体异构形式存在。因此，本发明还涉及基本上纯的在一个或更多个不对称中心处的异构体形式的化合物(例如，大于约90％ee，例如约95％ee或97％ee或大于99％ee)以及其混合物(包括外消旋混合物)。这些异构体可以是天然存在的或者可以通过不对称合成来制备，例如使用手性中间体或通过手性拆分。
当提及抗原结合分子时，如本文所使用的术语“特异性结合”、“特异性免疫相互作用”等是指在蛋白质与其他生物制剂的异质群体存在下对抗原的存在具有决定作用的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，特异性抗原结合分子与特定抗原相结合，并且不以显著量与样品中存在的其他蛋白质或抗原相结合。在该条件下与抗原特异性结合可需要选择其对特定抗原具有特异性的抗原结合分子。例如对于所选择的蛋白质抗原，可以出现抗原结合分子，其与该抗原结合，但不与样品中存在的其他蛋白质相结合。可以使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质特异性免疫相互作用的抗原结合分子。例如，固相ELISA免疫测定通常用于选择与蛋白质特异性免疫相互作用的单克隆抗体。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York中关于可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述。
术语“癌干细胞”或CSC是指具有肿瘤起始和肿瘤维持能力(包括大量增殖、形成新肿瘤和维持癌症发展的能力)的细胞，即，具有驱动肿瘤形成和生长的无限增殖潜能的细胞。CSC在生物学上不同于大块肿瘤细胞，并且具有与干细胞相关的特征，特别是自我更新和繁殖并产生特定癌症样品中存在的所有细胞类型的能力。术语“癌干细胞”或CSC包括干细胞(SC)中的基因改变和成为CSC的细胞中的基因改变两者。在一些具体实施方案中，CSC乳腺CSC(其适当地为CD24+CD44+)的示例性实例包括CD44高CD24低。
“编码序列”是指对编码基因的多肽产物做出贡献的任何核酸序列。与此相反，术语“非编码序列”是指不对编码基因的多肽产物做出贡献的任何核酸序列。
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”、“含有”和“包括”将被理解为暗示包括所声明的要素或步骤或者要素或步骤的组，而不排除任何其他的要素或步骤或者要素或步骤的组。因此，使用术语“包含”等表示所列要素是必需或强制性的，而其他要素是任选的并且可以存在或可以不存在。“由...组成”意指包括且限于短语“由...组成”之后所描述的内容。因此，短语“由...组成”表示所列要素是必需或强制性的，并且没有任何其他元素可以存在。“基本上由...组成”意指包括短语后列出的任何要素，并且限于对所列要素的公开内容中说明的活性或作用不干扰或无贡献的其他要素。因此，短语“基本上由...组成”表示所列要素是必需或强制性的，但其他要素是任选的并且可以存在或可以不存在，这取决于其是否影响所列要素的活性或作用。
“相当于”或“对应于”是指与参照核酸序列显示出大幅度序列同一性(例如，与参照核酸序列的全部或一部分具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、97％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至高达100％的序列同一性)的核酸序列，或者对参照氨基酸序列显示出大幅度序列相似性或同一性(例如，对参照氨基酸序列的全部或一部分具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、97％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至高达100％的序列相似性或同一性)的氨基酸序列。
术语“衍生化”、“衍生”等是指通过化学反应从另一种物质产生或获得化合物，例如，使化合物与添加的官能团试剂等反应向化合物添加一个或更多个反应基团。
“衍生物”意指通过修饰(例如，通过与其他化学部分缀合或复合，或者通过本领域已知的翻译后修饰技术)源自基本序列的多肽。术语“衍生物”在其范围内还包括对亲本序列做出的改变，包括提供功能等同分子的添加或缺失。
如本文所使用的癌干细胞的术语“分化”是指癌干细胞向多能肿瘤祖细胞的变化以及多能肿瘤祖细胞向单能肿瘤祖细胞和/或末端分化肿瘤细胞的变化。
在治疗或预防疾病的背景下，“有效量”是指以单一剂量或作为系列一部分向有此治疗或预防需要的个体施用一定量的药剂或组合物，所述量能够有效预防此疾病的症状发生、控制此种症状和/或治疗现有症状。有效量根据以下因素而变化：待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类组、组合物的制剂、对医学状况的评估和其他相关因素。预期所述量将落在可通过常规试验确定的相对宽的范围内。
如本文所使用的术语“上皮向间充质转变”(EMT)是指从上皮表型到间充质表型的转变，其是胚胎发育的正常过程。EMT也是充当离子和流体转运体的损伤上皮细胞变为基质重塑间充质细胞的过程。在癌中，这种转变通常导致改变的细胞形态学、间充质蛋白质的表达和侵袭性提高。用于定义体外EMT的标准包括上皮细胞极性的丧失、分离成单个细胞以及随后在获得细胞运动性之后分散。(参见，Vincent-Salomon等，Breast Cancer Res.2003；5(2)：101-106)。在EMT期间的表达、分布和/或功能改变以及因此涉及的分子种类包括生长因子(例如，转化生长因子β(TGF-β)、wnts)；转录因子(例如，Snail、SMAD、LEF和核β-联蛋白)；细胞至细胞粘附轴分子(钙粘素、联蛋白)；细胞骨架调节剂(Rho家族)；以及细胞外蛋白酶(基质金属蛋白酶、血纤维蛋白溶酶原激活物)(参见Thompson等，Cancer Research65，5991-5995，7月15日，2005)。
如本文所使用的术语“上皮”是指身体内表面和外表面的覆盖物，包括血管和其他小腔的衬壁。其由形成相对薄的片层或层的上皮细胞的集合组成，这是由于组成细胞在侧面通过细胞-细胞连接互相大量地粘附。所述层是极化的并具有顶侧和底侧。尽管上皮细胞是严密组织化的(tight regimentation)，但是上皮具有一定的可塑性，并且上皮层中的细胞可以改变形状，例如从平的变化到柱状或在一端收缩并在另一端扩张。然而，这些往往发生在细胞群体中而不是个体地发生(参见，Thompson等，2005，同上)。
术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，在编码序列的情况下，表达包括编码序列向mRNA的转录和mRNA向一种或更多种多肽的翻译。相反地，非编码序列的表达仅包括非编码序列向转录物的转录。
“表达载体”意指能够指导所述载体内包含的多核苷酸转录并且适当地合成由所述多核苷酸编码的肽或多肽的任何基因元件。此种表达载体对本领域的从业者是已知的。
如本文所使用的术语“功能”是指生物学、酶或治疗功能。
如本文所用的术语“基因”是指细胞基因组的任何和所有不连续的编码区，以及相关的非编码区和调控区。该术语旨在意指编码特异性多肽、内含子和邻近的参与表达调控的5′和3′非编码核苷酸序列的开放阅读框。在这点上，基因还可以包含控制信号(例如，启动子、增强子、终止子和/或与给定基因天然结合的多腺苷酸化信号或异源控制信号)。DNA序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。基因可被引入到适当的载体中用于染色体外保持或用于整合到宿主中。
如应用于化学物质的术语“基团”是指形成分子一部分的一组原子。在一些情况下，基团可包括彼此键合以形成分子一部分的两个或更多个原子。基团可以为单价或多价(例如，二价)以允许与分子的一个或多个另外的基团键合。例如，单价基团可以设想为其一个氢原子被移除以允许与分子的另一个基团相键合的分子。基团可带正电或负电。例如，带正电基团可以设想为添加一个或更多个质子(即，H+)的中性基团，并且带负电基团可设想为移除一个或更多个质子的中性基团。基团的非限制性实例包括但不限于：烷基、亚烃基、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、芳基、亚芳基、亚胺基、次亚胺基(iminylene group)、氢化物基团、卤素基团、羟基、烷氧基、羧基、硫代基、烷硫基、二硫基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、甲硅烷基和甲硅烷氧基。基团如烷基、烯基、炔基、芳基和杂环基，无论单独或在复合词还是在基团的定义中使用时，都可以被一个或更多个取代基任选地取代。如本文所使用的“任选地取代”是指基团可以被一个或更多个选自以下的基团进一步取代或者不被取代：烷基、烯基、炔基、芳基、卤素、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、卤代芳基、羟基、烷氧基、烯氧基、芳氧基、苄氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、卤代芳氧基、硝基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基芳基、硝基杂环基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、苯基氨基、二苯基氨基、苄基氨基、二苄基氨基、肼基、酰基、酰基氨基、二酰基氨基、酰氧基、杂环基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环基、羧基酯、羧基、羧基酰胺、巯基、硫代烷基、硫代苄基、硫代酰基和含磷基团。如本文所使用的术语“任选地取代”也可以指CH2基团被替换为羰基(C＝O)。任选的取代基的非限制性实例包括：烷基，优选C1-8烷基(例如，C1-6烷基例如甲基、乙基、丙基、丁基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基)；羟基C1-8烷基(例如，羟甲基、羟乙基、羟丙基)；烷氧基烷基(例如，甲氧基甲基、甲氧基乙基、甲氧基丙基、乙氧基甲基、乙氧基乙基、乙氧基丙基等)；C1-8烷氧基(例如，C1-6烷氧基例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基)；卤素(氟代、氯代、溴代、碘代)；一氟甲基；一氯甲基；一溴甲基；二氟甲基；二氯甲基；二溴甲基；三氟甲基；三氯甲基；三溴甲基；羟基；苯基(其自身可被如本文所述的任选取代基进一步取代，例如，羟基、卤素、甲基、乙基、丙基、丁基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基、氨基)；苄基(其中CH2和/或苯基可如本文所述被进一步取代)；苯氧基(其中CH2和/或苯基可如本文所述被进一步取代)；苄氧基(其中CH2和/或苯基可如本文所述被进一步取代)；氨基；C1-8烷氨基(例如，C1-6烷基例如甲氨基、乙氨基、丙氨基)；二C1-8烷氨基(例如，C1-6烷基例如二甲氨基、二乙氨基、二丙氨基)；酰基氨基(例如，NHC(O)CH3)；苯氨基(其中苯基本身可如本文所述被进一步取代)；硝基；甲酰基；-C(O)-C1-8烷基(例如，C1-6烷基例如乙酰基)；O-C(O)-烷基(例如，C1-6烷基例如乙酰氧基)；苯甲酰基(其中CH2和/或苯基本身可被进一步取代)；用C＝O替换CH2；CO2H；CO2C1-8烷基(例如，C1-6烷基例如甲基酯、乙基酯、丙基酯、丁基酯)；CO2苯基(其中苯基自身可被进一步取代)；CONH2；CONH苯基(其中苯基自身可如本文所述被进一步取代)；CONH苄基(其中CH2和/或苯基可如本文所述被进一步取代)；CONH C1-8烷基(例如，C1-6烷基例如甲基酰胺、乙基酰胺、丙基酰胺、丁基酰胺)；CONH C1-8烷基胺(例如，C1-6烷基例如氨基甲基酰胺、氨基乙基酰胺、氨基丙基酰胺、氨基丁基酰胺)；-C(O)杂环基(例如，-C(O)-1-哌啶、-C(O)-1-哌嗪、-C(O)-4-吗啉)；-C(O)杂芳基(例如，-C(O)-1-吡啶、-C(O)-1-哒嗪、-C(O)-1-嘧啶、-C(O)-1-吡嗪)；CONH二C1-8烷基(例如，C1-6烷基)。
“杂芳烷基”基团意指被杂芳基取代的如上所定义的烷基，例如，-CH2吡啶基、-(CH2)2嘧啶基、-(CH2)3咪唑基等、及其衍生物。
如本文所使用的术语“杂芳基”或“杂芳族”表示稳定的单环或每个环至多7个原子的二环，其中至少一个环是芳族的并且包含1至4个选自O、N和S的杂原子。定义范围内的杂芳基包括但不限于：吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、唑基、异唑基、吲哚基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氢喹啉。与以下杂环的定义一样，“杂芳基”也被理解为包括任何含氮杂芳基的N-氧化物衍生物。
“杂环基”和“杂芳基”的另一些实例包括但不限于以下：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、吲嗪基、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑、异唑基、萘啶基、二唑基、唑基、唑啉、异唑啉、氧杂环丁基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、吖丙啶基、1，4-二氧杂环己烷基、六氢氮杂、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑、二氢吲哚基、二氢异唑基、二氢异噻唑基、二氢二唑基、二氢唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基、及其N-氧化物。杂环基取代基的连接可以通过碳原子或通过杂原子进行。
如本文所使用的“杂亚芳基”是指二价单环或多环体系，优选约3至约15元，其中在环体系中的一个或更多个(更优选1至3个)原子为杂原子，即非碳的元素，例如，氮、氧和硫原子。亚杂芳基可以任选地被一个或更多个(优选1至3个)芳基取代基取代。示例性的杂亚芳基包括例如1，4-亚咪唑基。
如本文所使用的术语“杂环”、“杂脂肪族”或“杂环基”意在表示包含1至4个选自O、N和S的杂原子的5至10元非芳族杂环并且包括二环基团。
“杂环基烷基”基团是指被杂环基取代的如上所定义的烷基，例如，-CH2吡咯烷-1-基、-(CH2)2哌啶-1-基等、及其衍生物。
如本文所使用的术语“高”是指测量值大于正常，大于标准(如预定测量值或亚组测量值)，或者比另一个亚组测量值相对更大。例如，CD44高是指CD44的测量值大于正常CD44测量值。因此，“CD44高”总是对应于对象身体的相关部分或来自对象身体的相关样品中可检测的CD44。可以根据本领域技术人员任何可用的方法来确定正常测量值。术语“高”还可以指等于或大于预定测量值(例如预定截断)的测量值。如果对象对于特定的标志物不是“高”的，则其对于此标志物为低。通常，应该选择用于确定对象是“高”还是“低”的截断以使得划分成为临床上相关的。
本文中所使用的“同源物”表示基因或其产物，其与另一基因或产物通过来自于共同祖先DNA序列的血统相关联。
术语“激素受体阴性(HR-)肿瘤”是指这样的肿瘤：在如通过标准方法(例如，患者生物样品中核的免疫组织化学染色)确定的一定阈值之上，其不表达用于刺激肿瘤增殖、存活或生存力的激素的受体。所述阈值可例如使用Allred评分或基因表达来测量。例如，参见Harvey等(1999.J Clin Oncol 17：1474-1481)以及Badve等，(2008.J Clin Oncol 26(15)：2473-2481)。在一些实施方案中，所述肿瘤不表达雌激素受体(ER-)和/或孕酮受体(PR-)。
术语“激素受体阳性(HR+)肿瘤”是指这样的肿瘤：在如通过标准方法(例如，患者生物样品中核的免疫组织化学染色)确定的一定阈值之上，其表达用于刺激肿瘤增殖、存活或生存力的激素的受体。所述阈值可例如使用Allred评分或基因表达来测量。例如，参见Harvey等(1999.J Clin Oncol 17：1474-1481)以及Badve等(2008.J Clin Oncol 26(15)：2473-2481)。肿瘤表达雌激素受体(ER)或孕酮受体(PR)，如通过标准方法(例如，患者生物样品中的核的免疫组织化学染色)确定的。
如本文所使用的术语“激素抗性癌症”是指当与非激素抗性癌症相比时，对激素治疗或内分泌治疗的响应减小或消失的癌症。从生物学和临床观点来看，可以区分出几种模式的抗性：A)尽管具有内分泌受体表达但固有地对内分泌受体(例如，雌激素受体)靶向不敏感的肿瘤(泛内分泌治疗抗性(pan-endocrine therapy resistance)或从头抗性(denovo resistance))；B)具有激素依赖性但对一种或更多种特定内分泌治疗具有抗性的肿瘤(药剂选择性抗性；例如对他莫昔芬响应而对芳香酶抑制剂不响应)；以及C)最初对内分泌治疗响应但随后进展的肿瘤(获得性抗性)。所有类型的抗性都包括在其中。在一些实施方案中，激素抗性癌症是在施用激素或内分泌治疗之前为激素抗性的癌症(即，其为从头激素抗性)。在另一些实施方案中，激素抗性癌症是最初并不为激素抗性，但在至少一次治疗激素或内分泌治疗后变成激素抗性的癌症。
如本文所使用的术语“激素治疗”或“内分泌治疗”定义为属于阻断或除去激素的治疗。该治疗可移除合成激素或激素原的腺体，阻断或抑制激素合成，或者防止或抑制激素结合其受体，或者下调或降解激素受体。
“杂交”在本文中用于表示互补核苷酸序列的配对以产生DNA-DNA杂交体或DNA-RNA杂交体。互补碱基序列是通过碱基配对规则相关的那些序列。在DNA中，A与T配对，C与G配对。在RNA中，U与A配对，C与G配对。在这点上，如本文所使用的术语“匹配”和“错配”指互补核酸链中配对核苷酸的杂交潜力。匹配的核苷酸有效地杂交，例如上述的典型A-T和G-C碱基对。错配是不能有效杂交的其他核苷酸的组合。在本发明中，优选的配对机制包括寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的氢键键合，该氢键键合可以为Watson-Crick氢键键合、Hoogsteen氢键键合或反向Hoogsteen氢键键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱基，其通过形成氢键配对。杂交可以在如本领域技术人员已知的不同情况下发生。
短语“特异性杂交”等是指在严格条件下分子只与特定核苷酸序列(当所述序列存在于复杂的混合物(例如全细胞)DNA或RNA中时)结合、成双链、或杂交。
本文所使用的术语“烃基”包括含碳和氢的任何基团，包括饱和的、不饱和的、芳族的、直链或支链基团或环基团(包括多环基)。烃基包括但不限于：C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C10环烷基、芳基(例如苯基和萘基)、Ar(C1-C8)烷基如苄基，其任何一个都可以被任选取代。
本文所提到的“免疫相互作用”包括分子之间的任何相互作用、反应或其他形式的分子间缔合，特别是当其中一种分子是(或者模拟)免疫系统的组分的时候。
如本文所使用的术语“抑制剂”是指降低或抑制以下功能或生物学活性的药剂：LSD多肽(例如，LSD1-也称为赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1A；赖氨酸(K)-特异性脱甲基酶1(KDM1)；赖氨酸(K)-特异性脱甲基酶1A(KDM1A)；BRAF35-HDAC复合蛋白BHC110；FAD结合蛋白BRAF35-HDAC复合物，110kDa亚基；胺氧化酶(含黄素)结构域2(AOF2)；赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1；RP1-184J9.1-和LSD2-也称为赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1B(KDM1B)；含黄素胺氧化酶1(AOF1)；胺氧化酶(含黄素)结构域1；含黄素的含胺氧化酶结构域的蛋白质1；赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶2；或LSD基因(例如LSD1-也称为KDM1A；AOF2；BHC110；KDM1-和LSD2-也称为KDM1B；AOF1；bA204B7.3；C6orf193；dJ298J15.2)的表达；或PKC-θ多肽，或PKC-θ基因(例如，PRKCQ-也称为PRKCT、PKCT、MGC126514、MGC141919、nPKC-θ)的表达。
如本文所使用的术语“低”是指测量值低于正常，低于标准(如预定测量值或亚组测量值)，或者比另一个亚组测量值相对更低。例如，CD24低是指CD24测量值低于正常CD24测量值。可以根据本领域技术人员任何可用的方法来确定正常测量值。术语“低”还可以指测量值等于或低于预定测量值(例如预定截断)。
术语“低级烷基”是指具有1至6个碳原子的直链和支链烷基，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、正己基、2-甲基戊基等。在一些实施方案中，低级烷基是甲基或乙基。
术语“低级烷氧基”是指具有1至6个碳原子的直链和支链烷氧基，例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、2-甲基戊氧基等。通常，低级烷氧基是甲氧基或乙氧基。
如本文所用，术语“间充质”是指胚胎中胚层的部分，其由置于胶状基底物质中的松散包装的、非特化细胞组成，由其发育结缔组织、骨、软骨以及循环系统和淋巴系统。间充质是形成相对扩散的组织网络的细胞的集合。间充质不是完整的细胞层，并且细胞通常仅在它们的衔接表面上具有与其相邻细胞粘附的点。这些粘附还可涉及钙粘蛋白缔合(参见Thompson等，2005，同上)。
如本文所使用的术语“间充质向上皮转变”(MET)是可逆的生物学过程，其涉及从运动的、多极的或纺锤形的间充质细胞转变为称为上皮的极化细胞的平面阵列。MET是EMT的逆过程。MET发生在正常发育、癌症转移和诱导性多能干细胞重编程中。
“调节”是指直接或间接地提高或降低靶分子的水平或功能活性。例如，药剂可以通过与除靶分子之外的分子相互作用间接地调节水平/活性。在这点上，编码靶多肽的基因的间接调节在其范围内包括调节第一核酸分子表达，其中所述第一核酸分子的表达产物调节编码靶多肽的核酸分子表达。
如本文所使用的术语“寡核苷酸”是指由通过磷酸二酯键(或其相关的结构变体或合成类似物)连接的多种核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关的结构变体或合成类似物)构成的聚合物。因此，虽然术语“寡核苷酸”通常是指这样的核苷酸聚合物，其中核苷酸残基及它们之间的连接是天然存在的，但是应该理解，该术语在其范围内也包括包含但不仅限于肽核酸(PNA)、氨基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核酸等的多种类似物。分子的精确大小可以根据特定的应用而变化。寡核苷酸的长度通常相当短，通常为约10至30个核苷酸残基，但是该术语可以指任何长度的分子，尽管术语“多核苷酸”或“核酸”通常用于大的寡核苷酸。
如本文所使用的术语“有效相连”或“有效连接”是指将结构基因置于调节元件(包括但不限于启动子)的调节控制之下，从而控制基因的转录以及任选的翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选的是，将基因序列或启动子定位在距基因转录起始位点一定距离处，所述距离与其天然设置(即该基因序列或启动子所来源的基因)中该基因序列或启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域中已知的，可以在不丧失功能的情况下适应该距离的某些变化。类似地，调节序列元件相对于待在其控制下的异源基因的优选定位通过这一元件在天然设置(即，其所来源的基因)中的定位来限定。
术语“过表达”可互换地指与正常细胞相比，通常在癌细胞中以可检测的更高水平转录或翻译的基因(例如，LSD基因或PKC-θ基因)。因此，过表达是指蛋白质和RNA二者的过表达(由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工增加，稳定性改变以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运输模式改变(核定位增加)引起的局部过表达，以及增强的功能活性(例如，如底物的酶水解增加)。与正常细胞或比较细胞(例如，乳腺细胞)相比，过表达也可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
本文中可互换使用的术语“患者”、“对象”、“宿主”或“个体”指的是任何个体，特别是脊椎动物对象，并且甚至更特别是哺乳动物对象，对其来说，治疗或预防是期望的。落入本发明范围内的合适的脊椎动物包括但不限于任何脊索动物亚门成员，所述脊索动物亚门包括灵长类动物(例如，人，猴子和猿，并且包括猴的物种，例如来自猕猴(Macaca)属(例如，食蟹猴(如食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或猕猴(猕猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))，以及狨猴(来自狨属(Callithrix)的物种)，松鼠猴(来自松鼠猴(Saimiri)属的物种)和绢毛猴(来自柽柳猴(Saguinus)属的物种)，以及猿的物种例如黑猩猩(黑猩猩(Pan troglodytes)))；啮齿类(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)；兔类动物(例如，家兔、野兔)；牛类动物(例如，牛)；绵羊类动物(例如，绵羊)；山羊类动物(例如，山羊)；猪类动物(例如，猪)；马类动物(例如，马)；犬科动物(例如，狗)；猫科动物(例如，猫)；鸟类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅，伴侣鸟类例如金丝雀、虎皮鹦鹉等)；海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸)；爬行动物(蛇、蛙、蜥蜴等)和鱼。在一些具体的实施方案中，对象是灵长类动物，例如人。然而，应该理解，上述术语并不意味着症状存在。
“可药用载体”是指由非生物学或其他方面不期望的材料构成的药物载剂，即，所述材料可以与所选择的活性剂一起施用于对象而不引起任何或实质性的不良反应。载体可包括赋形剂和其他添加剂(例如，稀释剂、去污剂、着色剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂、转染剂等)。
术语“多核苷酸”、“遗传物质”、“遗传形式”、“核酸”和“核苷酸序列”包括如本领域技术人员所容易理解的RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式和混合聚合物、正义链和反义链两者，并且可以是经化学或生物化学修饰的，或者可以包含非天然或衍生化的核苷酸碱基。
“苯基烷基”是指被苯基取代的如上定义的烷基，例如，-CH2苯基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、CH3CH(CH3)CH2苯基等、及其衍生物。苯基烷基是芳烷基的一个子集。
术语“多核苷酸变体”和“变体”是指显示出与参照多核苷酸序列具有显著序列同一性的多核苷酸或在本领域已知的严格条件下(例如参见Sambrook等，MolecularCloning.A Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor Press，1989)与参照序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括其中一个或更多个核苷酸已添加或缺失或者被不同核苷酸替换的多核苷酸。在这点上，本领域内所公知的是，可以对参照多核苷酸做出包括突变、添加、缺失和替换在内的某些改变，由此使改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物学功能或活性。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然等位基因变体。
在本文中可互换使用的术语“多肽”、“蛋白性分子”、“肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或更多个氨基酸残基是合成的非天然氨基酸(例如相应天然氨基酸的化学类似物)以及天然氨基酸聚合物。这些术语不排除修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。对象蛋白性分子的可溶形式是特别有用的。在定义范围内包括例如含有一种或更多种氨基酸类似物(包括例如具有替换连接的非天然氨基酸或多肽)的多肽。
术语“多肽变体”指其中一个或更多个氨基酸被替换为不同氨基酸的多肽。本领域内所公知的是，如下所述，一些氨基酸可以改变为其他具有大致相似性质的氨基酸，而不改变该多肽的活性性质(保守替换)。这些术语还包括其中添加或缺失一个或更多个氨基酸或者被不同氨基酸替换的多肽。
术语“前药”以其最宽泛的含义使用，并且包括体内转化成本发明化合物的那些衍生物。所述衍生物容易被本领域的技术人员所想到，并且包括例如其中游离羟基被转化成酯衍生物的化合物。
如本文所用的术语“预防”是指其提高对象对患疾病或病症的抵抗力，或者换言之减少对象发生疾病或病症之可能性的预防性治疗，也指在发生疾病或病症开始后为了减轻或完全消除或防止其恶化的治疗。这些术语在其范围内还包括在可能易患疾病或病症但尚未被诊断为患病的对象中预防疾病或病症发生。
如本文所使用的“外消旋体”是指对映体的混合物。
当被用来提及第一样品中的物质和/或现象相对于第二样品的水平时，术语“减少”、“抑制”、“削弱”、“阻抑”、“降低”和语法等同物是指通过使用任何本领域接受的统计分析方法发现，第一样品中的物质和/或现象的量以任何具有统计学显著性的量低于第二样品中的物质和/或现象的量。在一个实施方案中，可以主观地确定减少，例如当患者提及其对疾病症状(例如疼痛、疲劳等)的主观感知时。在另一个实施方案中，可以客观地确定减少，例如当来自患者的样品中CSC和/或非CSC肿瘤细胞的数目低于来自患者的早期样品中的数目时。在另一个实施方案中，第一样品中物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少10％。在另一个实施方案中，第一样品中物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少25％。在另一个实施方案中，第一样品中物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少50％。在另一个实施方案中，第一样品中物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少75％。在另一个实施方案中，第一样品中物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少90％。或者，差异可以表示为“n倍”差异。
术语“盐”、“衍生物”和“前药”包括当施用于接受者时能够提供(直接或间接)本发明化合物或者其活性代谢物或残余物的任何可药用盐、酯、水合物或任何其他化合物。合适的可药用盐包括可药用无机酸(例如，盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸)的盐，或可药用有机酸(例如，乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲基磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙底酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗坏血酸和戊酸)的盐。碱盐包括但不限于与可药用阳离子(例如，钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵)形成的那些。另外，碱性含氮基团可以用以下试剂季铵化：如低级烷基卤化物(例如，甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)，二烃基硫酸盐(如二甲基和二乙基硫酸盐)等。然而，可以理解，由于不可药用盐可用于可药用盐的制备，故其也落入本发明的范围之内。盐和前药和衍生物的制备可以通过本领域中已知的方法来进行。例如，金属盐可以通过本发明的化合物与金属氢氧化物的反应来制备。酸式盐可以通过使适当的酸与本发明的化合物反应来制备。
术语“选择性”是指抑制LSD或对LSD显示出拮抗作用，而对另一种LSD或另一种酶例如单胺氧化酶(MAO)(例如，MAO A或MAO B)不显示显著抑制或拮抗作用的化合物。因此，对LSD1有选择性的化合物表现出相对于另一种LSD(即，除了LSD1之外的LSD，例如LSD2)或另一种酶(例如，MAO)的抑制或拮抗作用大于约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或大于约100倍的LSD1选择性。在一些实施方案中，选择性化合物对指定LSD显示出比对另一种LSD或另一种酶(例如，MAO)大至少50倍的抑制或拮抗作用。在另一些实施方案中，选择性化合物对指定LSD的抑制或显示出比对另一种LSD或另一种酶(例如，MAO)大至少100倍的抑制或拮抗作用。在另一些实施方案中，选择性化合物对指定LSD显示出比对另一种LSD或另一种酶(例如，MAO)大至少500倍的抑制或拮抗作用。在另一些实施方案中，选择性化合物对指定LSD显示出比对另一种LSD或另一种酶(例如，MAO)大至少1000倍的抑制或拮抗作用。或者，术语“选择性”是指抑制PKC-θ或对PKC-θ显示出拮抗作用，而不显著抑制或拮抗另一种PKC酶(例如，PKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ或PKC-ν)功能的化合物。相比之下，术语“非选择性”是指抑制PKC-θ或对PKC-θ显示出拮抗作用并且还显著抑制或拮抗至少一种其他PKC酶(例如，PKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ或PKC-ν)功能的化合物。通常，对PKC-θ有选择性的化合物表现出相对于另一种PKC(即，除PKC-θ之外的PKC，如PKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ或PKC-ν)的抑制或拮抗作用大约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或大约100倍的PKC-θ选择性。在一些实施方案中，选择性化合物对PKC-θ显示出比对另一种PKC(即，除PKC-θ之外的PKC，如PKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ或PKC-ν)大至少50倍的抑制或拮抗作用。在另一些实施方案中，选择性化合物对PKC-θ的抑制或显示出比对另一种PKC(即，除PKC-θ之外的PKC，如PKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ或PKC-ν)大至少100倍的抑制或拮抗作用。在另一些实施方案中，选择性化合物对PKC-θ显示出比对另一种PKC(即，除PKC-θ之外的PKC，如PKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ或PKC-ν)大至少500倍的抑制或拮抗作用。在另一些实施方案中，选择性化合物对PKC-θ显示出比对另一种PKC(即，除PKC-θ之外的PKC，如PKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ或PKC-ν)大至少1000倍的抑制或拮抗作用。
如本文所使用的术语“序列同一性”指的是比较窗口中的序列在核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的基础上序列相同的程度。因此，“序列同一性百分比”按如下计算：在比较窗口中比较两条最佳比对的序列，确定在两条序列上均出现相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His，、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目以得到相匹配的位置数目，用匹配的位置数目除以比较窗口的总位置数目(即窗口大小)，再将结果乘以100，以得到序列同一性的百分比。出于本发明的目的，“序列同一性”将被理解为通过合适的方法计算出的“匹配百分比”。例如，序列同一性分析可使用DNASIS计算机程序(windows 2.5版本；得自于HitachiSoftware engineering Co.Ltd.，South San Francisco，California，USA)，使用软件所附参考手册中使用的标准缺省值来进行。
“相似性”是指如表2中限定的相同或构成保守替换的氨基酸的百分比数。
表2
相似性可以使用序列比较程序如GAP(Deveraux等，1984，Nucleic AcidsResearch 12，387-395)来确定。以这种方式，可通过在对准中插入缺口来对于与本文引用的那些序列长度相似或很大不同的序列进行比较，这种缺口例如通过GAP所使用的比较算法确定。
用来描述两种或更多种多核苷酸或多肽之间序列关系的术语包括“参照序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参照序列”包括核苷酸和氨基酸残基，长度为至少12个，但经常为15至18个，并且通常至少25个单体单元。因为两种多核苷酸可以各自包含(1)两种多核苷酸之间相似的序列(即，只是完整多核苷酸序列的一部分)，以及(2)两种多核苷酸之间不同的序列，所以两种或更多种多核苷酸之间的序列比较通常通过比较两种多核苷酸在“比较窗口”中的序列进行，以确定和比较局部区域的序列相似性。“比较窗口”是指至少6个连续位置，通常约50至约100个，更通常约100至约150个的概念节段，其中在两个序列进行最佳比对之后，将一个序列与邻近位置相同数目的参照序列进行比较。与用于两个序列最佳比对的参照序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口可包含约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)。用于比对比较窗口的序列最佳比对可通过计算机化执行算法(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Drive Madison，WI，USA)，或者通过任何所选的多种方法得到的校验和最佳比对(即，在比较窗口中产生最高同源性百分比)来进行。也可以参考BLAST程序家族，例如Altschul等1997，Nucl.AcidsRes.25：3389公开的程序。序列分析的详细讨论可见于Ausubel等“Current Protocols inMolecular Biology，”John Wiley&Sons Inc，1994-1998第15章19.3单元。
如本文所使用的“小分子”指的是分子量小于3千道尔顿(kDa)并且通常小于1.5千道尔顿，并且合适地小于约1千道尔顿的组分。小分子可以是核酸、肽、多肽、肽模拟物、碳水化合物、脂质或其他有机(含碳)或无机分子。如本领域技术人员所理解的，根据本说明书，庞大的化学和/或生物混合物(通常为真菌、细菌或藻类提取物)库可以用本发明的任何测定来筛选，以确定调节生物活性的化合物。“小有机分子”是分子量小于3千道尔顿，小于1.5千道尔顿或甚至小于约1kDa的有机化合物(或与无机化合物(例如，金属)复合的有机化合物)。
如本文所使用的“严格性”指的是杂交过程中的温度和离子强度条件，以及某些有机溶剂的存在与否。严格性越高，则在序列之间观察到更高程度的互补性。如本文所使用的“严格条件”是指在仅具有高比例互补碱基，优选具有精确互补性的多核苷酸杂交的温度和离子条件。所要求的严格性取决于核苷酸序列，并且取决于杂交过程中存在的各种部件，并且当使用核苷酸类似物时变化很大。通常，严格条件选择为比特定序列在确定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约10℃至20℃。Tm是50％靶序列与互补探针杂交时的温度(在特定的离子强度和pH下)。应该理解的是，多核苷酸在至少低严格条件下，优选在至少中等严格条件下并且更优选在高严格条件下与靶序列杂交。本文提及的低严格条件包括并涵盖用于在42℃下杂交的至少约1％v/v至至少约15％v/v甲酰胺和至少约1M至至少约2M的盐，以及用于在42℃下洗涤的至少约1M至至少约2M盐。低严格条件还可以包括用于在65℃下杂交的1％牛血清白蛋白(BSA)，1mM EDTA，0.5M NaHPO4(pH 7.2)，7％SDS，以及用于在室温下洗涤的(i)2×SSC，0.1％SDS；或者(ii)0.5％BSA，1mM EDTA，40mM NaHPO4(pH 7.2)，5％SDS。中等严格条件包括并涵盖用于在42℃下杂交的至少约16％v/v至至少约30％v/v甲酰胺和至少约0.5M至至少约0.9M的盐，以及用于在42℃下洗涤的至少约0.5M至至少约0.9M的盐。中等严格条件还可以包括用于在65℃下杂交的1％牛血清白蛋白(BSA)，1mM EDTA，0.5MNaHPO4(pH 7.2)，7％SDS，以及用于在42℃下洗涤的(i)2×SSC，0.1％SDS；或者(ii)0.5％BSA，1mM EDTA，40mM NaHPO4(pH 7.2)，5％SDS。高严格条件包括并涵盖用于在42℃下杂交的至少约31％v/v至至少约50％v/v甲酰胺和至少约0.01M至至少约0.15M的盐，以及用于在42℃下洗涤的至少约0.01M至至少约0.15M的盐。高严格条件还可以包括用于在65℃下杂交的1％BSA，1mM EDTA，0.5M NaHPO4(pH 7.2)，7％SDS，以及用于在超过65℃的温度下洗涤的(i)0.2×SSC，0.1％SDS；或者(ii)0.5％BSA，1mM EDTA，40mM NaHPO4(pH 7.2)，1％SDS。高严格条件的一个实施方案包括在6×SSC中在约45℃下杂交；接着在0.2×SSC，0.1％SDS中在65℃下洗涤一次或更多次。非常高的严格条件的一个实施方案包括在0.5M磷酸钠，7％SDS中在65℃下杂交；接着在0.2×SSC，1％SDS中在65℃下洗涤一次或更多次。另一些严格条件是本领域中公知的。本领域技术人员应当理解，可以操纵多种因素以优化杂交的特异性。最终洗涤的严格性优化可用于确保高程度的杂交。关于详细实例，参见CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(同上)第2.10.1至2.10.16页，以及MOLECULARCLONING.A LABORATORY MANUAL(Sambrook等，编辑)(Cold Spring Harbor Press 1989)第1.101至1.104节。
“基本上互补”是指寡核苷酸或其子序列足够互补以与靶序列杂交。因此，寡核苷酸或子序列的核苷酸序列不需要反映靶序列的精确互补序列。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸不含有错配并具有靶序列。
如本文所使用的术语“协同”是指当第一药剂与第二药剂或治疗组合施用时，其治疗效果比当单独施用第一药剂和第二药剂或治疗所预测的累加治疗效果更大。因此，术语“协同”包括这样的实施方案，其中当LSD抑制剂(例如LSD1或LSD2抑制剂)与PKC-θ抑制剂组合施用时，其治疗效果比单独施用LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂的所预测的累加治疗效果更大。术语“协同”还包括这样的实施方案，其中当LSD抑制剂(例如LSD1或LSD2抑制剂)和PKC-θ抑制剂与癌症治疗或药剂组合施用时，其治疗效果比单独施用LSD抑制剂、PKC-θ抑制剂和癌症治疗或药剂所预测的累加治疗效果更大。当应用于LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂时，术语“协同有效量”是指组合物(通常为药物组合物)中各组分的量，其有效用于抑制EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力或(vi)EMT，或者用于刺激或诱导EMT调节基因过表达细胞的(vii)MET，其在LSD抑制剂的剂量相对于PKC-θ抑制剂的剂量相对于抑制EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力或(vi)EMT，或者刺激或诱导EMT调节基因过表达细胞的(vii)MET的剂量-响应图中(以LSD抑制剂剂量为轴或以PKC-θ抑制剂剂量为轴)产生不相交(intersect)的效果。当应用于LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂时，术语“协同有效量”也指组合物(通常为药物组合物)中各组分的量，其有效用于抑制CSC和非CSC肿瘤细胞的形成、增殖、存活、生存力或维持，从而治疗或预防癌症，并且其在LSD抑制剂剂量相对于PKC-θ抑制剂剂量相对于抑制CSC和非CSC肿瘤细胞的形成、增殖、存活、生存力或维持的剂量-响应图中(以LSD抑制剂剂量为轴或以PKC-θ抑制剂剂量为轴)产生不相交的效果。另外，当应用于LSD抑制剂、PKC-θ抑制剂和癌症治疗药剂时，术语“协同有效量”是指组合物(通常为药物组合物)中各组分的量，其有效用于抑制CSC和非CSC肿瘤细胞的形成、增殖、存活、生存力或维持，从而治疗或预防癌症，并且其在LSD抑制剂的剂量相对于PKC-θ抑制剂的剂量相对于癌症治疗药剂的剂量相对于抑制CSC和非CSC肿瘤细胞的形成、增殖、存活、生存力或维持的剂量-响应图中(以LSD抑制剂剂量为轴或以PKC-θ抑制剂剂量为轴或以癌症治疗药剂剂量为轴)产生不相交的效果。在本领域中用于确定协同作用的剂量响应曲线例如由Sande等(参见A.Goodman等，编辑，thePharmacological Basis of Therapeutics，MacMillan Publishing Co.，Inc.，New York(1980)中第1080至1105页)进行了描述。使用95％置信界限，通过改变因素(例如，剂量水平、时间表和响应)，并使用由LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂和任选的癌症治疗药剂的多种组合的剂量响应曲线生成等效线图的计算机生成模型，可以确定最佳协同量。在剂量响应曲线上，CSC和非CSC肿瘤细胞的形成、增殖、存活、生存力或维持的最高抑制与最佳剂量水平相关。
如本文所使用的术语“治疗”是指获得期望的药理学和/或生理学作用。该作用在部分或完全治愈疾病或病症(例如，恶性血液病)方面和/或该疾病或病症引起的不良影响方面可以是治疗性的。这些术语还涵盖哺乳类动物(特别是人)中疾病或病症的任何治疗，包括：(a)抑制疾病或病症，即，阻止其发展；或(b)缓解疾病或病症，即，使疾病或病症消退。
如本文所使用的术语“肿瘤”是指任何赘生性细胞生长和增殖(无论是恶性或良性的)，以及所有的癌前细胞和组织以及癌细胞和组织。术语“癌症”和“癌”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为部分特征的生理状态。如本文所使用的术语“癌症”是指非转移癌和转移癌，包括早期和晚期癌症。术语“癌前(precancerous)”是指通常先于癌症或发展成癌症的状态或生长。“非转移性”是指良性地，或仍然位于最初部位，并且没有渗透入除最初部位之外的淋巴或血管系统或组织的癌症。通常，非转移癌是0期、I期或II期癌症，并且偶尔III期癌症的任何癌症。“早期癌症”是指不为侵袭性或转移性的癌症或是归类为0期、I期或II期癌症的癌症。术语“晚期癌症”通常是指III期或IV期癌症，但也可以指II期癌症或II期癌症的亚期。本领域技术人员应理解，II期癌症分类为早期癌症或晚期癌症取决于癌症的具体类型。癌症的说明性实例包括但不限于，乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、肾癌、癌、黑素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、头和颈的鳞状细胞癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、直肠癌和食道癌。在一个示例性实施方案中，癌症是乳腺癌。
如本文所使用的术语“肿瘤样品”是指包含从癌患者获得的肿瘤材料的样品。该术语包括临床样品，例如，通过手术切除获得的组织和通过活组织检查(例如，组织芯活检或细针穿刺活检)获得的组织。该术语也包括包含从除原发性肿瘤以外的部位获得的肿瘤细胞的样品(例如，循环肿瘤细胞)；以及保存的肿瘤样品，例如，福尔马林固定的肿瘤样品、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。该术语包括是患者肿瘤细胞的后代的细胞(例如，来自原发性肿瘤细胞或循环肿瘤细胞的细胞培养样品)。该术语包括可包含从体内肿瘤细胞分离的蛋白质或核酸物质的样品，例如，骨髓、血液、血浆、血清等。该术语还包括已富集肿瘤细胞或在获得其后以其他方式操纵的样品以及包含从患者肿瘤材料获得的多核苷酸和/或多肽的样品。
“载体”是指多核苷酸分子，优选例如来自在其中可以插入或克隆多核苷酸的质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子。载体优选地包含一个或更多个单一限制性位点，并且能够在包含靶细胞或组织或其祖细胞或组织的确定宿主细胞中自主复制，或者可以与特定宿主的基因组整合，从而使得所克隆序列是可复制的。因此，载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如，线性或闭合环状质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。或者，载体可以是当被引入宿主细胞时可以整合在宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起进行复制的载体。载体系统可以包含单个载体或质粒，两个或更多个载体或质粒，其共同含有的整个DNA被引入宿主细胞的基因组，或转位子中。载体的选择通常依赖于载体与待引入所述载体的宿主细胞的相容性。在本发明中，载体优选病毒载体或病毒来源的载体，其在动物并且优选地在哺乳动物细胞中以可操作方式发挥功能。这样的载体可来源于痘病毒、腺病毒或酵母。所述载体也可包含选择标志物，例如可用于选择合适转化体的抗生素抗性基因。这种抗性基因的实例是本领域技术人员已知的，包括nptII基因(赋予对抗生素卡那霉素和G418的抗性)和hph基因(赋予对抗生素潮霉素B的抗性)。
如本文所使用的，下划线或斜体的基因名称应表明该基因，与其蛋白质产物相比，蛋白质产物用不加任何下划线或斜体的基因名称表示。例如，“LSD1”应指LSD1基因，而“LSD”应表示由所述“LSD1”基因的转录和翻译和/或选择性剪接产生的蛋白质产物。
除非另有特别说明，否则本文所述的每个实施方案被加以必要的改变以用于每个实施方案。
2.用于减少或终止癌干细胞的形成、维持、增殖或生存力的组合物和方法
本发明部分基于以下结论：乳腺癌(包括激素抗性乳腺癌)是富含CSC的，并且LSD(例如，LSD1和LSD2)和PKC-θ在那些CSC和非CSC肿瘤细胞中过表达。基于这些发现，本发明人分别用LSD(例如LSD1和LSD2)抑制剂和PKC-θ抑制剂处理乳腺CSC和乳腺非CSC肿瘤细胞，并且发现它们中的每一种单独特异性抑制乳腺CSC和非CSC肿瘤细胞的形成、增殖、维持、存活或生存力，抑制乳腺CSC的EMT，和/或在乳腺CSC中刺激/诱导MET。令人惊讶的是，本发明人还发现用LSD(例如LSD1和LSD2)抑制剂和PKC-θ抑制剂处理乳腺CSC和乳腺非CSC肿瘤细胞产生显著更大的作用，包括对于乳腺CSC和非CSC肿瘤细胞的形成、增殖、维持、存活或生存力的抑制，乳腺CSC的EMT的抑制，和/或乳腺CSC中MET的刺激/诱导的协同效应。不希望受任何理论或操作方式束缚，提出了LSD(包括LSD1和LSD2)和PKC-θ通过在其整个调节区解除对活性染色质结构域的调节对CSC特异性基因的转录起到至关重要的作用，并且通常该解除调节不仅刺激乳腺CSC的产生，而且也刺激CSC的产生。
基于以上观察，本发明人提出，LSD(例如，LSD1和LSD2)和PKC-θ抑制将导致CSC和/或非CSC肿瘤细胞的增殖、维持、存活或生存力显著降低，和/或CSC的EMT减少，和/或CSC的MET增加，这进而导致由其分化更少的非CSC肿瘤细胞，以及用癌症治疗或药剂更有效地治疗非CSC肿瘤细胞。
因此，根据本发明，提供了这样的组合物和方法：其利用LSD抑制剂(例如，LSD1或LSD2抑制剂)和PKC-θ抑制剂以降低或终止CSC和非CSC肿瘤细胞的增殖、维持、存活或生存力，和/或降低或终止CSC的EMT，和/或刺激或诱导CSC的MET，以用于治疗或预防癌症(例如，转移性癌症)。在一些具体的实施方案中，LSD抑制剂(例如，LSD1或LSD2抑制剂)和PKC-θ抑制剂与癌症治疗或药剂组合使用，所述癌症治疗或药剂降低那些细胞的非CSC肿瘤细胞后代的增殖、存活或生存力。因此，如下文所述，本发明的方法和组合物可特别地用于治疗或预防癌症(包括转移性癌症)。
2.1 LSD抑制剂
LSD抑制剂包括并涵盖减少LSD累积、功能或稳定，或者降低LSD基因表达的任何活性剂，并且这样的抑制剂包括但不限于小分子和大分子，例如，核酸、肽、多肽、肽模拟物、碳水化合物、多糖、脂多糖、脂质或其他有机(含碳)或无机分子。
在一些实施方案中，LSD抑制剂是拮抗性核酸分子，其功能是抑制LSD(例如，LSD1或LSD2)转录物的转录或翻译。这种类型的典型转录物包括对应于以下序列中任何一个的核苷酸序列：(1)例如在GenBank登录号：NM_015013.3、NP_001009999.1和NM_001009999.2中所述的人LSD1核苷酸序列，例如在GenBank登录号：NM_153042.3中所述的人LSD2核苷酸序列；(2)与(1)中所提及的序列中任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核苷酸序列；(3)在至少低、中等或高严格条件下与(1)中所提及的序列杂交的核苷酸序列；(4)编码以下氨基酸序列中任何一个的核苷酸序列：例如在GenPept登录号NP_055828.2、NP_001009999.1和O60341.2中所述的人LSD1氨基酸序列，例如在GenPept登录号NP_694587.3中所述的人LSD2氨基酸序列；(5)编码以下氨基酸序列的核苷酸序列，其与(4)中提及的任一个序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性；以及编码以下氨基酸序列的核苷酸序列，其与(4)中提及的任一个序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
说明性拮抗剂核酸分子包括反义分子、适配体、核酸酶和三链体形成分子、RNAi和外部引导序列。核酸分子可以作为效应物、抑制剂、调节剂和靶分子所具有特异性活性的刺激物起作用，或者功能性核酸分子可具有不依赖于任何其他分子的从头(de novo)活性。
拮抗剂核酸分子可以与任何大分子相互作用，例如DNA、RNA、多肽或碳水化合物链。因此，拮抗剂核酸分子可以与LSD(例如，LSD1或LSD2)mRNA或LSD(例如，LSD1或LSD2)的基因组DNA相互作用，或者其可以与LSD多肽(例如，LSD1或LSD2)相互作用。通常，拮抗剂核酸分子基于靶分子与拮抗剂核酸分子之间的序列同源性被设计成与其他核酸相互作用。在另一些情况下，拮抗剂核酸分子与靶分子之间的特异性识别不是基于拮抗剂核酸分子与靶分子之间的序列同源性，而是基于形成允许特异性识别发生的三级结构。
在一些实施方案中，反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA结合和阻止蛋白翻译被用于直接阻断LSD(例如，LSD1或LSD2)的翻译。反义分子通过规范或不规范碱基配对而被设计成与靶核酸分子相互作用。反义分子与靶分子的相互作用可被设计成促进靶分子的破坏，例如，通过RNAseH介导的RNA-DNA杂合体降解。或者，反义分子可被设计成中断通常在靶分子上发生的加工功能，例如转录或复制。反义分子可以基于靶分子的序列进行设计。存在多种通过寻找靶分子的最易接近区域来优化反义效率的方法。非限制性方法包括体外选择实验和使用DMS和DEPC的DNA修饰研究。在一些具体实例中，反义分子以小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12的解离常数(Kd)与靶分子相结合。在一些具体实施方案中，采用来源于翻译起始位点(例如，-10和+10之间区域)的反义寡脱氧核糖核苷酸。
适配体是合适地以特异性方式与靶分子相互作用的分子。适配体通常是长度为15至50个碱基的小核酸，其折叠成确定的二级和三级结构，例如茎-环或G-四链体(G-quartets)。适配体可以与小分子(例如，ATP和茶碱(theophiline))以及大分子(例如，逆转录酶和凝血酶)结合。适配体可以以小于10-12M的Kd与靶分子非常紧密地结合。适当地，适配体以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合靶分子。适配体可以以极高程度的特异性结合靶分子。例如，已分离了这样的适配体，其与靶分子和仅在分子的单一位置上不同的另一种分子之间的结合亲合力相差大于10,000倍。期望的是，适配体与靶分子的Kd比其与背景结合分子的Kd低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。适用于产生目标靶标(例如，PHD、FIH-1或vHL)的适配体的方法是“Systematic Evolution of Ligands by EXponentialEnrichment”(SELEXTM)。所述SELEXTM方法在美国专利No.5,475,096和美国专利No.5,270,163(也参见WO 91/19813)中进行了描述。简要地说，在有利于结合的条件下使核酸混合物与靶分子相接触。将未结合的核酸与结合的核酸分开，并且解离核酸-靶标复合物。然后扩增解离的核酸以产生核酸的配体富集混合物，根据需要使其经过结合、分开、解离和扩增的重复循环，以产生对靶分子具有高度特异性高亲合力的核酸配体。
在另一些实施方案中，抗LSD(例如，抗LSD1或LSD2)核酶用于催化LSD(例如，LSD1或LSD2)RNA的特异性切割。核酶作用机制包括核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，随后进行内切核苷酸切割。存在多种不同类型的催化核酸酶或核酸聚合酶类型反应的核酶，其基于天然系统中存在的核酶，例如锤头状核酶、发夹状核酶和四膜虫属核酶。还存在一些在天然系统中不存在的核酶，但其已被改造成从头催化特异性反应。代表性的核酶切割RNA或DNA底物。在一些实施方案中，使用切割RNA底物的核酶。潜在RNA靶标内的特异性核酶切割位点最初通过扫描核酶切割位点的靶分子确定，其包括以下序列：GUA、GUU和GUC。一旦确定，可评估对应于靶基因中含有切割位点的区域的15至20个核糖核苷酸的短RNA序列以预测可致使寡核苷酸序列不适宜的结构特征，例如二级结构。候选靶标的适宜性也可使用核糖核酸酶保护测定，通过测试其与互补寡核苷酸的杂交可及性(accessibility)来进行评估。
三链体形成功能性核酸分子是可以与双链核酸或单链核酸相互作用的分子。当三链体分子与靶区域相互作用时，形成了被称为三链体的结构，其中依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对二者三条DNA链形成复合物。三链体分子是优选的，因为其可以以高亲合力和特异性结合靶区域。通常期望的是，三链体形成分子与靶分子以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合。
外部引导序列(EGS)是与靶核酸分子结合形成复合物的分子，并且该复合物被切割靶分子的RNAse P识别。EGS可被设计成特异性地靶向所选择的RNA分子。RNAse P在细胞内帮助加工转移RNA(tRNA)。通过使用使靶RNA：EGS复合物模拟天然tRNA底物的EGS，可以募集细菌RNAse P以切割几乎任何RNA序列。类似地，RNA的真核EGS/RNAse P定向切割可用于在真核细胞内切割期望靶标。
在另一些实施方案中，介导LSD(例如，LSD1或LSD2)基因或LSD(例如，LSD1或LSD2)转录物之RNA干扰(RNAi)的RNA分子可用于降低或终止基因表达。RNAi是指通过引入与靶基因的转录物同源的单链或(通常)双链RNA(dsRNA)来干扰或破坏靶基因的产物。RNAi方法(包括双链RNA干扰(dsRNAi)或小干扰RNA(siRNA))已在多种生物体(包括哺乳动物细胞和线虫类秀丽隐杆线虫(C.elegans))中得到了广泛证实(Fire等，1998.Nature 391，806-811)。在哺乳动物细胞中，RNAi可由以下引发：21至23个核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)双链体(Chiu等，2002 Mol.Cell.10：549-561；Elbashir等，2001.Nature 411：494-498)；或者微RNA(miRNA)、功能性短发夹RNA(shRNA)或使用DNA模板与RNA聚合酶III启动子在体内表达的其他dsRNA(Zeng等，2002.Mol.Cell 9：1327-1333；Paddison等，2002.Genes Dev.16：948-958；Lee等，2002.Nature Biotechnol.20：500-505；Paul等，2002.NatureBiotechnol.20：505-508；Tuschl，T.，2002.Nature Biotechnol.20：440-448；Yu等，2002.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(9)：6047-6052；McManus等，2002.RNA 8：842-850；Sui等，2002.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(6)：5515-5520)。
在一些具体实施方案中，对应于LSD(例如，LSD1或LSD2)基因至少一部分的dsRNA本身以及特别是dsRNA产生构建体用于减少或终止其表达。基因表达的RNAi介导抑制可以使用本领域报道的任何技术来实现，例如通过将编码茎-环或发夹RNA结构的核酸构建体转染到靶细胞的基因组中；或者通过表达转染的核酸构建体，其具有LSD(例如，LSD1或LSD2)基因在会聚启动子(convergent promoter)之间的同源性；或者在单一启动子后按照头对头或尾对尾复制。也可以使用任何类似的构建体，只要其产生能够在其上向后折叠并产生dsRNA的单一RNA，或者只要其产生两个单独的RNA转录物，所述RNA转录物然后退火以形成与靶基因具有同源性的dsRNA即可。
对于RNAi不需要绝对的同源性，对于约200个碱基对的dsRNA具有所描述的约85％同源性的更低阈值(Plasterk和Ketting，2000，Current Opinion in Genetics andDev.10：562-67)。因此，根据dsRNA的长度，RNAi编码核酸可以改变其包含的对靶基因转录物的同源性水平，即，100至200个碱基对的dsRNA与靶基因具有至少约85％的同源性，并且更长的dsRNA(即，300至100个碱基对)与靶基因具有至少约75％的同源性。表达单一RNA转录物(被设计成与单独表达的RNA退火)的RNA编码构建体或者由会聚启动子表达单独转录物的单一构建体的长度合适地为至少约100个核苷酸。表达单一RNA的RNA编码构建体通常长度为至少约200个核苷酸，所述单一RNA被设计成通过内部折叠形成dsRNA。
如果所得的dsRNA对于目标用于破坏的细胞谱系中的基因产物是特异性的，则用于表达dsRNA形成构建体的启动子可以是任何类型的启动子。或者，所述启动子的谱系特异性可在于其仅在特定发育谱系的细胞中表达。这在当用非靶细胞谱系中表达的基因观察到一些同源性重叠的情况下可能是有利的。该启动子也可通过外部控制因素或通过细胞内环境因素诱导。
在一些实施方案中，约21至约23个核苷酸的RNA分子可以用于介导RNAi，所述RNA分子引导切割其所对应的特异性mRNA，例如如Tuschl等在美国2002/0086356中所述的。此种21nt至23nt RNA分子可以包含3’羟基，可以是单链或双链(例如两个21nt至23nt RNA)的，其中所述dsRNA分子可以是平端的或者包含突出端(例如，5’、3’)。
在一些实施方案中，拮抗剂核酸分子是siRNA。siRNA可通过任何合适的方法制备。例如，可参照国际公开WO 02/44321，其公开了当与3’突出端碱基配对时能够序列特异性降解靶mRNA的siRNA，其通过引用并入本文。使用模拟由酶dicer产生的siRNA的合成短双链RNA，可以在哺乳动物细胞中实现序列特异性基因沉默。siRNA可以是化学或体外合成的，或者可以是在细胞内被加工成siRNA的短双链发夹状RNA(shRNA)的结果。合成siRNA通常使用算法和常规的DNA/RNA合成仪进行设计。供应商包括Ambion(Austin，Tex.)、ChemGenes(Ashland，Mass.)、Dharmacon(Lafayette，Colo.)、Glen Research(Sterling，Va.)、MWBBiotech(Esbersberg，Germany)、Proligo(Boulder，Colo.)和Qiagen(Vento，TheNetherlands)。也可以使用试剂盒(例如，Ambion的SILENCERTM siRNA构建试剂盒)在体外合成siRNA。
从载体产生siRNA更通常地通过短发夹RNA(shRNA)的转录实现。例如，用于产生含shRNA载体的试剂盒是可用的，例如Imgenex的GENESUPPRESSORTM构建试剂盒和Invitrogen的BLOCK-ITTM诱导型RNAi质粒和慢病毒载体。此外，用于配制siRNA和向对象递送siRNA的方法也是本领域中公知的。例如，参见US 2005/0282188、US 2005/0239731、US 2005/0234232、US 2005/0176018、US 2005/0059817、US 2005/0020525、US 2004/0192626、US2003/0073640、US 2002/0150936、US 2002/0142980和US 2002/0120129，其各自通过引用并入本文。
说明性RNAi分子(例如，LSD(例如，LSD1或LSD2)siRNA和shRNA)在本领域中进行了描述(例如，Yang等，2010.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107：21499-21504和He等，2012.Transcription 3：3：1-16)或者可商购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(SantaCruz，CA，USA)和OriGene Technologies，Inc.(Rockville，MD，USA)。
本发明还考虑基于肽或多肽的抑制剂化合物。例如，BHC80(也称为PHD指蛋白21A)与LSD1形成复合物的一部分，并且可以抑制LSD1脱甲基酶活性。因此，本发明还考虑使用BHC80或其生物学活性片段来抑制LSD1酶促活性。BHC80多肽的氨基酸序列以及编码BHC80多肽的核苷酸序列是公开可用的。在这方面，可以参考例如对于智人(Homo sapiens)BHC80氨基酸序列，GenBank登录号：NP057705；和对于编码GenBank登录号：NP057705中所示氨基酸序列的核苷酸序列，GenBankNM016621；2)对于小家鼠(mus musculus)BHC80氨基酸序列，GenBank登录号：NP620094；和对于编码GenBank登录号：NP620094中所示氨基酸序列的核苷酸序列，GenBank登录号：NM138755；3)对于原鸡(Gallus gallus)BHC80氨基酸序列，GenBank登录号：NP00118576.1；和对于编码GenBank登录号：NP00118576.1中所示氨基酸序列的核苷酸序列，GenBank登录号：NM001199647；以及4)对于牛(Bos taurus)BHC80氨基酸序列，GenBank登录号：DAA21793。
说明性BHC80多肽选自：(1)包含以下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与上述GenBank BHC80多肽记录中任一项所列的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性；(2)包含以下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与上述GenBank BHC80多肽记录中任一项所列的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性；(3)包含由以下核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽，所述核苷酸序列在至少低、中等或高严格条件下与上述GenBank BHC80多核苷酸记录中任一项所列的核苷酸序列杂交；(4)包含由以下核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽，所述核苷酸序列与上述GenBank BHC80多核苷酸记录中任一项所列的核苷酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性；以及(5)根据(1)至(4)中任一项的多肽的片段，其抑制LSD1酶促活性。
BHC80多肽可以通过以下过程引入到细胞中：通过递送多肽本身或者通过将包含编码BHC80多肽之核苷酸序列的BHC80核酸引入细胞中。在一些实施方案中，BHC80核酸包含选自以下的核苷酸序列：(1)在上述GenBank BHC80多核苷酸记录中任一项所列的BHC80核苷酸序列；(2)与(1)中所提及的序列中任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核苷酸序列；(3)在至少低、中等或高严格条件下与(1)中所提及的序列杂交的核苷酸序列；(4)编码以下氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列列于上述GenBank BHC80多肽记录的任一项中；(5)编码以下氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列与(4)中所提及的序列中任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性；以及编码以下氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列与(4)中所提及的序列中任一个具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
BHC80核酸可以是重组表达载体的形式。BHC80核苷酸序列可以有效与表达载体中的转录控制元件(例如，启动子)连接。合适的载体包括：例如，重组逆转录病毒、慢病毒和腺病毒；逆转录病毒表达载体、慢病毒表达载体、核酸表达载体以及质粒表达载体。在一些情况下，表达载体整合到细胞的基因组中。在另一些情况下，表达载体在细胞中保持为附加体状态。
合适的表达载体包括但不限于，病毒载体，例如，基于以下病毒的病毒载体：痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒(例如，参见，Li等，Invest Opthalmol V is Sci 35：25432549，1994；Borras等，Gene Ther 6：515 524，1999；Li和Davidson，PNAS 92：7700 7704，1995；Sakamoto等，H Gene Ther 5：1088 1097，1999；WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)、腺相关病毒(例如，参见，Ali等，HumGene Ther 9：8186，1998，Flannery等，PNAS 94：6916 6921，1997；Bennett等，InvestOpthalmol V is Sci 38：2857 2863，1997；Jomary等，Gene Ther 4：683 690，1997，Rolling等，Hum Gene Ther 10：641 648，1999；Ali等，Hum Mol Genet.5：591 594，1996；WO93/09239中的Srivastava，Samulski等，J.Vir.(1989)63：3822-3828；Mendelson等，Virol.(1988)166：154-165；以及Flotte等，PNAS(1993)90：10613-10617)、SV40、单纯性疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(例如，参见，Miyoshi等，PNAS 94：10319 23，1997；Takahashi等，J Virol73：7812 7816，1999)、逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和来自于逆转录病毒(例如，劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)的载体)等。
本发明还考虑了降低LSD(例如，LSD1或LSD2)酶促活性的小分子试剂。
适用于本发明的降低LSD1酶促活性的小分子试剂包括还抑制LSD1酶促活性的单胺氧化酶(MAO)抑制剂；抑制LSD1酶促活性的聚胺化合物；抑制LSD1酶促活性的苯基环丙胺衍生物；等。
MAO抑制剂的非限制性实例包括MAO-A选择性抑制剂、MAO-B选择性抑制剂和MAO非选择性抑制剂。MAO抑制剂的说明性实例包括报道的MAO-A同工型抑制剂(其优先使5-羟色胺(血清素)(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)脱氨基)，和/或MAO-B同工型抑制剂(其优先使苯乙胺(PEA)和苄胺(MAO-A和MAO-B代谢多巴胺(DA)二者)脱氨基)。在多个实施方案中，MAO抑制剂可以是不可逆或可逆的(例如，MAO-A的可逆抑制剂(RIMA))，并且对MAO-A和/或MAO-B具有不同的效力(例如，非选择性双重抑制剂或同工型选择性抑制剂)。
在一些实施方案中，MAO抑制剂选自：氯吉灵；L-丙炔苯丙胺；异卡波肼(MarplanTM)；死藤水；烟肼酰胺；异丙烟肼；异丙氯肼；吗氯贝胺(AurorixTM、4-氯-N-(2-吗啉-4-基乙基)苯甲酰胺)；苯乙肼(NardilTM、(±)-2-苯基乙基肼)；反苯环丙胺(ParnateTM、(±)-反-2-苯基环丙烷-1-胺)(苯乙肼的同类)；托洛沙酮；左旋丙炔苯丙胺(levo-deprenyl)(SelegilineTM)；骆驼蓬(harmala)；RIMA(例如，吗氯贝胺，描述于Da Prada等(1989.J Pharmacol Exp Ther 248：400-414))；溴法罗明；和贝氟沙通(描述于Curet等(1998.J Affect Disord 51：287-30))；拉扎贝胺(Ro 19 6327)(描述于Ann.Neurol.，40(1)：99-107(1996))；和SL25.1131(描述于Aubin等(2004.J.Pharmacol.Exp.Ther.310：1171-1182))；盐酸司来吉兰(1-丙炔苯丙胺、ELDEPRYL、ZELAPAR)；二甲基司来吉兰(dimethylselegilene)；沙芬酰胺；雷沙吉兰(AZILECT)；二苯美伦；脱氧鸭嘴花碱(desoxypeganine)；骆驼蓬碱(也称为南美卡皮根碱或banasterine)；利奈唑胺(ZYVOX、ZYVOXID)；帕吉林(EUDATIN、SUPIRDYL)；二氧烯醇酯卡瓦吡喃酮去甲氧基麻醉椒素(dienolide kavapyrone desmethoxyyangonin)；5-(4-芳基甲氧基苯基)-2-(2-氰基乙基)四唑；等。
小分子LSD1抑制剂也可以选自例如由Woster等在美国公开No.2007/0208082(其通过引用整体并入本文)中所述的聚胺化合物。LSD1的说明性聚胺抑制剂包括根据式(I)的化合物或其盐、溶剂合物或水合物：
其中n是1至12的整数；m和p独立地为1至5的整数；q是0或1；每个R1独立地选自C1-C8烷基、C4-C15环烷基、C3-C15支链烷基、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C7-C24芳烷基、C7-C24杂芳烷基，和
其中R3选自C1-C8烷基、C4-C15环烷基、C3-C15支链烷基、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C7-C24芳烷基和C7-C24杂芳烷基，并且
每个R2独立地选自氢或C1-C8烷基。
合适的聚胺化合物是式(I)的化合物，其中一个或两个R1为C6-C20芳基，例如单环芳基，包括但不限于苯基。在一个实施方案中，该化合物是式(I)的化合物，并且每个R1是苯基。在一个实施方案中，q是1，m和p是3，并且n是4。在另一个实施方案中，q是1，m和p是3，并且n是7。
合适的聚胺化合物是式(I)的化合物，其中至少一个或两个R1为C8-C12或C1-C8烷基，例如直链烷基(linear alkyl)。一个或两个R1可以是C1-C8直链烷基，例如甲基或乙基。在一个实施方案中，每个R1是甲基。一个或两个R1可以包含或者可以是C4-C15环烷基，例如包含直链烷基的环烷基，其中所述环烷基通过其烷基或环烷基部分与分子相连接。例如，一个或两个R1都可以是环丙基甲基或环己基甲基。在一个实施方案中，一个R1为环丙基甲基或环己基甲基，而另一个R1是直链烷基，例如直链C1-C8未取代的烷基，包括但不限于乙基。在一个实施方案中，R1是C3-C15支链烷基，例如异丙基。当R1是C1-C8经取代的烷基时，经取代的烷基可被任何取代基(包括伯胺、仲胺、叔胺或季胺)取代。因此，在一个实施方案中，R1是被胺取代的C1-C8烷基，以使得R1可以是例如烷基-NH2或烷基-胺-烷基部分，例如-(CH2)yNH(CH2)zCH3，其中y和z独立地为1至8的整数。在一个实施方案中，R1是-(CH2)3NH2。
在一个实施方案中，化合物是式(I)的化合物，其中一个或两个R1是C7-C24经取代或未取代的芳烷基，其在一个实施方案中是通过其烷基部分(例如，苄基)与分子相连接的芳烷基。在一个实施方案中，两个R1都是芳烷基部分，其中所述部分的烷基部分被两个芳基取代，且所述部分通过其烷基与分子相连接。例如，在一个实施方案中，一个或两个R1是C7-C24芳烷基，其中烷基部分被两个苯基取代，例如当R1是2，2-二苯基乙基或2，2-二苄基乙基时。在一个实施方案中，式(I)的两个R1都是2，2-二苯基乙基且n为1、2或5。在一个实施方案中，式(I)的每个R1均为2，2-二苯基乙基，n是1、2或5，且m和p各自为1。
在一个实施方案中，至少一个R1是氢。当一个R1是氢时，另一个R1可以是上述列出的R1的任何一部分，包括芳基，例如苄基。上述列出的任何式(I)的化合物包括其中至少一个或两个R2是氢或者C1-C8经取代或未取代烷基的化合物。在一个实施方案中，每个R2均为未取代的烷基，例如甲基。在另一个实施方案中，每个R2均为氢。上述列出的任何式(I)的化合物可以是其中q为1且m和p相同的化合物。因此，式(I)的聚氨基胍(polyaminoguanidine)参照聚氨基胍中心(例如，不包括R1)可以是对称的。或者，式(I)的化合物可以是不对称的，例如，当q是0时。在一个实施方案中，m和p是1。在一个实施方案中，q是0。在一个实施方案中，n是1至5的整数。
在一些实施方案中，化合物是聚氨基双胍或N-烷基化聚氨基双胍。N-烷基化聚氨基双胍意指其中至少一个双胍的至少一个亚胺氮被烷基化的聚氨基双胍。在一个实施方案中，化合物是式(I)的聚氨基双胍、或其盐、溶剂合物或水合物，其中q是1，并且至少一个或每个R1为以下结构：
其中每个R3独立地选自C1-C8烷基、C6-C20芳基、C6-C20杂芳基、C7-C24芳烷基和C7-C24杂芳烷基，并且每个R2均独立地为氢或C1-C8烷基。
在一个实施方案中，在聚氨基双胍化合物中，至少一个或每个R3是C1-C8烷基。例如，当R3是C1-C8烷基时，该烷基可以被任意取代基取代，包括伯胺、仲胺、叔胺或季胺。因此，在一个实施方案中，R3是被胺取代的C1-C8烷基，以使得R3可以是例如烷基-NH2或烷基-胺-烷基部分，例如-(CH2)yNH(CH2)zCH3，其中y和z独立地为1至8的整数。在一个实施方案中，R3是-(CH2)3NH2。R3也可以是C4-C15环烷基或C3-C15支链烷基。在一个实施方案中，至少一个或每个R3是C6-C20芳基。在一个实施方案中，q是1，m和p是3并且n是4。在另一个实施方案中，q是1，m和p是3并且n是7。
在一个实施方案中，化合物是式(I)的聚氨基双胍，其中至少一个R3是C7-C24芳烷基，在一个实施方案中其是通过其烷基部分与分子相连接的芳烷基。在一个实施方案中，每个R3均为芳烷基部分，其中所述部分的烷基部分被一个或两个芳基取代，并且所述部分通过其烷基部分与分子相连接。例如，在一个实施方案中，至少一个或每个R3为其中烷基部分被两个苯基或苄基取代的芳烷基，例如，当R3是2，2-二苯基乙基或2，2-二苄基乙基时。在一个实施方案中，每个R3均为2，2-二苯基乙基且n为1、2或5。在一个实施方案中，每个R3均为2，2-二苯基乙基且n为1、2或5，m和p各自为1。
上述列出的任何式(I)的聚氨基双胍化合物包括其中至少一个或两个R2为氢或C1-C8烷基的化合物。在一个实施方案中，每个R2均为未取代的烷基，例如甲基。在另一个实施方案中，每个R2是氢。
上述列出的任何式(I)的聚氨基双胍化合物包括其中q为1，且m和p相同的化合物。因此，式(I)的聚氨基双胍可以是参照该聚氨基双胍中心对称的。或者，式(I)的化合物可以是不对称的。在一个实施方案中，m和p是1。在一个实施方案中，q是0。在一个实施方案中，n是1至5的整数。在一个实施方案中，q、m和p各自为1，且n是1、2或5。
通过本公开内容应该理解和清楚传达的是，参照式(I)公开的每个R1、R2、R3、m、n、p和q意指并包括其所有组合，如同R1、R2、R3、m、n、p和q的每个组合被具体和单独地列出一样。
代表性的式(I)的化合物包括，例如：
在某些实施方案中，聚胺化合物由根据式(II)的结构：
或者其盐、溶剂合物或水合物表示，
其中n是1、2或3；
每个L独立地是长度为约2至14个碳，例如长度为约2、3、4、5、6、8、10、12或14个碳的接头(linker)，其中所述接头的骨架原子可以是饱和或不饱和的，通常不多于一个、二个、三个或四个不饱和原子存在于系链骨架(tether backbone)中，其中每个骨架原子均可以是经取代或未取代(例如，被C1-C8烷基取代)的，其中接头骨架可包括环状基团(例如，环己-1，3-二基(cyclohex-1，3-diyl group)，其中所述环的3个原子包含在骨架中)；
每个R12均独立地选氢和C1-C8烷基；并且
每个R11均独立地选自：氢；C2-C8烯基；C1-C8烷基或C3-C8支链烷基(例如，甲基、乙基、叔丁基、异丙基、戊基、环丁基、环丙基甲基、3-甲基丁基、2-乙基丁基、5-NH2-戊-1-基、丙基-1-基甲基(苯基)次膦酸盐、二甲基二环[3.1.1]庚基)乙基、2-(十氢萘基)乙基等)；C6-C20芳基或杂芳基；C1-C24芳烷基或杂芳烷基(2-苯基苄基、4-苯基苄基、2-苄基苄基、3-苄基苄基、3，3-二苯基丙基、3-(苯并咪唑基)-丙基、4-异丙基苄基、4-氟苄基、4-叔丁基苄基、3-咪唑基-丙基，2-苯乙基等)；-C(＝O)-C1-C8烷基；-C(＝O)-C1-C8烯基；-C(＝O)-C1-C8炔基；氨基取代的环烷基(例如，被伯胺、仲胺、叔胺或季胺取代的环烷基，例如5-NH2-环庚基、3-NH2-环戊基等)和C2-C8烷酰基(例如，被甲基和烷基叠氮基(alkylazide group)取代的烷酰基)。
在某些实施方案中，每个L均独立地选自：-CHR13-(CH2)m-、-CHR13-(CH2)n-CHR13-、-(CH2)mCHR13-、-CH2-A-CH2-和-(CH2)P-，
其中：
m为1至5的整数；
A是(CH2)m、乙烷-1，1-二基或环己-1，3-二基；
p是2至14的整数，例如1、2、3、4或5；
n是1至12的整数；并且
R13是C1-C8烷基。
参照式(II)的经取代芳烷基或杂芳烷基意指并包括被芳基或杂芳基取代的烷酰基部分(即，-C(＝O)-芳基、-C(＝O)-芳烷基、-C(＝O)-杂芳基和-C(＝O)-杂芳烷基)。在一个实施方案中，芳烷基或杂芳基部分的烷基部分通过其烷基部分与分子相连接。例如，至少一个或两个R11可以是芳烷基部分，例如，2-苯基苄基、4-苯基苄基、3，3-二苯基丙基、2-(2-苯基乙基)苄基、2-甲基-3-苯基苄基、2-萘基乙基、4-(芘基)丁基、2-(3-甲基萘基)乙基、2-(1，2二氢苊-4-基)乙基等。在另一个实施方案中，至少一个或两个R11可以是杂芳基烷基部分，例如3-(苯并咪唑基)丙酰基、1-(苯并咪唑基)甲酰基、2-(苯并咪唑基)乙酰基、2-(苯并咪唑基)乙基等。
在某些实施方案中，式(II)的化合物包括选自以下的至少一个部分：叔丁基、异丙基、2-乙基丁基、1-甲基丙基、1-甲基丁基、3-丁烯基、异戊-2-烯基、2-甲基-3-丙醇基(2-methylpropan-3-olyl)、含硫乙基(ethyl thiyl)、含硫苯基(phenylthiyl)、丙酰基、1-甲基-1H-吡咯-2-基、三氟甲基、环丙烷甲醛、卤素取代的苯基、硝基取代的苯基、烷基取代的苯基、2，4，6-三甲基苄基、卤素-5-取代的苯基(例如对-(F3S)-苯基、叠氮基和2-甲基丁基。
在某些实施方案中，在式(II)中，每个R11均独立地选自氢、正丁基、乙基、环己基甲基、环戊基甲基、环丙基甲基、环庚基甲基、环己乙-2-基和苄基。
在某些实施方案中，聚胺化合物是式(II)的结构，其中n是3，以使得该化合物具有根据式(III)的结构：
其中L1、L2和L3独立地选自-CHR13-(CH2)m-、-CHR13-(CH2)n-CHR13-、-(CH2)m-CHR13-、-CH2-A-CH2-和-(CH2)P-，
其中m、A、p、n和R13如上所限定。
在某些实施方案中，聚胺化合物是式(III)的结构，其中：L1是-CHR13-(CH2)m-；L2是-CHR13-(CH2)n-CHR13-；并且L3是-(CH2)m-CHR13-；其中R11、R12、R13、m和n如上所限定。
在某些实施方案中，聚胺化合物是式(III)的结构，其中：L1、L2和L3独立地为-CH2-A-CH2-；且R12是氢；其中R11和A如上所限定。在一些具体实施方案中，A和R11的至少一个包含烯基部分。
在某些实施方案中，聚胺化合物是式(III)的结构，其中：L1、L2和L3独立地为-(CH2)p-，其中p如上所限定；并且R12是氢。在一些具体实施方案中，对于L1和L3，p是3至7的整数；对于L3，p是3至14的整数。
在某些实施方案中，聚胺化合物是式(III)的结构，其中：L1和L3独立地为-(CH2)p-；L2是-CH2-A-CH2-；且R12是氢；其中R12、p和A如上所限定；在一些具体实施方案中，对于L1和L3，p是2至6的整数；对于L3，A是(CH2)x(其中x是1至5的整数)或环己-1，3-二基。
在某些实施方案中，聚胺化合物是式(II)的结构，其中n是2，以使得该化合物具有根据式(IV)的结构：
其中L1和L2独立地选自：-CHR13-(CH2)m-CHR13-(CH2)n-CHR13-、-(CH2)n、CHR13-、-CH2-A-CH2-和-(CH2)P-，
其中m、A、p、n和R13如上所限定。
在某些实施方案中，聚胺化合物是式(IV)的结构，其中：L1是-(CH2)p-；且L2是-(CH2)m-CHR13-；其中R13、m和p如上所限定。在一些具体实施方案中，对于L1，p是3至10的整数；对于L2，n是2至9的整数。
在某些实施方案中，聚胺化合物是式(IV)的结构，其中：L1和L2是-(CH2)p-；其中p如上所限定。在一些具体实施方案中，p是3至7的整数。
在某些实施方案中，聚胺化合物是式(II)的结构，其中n是1，以使得该化合物具有根据式(V)的结构：
其中L1是-(CH2)p-，其中p如上所限定。在一些具体实施方案中，p是2至6的整数。
在一些具体实施方案中，在式(V)中，一个R11是经氨基取代的环烷基(例如，被伯胺、仲胺、叔胺或季胺取代的环烷基)或C2-C8烷酰基(该烷酰基可以被一个或更多个取代基(例如甲基或烷基叠氮基)取代)；并且另一个R11是C1-C8烷基或C7-C24芳烷基。
代表性的式(II)化合物包括，例如：
α-甲基CHENspm
作为抑制剂的苯基环丙胺衍生物包括由式(VI)表示的化合物：
其中：
R1-R5各自独立地选自：H、卤素、烷基、烷氧基、环烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、-L-芳基、-L-杂环基、-L-碳环基、酰基氨基、酰氧基、烷硫基、环烷硫基、炔基、氨基、烷基氨基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳硫基、氰基、氰氧基(cyanato)、卤代芳基、羟基、杂芳氧基、杂芳基烷氧基、异氰酸基(isocyanato)、异硫氰酸盐/酯、硝基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、硫代氰氧基、三卤代甲烷亚磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基和C-酰氨基；
R6是H或烷基；
R7是H、烷基或环烷基；
R8是-L-杂环基，其中所述-L-杂环基的环或环系统具有0至3个选自以下的取代基：卤素、烷基、烷氧基、环烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、-L-芳基、-L-杂环基、-L-碳环基、酰基氨基、酰氧基、烷硫基、环烷硫基、炔基、氨基、烷基氨基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳硫基、氰基、氰氧基、卤代芳基、羟基、杂芳氧基、杂芳基烷氧基、异氰酸基、异硫氰酸盐/酯、硝基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、硫代氰氧基、三卤代甲烷亚磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基和C-酰氨基；或者
R8是-L-芳基，其中所述-L-芳基的环或环系统具有1至3个选自以下的取代基：卤素、烷基、烷氧基、环烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、-L-芳基、-L-杂环基、-L-碳环基、酰基氨基、酰氧基、烷硫基、环烷硫基、炔基、氨基、烷基氨基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳硫基、氰基、氰氧基、卤代芳基、羟基、杂芳氧基、杂芳基烷氧基、异氰酸基、异硫氰酸盐/酯、硝基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、硫代氰氧基、三卤代甲烷亚磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基和C-酰氨基；
其中每个L均独立地选自：-(CH2)n-(CH2)n-、-(CH2)nNH(CH2)n-、-(CH2)nO(CH2)n-和-(CH2)nS(CH2)n-，且其中每个n均独立地选自0、1、2和3；
或其可药用盐。
在一些情况下，L是共价键。在一些情况下，R6和R7是氢。在一些情况下，R1-R5中的一个选自：-L-芳基、-L-杂环基和-L-碳环基。
在式(VI)化合物的一些实施方案中，R8环或环系统上的取代基选自：羟基、卤素、烷基、烷氧基、环烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、-N(C1-3烷基)2、-NH(C1-3烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(C1-3烷基)、-C(＝O)N(C1-3烷基)2、-S(＝O)2(C1-3烷基)、-S(＝O)2NH2、-S(O)2NH2、-S(O)2N(C1-3烷基)2、-S(＝O)2NH(C1-3烷基)、-CN、-NH2和-NO2。
在某些实施方案中，本发明的化合物是式(VI)的化合物，其中：
R1-R5各自是任选地经取代的，并且独立地选自：-H、卤素、烷基、烷氧基、环烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、-L-芳基、-L-杂芳基、-L-杂环基、-L-碳环基、酰基氨基、酰氧基、烷硫基、环烷硫基、炔基、氨基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳硫基、氰基、氰氧基、卤代芳基、羟基、杂芳氧基、杂芳基烷氧基、异氰酸基、异硫氰酸基(isothiocyanato)、硝基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、硫代氰氧基、三卤代甲烷亚磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基和C-酰氨基；
R6选自-H和烷基；
R7选自-H、烷基和环烷基；
R8选自-C(＝O)NRxRy和-C(＝O)Rz；
Rx当存在时选自-H、烷基、炔基、烯基、-L-碳环基、-L-芳基和-L-杂环基，所有的这些都是任选地经取代的(除了-H)；
Ry当存在时选自-H、烷基、炔基、烯基、-L-碳环基、-L-芳基和-L-杂环基，所有的这些都是任选地经取代的(除了-H)，其中Rx和Ry可以是环状连接的；
Rz当存在时选自-H、烷氧基、-L-碳环基、-L-杂环基、-L-芳基，其中所述芳基、杂环基或碳环基是任选地经取代的；每个L均为将式I之主骨架与碳环基、杂环基或芳基连接的接头，其中所述接头-L-的烃部分是饱和的、部分饱和的或不饱和的，并且独立地选自具有下式的饱和母体基团：-(CH2)n-(CH2)n-、-(CH2)nC(＝O)(CH2)-、-(CH2)nC(＝O)NH(CH2)n-、-(CH2)nNHC(O)O(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝O)NH(CH2)n-、-(CH2)nNHC(＝S)S(CH2)n-、-(CH2)nOC(＝O)S(CH2)n-、-(CH2)nNH(CH2)n-、-(CH2)n-O-(CH2)n-、-(CH2)nS(CH2)n-和-(CH2)nNHC(＝S)NH(CH2)n-，其中每个n均独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7和8。根据该实施方案，任选地经取代是指0或1至4个任选的取代基，所述取代基独立地选自：酰基氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、环烷氧基、烷基、烷硫基、环烷硫基、炔基、氨基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳硫基、碳环基、氰基、氰氧基、卤素、卤代烷基、卤代芳基、羟基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂芳基烷氧基、异氰酸基、异硫氰酸基、硝基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、硫代氰氧基、三卤代甲烷亚磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基和C-酰氨基。在该实施方案的一个更具体方面中，任选的取代基是1或2个选自卤素、烷基、芳基和芳烷基的任选取代基。
在某些实施方案中，在式(VI)中，R8是-CORz，以使得该化合物为以下结构：
其中：R1-R7如上所述；且Rz是任选地被1至4个任选的取代基取代的-L-杂环基，所述取代基独立地选自：酰基氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、环烷氧基、烷基、烷硫基、环烷硫基、炔基、氨基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、芳基烷氧基、芳氧基、芳硫基、杂芳硫基、碳环基、氰基、氰氧基、卤素、卤代烷基、卤代芳基、羟基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂芳基烷氧基、异氰酸基、异硫氰酸基、硝基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、硫代羰基、硫代氰氧基、三卤代甲烷亚磺酰氨基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基和C-酰氨基，并且其中所述-L-独立地选自：-(CH2)n-(CH2)n-、-(CH2)nNH(CH2)n-、-(CH2)n-O-(CH2)n-和-(CH2)nS(CH2)n-，其中每个n均独立地选自0、1、2和3。
在本实施方案的一个具体方面中，每个L均独立地选自-(CH2)n-(CH2)n-和-(CH2)n-O-(CH2)n，其中每个n均独立地选自0、1、2和3。在本实施方案的一个更具体的方面中，每个L均选自：键、-CH2-、-CH2CH2-、-OCH2-、-OCH2CH2-、-CH2OCH2-、-CH2CH2CH2-、-OCH2CH2CH2-和-CH2OCH2CH2-。在一个甚至更具体的方面中，每个L选自：键、-CH2-、-CH2CH2-、-OCH2-和-CH2CH2CH2-。在又一个甚至更具体的方面中，L选自键和-CH2-。
式(VI)的示例性化合物包括：
式(VI)的示例性化合物包括：N-环丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺；2-[(反式)-2-苯基环丙基]氨基乙酰胺；N-环丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酰胺；2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}-N-丙-2-炔基乙酰胺；N-异丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺；N-(叔丁基)-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺；N-(2-吗啉-4-基-2-氧代乙基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺；2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酰胺；2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酸甲酯；N-环丙基-2-{甲基[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺；2-{甲基[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺；N-甲基-反式-2-(苯基环丙基氨基)丙酰胺；1-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)乙酮；1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)乙酮；1-(4-苄基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)-乙酮；2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)-1-(4-苯基哌嗪-1-基)乙酮；2-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；2-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)-N-环丙基乙酰胺；2-((反式)-2-(4-(3-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；2-((反式)-2-(4-(3-氯苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；2-((反式)-2-(联苯-4-基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；1-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-(4-苯乙氧基苯基)环丙基氨基)乙酮；2-((反式)-2-(4-(4-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；2-((反式)-2-(4-(联苯-4-基甲氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；(反式)-N-(4-氟苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(4-氟苄基)-2-苯基环丙铵；4-(((反式)-2-苯基环丙基氨基)甲基)苄腈；(反式)-N-(4-氰基苄基)-2-苯基环丙铵；(反式)-2-苯基-N-(4-(三氟甲基)苄基)环丙胺；(反式)-2-苯基-N-(4-(三氟甲基)苄基)环丙铵；(反式)-2-苯基-N-(吡啶-2-基甲基)环丙胺；(反式)-2-苯基-N-(吡啶-3-基甲基)环丙胺；(反式)-2-苯基-N-(吡啶-4-基甲基)环丙胺；(反式)-N-((6-甲基吡啶-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-2-苯基-N-(噻唑-2-基甲基)环丙胺；(反式)-2-苯基-N-(噻吩-2-基甲基)环丙胺；(反式)-N-((3-溴噻吩-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((4-溴噻吩-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(3，4-二氯苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(3-氟苄基)-2-苯基环丙铵；(反式)-N-(2-氟苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-2-苯基-N-(喹啉-4-基甲基)环丙胺；(反式)-N-(3-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-2-苯基-N-((6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲基)环丙胺；(反式)-N-((6-氯吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((4-甲基吡啶-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((6-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺；2-(((反式)-2-苯基环丙基氨基)甲基)吡啶-3-醇；(反式)-N-((6-溴吡啶-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺；4-(((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)甲基)苄腈；(反式)-N-(4-(苄氧基)苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-苄基-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙胺；(反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)-N-(4-甲氧基苄基)环丙胺；(反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)-N-(4-氟苄基)环丙胺；(反式)-2-苯基-N-(喹啉-2-基甲基)环丙胺；(反式)-2-苯基-N-((5-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲基)环丙胺；(反式)-N-((3-氟吡啶-2-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-2-苯基-N-(喹啉-3-基甲基)环丙胺；(反式)-N-((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((5-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((2-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((3H-吲哚-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺；3-(((反式)-2-苯基环丙基氨基)甲基)苄腈；(反式)-N-(2-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；3-(((反式)-2-苯基环丙基氨基)甲基)吡啶-2-胺；(反式)-N-((2-氯吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(3，4-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((2，3-二氢苯并呋喃-5-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧杂环己二烯-6-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(2，6-二氟-4-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-2-苯基-N-(4-(三氟甲氧基)苄基)环丙胺；(反式)-N-(5-氟-2-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(2-氟-4-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((4-甲氧基萘-1-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(2-氟-6-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((2-甲氧基萘-1-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((4，7-二甲氧基萘-1-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(4-甲氧基-3-甲基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(3-氯-4-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(3-氟-4-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(4-甲氧基-2-甲基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚-6-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚-7-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((2，2-二甲基色满-6-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(4-甲氧基-2，3-二甲基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(4-甲氧基-2，5-二甲基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(2-氟-4，5-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(3-氯-4，5-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(2-氯-3，4-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(2，4-二甲氧基-6-甲基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(2，5-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(2，3-二甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(2-氯-3-甲氧基苄基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((1H-吲哚-5-基)甲基)-2-苯基环丙胺；(反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)-N-(吡啶-2-基甲基)环丙胺；(反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)-N-(2-甲氧基苄基)环丙胺；(反式)-N-(1-(4-甲氧苯基)乙基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(1-(3，4-二甲氧基苯基)乙基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(1-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧杂环己二烯-6-基)乙基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(1-(5-氟-2-甲氧基苯基)乙基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(1-(3，4-二甲氧基苯基)丙-2-基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-((3-甲基-1，2，4-二唑-5-基)甲基)-2-苯基环丙胺；
及其可药用盐。
替选的小分子LSD抑制剂化合物可选自例如在以下中公开的选择性LSD1和LSD1/MAOB双重抑制剂：WO2010/043721(PCT/EP2009/063685)；WO2010/084160(PCT/EP2010/050697)；PCT/EP2010/055131；PCT/EP2010/055103；和EP申请号EP10171345，所有的这些都明确地通过引用以不与本公开内容相矛盾的程度整体并入本文。这种类型的代表性化合物包括苯基环丙胺衍生物或同系物，其说明性实例包括在胺基上具有一或两个取代的苯基环丙胺；在胺基上具有零、一或两个取代以及在苯基上具有一、二、三、四或五个取代的苯基环丙胺；在苯基上具有一、二、三、四或五个取代的苯基环丙胺；在胺基上具有零、一或两个取代的苯基环丙胺，其中PCPA的苯基被选自芳基或杂环基的另一个环系统取代(交换)，以提供在胺基上具有零、一或两个取代基的芳基环丙胺或杂芳基环丙胺；其中PCPA的苯基被选自芳基或杂环基的另一个环系统取代(交换)以提供芳基环丙胺或杂环基环丙胺的苯基环丙胺，其中在所述芳基或杂环基部分上的所述芳基环丙胺或杂环环丙胺在胺基上具有零、一或两个取代以及在苯基上具有一、二、三、四或五个取代；在苯基上具有一、二、三、四或五个取代的苯基环丙胺；或者上述苯基环丙胺类似物或衍生物中的任一种，其中所述环丙基具有一、二、三或四个额外的取代基。适当地，本段中的上述杂环基是杂芳基。
苯基环丙胺衍生物或类似物的非限制性实施方案包括“环丙胺酰胺”衍生物和“环丙胺”衍生物。“环丙胺乙酰胺”衍生物的具体实例包括但不限于：N-环丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺；2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺；N-环丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酰胺；2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}-N-丙-2-炔基乙酰胺；N-异丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺；N-(叔丁基)-2-{[(反式)-2-苯基环丙基1氨基}乙酰胺；N-(2-吗啉-4-基-2-氧代乙基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺；2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酰胺；2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}丙酸甲酯；1-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)乙酮；1-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)乙酮；1-(4-苄基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)乙酮；2-((反式)-2-苯基环丙基氨基)-1-(4-苯基哌嗪-1-基)乙酮；2-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1基)乙酮；2-((反式)-2-(1，1’-联苯-4-基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；2-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)-N-环丙基乙酰胺；2-((反式)-2-(4-(3-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；2-((反式)-2-(4-(4-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；2-((反式)-2-(4-(3-氯苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；1-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((反式)-2-(4-苯乙氧基苯基)环丙基氨基)乙酮；2-((反式)-2-(联苯-4-基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；N-环丙基-2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺；N-甲基-反式-2-(苯基环丙基氨基)丙酰胺；2-{甲基[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙酰胺；N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺；N-环丙基-N’-[(反式)-2-苯基环丙基]乙烷-1，2-二胺；N，N-二甲基-N’-(2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙基)乙烷-1，2-二胺；(3R)-1-(2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙基)吡咯烷-3-胺；(3S)-N，N-二甲基-1-(2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙基)吡咯烷-3-胺；(3R)-N，N-二甲基-1-(2-{[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}乙基)吡咯烷-3-胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(2-哌嗪-1-基乙基)胺；N，N-二乙基-N’-[(反式)-2-苯基环丙基]乙烷-1，2-二胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(2-哌啶-1-基乙基)胺；(反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)环丙胺；(反式)-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)-2-(3’(三氟甲基)联苯-4-基)环丙胺；(反式)-2-(3’-氯联苯-4-基)-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)环丙胺；(R)-1-(2-((反式)-2-(3’-(三氟甲基)联苯-4-基)环丙基氨基)乙基)吡咯烷-3-胺；和N1-环丙基-N2-((反式)-2-(3＇-(三氟甲基)联苯-4-基)环丙基)乙烷-1，2-二胺。
“环丙胺”衍生物的具体实例包括但不限于：N-4-氟苄基-N-{(反式)-2-[4-(苄氧基)苯基]环丙基}胺；N-4-甲氧基苄基-N-{(反式)-2-[4-(苄氧基)苯基]环丙基}胺；N-苄基-N-{(反式)-2-[4-(苄氧基)苯基]环丙基}胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]氨基甲基)吡啶-3-醇；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(3-甲基吡啶-2-基甲基)胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(4-氯吡啶-3-基甲基)胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(4-三氟甲基吡啶-3-基-甲基)胺；N-(3-甲氧基苄基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(喹啉-4-基甲基)胺；N-(2-氟苄基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺；N-(3-氟苄基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(3，4-二氯-1-苯基甲基)胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(5-溴-噻吩-2-基甲基)胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(3-溴-噻吩-2-基甲基)-胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(噻吩-2-基甲基)胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(1，3-噻唑-2-基甲基)胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(3-甲基-吡啶-2-基甲基)胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(吡啶-4-基甲基)胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(吡啶-3-基甲基)胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(吡啶-2-基甲基)胺；[(反式)-2-苯基环丙基]-N-[4-(三氟甲基)苄基]胺；({[(反式)-2-苯基环丙基]氨基}甲基)苄腈；N-(4-氟苄基)-N-[(反式)-2-苯基环丙基]胺；N-[(反式)-2-苯基环丙基]-N-(3-溴-吡啶-2-基甲基)胺；N-4-氰基苄基-N-{(反式)-2-[4-(苄氧基)苯基]环丙基}胺；N-4-[(苄氧基)-苄基]-N-[(反式)-2-(4-苯基)环丙基]胺；2-((反式)-2-(4-(4-氰基苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺；2-((反式)-2-(4-(3-氰基苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺；2-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺；2-((反式)-2-(4-(4-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺；2-((反式)-2-(4-(3-氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺；2-((反式)-2-(4-(3-氯苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺；2-((反式)-2-(4-(4-氯苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺；2-((反式)-2-(4-(3-溴苄基氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺；2-((反式)-2-(4-(3，5-二氟苄氧基)苯基)环丙基氨基)乙酰胺；2-((反式)-2-(4-苯乙氧基苯基)环丙基氨基)乙酰胺；2-((反式)-2-(3＇-(三氟甲基)联苯-4-基)环丙基氨基)乙酰胺；和2-((反式)-2-(3＇-氯联苯-4-基)环丙基氨基)乙酰胺。
LSD1抑制剂的另一些实例是例如苯乙肼或帕吉林(炔丙基胺)或其衍生物或类似物。苯乙肼和帕吉林(炔丙基胺)的衍生物和类似物包括但不限于这样的化合物：其中该母体化合物的苯基基团被替换为杂芳基或任选取代的环状基团或者该母体化合物的苯基基团任选地被环状基团取代。在一个方面中，苯乙肼或帕吉林衍生物或其类似物具有如本文所述的选择性LSD1抑制活性或双重LSD1/MAOB抑制活性。在一些实施方案中，苯乙肼衍生物或类似物在苯基上具有一、二、三、四或五个取代基。在一个方面中，苯乙肼衍生物或者类似物具有用芳基或杂环基取代(交换)的苯基，其中所述芳基或杂环基具有零、一、二、三、四或五个取代基。在一个方面中，帕吉林衍生物或类似物在苯基上具有一、二、三、四或五个取代基。在一个方面中，帕吉林衍生物或类似物具有被芳基或杂环基取代(交换)的苯基，其中所述芳基或杂环基具有零、一、二、三、四或五个取代基。制备这类化合物的方法对本领域技术人员来说是已知的。
本发明还考虑例如由Binda等(2010.J.Am.Chem.Soc.132：6827-6833，其在此通过引用整体并入本文)所述的反苯环丙胺(tranylcypromine)衍生物作为LSD(例如，LSD1和/或LSD2)酶促功能抑制剂。这类化合物的非限制性实例包括：
或者，LSD1抑制剂化合物可选自由Benelkebir等(2011.Bioorg.Med.Chem.doi：10.1016/j.bmc.2011.02.017，其在此通过引用整体并入本文)所述的反苯环丙胺类似物。这种类型的代表性类似物(包括邻、间和对溴代类似物)包括：(1R，2S)-2-(4-溴代苯基)环丙胺盐酸盐(化合物4c)；(1R，2S)-2-(3-溴代苯基)环丙胺盐酸盐(化合物4d)；(1R，2S)-2-(2-溴代苯基)环丙胺盐酸盐(化合物4e)；(1R，2S)-2-(联苯-4-基)环丙胺盐酸盐(化合物4f)。
也可以参考由Culhane等(2010.J.Am.Chem.Soc.132：3164-3176，其在此通过引用整体并入本文)所公开的肽骨架化合物，其包括氯乙烯基、内环丙胺和肼官能团。由Culhane等公开的非限制性化合物包括：炔丙基-Lys-4；N-甲基炔丙基-Lys-4-H3-21；顺式-3-氯烯丙基-Lys-4-H3-21；反式-3-氯烯丙基-Lys-4 H3-21；外-环丙基-Lys-4 H3-21；内-环丙基-Lys-4 H3-21；内-二甲基环丙基-Lys-4；肼基-Lys-4 H3-21和肼基-Lys-4 H3-21。
可用于抑制LSD1的替代环丙胺化合物包括由Fyfe等在美国公开No.2013/0197013中公开的那些，其通过引用整体并入本文。LSD1的说明性环丙胺抑制剂(其被公开为选择性抑制LSD1)包括根据式(VI)I的化合物：
其中：
E是-N(R3)-、-O-，或-S-，或者是-X3＝X4-；
X1和X2独立地是C(R2)或N；
X3和X4当存在时独立地是C(R2)或N；
(G)是环基(cyclyl group)(如式(VII)中所示，所述环基(G)具有n个取代基(R1))；
每个(R1)独立地选自：烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸盐/酯、酰基或羧基；
每个(R2)独立地选自：-H、烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸盐/酯、酰基或羧基，其中每个(R2)基团具有1、2或3个独立选择的任选取代基或两个(R2)基团可以一起形成具有1、2或3个独立选择的任选取代基的杂环基或芳基，其中所述任选取代基独立地选自：烷基、烷酰基、杂烷基、杂环基、卤代烷基、环烷基、碳环基、芳基烷氧基、杂环基烷氧基、芳基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基、卤代烷氧基、氧代、酰氧基、羰基、羧基、甲酰氨基、氰基、卤素、羟基、氨基、氨基烷基、酰氨基烷基、酰氨基、硝基、硫醇、烷硫基、芳硫基、磺酰胺、亚硫酰基、磺酰基、脲或氨基甲酸盐/酯；
R3是-H或(C1-C6)烷基；
每个L1均独立地为亚烷基或杂亚烷基；并且
n是0、1、2、3、4或5，
或者其对映体、非对映体或混合物，或者其可药用盐或溶剂合物。
在一些实施方案中，式(VII)的化合物由式(VIII)表示：
其中：
X1是CH或N；(G)是环基；
每个(R1)均独立地选自：烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸盐/酯、酰基或羧基；
每个(R2)均独立地选自：烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸盐/酯、酰基或羧基，其中每个(R2)基团具有1、2或3个任选的取代基，其中所述任选的取代基独立地选自：烷基、烷酰基、杂烷基、杂环基、卤代烷基、环烷基、碳环基、芳基烷氧基、杂环基烷氧基、芳基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基、卤代烷氧基、氧代、酰氧基、羰基、羧基、甲酰氨基、氰基、卤素、羟基、氨基、氨基烷基、酰氨基烷基、酰氨基、硝基、硫醇、烷硫基、芳硫基、磺酰胺、亚硫酰基、磺酰基、脲或氨基甲酸盐/酯；
每个L1均独立地为亚烷基或杂亚烷基；
m是0、1、2或3；且n是0、1、2、3、4或5，前提条件是：当X1是-CH-且(G)是芳基时，独立地选择n和m以使得n+m大于零，
或者由其对映体、非对映体或混合物，或者其可药用盐或溶剂合物表示。
在另一些实施方案中，式(VII)的化合物由式(IX)表示：
其中：
(G)是环基；
每个(R1)均独立地选自：烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸盐/酯、酰基或羧基；
每个(R2)均独立地选自：烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸盐/酯、酰基或羧基，其中每个(R2)基团具有0、1、2或3个任选的取代基，其中所述任选的取代基独立地选自：烷基、烷酰基、杂烷基、杂环基、卤代烷基、环烷基、碳环基、芳基烷氧基、杂环基烷氧基、芳基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基、卤代烷氧基、氧代、酰氧基、羰基、羧基、甲酰氨基、氰基、卤素、羟基、氨基、氨基烷基、酰氨基烷基、酰氨基、硝基、硫醇、烷硫基、芳硫基、磺酰胺、亚硫酰基、磺酰基、脲或氨基甲酸盐/酯；
每个L1均独立地为亚烷基或杂亚烷基；m是0、1、2或3；并且
n是0、1、2、3、4或5，
或者由其对映体、非对映体或混合物，或者其可药用盐或溶剂合物表示。
在又一些实施方案中，式(VII)的化合物由式(X)表示：
其中：
E是-N(R3)-、-O-或-S-，或者是-X3＝X4-；
X1、X2、X3和X4独立地是C(R2)或N，前提条件是当E是-X3＝X4-时，X1、X2、X3和X4中的至少一个是N；
(G)是环基，每个(R1)均独立地选自：烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸盐/酯、酰基或羧基；
每个(R2)均独立地选自：烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸盐/酯、酰基或羧基，其中每个(R2)基团具有1、2或3个任选的取代基，其中所述任选的取代基独立地选自：烷基、烷酰基、杂烷基、杂环基、卤代烷基、环烷基、碳环基、芳基烷氧基、杂环基烷氧基、芳基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基、卤代烷氧基、氧代、酰氧基、羰基、羧基、甲酰氨基、氰基、卤素、羟基、氨基、氨基烷基、酰氨基烷基、酰氨基、硝基、硫醇、烷硫基、芳硫基、磺酰胺、亚硫酰基、磺酰基、脲或氨基甲酸盐/酯；
R3是-H或(C1-C6)烷基；每个L1是亚烷基或杂亚烷基；且n是0、1、2、3、4或5，
或者由其对映体、非对映体或混合物，或者其可药用盐或溶剂合物表示。
在又一些实施方案中，式(VII)的化合物由式(XI)表示：
其中：
X1、X2、X3和X4独立地是CH或N，条件是X1、X2、X3和X4中的至少一个是N；
(G)是环基，每个(R1)均独立地选自：烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸盐/酯、酰基或羧基；
每个(R2)均独立地选自：烷基、烯基、炔基、环基、-L1-环基、-L1-氨基、-L1-羟基、氨基、酰氨基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚硫酰基、磺酰基、磺酰胺、羟基、烷氧基、脲、氨基甲酸盐/酯、酰基或羧基，其中每个(R2)基团具有1、2或3个任选的取代基，其中所述任选的取代基独立地选自：烷基、烷酰基、杂烷基、杂环基、卤代烷基、环烷基、碳环基、芳基烷氧基、杂环基烷氧基、芳基、芳氧基、杂环氧基、烷氧基、卤代烷氧基、氧代、酰氧基、羰基、羧基、甲酰氨基、氰基、卤素、羟基、氨基、氨基烷基、酰氨基烷基、酰氨基、硝基、硫醇、烷硫基、芳硫基、磺酰胺、亚硫酰基、磺酰基、脲或氨基甲酸盐/酯；每个L1是亚烷基或杂亚烷基；
m是0、1、2或3；且n是0、1、2、3、4或5，
或者由其对映体、非对映体或混合物，或者其可药用盐或溶剂合物表示。
根据式(VII)的代表性化合物适当地选自：(反式)-2-(3’-(三氟甲基)联苯-4-基)环丙胺；(反式)-2-(三联苯-4-基)环丙胺；4’-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-4-醇；4’-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-3-醇；(反式)-2-(6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(3，5-二氯苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(4-氯苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(3-氯苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(4-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(4-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(3-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺；4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苄腈；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苄腈；(反式)-2-(6-对甲苯基吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-间甲苯基吡啶-3-基)环丙胺；4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯酚；4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯甲酰胺；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯甲酰胺；2-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯酚；(反式)-2-(6-(3-甲氧基-4-甲基苯基)吡啶-3-基)环丙胺；5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2-氟苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-氟苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-氟苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2-氟苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2，4-二氟苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2，4，6-三氟苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-氯苯酚；(反式)-2-(6-(2-氟-3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(5-氯噻吩-2-基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(5-甲基噻吩-2-基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(1H-吲哚-6-基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(苯并[b]噻吩-5-基)吡啶-3-基)环丙胺；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)-3-甲基吡啶-2-基)苯酚；(反式)-2-(6-(3-氯苯基)-5-甲基吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(5-甲基-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(4-氟-3-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(3-氟-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(2-氟-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺，(反式)-2-(6-(2-氟-3-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(3-氯-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(2-氯-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(3-甲氧基-5-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-甲氧基苄腈；5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2-甲基苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-氯苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)苯酚；(反式)-2-(6-(2-氟-5-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(3，5-双(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)乙酰胺；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)甲磺酰胺；(反式)-2-(6-(苯并[b]噻吩-2-基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(苯并[b]噻吩-3-基)吡啶-3-基)环丙胺；5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)噻吩-2-甲腈；(反式)-2-(6-(4-甲基噻吩-3-基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(2-氯-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(2-(4-氯苯基)-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺；4-(3-((反式)-2-氨基环丙基)-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-2-基)苯酚；4-(3-((反式)-2-氨基环丙基)-6-(3-(三氟甲基)苯基)-吡啶-2-基)苯甲酰胺；(反式)-2-(2-甲基-6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙胺；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-羟基苄腈；(反式)-2-(6-(3，4-二氟-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺；5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2，3-二氟苯酚；(反式)-2-(6-(3-氯-4-氟-5-甲氧基苯基)吡啶-3-基)环丙胺；5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-3-氯-2-氟苯酚；(反式)-2-(6-(1H-吲唑-6-基)吡啶-3-基)环丙胺；(反式)-2-(6-(9H-咔唑-2-基)吡啶-3-基)环丙胺；6-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)吲哚啉-2-酮；6-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯并呋喃-2(3H)-酮；4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)吡啶-2(1H)-酮；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)苯磺酰胺；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)丙烷-2-磺酰胺；4’-((反式)-2-氨基环丙基)-4-氟联苯-3-醇；4’-((反式)-2-氨基环丙基)-5-氯联苯-3-醇；4’-((反式)-2-氨基环丙基)-5-氯-4-氟联苯-3-醇；N-(4’-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-3-基)苯磺酰胺；N-(4’-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-3-基)丙烷-2-磺酰胺；N-(4’-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-3-基)甲磺酰胺；N-(2-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)甲磺酰胺；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-甲氧基苄腈；N-(4’-((反式)-2-氨基环丙基)联苯-2-基)甲磺酰胺；4’-((反式)-2-氨基环丙基)-6-甲氧基联苯-3-甲腈；N-(4’-((反式)-2-氨基环丙基)-6-甲氧基联苯-3-基)甲磺酰胺；4’-((反式)-2-氨基环丙基)-6-羟基联苯-3-甲腈；N-(4’-((反式)-2-氨基环丙基)-6-羟基联苯-3-基)甲磺酰胺；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-羟基苄腈；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-羟基苯基)甲磺酰胺；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)苯基)乙磺酰胺；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)苯基)甲磺酰胺；3-(6-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-3-基)苯酚；(反式)-2-(5-(3-甲氧基苯基)吡啶-2-基)环丙胺；4-(6-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-3-基)苯酚；2-(6-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-3-基)苯酚；2-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻吩-2-基)苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻吩-2-基)苯酚；4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻吩-2-基)苯酚；2-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-2-基)苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-2-基)苯酚；4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-2-基)苯酚；2-(2-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-5-基)苯酚；3-(2-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-5-基)苯酚；2-(2-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-5-基)苯酚；3-(2-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-5-基)苯酚；3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)嘧啶-2-基)苯酚；4-(5-((反式)-2-氨基环丙基)嘧啶-2-基)苯酚；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-4-甲氧基苯基)甲磺酰胺；N-(4’-((反式)-2-氨基环丙基)-5-氯-[1，1’-联苯]-3-基)甲磺酰胺；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-氯苯基)甲磺酰胺；N-(4’-((反式)-2-氨基环丙基)-4-氟-[1，1’-联苯]-3-基)甲磺酰胺；N-(5-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-2-氟苯基)甲磺酰胺；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)乙磺酰胺；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)-4-氰基苯磺酰胺；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)-3-氰基苯磺酰胺；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)苯基)-2-氰基苯磺酰胺；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)苯基)-4-氰基苯磺酰胺；N-(4’-((反式)-2-氨基环丙基)-[1，1’-联苯]-3-基)-1，1，1-三氟甲磺酰胺；4’-((反式)-2-氨基环丙基)-6-羟基-[1，1’-联苯]-3-甲腈；4’-((反式)-2-氨基环丙基)-[1，1’-联苯]-2-醇；4’-((反式)-2-氨基环丙基)-3’-甲氧基-[1，1’-联苯]-3-醇；N-(3-(5-((反式)-2-氨基环丙基)噻唑-2-基)苯基)-2-氰基苯磺酰胺；或其可药用盐或溶剂合物。
在另一些实施方案中，LSD1抑制剂化合物选自例如由Ogasawara等(2013，Angew.Chem.Int.Ed.52：8620-8624，其在此通过引用整体并入本文)所述的苯基环丙胺衍生物。这种类型的代表性化合物由式(XII)表示：
其中Ar1是5至7元芳环或杂芳环；
Ar2和Ar3各自独立地选自5至7元芳环或杂芳基环，任选地被1至3个取代基取代；
R1和R2独立地选自氢和羟基，或者R1和R2一起形成＝O、＝S或＝NR3；
R3选自氢、-C1-6烷基或-OH；
m是1至5的整数；并且
n是1至3的整数；
或由其可药用盐表示。
在式(VII)的一些具体实施方案中，以下的一个或更多个适用：
Ar1是六元芳环或杂芳环，特别是苯基、吡啶、嘧啶、吡嗪1，3，5-三嗪、1，2，4-三嗪和1，2，3-三嗪，更特别是苯基；
Ar2是六元芳环或杂芳环，特别是苯基、吡啶、嘧啶、吡嗪1，3，5-三嗪、1，2，4-三嗪和1，2，3-三嗪，特别是苯基；特别地其中所述六元芳环或杂芳环任选地被一个任选的取代基取代，特别在3或4位；
Ar3是六元芳环或杂芳环，特别是苯基、吡啶、嘧啶、吡嗪1，3，5-三嗪、1，2，4-三嗪和1，2，3-三嗪，特别是苯基；特别地其中所述六元芳环或杂芳环任选地被一个任选的取代基取代，特别在3或4位。
Ar1和Ar2的特别的任选取代基包括-C1-6烷基、-C2-6烯基、-CH2F、-CHF2、-CF3、卤素、芳基、杂芳基、-C(O)NHC1-6烷基、-C(O)NHC1-6烷基NH2、-C(O)-杂环基，特别是甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、-CH2F、-CHF2、-CH3、Cl、F、苯基、-C(O)NH(CH2)1-4NH2和-C(O)-杂环基；
R1和R2一起形成＝O、＝S或＝NR3，特别是＝O或＝S，更特别是＝O；
R3是H、-C1-3烷基或-OH，特别是H、-CH3或-OH。
m是2至5，特别是3至5，更特别是4，
n是1或2，特别是1。
在一些实施方案中，式(XII)的化合物是式(XIIa)的化合物：
其中Ar2和Ar3如式(XII)中所限定。
由式(XII)表示的非限制性化合物包括以下：
化合物 Ar2 Ar3
1b 苯基 苯基
1c 4-甲基苯基 苯基
1d 4-叔丁基苯基 苯基
1e 4-氯苯基 苯基
1f 4-氟苯基 苯基
1g 4-苯基-苯基 苯基
1h 4-三氟甲基苯基 苯基
1i 3-(2-氨基乙基氨基甲酰基)苯基 苯基
1j 3-(哌嗪-1-羰基)苯基 苯基
1k 4-苯基-苯基 4-甲基苯基
1l 4-苯基-苯基 4-氟苯基
1m 4-苯基-苯基 4-苯基-苯基
1n 4-苯基-苯基 4-叔丁基苯基
1o 4-苯基-苯基 3-甲基苯基
1p 4-苯基-苯基 3-氟苯基
1q 4-苯基-苯基 3-苯基-苯基
根据式(XII)(本文命名为NCD-38)的示例性化合物由以下结构表示：
Ogasawara等(2013，同上)描述了式(VII)的化合物的合成和抑制活性。
其他LSD1抑制剂包括但不限于例如在Ueda等(2009.J.Am.Chem.Soc.131(48)：17536-17537)中公开的那些，包括Mimasui(2010.Biochemistry，6月22日[出版前的电子版本]PMID：20568732[PubMed-由出版商提供])。
其他苯基环丙胺衍生物和类似物例如见于Kaiser等(1962，J.Med.Chem.5：1243-1265)；Zirkle等(1962.J.Med.Chem.1265-1284；美国专利No.3,365,458、3,471,522、3,532,749)；和Bolesov等(1974.Zhurnal Organicheskoi Khimii 10：81661-1669)；以及俄国专利No.230169(19681030)。
在另一些实施方案中，LSD1抑制剂化合物选自环丙胺化合物，例如由Tomita等在美国公开No.2014/0228405中描述的，其在此通过引用整体并入本文。这种类型的代表性化合物由式(XHI)或其盐表示：
其中：
A是任选具有取代基的烃基，或任选具有取代基的杂环基；
R是氢原子、任选具有取代基的烃基、或任选具有取代基的杂环基；或者
A和R任选地彼此键合以形成任选具有取代基的环；
Q1、Q2、Q3和Q4各自独立地为氢原子或取代基；Q1与Q2以及Q3与Q4各自任选地彼此键合以形成任选具有取代基的环；
X是氢原子、任选具有取代基的非环烃基、或任选具有取代基的饱和环状基团；
Y1、Y2和Y3各自独立地为氢原子、任选具有取代基的烃基、或任选具有取代基的杂环基；
X与Y1以及Y1与Y2各自任选地彼此键合以形成任选具有取代基的环；以及
Z1、Z2和Z3各自独立地为氢原子或取代基。
在根据式(XIII)的化合物或其盐的一些具体实施方案中，A是任选具有1至3个被1至3个卤素原子取代的C1-6烷基的苯基、联苯基或吡唑基；R是氢原子；或A和R任选彼此键合以形成具有1或2个氧代基团的二氢异吲哚环；Q1是氢原子或C1-6烷基；Q2、Q3和Q4各自为氢原子；X是氢原子；Y1、Y2和Y3各自独立地为氢原子或C3-8环烷基；Y1和Y1任选彼此键合以与相邻的碳原子一起形成任选具有1至3个C1-6烷基的哌啶环；以及Z1、Z2和Z3各自为氢原子。
根据式(XIII)的代表性化合物适当地选自：(1)N-(4-{反式-2-[(环丙基甲基)氨基]环丙基}-2-甲基苯基)苯甲酰胺，(2)N-(4-{反式-2-[(环丙基甲基)氨基]环丙基}苯基)-3-(三氟甲氧基)苯甲酰胺，(3)N-(4-{反式-2-[(环丙基甲基)氨基]环丙基}苯基)苯甲酰胺，(4)N-(4-{反式-2-[(环丙基甲基)氨基]环丙基}苯基)-环己烷甲酰胺，(5)N-(4-{反式-2-[(1，1-二氧四氢-2H-噻喃-4-基)氨基]环丙基-}苯基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺，(6)N-(4-{反式-2-[(环丙基甲基)氨基]环丙基}苯基)-1，3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺，(7)N-(4-{反式-2-[(环丙基甲基)氨基]环丙基}苯基)-1，5-二甲基-1H-吡唑-3-甲酰胺，(8)N-(4-{反式-2-[(环丙基甲基)氨基]环丙基}苯基)-1-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-甲酰胺，(9)N-(4-{反式-2-[(环丙基甲基)氨基]环丙基}苯基)-1-甲基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-甲酰胺，和(10)N-(4-{反式-2-[(环丙基甲基)氨基]环丙基}苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺，或其盐。
在另一些实施方案中，LSD1抑制剂化合物选自例如由等在美国公开No.2004/0213657中描述的化合物，其在此通过引用整体并入本文。这种类型的代表性化合物由式(XIV)表示：
(A’)x-(A)-(B)-(Z)-(L)-(D) (XIV)
其中：
(A)是杂芳基或芳基；
如果存在，每个(A’)均独立地选自芳基、芳基烷氧基、芳基烷基、杂环基、芳氧基、卤素、烷氧基、卤代烷基、环烷基、卤代烷氧基和氰基，其中每个(A’)被0、1、2或3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、芳基、芳基烷氧基、烷基、烷氧基、酰氨基、-CH2C(＝O)NH2、杂芳基、氰基、磺酰基和亚磺酰基；
X是0、1、2或3；
(B)是环丙基环，其中(A)和(Z)共价键合(B)的不同碳原子；
(Z)是-NH-；(L)选自单键、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-；以及
(D)是脂肪族碳环基团或苯并环烷基，其中所述脂肪族碳环基团或所述苯并环烷基具有0、1、2或3个独立地选自-NH2、-NH(C1-C6烷基)、-N(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)、烷基、卤素、酰氨基、氰基、烷氧基、卤代烷基和卤代烷氧基的取代基；或者其对映异构体、非对映异构体或混合物，或者其可药用盐或溶剂合物。
根据式(XIV)的化合物的非限制性实例包括：N-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)-6-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺；N-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)-5，6-二甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺；N-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)-4，5-二甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺；N-((反式)-2-苯基环丙基)-2，3-二氢-1H-茚-1-胺；6-甲氧基-N-((反式)-2-苯基环丙基)-2，3-二氢-1H-茚-1-胺；6-氯-N-((反式)-2-苯基环丙基)-2，3-二氢-1H-茚-1-胺；N-((反式)-2-苯基环丙基)-6-(三氟甲基)-2，3-二氢-1H-茚-1-胺；7-甲氧基-N-((反式)-2-苯基环丙基)-1，2，3，4-四氢萘-1-胺；N-((反式)-2-(3’-氯二苯基-4-基)环丙基)-6-甲氧基-2，3-二氢-1-H-茚-1-胺；N-((反式)-2-(4′-氯二苯基-4-基)环丙基)-6-甲氧基-2，3-二氢-1-H-茚-1-胺；6-甲氧基-N-((反式)-2-(3′-甲氧基二苯基-4-基)环丙基)-2，3-二氢-1H-茚-1-胺；N-反式-(2-环己基乙基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(3-环己基丙基)-2-苯基环丙胺；(反式)-N-(2-环庚基乙基)-2-苯基环丙胺；(反式)-2-(4-(3-溴苄氧基)苯基)-N-(2-环己基乙基)环丙胺；N-((反式)-2-(4-(3-溴苄氧基)苯基)环丙基)-6-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺；(反式)-2-(3’-氯二苯基-4-基)-N-(2-环己基乙基)环丙胺；(反式)-2-(4’-氯二苯基-4-基)-N-(2-环己基乙基)环丙胺；(反式)-N-(2-环己基乙基)-2-(3’-甲氧基二苯基-4-基)环丙胺；N-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)-7-甲氧基-1，2，3，4-四氢萘-1-胺；和1-((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)环丙烷甲酰胺；或其可药用盐或溶剂合物。
在另一些实施方案中，LSD1抑制剂化合物选自经取代的(E)-N’-(1-苯基亚乙基)苯甲酰肼类似物，例如由Vankayalapati等在美国公开No.2004/0163017中所描述的，其在此通过引用整体并入本文。这种类型的代表性化合物由式(XV)表示：
或由式(XVI)表示：
其中：
m是0或1；
n是0至3的整数；
X选自OH、NO2和F；
Z选自N和CH；
R1选自卤素、C1-C3卤代烷基和C1-C3多卤代烷基(polyhaloalkyl)；
R2、R3和R4各自独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、氨基、C2-C6烷基烷氧基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6多卤代烷基和C1-C6卤代烷基；
R5选自NR6R7、C1-C6烷基、C3-C6环烷基，
和Cy，并且被0-3个独立地选自卤素、羟基、氨基、C2-C6烷基烷氧基、C1-C6烷基醇、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6多卤代烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6环烷基和Cy的基团取代；Cy是选自以下的杂环烷基：氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环庚烷基、唑烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、哌嗪基、嗪烷基、吗啉基、六氢嘧啶基和六氢哒嗪基；并且R6和R7各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基和C3-C6杂环烷基；或其可药用盐。
根据式(XV)和(XVI)的说明性化合物包括：
在另一些实施方案中，LSD1抑制剂化合物选自羟基酪醇、羟基酪醇衍生的和/或经取代的化合物，和/或羟基酪醇代谢物，如McCord等在美国公开No.2004/0155339中所述，其在此通过引用整体并入本文。这种类型的代表性化合物包括：
其中：R1、R2和R3独立地选自氢、经取代或未取代的烷基、经取代或未取代的烯基、经取代或未取代的炔基、经取代或未取代的芳基、经取代或未取代的杂环基、经取代或未取代的酰基、ORa、SRa、SORa、SO2Ra、OSO2Ra、OSO3Ra、NO2、NHRa、N(Ra)2、＝N-Ra、N(Ra)CORa、N(CORa)2、N(Ra)SO2R’、N(Ra)C(＝NRa)N(Ra)Ra、CN、卤素、CORa、COORa、OCORa、OCOORa、OCONHRa、OCON(Ra)2、CONHRa、CON(Ra)2、CON(Ra)ORa、CON(Ra)SO2Ra、PO(ORa)2、PO(ORa)Ra、PO(ORa)(N(Ra)Ra)和对LSD1蛋白具有抑制功效的氨基酸酯；并且其中每个Ra基团独立地选自氢、经取代或未取代的烷基、经取代或未取代的烯基、经取代或未取代的炔基、经取代或未取代的芳基、和经取代或未取代的杂环基、经取代或未取代的酰基，和对LSD1蛋白具有抑制功效的类似物；并且其中经取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基和/或酰基中的每一个是C1-28(包括其中的所有范围)。
在另一些实施方案中，LSD1抑制剂化合物选自Casero等在美国公开No.2014/0011857中描述的小分子化合物，其在此通过引用整体并入本文。这种类型的代表性化合物由式(XVII)表示：
其中：
Y是
(i)
(ii)-C(O)OH；或
(iii)-NH2；J是O、S或不存在，其中如果J不存在，则J所连接的碳是-CH2-；R3是烷基、芳基、碳环、杂环、芳烷基、烷氧基、芳氧基、卤代烷基或卤素(其各自任选地被取代)、硝基、羟基、硫代、C(O)NRARB或C(O)ORA；R4是H、烷基、芳基、碳环、杂环、芳烷基、烷氧基、芳氧基、卤代烷基或卤素(其各自任选被取代)、硝基、羟基、硫代、C(O)NRARB或C(O)ORA；R5是H、烷基、芳基、碳环、杂环、芳烷基、烷氧基、芳氧基、卤代烷基或卤素(其各自任选被取代)、硝基、羟基、硫代、C(O)NRARB或C(O)ORA；其中R3是邻位取代的；每个R1D或R1E独立地为H、烷基、芳基、碳环、杂环、烷氧基或卤素，其各自任选被取代；RA和RB在每次出现时各自独立地选自以下：任选经取代的烷基、任选经取代的烯基或任选经取代的炔基，其各自含有0、1、2或3个选自O、S或N的杂原子；任选经取代的芳基；任选经取代的杂芳基；任选经取代的杂环；任选经取代的碳环；或氢；并且q为1、2、3、4、5、6或7。
在另一些实施方案中，LSD1抑制剂选自等在美国公开No.2013/0231342中描述的芳基环丙基胺化合物，其在此通过引用整体并入本文。这种类型的代表性化合物由式(XVIII)表示：
其中：
(A)是具有n个取代基(R3)的环基。
(B)是环基或-(L1)-环基，其中所述环基或所述-(L1)-环基中包含的环基部分具有n个取代基(R2)；
(L1)是-O-、-NH-、-N(烷基)-、亚烷基或杂亚烷基；
(D)是杂芳基或-(L2)-杂芳基，其中所述杂芳基或所述-(L2)-杂芳基中包含的杂芳基部分具有一个取代基(R1)，并且其中所述杂芳基通过环碳原子与分子的其余部分共价键合，或所述-(L2)-杂芳基中包含的杂芳基部分通过环碳原子与(L2)部分共价键合；
(L2)是-O-、-NH-、-N(烷基)-、亚烷基或杂亚烷基；
(R1)是氢键合基团；
每个(R2)均独立地选自烷基、烯基、炔基、环基、氨基、酰氨基、C-酰氨基、烷基氨基、羟基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、烷氧基、酰基、羧基、氨基甲酸盐/酯或脲；
每个(R3)均独立地选自烷基、烯基、炔基、环基、氨基、酰氨基、C-酰氨基、烷基氨基、羟基、硝基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、氰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺、烷氧基、酰基、羧基、氨基甲酸盐/酯或脲；并且n独立地是0、1、2、3或4。
根据式(XVIII)的化合物的非限制性实例选自：5-(((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)甲基)嘧啶-2-胺；5-(((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)甲基)噻唑-2-胺；5-(((反式)-2-(6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙基氨基)甲基)嘧啶-2-胺；5-(((反式)-2-(6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙基氨基-)甲基)噻唑-2-胺；3-(5-((反式)-2-((2-氨基嘧啶-5-基)甲基氨基)环丙基)吡啶-2-基)苯酚；3-(5-((反式)-2-((2-氨基噻唑-5-基)甲基氨基)环丙基)吡啶-2-基)苯酚；4’-((反式)-2-((2-氨基嘧啶-5-基)甲基氨基)环丙基)二-苯基-3-醇；4’-((反式)-2-((2-氨基噻唑-5-基)甲基氨基)环丙基)二苯基-3-醇；5-(((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)甲基)-1，2，4-二唑-3-胺；5-(((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)甲基)-1，3，4-二唑-2-胺；5-((((反式)-2-(4-((4-氟苄基)氧)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1，3，4-二唑-2-胺；5-((((反式)-2-(4-((3-氟苄基)氧)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1-，3，4-二唑-2-胺；5-((((反式)-2-(4-((3，5-二氟苄基)氧)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1，3，4-二唑-2-胺；5-((((反式)-2-(4-((4-氯苄基)氧)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1-，3，4-二唑-2-胺；5-((((反式)-2-(4-((3-氯苄基)氧)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1，3，4-二唑-2-胺；5-((((反式)-2-(4-((2-氟苄基)氧)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1-，3，4-二唑-2-胺；5-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)-N-甲基-1，-3，4-二唑-2-胺；N-(5-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1，3，4-二唑-2-基)乙酰胺；4’-((反式)-2-(((5-氨基-1，3，4-二唑-2-基)甲基)氨基)环丙基)-[-1，1’-二苯基]-3-醇；5-((((反式)-2-(6-(3-(三氟甲基)苯基)吡啶-3-基)环丙基)氨基)甲基)-1，3，4-二唑-2-胺；5-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1，3，4-噻二唑-2-胺；2-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)噻唑-5-胺；4-((((反式)-2-(3’-(三氟甲基)-[1，1’-二苯基]-4-基)环丙基)氨基)甲基)噻唑-2-胺；2-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)唑-5-胺；3-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)异唑-5-胺；5-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1，2，4-二唑-3-胺；3-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1，2，4-二唑-5-胺；5-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1，2，4-噻二唑-3-胺；5-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)吡啶-2-胺；6-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)哒嗪-3-胺；5-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)吡嗪-2-胺；2-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)嘧啶-5-胺；6-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1，2，4-三嗪-3-胺；3-((((反式)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基)氨基)甲基)-1，2，4-三嗪-6-胺；或其可药用盐或溶剂合物。
本发明不仅包括已知的LSD(例如，LSD1或LSD2)抑制剂，而且包括通过任何合适的筛选测定鉴定的LSD抑制剂。因此，本发明扩展至筛选可用于以下的调节剂的方法：用于抑制LSD(例如，LSD1或LSD2)并进而用于改变LSD过表达细胞(例如，CSC)的以下特征中的至少一个：(i)形成、(ii)增殖、(iii)存活、(iv)生存力、(v)维持、(vi)EMT或(vii)MET，或者用于治疗或预防癌症(例如，转移性癌症)。在一些实施方案中，筛选方法包括：(1)使制备物与测试药剂相接触，其中所述制备物包含(i)含有对应于至少LSD(例如，LSD1或LSD2)生物学活性片段的氨基酸序列的多肽，或其变体或衍生物，或者(ii)含有可产生LSD基因(例如，LSD1或LSD2)之转录物或其一部分的核苷酸序列的多核苷酸，或者(iii)含有调节LSD基因(例如，LSD1或LSD2)表达之基因序列(例如，转录元件)至少一部分的多核苷酸，其与报道基因有效地连接；以及(2)相对于在测试药剂不存在下的参照水平或功能活性，检测所述多肽、多核苷酸、或报道基因之表达产物的水平或功能活性的变化。相对于在测试药剂不存在下的正常或参照水平和/或功能活性，检测到多肽、转录物或转录物一部分、或者报道基因之表达产物的水平和/或功能活性降低，表明所述药剂可用于改变LSD过表达细胞(例如，CSC)的以下特征中的至少一个：(i)形成、(ii)增殖、(iii)存活、(iv)生存力、(v)维持、(vi)EMT或(vii)MET，或者用于治疗或预防癌症。合适地，这通过分析或确定所述测试药剂是否改变LSD过表达细胞以下特征中的至少一个确认：(i)形成、(ii)增殖、(iii)存活、(iv)生存力、(v)维持、(vi)EMT或(vii)MET，或者是否治疗或预防癌症来确认。
落入本发明范围内的调节剂包括LSD(例如，LSD1或LSD2)的水平或功能活性的抑制剂，包括LSD(例如，LSD1或LSD2)的拮抗性抗原结合分子和抑制剂肽片段、反义分子、核酶、RNAi分子和共抑制分子，以及多糖和脂多糖抑制剂。
候选药剂包括许多化学物质类别，但是其通常是有机分子，优选分子量大于50且小于约2500道尔顿的小有机化合物。候选药剂包含与蛋白质结构相互作用特别是氢键合所必需的官能团，并且通常包含至少一个胺、羰基、羟基或羧基，期望至少两个化学官能团。候选药剂经常包含被一个或更多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构或芳族或聚芳族结构。候选药剂也存在于生物分子中，所述生物分子包括但不限于：肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。
LSD(例如，LSD1或LSD2)的小(非肽)分子调节剂是特别有利的。在这方面，小分子是理想的，这是因为此种分子在经口施用后更容易吸收，具有较少的潜在抗原决定簇，或者比更大的基于蛋白质的药物更有可能穿过细胞膜。小有机分子还可以具有实现以下的能力：进入合适的细胞并影响基因的表达(例如，通过与参与基因表达的调节区或转录因子相互作用)；或者通过抑制或增强辅助分子的结合影响基因的活性。
或者，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库是可用的或容易产生的。此外，天然或合成产生的库和化合物容易通过常规的化学、物理和生物化学方法进行修饰，并且可用于产生组合库。已知的药理学试剂可以经过定向或随机化学修饰(例如，酰化、烷基化、酯化、酰胺化等)以产生结构类似物。
筛选也可以针对已知的药理学活性化合物和其化学类似物。
筛选根据本发明的调节剂可以通过任何合适的方法来实现。例如，该方法可以包括使表达对应于编码LSD(例如，LSD1或LSD2)之基因的多核苷酸的细胞与怀疑的具有调节活性的药剂相接触以及筛选LSD(例如，LSD1或LSD2)的水平或功能活性的调节，或由多核苷酸编码的转录物的水平的调节，或所述多肽或转录物的下游细胞靶分子(以下称为靶分子)的活性或表达的调节。检测这种调节可以利用包括但不限于以下的技术来实现：ELISA；基于细胞的ELISA；抑制型ELISA；Western印迹法；免疫沉淀；狭缝或斑点印迹测定；免疫染色；RIA；亲近闪烁测定(scintillation proximity assay)；采用抗原结合分子缀合物或例如荧光素或罗丹明荧光物质的抗原缀合物的免疫荧光测定；乌赫特朗尼双重扩散分析；采用亲合素-生物素或链霉亲合素-生物素检测系统的免疫测定；以及核酸检测测定，包括逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。
应该理解的是，调控或表达LSD(例如，LSD1或LSD2)的多核苷酸可以天然存在于测试对象的细胞中，或者也可以出于测试的目的而引入宿主细胞中。此外，天然存在或引入的多核苷酸可以是组成型表达的，从而提供可用于筛选下调序列之编码产物表达的药剂的模型，其中所述下调可以在核酸或表达产物水平。此外，在将多核苷酸引入细胞中的情况下，该多核苷酸可以包含编码LSD(例如，LSD1或LSD2)的整个编码序列，或者其可以包含编码序列的一部分(例如，所述LSD的活性位点)或调节编码所述LSD的对应基因之表达的一部分(例如，LSD1启动子或LSD2启动子)。例如，天然与多核苷酸相关联的启动子可以被引入测试对象的细胞中。在这种情况下，只有在使用启动子的情况下，才可以实现检测启动子活性的调节，例如，通过使该启动子与合适的报道多核苷酸(包括但不限于：绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶、β-半乳糖苷酶和儿茶酚胺乙酰转移酶(catecholamine acetyl transferase，CAT))有效地连接。表达的调节可以通过测量与报道多核苷酸相关的活性来确定。
这些方法提供了用于进行推定调节剂(例如，包含蛋白质药剂或者非蛋白质药剂的合成、组合、化学和天然库)的高通量筛选的机制。这些方法也将促进以下药剂的检测，其与编码靶分子的多核苷酸结合或者调节上游分子的表达，所述上游分子随后调节编码靶分子的多核苷酸的表达。因此，这些方法提供了检测直接或间接地调节根据本发明的靶分子之表达或活性的药剂的机制。
在一些替代实施方案中，使用可商购测定来筛选测试药剂，所述测定的说明性实例包括EpiQuik组蛋白脱甲基酶LSD1抑制剂筛选测定试剂盒(Epigentek Group，Brooklyn，NY)或LSD1抑制剂筛选测定试剂盒(Cayman Chemical Company，Ann Arbor，MI)。
还可以在动物模型中进一步测试化合物以鉴定在体内作用方面最有效的那些化合物。这些分子可以充当用于药物进一步研发的“先导化合物”，例如通过使所述化合物经过顺序修饰、制作分子模型和合理药物设计中使用的其他常规方法来实现。
2.2 PKC-θ抑制剂
PKC-θ抑制剂包括并涵盖降低PKC-θ的积累、功能或稳定性或降低PKC-θ基因表达的任何活性剂，并且这种抑制剂包括但不限于小分子和大分子如核酸、肽、多肽、肽模拟物、碳水化合物、多糖、脂多糖、脂质或其它有机(含碳)或无机分子。
在一些实施方案中，PKC-θ抑制剂是用于抑制PKC-θ转录物的转录或翻译的拮抗性核酸分子。这种类型的代表性转录物包括对应于以下序列中任何一个的核苷酸序列：(1)例如GenBank登录号XM_005252496、XM_005252497、XM_005252498和XM_005252499中所示的人PKC-θ核苷酸序列，(2)与(1)中提及的任何一个序列具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％序列同一性的核苷酸序列；(3)在至少低、中等或高严格性条件下与(1)中提及的序列杂交的核苷酸序列；(4)编码以下氨基酸序列中任何一个的核苷酸序列：如GenPept登录号XP_005252553、XP_005252554、XP_005252555和XP_005252556中所示的人PKC-θ氨基酸序列；(5)编码与(4)中提及的任何一个序列具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％序列相似性的氨基酸序列的核苷酸序列；和编码与(4)中提及的任何一个序列具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。说明性拮抗剂核酸分子包括反义分子、适配体、核酶和三链体形成分子，包括dsRNA、siRNA和shRNA的RNAi以及外部引导序列。
说明性RNAi分子(例如，PKC-θsiRNA和shRNA)在本领域中进行了描述(例如，Ma等，2013.BMC Biochem.14：20和Kim等，2013.Immune Netw.13(2)：55-62)或者可商购自SantaCruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA，USA)、OriGene Technologies，Inc.(Rockville，MD，USA)、Sigma-Aldrich Pty Ltd(Castle Hill，NSW，Australia)。
本发明还考虑基于肽或多肽的抑制剂化合物。例如，多种PKC-θ同工酶和可变区特异性肽是已知的，其说明性实例包括：
(a)θV1衍生肽θV1-1和θV1-2，分别具有氨基酸序列GLSNFDCG[SEQ ID NO：1](PKC-θ残基8-15)或YVESENGQMYI[SEQ ID NO：2](PKC-θ残基36-46)，如例如美国专利No.5,783,405中所公开的，其在此通过引用整体并入本文；
(b)θV5衍生肽，其具有氨基酸序列VKSPFDCS[SEQ ID NO：3](PKC-θ残基655-662)或DRALINS[SEQ ID NO：4]或经修饰肽VrSPFDCS[SEQ ID NO：5]，如例如US 2004/0009922中所公开的，其在此通过引用整体并入本文；以及
(c)ΨθRACK衍生肽，其具有氨基酸序列KGDNVDLI[SEQ ID NO：6]，KGENVDLI[SEQID NO：7]，KGKEVDLI[SEQ ID NO：8]，KGKNVDLI[SEQ ID NO：9]，RGKNVELA[SEQ ID NO：10]，RGENVELA[SEQ ID NO：11]，KGKQVNLI[SEQ ID NO：12]，KGKQVNLI[SEQ ID NO：13]，KGDQVNLI[SEQ ID NO：14]或KGEQVNLI[SEQ ID NO：15]，如例如US 2010/0311644中所公开的，其在此通过引用整体并入本文。
PKC-θ抑制肽，如例如以上描述的，可通过是融合蛋白的一部分进行修饰。融合蛋白可包括这样的转运蛋白或肽，其功能是增加肽抑制剂的细胞摄入，具有另一种期望的生物学作用如治疗作用，或者可以具有这两种功能。融合蛋白可通过本领域技术人员已知的方法产生。抑制肽可以以本领域已知的多种方式与另一条肽结合或以其他方式缀合。例如，抑制肽可通过交联与载体肽或本文所述的其他肽结合，其中融合蛋白的两条肽均保留其活性。作为另一个实例，所述肽可通过一条肽的C端与另一条肽的N端的酰胺键彼此连接或以其他方式缀合。融合蛋白中抑制肽与其他成员之间的键可以是不能切割的(肽键)或者可切割的(例如，酯键或本领域已知的其他可切割键)。
在一些实施方案中，转运蛋白或肽可为例如包含氨基酸序列CRQIKIWFQNRRMKWKK[SEQ ID NO：16]的果蝇(Drosophila)触角足同源域衍生序列，并且可通过经N端Cys-Cys键交联而与抑制剂连接(如例如Theodore等，1995.J.Neurosci.15：7158-7167；Johnson等，1996.Circ.Res 79：1086中所讨论的)。或者，抑制剂可通过来自人免疫缺陷病毒1型的反式激活调节蛋白(Tat)衍生转运多肽(例如，SEQ ID NO：17所示的Tat的第47至57位氨基酸；YGRKKRRQRRR)修饰，如Vives等，1997.J.Biol.Chem，272：16010-16017，美国专利No.5,804,604和GenBank登录号：AAT48070中所述；或者用聚精氨酸修饰，如Mitchell等，2000.J.Peptide Res.56：318-325和Rolhbard等，2000.Nature Med.6：1253-1257中所描述的。抑制剂可通过本领域技术人员已知的其他方法进行修饰以增加抑制剂的细胞摄入。
还可以通过将包含编码PKC-θ抑制肽的核苷酸序列的核酸引入到细胞中将PKC-θ抑制肽引入细胞中。核酸可以是重组表达载体的形式。PKC-θ抑制肽编码序列可以与表达载体中的转录控制元件(例如，启动子)有效连接。合适的载体包括：例如，重组逆转录病毒、慢病毒和腺病毒；逆转录病毒表达载体、慢病毒表达载体、核酸表达载体以及质粒表达载体。在一些情况下，表达载体整合到细胞的基因组中。在另一些情况下，表达载体在细胞中保持为附加体状态。
合适的表达载体包括但不限于，病毒载体(例如，基于以下病毒的病毒载体：痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒(例如，参见，Li等，Invest Opthalmol Vis Sci 35：25432549，1994；Borras等，Gene Ther 6：515 524，1999；Li和Davidson，PNAS 92：7700 7704，1995；Sakamoto等，H Gene Ther 5：1088 1097，1999；WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)、腺相关病毒(例如，参见，Ali等，HumGene Ther 9：8186，1998，Flannery等，PNAS 94：6916 6921，1997；Bennett等，InvestOpthalmol Vis Sci 38：2857 2863，1997；Jomary等，Gene Ther 4：683 690，1997，Rolling等，Hum Gene Ther 10：641 648，1999；Ali等，Hum Mol Genet.5：591 594，1996；WO 93/09239中的Srivastava，Samulski等，J.Vir.63：3822-3828，1989；Mendelson等，Virol.166：154-165，1988；以及Flotte等，PNAS(1993)90：10613-10617)、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(例如，参见，Miyoshi等，PNAS 94：10319 23，1997；Takahashi等，J Virol 73：7812 7816，1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和来自于逆转录病毒(例如，劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)的载体)、等。
本发明还考虑了这样的小分子药剂，其降低PKC-θ的功能活性(例如，降低PKC-θ介导的磷酸化、抑制PKC-θ与CD44或uPAR启动子的结合、减少PKC-θ(例如，活性PKC-θ)与染色质的结合、降低PKC-θ介导的鸟嘌呤交换因子(GIV/Girdin)抑制、降低PKC-θ介导的调节性T细胞功能抑制、降低PKC-θ介导的EMT等)。
适用于本发明的降低PKC-θ功能活性的小分子药剂包括：抑制PKC-θ功能活性的吡啶衍生物、抑制PKC-θ功能活性的嘌呤化合物、抑制PKC-θ功能活性的嘧啶衍生物、抑制PKC-θ功能活性的苯胺化合物、抑制PKC-θ功能活性的吲哚衍生物等。
在一些实施方案中，小分子PKC-θ抑制剂选自例如由Cooke等在美国公开No.2013/0157980(其通过引用整体并入本文)中所述的经取代吲哚衍生物。该类型的说明性衍生物包括根据式(XIX)的化合物：
或其可药用盐或水合物。
在根据式(XIX)的化合物的一些实施方案中：
X是CH或N；
R是H或PO3H2；
R1是H或C1-4烷基；R2是H或C1-4烷基；R3是H、C1-4烷基、CN、Hal或OH；并且R4和R5彼此独立地为H或C1-4烷基，或者R4和R5与其所连接的碳原子一起形成3至6元环烷基。
在根据式(XIX)的化合物的另一些实施方案中：
X是CH；
R是PO3H2；
R1是H；
R2是H或C1-4烷基；R3是H或C1-4烷基；并且R4和R5彼此独立地为H，或者R4和R5与其所连接的碳原子一起形成3至6元环烷基。
在根据式(XIX)的化合物的又一些实施方案中：
X是CH；
R是H；
R1是H；
R2是H或C1-4烷基；R3是H或C1-4烷基；并且R4和R5彼此独立地为H，或者R4和R5与其所连接的碳原子一起形成3至6元环烷基。
在根据式(XIX)的化合物的又一些实施方案中：
X是N；
R是PO3H2；
R1是H；
R2是H或C1-4烷基；
R3是H；并且
R4和R5彼此独立地为H，或者R4和R5与其所连接的碳原子一起形成3至6元环烷基。
在根据式(XIX)的化合物的又一些实施方案中：
X是N；
R是PO3H2；
R1是H；
R2是H或C1-4烷基；
R3是H；并且
R4和R5彼此独立地为H或C1-4烷基。
在一些实施方案中，抑制PKC-θ功能活性的经取代吲哚衍生物包括根据式(XX)的化合物：
或其可药用盐。
在另一些实施方案中，抑制PKC-θ功能活性的经取代吲哚衍生物包括根据式(XXI)的化合物：
或其可药用盐或水合物。
在又一些实施方案中，抑制PKC-θ功能活性的经取代吲哚衍生物包括根据式(XXII)的化合物：
或其可药用盐。
根据式(XXII)的化合物的代表性实例包括：磷酸单-[3-[3-(4，7-二氮杂-螺[2.5]辛-7-基)-异喹啉-1-基]-4-(7-甲基-1-H-吲哚-3-基)-2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基甲基]酯单水合物；3-[3-(4，7-二氮杂-螺[2.5]辛-7-基)-异喹啉-1-基]-1-羟甲基-4-(-7-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮或其可药用盐；和磷酸单-{3-(1H-吲哚-3-基)-4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-喹唑啉-4-基]-2，5-二氧代-2，5-二氢-吡咯-1-基甲基}酯或其可药用盐。
在另一些实施方案中，小分子PKC-θ抑制剂选自如例如Zhao等在美国公开No.2013/0143875(其通过引用整体并入本文)中所述的嘧啶二胺衍生物。该类型的代表性衍生物包括根据式(XXIII)的化合物：
其中：
R1选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、-C(O)OR1a、-S(O)R1b和-S(O)2R1c；其中R1a、R1b和R1c各自独立地是氢、烷基或苯基-烷基；
Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自氢和烷基；
m是1至5的整数；
p是0至6的整数；
R2选自酰氧基、羟基、硫醇、酰基、烷基、烷氧基、经取代的烷基、经取代的烷氧基、氨基、经取代的氨基、氨基酰基、酰基氨基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤素、硝基、氨基酰氧基、氧基酰基氨基、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、-SO-烷基、-SO-经取代烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-经取代烷基、-SO2-芳基、-SO2-杂芳基和三卤代甲基；
X1、X2和X3是CR5，或者X1、X2和X3之一是N并且其余的是CR5；
R5选自氢、卤素、烷基和经取代的烷基；
R3和R4在每次出现时独立地选自氢、烷基、经取代的烷基、烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫代酮基、羧基、羧基烷基、硫醇、硫代烷氧基、经取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-经取代烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、-SO2-经取代烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基；或R3和R4与其所连接的碳原子一起形成碳环或杂环的4至8元环；
n是1至3的整数；
Z1、Z2和Z3选自CR6R6a、N、O和S；
Z4和Z5选自N、C和CR6；
R6选自氢、卤素、烷基和经取代的烷基；
R6a选自氢、卤素、烷基和经取代的烷基或者不存在以满足化合价要求；并且
虚线表示单键或双键；
或其盐或溶剂合物或立体异构体。
在根据式(XXIII)的化合物的一些实施方案中，Ra、Rb、Rc和Rd表示低级烷基。这样的化合物的说明性实例包括其中Ra、Rb、Rc和Rd是甲基并且具有式(XXIV)的那些化合物：
在根据式(XXIII)的化合物的另一些实施方案中，X1、X2和X3各自是CH。这些化合物具有下式(XXV)：
在根据式(XXIII)的化合物的另一些实施方案中，X1、X2和X3各自是CH；并且m是2。这些化合物具有下式(XXVI)：
在根据式(XXIII)的化合物的又一些实施方案中，X1、X2和X3各自是CH；并且m是1。这些化合物具有下式(XXVII)：
在根据式(XXIII)的化合物的又一些实施方案中，X1、X2和X3各自是CH；n是2；并且一组R3和R4是氢。这些化合物具有下式(XXVIII)：
在根据式(XXIII)的化合物的又一些实施方案中，X2是N并且X1和X3各自是CH。这些化合物具有下式(XXIX)：
在根据式(XXIII)的化合物的又一些实施方案中，X3是N并且X1和X2各自是CH。这些化合物具有下式(XXX)：
在根据式(XXIII)的化合物的另一些实施方案中，Z4是C并且Z5是N。这样的化合物具有下式(XXXI)：
式(XXIII)的示例性化合物包括：N2-(4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4-(2，2，6，6-四甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4-(1，2，2，6，6-五甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4H-苯并[b]吡咯并[1，2-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4-(2，2，6，6-四甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4H-苯并[b]吡咯并[1，2-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4-(1，2，2，6，6-五甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4，4-二氟-4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4--(2，2，6，6-四甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4，4-二氟-4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4--(1，2，2，6，6-五甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4，4-二甲基-4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4--(1，2，2，6，6-五甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4，4-二甲基-4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4--(2，2，6，6-四甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(5，5-二甲基-5H-苯并[e]四唑并[1，5-c][1，3]嗪-9-基)-5-氟-N4--(2，2，6，6-四甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(5，5-二甲基-5H-苯并[e]四唑并[1，5-c][1，3]嗪-9-基)-5-氟-N4--(1，2，2，6，6-五甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(8，9-二氢螺[苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-4，1′-环丁烷]-8-基)-5-氟-N4-(2，2，6，6-四甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(8，9-二氢螺[苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-4，1′-环丁烷]-8-基)-5-氟-N4-(1，2，2，6，6-五甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；5-氟-N2-(4-甲基-8，9-二氢-4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-N4-(2，2，6，6-四甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；5-氟-N2-(4-甲基-8，9-二氢-4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-N4-(1，2，2，6，6-五甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4-((1，2，2，5，5-五甲基吡咯烷-3-基)甲基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4-((2，2，5，5-四甲基吡咯烷-3-基)甲基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4，4-二甲基-4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4--((1，2，2，5，5-五甲基吡咯烷-3-基)甲基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4，4-二甲基-4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4-((2，2，5，5-四甲基吡咯烷-3-基)甲基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(4，4-二甲基-4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4-(((3S)-2，2，5-三甲基吡咯烷-3-基)甲基)嘧啶-2，4-二胺；和N2-(4，4-二甲基-4H-苯并[b]四唑并[1，5-d][1，4]嗪-8-基)-5-氟-N4--(((3R)-2，2，5-三甲基吡咯烷-3-基)甲基)嘧啶-2，4-二胺，
或其盐或溶剂合物或立体异构体。
替代性小分子PKC-θ抑制剂化合物可选自如例如Maltais等在美国公开No.2013/0137703(其通过引用整体并入本文)中所述的氨基吡啶化合物。该类型的非限制性化合物具有式(XXXII)：
或其可药用盐，
其中：
R1是-H、C1-C3脂肪族基团、F或Cl。环B是5或6元单环杂芳环。X是-CH-、-S-或-NR2-。R2不存在或是-H。Y是-Y1或-Q1。Y1是任选地且独立地被一个或更多个F取代的C1-10脂肪族基团。
Q1是苯基或具有0至3个独立地选自氮、氧和硫之杂原子的5至6元单环杂芳环；并且Q1任选地且独立地被一个或更多个Ja取代。
D是环C或-Q-R3。
环C是具有1至2个氮原子的6至8元非芳族单环环或具有1至3个选自氮和氧之杂原子的8-12元非芳族桥连二环环系统；并且环C任选地且独立地被一个或更多个Jb取代。
Q是-NH-或-O-。
R3是被-OH或-NH2取代的C1-10烷基；其中R3中的三个至六个亚甲基单元可任选地形成C3-C6元环烷基环；并且R3进一步独立任选地且独立地被一个或更多个Je取代。
各Ja独立地是F或C1-C6烷基。
Jb是C1-C10烷基，其中多至三个亚甲基单元任选地被替代为-O-；并且其中C1-C10烷基任选地且独立地被一个或更多个Jc取代；或者Jb是C3-C6环烷基或C5-C6杂芳基；或者Jb是任选地且独立地被Jd取代的苯基；或者同一碳原子上的两个Jb形成＝O或螺C3-C6环烷基。
各Jc独立地是F、-OH或C3-C6环烷基。
各Jd独立地是F或Cl。
各Je独立地是苯基、具有1至3个独立地选自氮、氧和硫之杂原子的5至6元单环芳族或非芳族环；或者同一碳原子上的两个Je形成螺C3-C6环烷基。
u是0或1。
在一些实施方案中，环B是吡啶基；环C选自哌啶基、哌嗪基、二氮杂环庚基、三氮杂环庚基、azocanyl、diazocanyl、triazocanyl、吲哚基、吲唑基或二氮杂二环辛基；并且环C任选地且独立地被一个或更多个Jb取代并且其余变量如上所述。
根据式(XXXII)的代表性化合物包括：
本发明还考虑了如例如Jimenez等在美国公开No.2013/0053395(其通过引用整体并入本文)中所述的吡唑并吡啶化合物。该类型的说明性衍生物包括根据式(XXXIII)的化合物：
或其可药用盐，
其中：
T是-NH-或不存在。
各Jc1和Jc2独立地是-CN、-F、-Cl、-OR、-CH2OR或-CF3。
各U1、U2和U3独立地是-H、Z或Jb，其中U1、U2和U3中的不多于一个是-H，或者U1、U2和U3中的两个连接在一起形成具有0至1个杂原子的C1-C6环烷基环，所述C1-C6环烷基环任选地且独立地被一个或更多个Je取代。
Z是Y2-Q2。
Y2不存在或者是任选地且独立地被一个或更多个Jd取代的C1-6烷基。
Q2不存在或者是具有0至1个杂原子的任选地且独立地被一个或更多个Je取代的C3-C8环烷基，其中Y2和Q2不同时不存在。
各Jb独立地是-F、-OR、-CN、-CF3、-N(R)2、-C(O)N(R)2、任选地且独立地被一个或更多个Ja取代的C1-6烷基。
各Ja独立地是-F、-OR、-N(R)2或-C(O)N(R)2。
各Jd独立地是-OR、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)2或F。
各Je独立地是C1-C6烷基、-OR、-N(R)2、-CF3或F。
各R是-H或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，在由＊表示的碳上存在非手性中心。
根据式(XXXIII)的化合物的非限制性实例包括由以下结构表示的化合物：
在Jimenez等(2013，J.Med.Chem.561799-180)中公开了替代的吡唑并吡啶PKC-θ抑制剂，其通过引用整体并入本文。示例性化合物由式(XXXIIIa)表示：
其中：
R1独立地是F、Cl或CF3；并且
R2独立地是H、F、Cl、OH、CN或CH2OH。
在一些具体实施方案中，吡唑并吡啶化合物由式(XXXIIIb)表示：
该化合物在Jimenez等(2013，J.Med.Chem.561799-180)中被命名为化合物27(本文中也称为“C27”)。
在又一些实施方案中，小分子PKC-θ抑制剂选自如例如Brenchley等在美国公开No.2012/0184534(其通过引用整体并入本文)中所述的三环吡唑并吡啶化合物。该类型的非限制性化合物由(XXXIV)式表示：
或其可药用盐，
其中：
R1是-H、卤素、-OR′、-N(R′)2、-C(O)OR′、-C(O)N(R′)2、-NR′C(O)R′、NR′C(O)OR′、-CN、-NO2、任选地且独立地被一个或更多个Ja取代的C1-C10脂肪族基团、或者任选地且独立地被一个或更多个Jb取代的C3-C8脂环族基团(cycloaliphatic)。
R2是-H、卤素、-CN、-NO2、-OR′、-N(R′)2、-C(O)OR′、-C(O)N(R′)2、-NR′C(O)R′、-NR′C(O)OR′、任选地且独立地被一个或更多个Ja取代的C1-C10脂肪族基团、或者任选地且独立地被一个或更多个Jb取代的C3-C8脂环族基团。
X是-C-或-N-。
Rx不存在或是-H。
环B是任选地与芳族或非芳族环稠合的5元单环杂芳环；并且环B任选地被一个Y取代并且独立地进一步任选地且独立地被一个或更多个Jc取代。
Y是-Y1-Q1。
Y1不存在或者是C1-10脂肪族基团，其中Y1的多至三个亚甲基单元任选地且独立地被G′替代，其中G′是-O-、-C(O)-、-N(R′)-或-S(O)p-；并且Y1任选地且独立地被一个或更多个Jd取代。
Q1不存在，或者是具有0至3个独立地选自氮、氧和硫之杂原子的C3-8元饱和、部分不饱和或完全不饱和的单环的环；并且Q1任选地且独立地被一个或更多个Jb取代；其中Y1和Q1不同时不存在。
环C是具有0至3个独立地选自氮、氧和硫之杂原子的3至8元饱和、部分不饱和或完全不饱和的单环的环，或者具有0至5个独立地选自氮、氧和硫之杂原子的8至12元饱和、部分不饱和或完全不饱和的二环环系统；并且环C任选地被一个Z取代并且独立地进一步任选地且独立地被一个或更多个Jb取代。
Z是-Y2-Q2。
Y2不存在或者是C1-10脂肪族基团，其中Y2的多至三个亚甲基单元任选地且独立地被G′替代，其中，G′是-O-、-C(O)-、-N(R′)-或-S(O)p-；并且Y2任选地且独立地被一个或更多个Jd取代。
Q2不存在，是具有0至3个独立地选自氮、氧和硫之杂原子的C3-8元饱和、部分不饱和或完全不饱和的单环的环，或者具有0至5个独立地选自氮、氧和硫之杂原子的8至12元饱和、部分不饱和或完全不饱和的二环环系统；并且Q2任选地且独立地被一个或更多个Je取代；其中Y2和Q2不同时不存在。
各R′独立地是-H或者任选地且独立地被一个或更多个Ja取代的C1-C6烷基。
各Ja独立地是卤素、-OR、-N(R)2、-C(O)OR、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)OR、-CN、-NO2或氧代。
各Jb独立地是卤素、-OR、-N(R)2、-C(O)OR、-C(O)N(R)2、-NRC(O)R、-NRC(O)OR、-CN、-NO2、氧代或任选地且独立地被Ja取代的C1-C6烷基。
各Jc独立地是卤素、-OR′、-N(R′)2、-C(O)OR′、-C(O)N(R′)2、-NR′C(O)R′、-NR′C(O)OR′、-CN、-NO2、或者任选地且独立地被一个或更多个Ja取代的C1-C10脂肪族基团、或者任选地且独立地被一个或更多个Jb取代的C3-C8脂环族基团。
各Jd独立地是卤素、-CN或-NO2。各Je独立地是卤素、-CN、-NO2、氧代、C1-10脂肪族基团，其中多至三个亚甲基单元任选地且独立地被G′替代，其中G′是-C-、-C(O)-、-N(R′)-或-S(O)p-，并且所述脂肪族基团任选地且独立地被一个或更多个Jd取代，或者Je是任选地且独立地被一个或更多个Jb取代的C3-8脂环族基团。
各R独立地是-H或C1-C6烷基。
各p独立地是0、1或2。
根据式(XXXIV)的化合物的代表性实例包括：
小分子PKC-θ抑制剂的又一些实施方案包括如例如Fleming等在美国公开No.2011/0071134(其通过引用整体并入本文)中所述的2-(氨基取代的)-4-芳基嘧啶化合物。该类型的代表性化合物由式(XXXV)表示：
或其可药用盐，
其中：
R1和R2各自独立地是H、C1-3烷基或C3-5环烷基；
R3是H或F；
R4是H、F、-ORa、-C(O)Ra、-C(O)ORa或-N(Ra)2，或者R3和R4与其所连接的碳原子一起形成羰基；其中Ra在每次出现时独立地是H、C1-3烷基或C3-5环烷基；
环A任选地被1或2个独立出现的R5取代，其中各R5独立地选自卤素、C1-4脂肪族基团、-CN、-ORb、-SRC、-N(Rb)2、-NRbC(O)Rb、-NRbC(O)N(Rb)2、-NRbCO2RC、-CO2Rb、-C(O)Rb、-C(O)N(Rb)2、-OC(O)N(Rb)2、-S(O)2RC、-SO2N(Rb)2、-S(O)RC、-NRbSO2N(Rb)2、-NRbSO2RC，或者任选地被卤素、-CN、-ORb、-SRC、-N(Rb)2、NRbC(O)Rb、-NRbC(O)N(Rb)2、-NRbCO2RC、-CO2Rb、-C(O)Rb、-C(O)N(Rb)2、-OC(O)N(Rb)2、-S(O)2RC、-SO2N(Rb)2、-S(O)RC、-NRbSO2N(Rb)2或-NRbSO2RC取代的C1-4脂肪族基团，其中Rb在每次出现时独立地是H或C1-4脂肪族基团，或者同一氮原子上的两个Rb与该氮原子一起形成除该氮原子之外还具有0至2个选自N、O或S之环杂原子的5至8元芳族或非芳族环；并且RC在每次出现时独立地是C1-4脂肪族基团；
Cy1选自：a)在环的间位或对位被出现一次的W取代的6元芳基或杂芳基环，或者b)被出现一次的W取代的5元杂芳基环；
其中Cy1还任选地被1至3个独立出现的R6取代，其中R6在每次出现时独立地选自卤素、C1-8脂肪族基团、-CN、-ORb、-SRD、-N(RE)2、-NREC(O)Rb、-NREC(O)N(RE)2、-NRECO2RD、-CO2Rb、-C(O)Rb、-C(O)N(RE)2、-OC(O)N(RE)2、-S(O)2RD、-SO2N(RE)2、-S(O)RD、-NRESO2N(RE)2、-NRESO2RD、-C(＝NH)-N(RE)2，或者任选地被卤素、-CN、-ORb、-SRD、-N(RE)2、-NREC(O)Rb、-NREC(O)N(RE)2、-NRECO2RD、-CO2Rb、-C(O)Rb、-C(O)N(RE)2、-OC(O)N(RE)2、-S(O)2RD、-SO2N(RE)2、-S(O)RD、-NRESO2N(RE)2、-NRESO2RD或-C(＝NH)-N(RE)2取代的C1-8脂肪族基团，其中RD在每次出现时是C1-6脂肪族基团，并且RE在每次出现时独立地是H、C1-6脂肪族基团、-C(＝O)Rb、-C(O)ORb或-SO2Rb，或者同一氮原子上的两个RE与该氮原子一起形成除该氮原子之外还具有0至2个选自N、O或S之环杂原子的5至8元芳族或非芳族环；
W是-R8、V-R8、L1-R7、V-L1-R7、L1-V-R8或L1-V-L2-R7；其中L1和L2各自独立地是任选经取代的C1-6亚烷基链；V是-CH2-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)-、-CO2-、-NRE-NREC(O)-、-NRECO2-、-NRESO2-、-C(O)N(Rb)-、-SO2N(Rb)-、-NREC(O)N(Rb)-或-OC(O)-；R7是H、卤素、-OH、-N(RF)2、-CN、-ORG、-C(O)RG、-CO2H、-CO2RG、-SRG、-S(O)RG、-S(O)2RG、-N(RE)C(O)RG、-N(RE)CO2RG、-N(RE)SO2RG、-C(O)N(RF)2、-SO2N(RF)2、-N(RE)C(O)N(RF)2、-OC(O)RF，或者选自C1-10脂肪族基团、C6-10芳基、3至14元杂环基或5至14元杂芳基的任选经取代的基团，其中RF在每次出现时独立地是H、C1-6脂肪族基团、C6-10芳基、3至14元杂环基、5至14元杂芳基、-C(＝O)Rb、-C(O)ORb或-SO2Rb，或者同一氮原子上的两个RF与该氮原子一起形成除该氮原子之外还具有0至2个选自N、O或S之环杂原子的任选经取代的5至8元芳族或非芳族环；并且RG在每次出现时是C1-6脂肪族基团、C6-10芳基、3至14元杂环基或5至14元杂芳基；R8是选自C1-10脂肪族基团、C6-10芳基、3至14元杂环基或5至14元杂芳基的任选经取代的基团；
Q是键、CH2或C(＝O)；
Cy2是C6-10芳基、5至10元杂芳基或5至10元杂环基环，其中每个环任选地被1至3个独立出现的R9和出现一次的R10取代，
其中R9的每一次出现独立地选自C1-4脂肪族基团、-N(Rb)2、卤素、NO2、-CN、-ORb、-C(O)Ra、-CO2Ra、-SRC、-S(O)RC、-S(O)2RC、-OS(O)2RC-、N(Rb)C(O)Ra、-N(Rb)CO2Ra、-N(Rb)SO2Ra、-C(O)N(Rb)2、-SO2N(Rb)2、-N(Rb)C(O)N(Rb)2、-OC(O)Ra，或者任选地被-N(Rb)2、卤素、NO2、-CN、-ORb、-C(O)Ra、-CO2Ra、-SRC、-S(O)RC、-OS(O)2RC、-S(O)2RC、-N(Rb)C(O)Ra、-N(Rb)CO2Ra、-N(Rb)SO2Ra、-C(O)N(Rb)2、-SO2N(Rb)2、-N(Rb)C(O)N(Rb)或-OC(O)Ra取代的C1-4脂肪族基团，并且
R10选自苯基，或者5至6元杂环基或杂芳基环。
在某些实施方案中，式XVII的化合物具有一个或更多个或所有的以下限制：
1)当Cy1是在间位被W取代的苯基时，则：
a)当W是-OMe，R1、R2、R3和R4各自是氢并且Q是键时，则当环A进一步被R5取代时，R5是除-CF3或-C(O)N(Rb)2之外的基团；并且
b)当W是-OMe，R1、R2、R3和R4各自是氢并且Q是-CH2-时，则Cy2不是1H-苯并咪唑-1-基；
2)当Cy1是在对位被W取代的苯基并且R1、R2、R3和R4各自是氢时，则：
a)当Q是键时，W不是：i)-CONH2；ii)-CONHR8，其中R8是选自苯基、-烷基苯基、烷基或-烷基杂环的任选经取代的基团；iii)-CF3；iv)-SO2Me；v)-NH2；vi)-tBu；vii)-CO2H，当Cy2是吗啉时；viii)-O(苯基)，当Cy2是吲哚时；和ix)-OMe；
b)当Q是-CH2-时，W不是：i)-CONH2，当Cy2是任选经取代的咪唑或苯并咪唑时；ii)-CONHR8，其中R8是选自苯基、-烷基苯基或-烷基杂环的任选经取代的基团；iii)-CF3；iv)-SO2Me；v)-OH，其中Cy2是5至10元杂环基环；vi)tBu，当Cy2是5至10元杂环基环时；和vii)-OMe；以及3)当Cy1是5元杂芳基环时，则：
a)当Cy1是异唑，R1、R2、R3和R4各自是氢，Q是键并且W是对氟苯基时，则Cy2是除吡啶基或N-吡咯烷基的基团；
b)当Cy1是三唑基，R1、R2、R3和R4各自是氢，Q是键并且W是-(CH2)2N(环戊基)C(O)CH2(萘基)时，则Cy2是除N-哌啶基的基团；
c)当Cy1是咪唑基，R1、R2、R3和R4各自是氢、Q是键并且W是是间-CF3-苯基时，则R6是除C(O)OCH2CH3的基团；并且
d)当Cy1是咪唑-5-基和W是对氟苯基时，则R6是除环己基的基团。
该类型的非限制性化合物由以下结构表示：
和
在另一些实施方案中，小分子PKC-θ抑制剂包括如例如由Cardozo等在美国公开No.2005/0124640中所述的嘧啶衍生物，其通过引用整体并入本文。这种类型的代表性化合物由式(XXXVI)表示：
其中：
R1是C1-8烷基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-8烷基、萘基、喹啉基、芳基-C1-8烷基或杂芳基C1-8烷基，其中在每个C1-8烷基中，亚甲基可以任选地被-NHC(O)-或-C(O)NH-替代，并且其中每个C1-8烷基任选地被氧代基团或者一个或更多个C1-3烷基取代，其中C1-8烷基的相同碳原子上的两个烷基取代基可以任选地结合以形成C2-5亚烷基桥，并且其中所述芳基任选地在相邻碳原子上被C3-6亚烷基桥基团取代，其中亚甲基任选地被氧、-S-、-S(O)-、-SO2-或-N(R6)-替代；
或R1具有以下结构：
其中x和y独立地为0、1、2、3或4，条件是x+y为2至4，z是0、1或2，并且环中的一个或两个CH2基团可任选地被-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-或-N(R6)-替代；
其中每个R1基团任选地被一个或更多个以下基团取代：C1-6烷基、C3-6环烷基、卤素、硝基、羟基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、芳基、芳基C1-6烷基、芳氧基、芳硫基、氨基磺酰基、或任选地被一个或两个C1-6烷基取代的氨基，其中每个芳基任选地被一个或更多个C1-6烷基、卤素、硝基、羟基或任选地被一个或两个C1-6烷基取代的氨基取代，并且其中在每个C1-6烷基中，亚甲基可以任选地被-NHC(O)-或-C(O)NH-替代，并且其中每个C1-6烷基任选地被一个或更多个卤素取代；
R2选自以下基团：
其中：
n是3至8的整数；
p是1至3的整数；
q是0至3的整数；
R4和R5各自独立地选自：氢、C1-6烷基、芳基C1-6烷基或脒基，其中每个芳基任选地被一个或更多个C1-6烷基、卤素、硝基、羟基或任选地被一个或两个C1-6烷基取代的氨基取代，并且其中每个C1-6烷基任选地被一个或更多个卤素取代，并且其中所述脒基任选地被一至三个C1-6烷基取代；
R6是氢或C1-6烷基；
其中每个R2基团任选地被一个或更多个C1-6烷基、C1-6烷氧基、CN、-OH、-NH2或卤素取代；
R3是卤素、氰基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基或氨基羰基，其中每个C1-6烷基任选地被一个或更多个卤素取代；
或其互变异构体、可药用盐、溶剂合物或氨基保护的衍生物，
在式(XVIII)的嘧啶衍生物化合物的一些实施方案中：
R1是芳基-C1-4烷基或杂芳基-C1-4烷基，其中在每个C1-4烷基中，亚甲基可以任选地被-NHC(O)-或-C(O)NH-替代，并且其中每个C1-4烷基任选地被氧代基团或一个或更多个C1-3烷基取代，其中C1-4烷基的相同碳原子上的两个烷基取代基可以任选地结合以形成C2-5亚烷基桥，并且其中所述芳基任选地在相邻碳原子上被C3-6亚烷基桥基团取代，其中亚甲基任选地被氧、硫或-N(R6)-替代；
或R1具有以下结构：
其中x和y独立地为0、1、2或3，条件是x+y为2至3，并且z是0或1；
其中“杂芳基”被定义为吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基或吲哚基；
其中每个R1基团任选地被一个或更多个以下基团取代：C1-6烷基、Cl、Br、F、硝基、羟基、CF3、-OCF3、-OCF2H、-SCF3、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、苯基、苄基、苯氧基、苯硫基、氨基磺酰基或任选地被一个或两个C1-3烷基取代的氨基；
R2选自以下基团：
其中：
n是5至7的整数；
p是1至2的整数；
q是1至2的整数；
R4和R5各自独立地选自氢、C1-6烷基、芳基C1-6烷基或脒基；
R6是氢；
R3是Br、Cl、F、氰基或硝基；
或其互变异构体、可药用盐、溶剂合物或氨基保护的衍生物；
在式(XVIII)的嘧啶衍生物化合物的另一些实施方案中：
R1是苯基-C1-4烷基或萘基C1-2烷基，
其中每个R1基团任选地被一个或更多个以下基团取代：甲基、Cl、Br、F、硝基、羟基、CF3、-OCF3、-SCF3、C1-4烷氧基或C1-4烷硫基；
R2选自以下基团：
其中：
R4和R5各自独立地选自氢、C1-3烷基或脒基；
R3是Br、Cl、氰基或硝基；
或其互变异构体、可药用盐、溶剂合物或氨基保护的衍生物；
在式(XVIII)的嘧啶衍生物化合物的又一些实施方案中：
R1是苯基CH2-
其中所述苯基任选地被一个或更多个以下基团取代：甲基、Cl、Br、F、硝基、羟基、CF3、-OCF3、-SCF3、C1-4烷氧基或C1-4烷硫基；
R2选自以下基团：
R3是硝基；
R4和R5各自独立地选自氢、甲基或脒基；
或其互变异构体、可药用盐、溶剂合物或氨基保护的衍生物。
式(XXXVI)的嘧啶衍生物化合物的非限制性实例选自：
4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-2-[(2-氯苄基)氨基]嘧啶-5-羧酸乙酯；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]-甲基}-5-硝基-N2-[(2R)-1，2，3，4-四氢萘-2-基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[(2S)-1，2，3，4-四氢萘-2-基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[(1R)-1，2，3，4-四氢萘-1-基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]-甲基}-5-硝基-N2-[(1S)-1，2，3，4-四氢萘-1-基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(4-氯苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(2-甲基苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(3-甲基苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(4-甲苯基)甲基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(2-氟苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]-甲基}-N2-[2-(3-氟苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(4-氟苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N2-(2-氨基苄基)-N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]间-乙基}-N2-(3，5-二甲氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[3，5-双(三氟甲基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；{3-[({2-[(2-氯苄基)氨基]-5-硝基嘧啶-4-基}氨基)甲基]苯基}甲烷胺；2-({[4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-5--硝基嘧啶-2-基]氨基}甲基)苯酚；N2-(5-氨基-2-氯苄基)-N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-2-[(2-氯苄基)氨基]嘧啶-5-甲酰胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯苄基)-5-氟嘧啶-2，4-二胺；3-({[4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-5-硝基嘧啶-2-基]氨基}甲基)-N-[2-(2-甲基苯基)乙基]苯甲酰胺；(1S，2R)-2-({[4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-5-硝基嘧啶-2-基]氨基}甲基)环己醇；(1R，2R)-2-({[4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-5-硝基嘧啶-2-基]氨基}甲基)环己醇；4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-2-[(2-氯苄基)氨基]嘧啶-5-羧酸甲酯；4-{[4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-5-硝基嘧啶-2-基]氨基}-N-[2-(2-甲基苯基)乙基]丁酰胺；5-{[4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-5-硝基嘧啶-2-基]氨基}-N-[2-(2-甲基苯基)乙基]戊酰胺；6-{[4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-5-硝基嘧啶-2-基]氨基}-N-[2-(2-甲基苯基)乙基]己酰胺；(1R，3R)-3-({[4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-5-硝基嘧啶-2-基]氨基}甲基)-4，4-二甲基环己醇；N4-({4-顺式-[(二甲基氨基)甲基]环己基}甲基)-N2-(1-萘基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N2-(1-萘基甲基)-5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；N4-({4-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-({4-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-5-硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N4-({4-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-N2-(1-萘基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{4-[(二甲氨基)甲基]苄基}-N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{4-[(二甲氨基)甲基]苄基}-5-硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N4-{4-[(二甲氨基)甲基]苄基}-N2-(1-萘基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-[(1-甲基哌啶-4-基)甲基]-N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-[(1-甲基哌啶-4-基)甲基]-5-硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4二胺；N4-[(1-甲基哌啶-4-基)甲基]-N2-(1-萘基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N2-(2-氯苄基)-N4--[(1-间乙基哌啶-4-基)甲基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N2-(2-甲氧基苄基)-N4-[(1-甲基哌啶-4-基)甲基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-甲氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[2-(三氟甲基)苄基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(-2，4-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(3-甲氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[4-氟-2-(三氟甲基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(3-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(吡啶-2-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)-环己基]甲基}-N2-(3-氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(4-氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N-(4-溴苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，4-二甲氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N.S-up.2-[2-氯-5-(三氟甲基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，5-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[2-(三氟甲氧基)苄基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯-6-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，3-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]-甲基}-N2-(2-呋喃基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(噻吩-2-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯苄基)-5-甲基嘧啶-2，4-二胺；N4-(6-氨基己基)-N2-(2-氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N-[4-(氨基甲基)苄基]-N2-(2-氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-(7-氨基庚基)-N2-(2-氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[3-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(1-甲基-1-苯乙基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；4-(4，4’-联哌啶-1-基)-N-(2-氯苄基)-5-硝基吡啶-2-胺；N2-(2-氯苄基)-N4-({4-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-5-硝基吡啶(N2-(2-chlorobenzyl)-N4-({4-[(dimethylamino)methyl]cyclohexyl}methyl)-5-nitropyri)；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]间乙基}-N2-(2，5-二氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基-)环己基]甲基}-N2-[4-(二氟甲氧基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-乙氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[(1S)-1-苯乙基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N.s-up.2-(2-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(3-氯-2-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(4-戊基苯基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(4-丁氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，3-二甲氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)-环己基]甲基}-N2-(2，5-二甲氧基苄基)-5-硝基-嘧啶-2，4-二胺；N2-(2-氯苄基)-N4-[7-(二甲氨基)庚基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(1，1’-联苯-2-基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(-4-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，4-二氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基-)环己基]甲基}-N2-(3-氟-4-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，3-二氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-(2-氯苄基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]-甲基}-N2-(2，6-二甲氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，6二氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-氟-3-(三氟甲基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(4-氯-2-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(1-苯基环丙基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2--[1-(2-氯苯基)-1-甲基乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[(1，5-二甲基-1H-吡咯-2-基)甲基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-溴苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，3-二甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，4-二甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，5-二甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；2N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-氟-5-(三氟甲基)苄基[-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5--硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]-苄基}嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(3-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(6-氯-2-氟-3-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯-6-氟-3-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-2-萘基-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(1-萘基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N N2-[2-氟-4-(三氟甲基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(4-氯-2-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(5-氯-2-)甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(3-氯-2-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基[-甲基}-N2-[5-氟-2-(三氟甲基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(-5-氯-2-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基-)环己基]甲基}-N2-(2，3-二氟-4-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(-5-氟-2-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基-)环己基]甲基}-N2-1-萘基-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；{4-反式-[({2-[(2-氯苄基)氨基]-5-硝基嘧啶-4-基}氨基)甲基]环己基}甲醇；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-(2，5-二氯苄基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-(2，4-二氯苄基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-(2-溴苄基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N.su-p.2-(环己基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-萘基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-[2-(三氟甲氧基)苄基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-[2-(三氟甲基)苄基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(二氟甲氧基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基-]甲基}-N2-[3-(二氟甲氧基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯-4-氟苄基)-5-硝基嘧啶--2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)-环己基]甲基}-N2-(2-氯-3，6-二氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(2，3，5-三氟苄基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(2，3，4，5-四氟苄基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[(1R)-1-苯乙基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]间乙基}-N2-2，3-二氢-1H-茚-2-基-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[(1S)-2，3-二氢-1H-茚-1-基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[(1R)-2，3-二氢-1H-茚-1-基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(4-氯-1-萘基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(4-甲氧基-2-萘基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-喹啉-6-基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-反式-(氨基甲基)环己基]甲基}--N2-(2，5-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-反式-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，3-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(2-氯苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(3-氯苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯-6-苯氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-2-萘基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-(1-萘基甲基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5--硝基-N2-(吡啶-3-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-2-[(2-氯苄基)氨基]嘧啶-5-甲腈；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[4-(二甲氨基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-反式-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-溴苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-(7-氨基庚基)-N2-(2-溴苄基-)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-(7-氨基庚基)-N2-(2，5-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N-({4-[({2-[(2-氯苄基)氨基]-5-硝基嘧啶-4-基}氨基)甲基]环己基}甲基-)胍；N2-(3-氨基苄基)-M-{-[4(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(2-硝基苄基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[-2-(2-溴苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-溴苄基)-5-氯嘧啶-2，4-二胺；(4-{[(2-{[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基}-5-硝基嘧啶-)4-基)氨基]甲基}环己基)氯化甲烷铵；N-({3-[({2-[(2-氯苄基)-氨基]-5-硝基嘧啶-4-基}氨基)甲基]环己基}甲基)胍；3-({[4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-5-硝基嘧啶-2-基]氨基}甲基)苯酚；(4-{[(2-{[2-(1H-咪唑-4-基)乙基]氨基}-5-硝基嘧啶-4-基)氨基]甲基}环己基)-氯化甲烷铵；N2-(2-氯苄基)-M-({4-顺式-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-氯-N2-(2-氯苄基)嘧啶-2，4-二胺；N2-(2-氯苄基)-5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(2-苯乙基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(3-苯丙基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(4-苯丁基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基-]甲基}-5-硝基-N2-(2-苯丙基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(3-甲氧基苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(2-甲氧基苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；4-[({2-[(2-氯苄基)氨基]-5-硝基嘧啶-4-基}氨基)甲基]哌啶-1-甲脒；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(3，5-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-(5-氨基戊基)-N2-(2-氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；2-(苄基氨基)-4-(1，4，6，7-四氢-咪唑并[4，5-c]吡啶-5-基)-5-三氟甲基-嘧啶；2-(4-氯苄基氨基)-4-(1，4，6，7-四氢-咪唑并[4，5-c]吡啶-5-基)-5-硝基-嘧啶；2-(2-氯苄基氨基)-4-(1，4，6，7-四氢-咪唑并[4，5-c]吡啶-5-基)-5-硝基-嘧啶；2-(苄氨基)-4-(1，4，6，7-四氢咪唑并[4，5-c]吡啶-5-基)-5-硝基-嘧啶；或N4-{[反式-4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[2-(三氟甲氧基)苄基]嘧啶-2，4-二胺。
在一些实施方案中，式(XXXVI)的嘧啶衍生物化合物选自：
N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[(2R)-1，2，3，4-四氢萘-2-基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(4-氯苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(3-甲基苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基-)环己基]甲基}-N2-[2-(4-甲基苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(3-氟苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(4-氟苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；(1R，3R)-3-({[4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-5-硝基嘧啶-2-基]氨基}甲基)-4，4-二甲基环己醇；N4-({4-顺式-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-N2-(1-萘基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)-N2-{-2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N2-(1-萘基甲基)-5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；N4-({4-[(二甲基氨基)甲基]环己基}甲基-)-N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-({4-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-5-硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N4-({4-[(二甲基氨基)甲基]环己基}甲基)-N2-(1-萘基-甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{4-[(二甲基氨基)甲基]苄基}-N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{4-[(二甲氨基)甲基]苄基}-5-硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N4-[(1-甲基哌啶-4-基)甲基]-N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-[(1-甲基哌啶-4-基)甲基]-5-硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-甲氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[2-(三氟甲基)苄基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，4-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[4-氟-2-(三氟甲基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(3-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(3-氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(4-溴苄基-)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-氯-5-(三氟甲基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，5-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[2-(三氟甲氧基)苄基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯-6-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，3-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[3-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N2-(2-氯苄基)-N4-({4-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，5-二氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-乙氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(3-氯-2-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(1，1’-联苯-2-基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，4-二氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(-2，3-二氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，6-二氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-氟-3-(三氟甲基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(4-氯-2-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-溴苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基-)环己基]甲基}-N2-(2，3-二甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2--(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫基]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(3-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(6-氯-2-氟-3-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯-6-氟-3-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-2-萘基-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(1-萘基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(4-氯-2-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(5-氯-2-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(3-氯-2--甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[5-氟-2-(三氟甲基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(5-氯-2-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基-)环己基]甲基}-N2-(2，3-二氟-4-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(5-氟-2-甲基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-(2，5-二氯苄基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-(2-溴苄基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(环己基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-[2-(三氟甲基)苄基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(二氟甲氧基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯-4-氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基-)环己基]甲基}-N2-(2-氯-3，6-二氟苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(2，3，5-三氟苄基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-2，3-二氢-1H-茚-2-基-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(4-氯-1-萘基)--5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(4-甲氧基-2-萘基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-喹啉-6-基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-反式-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，3-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(2-氯苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(3-氯苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-溴-N2-2-萘基嘧啶-2，4-二胺；4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-2-[(2-氯苄基)氨基]嘧啶-5-甲腈；N4-{[4-反式-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-溴苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-(7-氨基庚基)-N2-(2-溴苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-(7-氨基庚基)-N2-(2，5-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N-({4-[({2-[(2-氯苄基)氨基]-5-硝基嘧啶-4-基}氨基)甲基]环己基}甲基)胍；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(2-硝基苄基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(2-溴苯基)乙基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-溴苄基)-5-氯嘧啶-2，4-二胺；N-({3-[({2-[(2-氯苄基)氨基]-5-硝基嘧啶-4-基}氨基)甲基]环己基}甲基)胍3-({[4-({[4-(氨基甲基)环己基]甲基}氨基)-5-硝基嘧啶-2-基]氨基}甲基)苯酚；N2-(2-氯苄基)-N4-({-4-顺式-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N2-(2-氯苄基)-5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(2-苯乙基)嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-(4-苯丁基)嘧啶-2，4-二胺；或N4-{[反式-4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[2-(三氟甲氧基)-苄基]嘧啶-2，4-二胺。
在另一些实施方案中，式(XXXVI)的嘧啶衍生物化合物选自：
N4-({4-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-N2-(1-萘基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)-N2-{-2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N2-(1-萘基甲基)-5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；N4-({4-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基-)-N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-({4-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-5-硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N4-({4-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-N2-(1-萘基-甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{4-[(二甲氨基)甲基]苄基}-N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{4-[(二甲氨基)甲基]苄基}-5-硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N4-[(1-甲基哌啶-4-基)甲基]-N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-[(1-甲基哌啶-4-基)甲基]-5-硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]苄基}嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-甲氧基苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[2-(三氟甲氧基)苄基]嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]-甲基}-N2-(2，3-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[3-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N2-(2-氯苄基)-N4-({4-[(二甲氨基)甲基]环己基}甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-溴苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-[2-(甲硫基)苄基]-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-{2-[(三氟甲基)硫代]苄基}-嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(1-萘基甲基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2，3-二氯苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N4-{[4-(氨基甲基)环己基]甲基}-N2-(2-溴苄基)-5-硝基嘧啶-2，4-二胺；N2-(2-氯苄基)-5-硝基-N4-(哌啶-4-基甲基)嘧啶-2，4-二胺；或N4-{[反式-4-(氨基甲基)环己基]甲基}-5-硝基-N2-[2-(三氟甲氧基)-苄基]嘧啶-2，4-二胺。
替选的PKC-θ抑制剂嘧啶衍生物包括由Barbosa等在美国公开No.2010/0318929中所述的化合物，其通过引用整体并入本文。这些化合物由式(XXXVII)表示：
R1选自以下组，或其互变异构体、可药用盐、溶剂合物或氨基保护的衍生物：
其中：p是1、2或3；q是0或1，R5、R6各自独立地选自：(A)氢，(B)C1-6烷基，或其中R5和R6一起构成亚甲基桥，该亚甲基桥连同它们之间的氮原子形成四至六元环，其中所述一个亚甲基任选地被氧或氮原子替代，并且所述环任选且独立地被一个或更多个以下基团取代：(i)C1-6烷基(ii)COR7，其中R7是：(a)C1-6烷基，(b)C1-6烷氧基，(C)C1-6烷基羰基，(D)C1-6烷基磺酰基，(E)-CONR8R9，其中R8和RR各自独立地选自：(i)氢(ii)C1-6烷基；R2选自以下基团：(F)CF3，(G)氰基，(H)CONH2(I)卤素，或(J)硝基；R3选自以下基团：(A)氢，(B)C1-6烷基，其任选地被卤素取代，(C)C1-6烷氧基，其任选地被卤素取代，(D)卤素，R4选自以下基团：(A)杂芳基，其任选地被C1-6烷基取代；(B)芳基或杂芳基，其被一个或更多个以下基团取代：(i)C1-6烷基，其被羟基、氧代或NR10R11取代，其中R10和R11各自独立地选自以下基团：(a)氢，(b)C1-6烷基，其任选地被羟基或CONH2取代，(c)C1-6烷基羰基，其任选地被一个或更多个卤素取代，(d)C1-6烷基磺酰基，(e)或者其中R10和R11构成亚甲基桥，该亚甲基桥连同它们之间的氮原子形成四至六元环，(ii)CONR12R13，其中R12和R13各自独立地选自氢或C1-6烷基，(iii)SO2NR12R13，其中R12和R13各自独立地选自氢或C1-6烷基，(C)-NR14R15，其中R14和R15各自独立地选自：(i)C1-6烷基羰基，其被氨基取代，(ii)或者其中R14和R15构成亚甲基桥，该亚甲基桥连同它们之间的氮原子形成四至七元环，其中所述一个亚甲基被C1-6烷基取代，并且其中每个C1-6烷基任选地被羟基或NR10R11取代，其中R10和R11如前面所定义，(D)-CONR16R17，其中R16和R17各自独立地选自：(i)C1-6烷基，其被羟基或NR18R19取代，其中R18和R19各自独立地选自氢或C1-6烷基，或其中R18和R19构成亚甲基桥，该亚甲基桥连同它们之间的氮原子形成四至六元环，其中所述一个亚甲基任选地被氧替代，(E)任选地被氨基、C1-3烷基氨基或二-(C1-3烷基)氨基取代的C6炔基；并且A独立地选自碳或氮。
在此类型的说明性实例中：R1选自以下基团，或其互变异构体、可药用盐、溶剂合物或氨基保护的衍生物：
其中：q是0或1，R5、R6各自独立地选自：(A)氢，(B)或者其中R5和R6一起构成亚甲基桥，该亚甲基桥连同它们之间的氮原子形成五至六元环，其中所述一个亚甲基任选地被氮原子替代，并且所述环任选且独立地被一个或更多个以下基团取代：(iv)C1-6烷基(v)COR7，其中R7是C1-6烷氧基，(C)C1-6烷基羰基，(D)C1-6烷基磺酰基；R2选自以下基团：(A)氰基，或(B)硝基；R3选自以下基团：(A)C1-3烷基，(B)C1-3烷氧基，其任选地被氟取代，(C)卤素；R4选自以下基团：(A)芳基，其被一个或更多个以下基团取代：(i)C1-3烷基，其被羟基或NR20R21取代，其中R20和R21各自独立地选自以下基团：(f)氢，(g)C1-3烷基，其任选地被羟基或CONH2取代，(h)或者其中R20和R21构成亚甲基桥，该亚甲基桥连同它们之间的氮原子形成五至六元环，(ii)CONH2(iii)SO2NH2，(B)3-吡啶基，其任选地被C1-3烷基取代，其中每个烷基任选地被氨基取代，(C)-NR22R23，其中R22和R23构成亚甲基桥，该亚甲基桥连同它们之间的氮原子形成五至六元环，其中所述一个亚甲基被C1-3烷基取代，并且其中每个C1-3烷基任选地被OH或NR20R21取代，其中R20和R21如前面所定义，(D)-CONR24R25，其中R24和R25各自独立地选自：(i)C1-3烷基，其被C1-3烷基氨基取代；并且A独立地选自碳或氮。
在另一些说明性实例中，式(XXXVII)的化合物由式(XXXVII a)表示：
其中：
R1选自以下基团：
其中：q是0或1，R5、R6各自独立地选自：(A)氢、(B)C1-6烷基羰基、(C)C1-6烷基磺酰基；R2选自以下基团：(A)氰基或(B)硝基；R3选自以下基团：(A)CH3、(B)OCF3、(C)Cl；R4选自以下基团：
其中：R26选自以下基团，或其互变异构体、可药用盐、溶剂合物或氨基保护的衍生物：(A)C1-3烷基，其被羟基或NR27R28取代，其中R27和R28各自独立地选自以下基团：(i)氢，(ii)C1-3烷基，其任选地被羟基或CONH2取代，(B)CONH2(C)SO2NH2；并且A是碳或氮。
还考虑作为小分子PKC-θ抑制剂的是如例如由Ajioka等在美国公开No.2010/0120869中所述的苯胺化合物，其通过引用整体并入本文。这种类型的代表性化合物由式(XXXVIII)表示：
其中式XX的X是芳基或杂芳基，各自被1-5 R1基团取代。式XX的Y是-O-、-S(O)n-、-N(R4)-和-C(R4)2-，其中下标n是0-2。式XX的Z是-N＝或-CH＝。式XX的每个R1独立地选自：H、卤素、C1-8烷基、C1-6杂烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷氧基、-OR1a、-C(O)R1a、-C(O)OR1a、-C(O)NR1aR1b、-NR1aR1b、-SR1a、-N(R1a)C(O)R1b、-N(R1a)C(O)OR1b、-N(R1a)C(O)NR1aR1b、-OP(O)(OR1a)2、-S(O)2OR1a、-S(O)2NR1aR1b、-S(O)2-C1-6卤代烷基、-CN、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。式XX的每个R1a和R1b独立地为H或C1-6烷基。式XX的每个R2独立地为H、卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-NR1aR1b、-NR1aC(O)-C1-6烷基、-NR1aC(O)-C1-6卤代烷基、-NR1a-(CH2)-NR1aR1b、-NR1a-C(O)-NR1aR1b或-NR1a-C(O)OR1a，或者，相邻的R1基团和相邻的R2基团可结合以形成环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。式XX的R3是-NR3aR3b或-NCO。式XX的每个R3a和R3b独立地为H、C1-6烷基、-C(O)-C1-6烷基、-C(O)-C1-6卤代烷基、-(CH2)-NR1aR1b、-C(O)-NR1aR1b、-C(O)OR1a、-C(S)CN、氨基酸残基、肽或寡肽。式XX的每个R4独立地为H或C1-6烷基，或者当多于一个R4基团与同一原子相连接时，所述R4基团任选地结合以形成C5-8环烷基。式XX的化合物还包括其盐、水合物和前药。
在一些实施方案中，式XXXVIII的苯胺化合物由式XXXVIIIa表示：
其中式XXXVIIIa的每个R1独立地为H、卤素、C1-8烷基、C1-6杂烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷氧基、-OR1a、-CN、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，并且式XXXVIIIa的每个R3a和R3b独立地为H、-C(O)-C1-6烷基、氨基酸残基、肽或寡肽。
在又一些实施方案中，式XXXVIIIa的每个R1独立地为H、卤素、C1-8烷基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、-C(O)OR1a、环烷基或杂芳基。此外，式XXXVIIIa的每个R2独立地为H、卤素或-NR1aC(O)-C1-6烷基。在另一些实施方案中，式XXXVIIIa的每个R1独立地为H、甲基、正丙基、异丙基、叔丁基、叔戊基、Cl、Br、CF3、OCF3、环戊基、吡咯基或CO2H，并且每个R2独立地为H或Cl。在另一些实施方案中，式XX的R3a是氨基酸残基，并且R3b是H。合适地，所述氨基酸残基是精氨酸残基。
在又一些实施方案中，式XXXVIII的苯胺化合物具有式XXXVIIIb：
在一些实施方案中，式XXXVIIIb的Y是S。在又一些实施方案中，式XXXVIIIb的Y是O。在一些实施方案中，式XXXVIIIb的每个R1独立地为H、甲基、正丙基、异丙基、叔丁基、叔戊基、Cl、Br、CF3、OCF3、环戊基、吡咯基或CO2H。在另一些实施方案中，式XXXVIIIb的每个R1独立地为C1-8烷基或环烷基。在又一些实施方案中，式XXXVIIIb的每个R1独立地为4-叔丁基、4-环戊基或4-叔戊基。
在另一些实施方案中，小分子PKC-θ抑制剂选自具有式(XXXIX)的粗糠柴苦素(rottlerin)(也称为菲律宾野桐毒素(mallotoxin)或1-[6-[(3-乙酰基-2，4，6-三羟基-5-甲基苯基)甲基]-5，7-二羟基-2，2-二甲基-2H-1-苯并吡喃-8-基]-3-苯基-2-丙烯-1-酮，可购自Calbiochem，San Diego，Calif.)，或其衍生物或类似物。
在又一些实施方案中，小分子PKC-θ抑制剂包括如例如由Baudler在美国专利申请公开US2005/0222186 A1中公开的经取代的二氨基嘧啶，其通过引用整体并入本文。这些化合物由式(XXXX)表示：
其中R1、R2和R3独立地选自：经取代或未取代的苯基、萘基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、1，2，3-三唑基、吲哚基、苯并咪唑基、呋喃基(呋喃基)、苯并呋喃基(苯并呋喃基)、苯硫基(噻吩基)、苯并苯硫基(苯并噻吩基)、噻唑基、异唑基、吡啶基、嘧啶基、喹啉基和异喹啉基；R4是氢或甲基；R5是氢或甲基；A1是C1-3亚烷基或乙烯氧基(-CH2-CH2-O-)；并且A2是C1-3亚烷基或乙烯氧基(-CH2-CH2-O-)；以及由其水合物、溶剂合物、盐或酯表示。
此类化合物的非限制性实例包括：[1-苄基(4-哌啶基)]{2-[(2-吡啶基甲基)氨基]-5-(3-噻吩基)嘧啶-4-基}胺；{5-(4-甲氧基苯基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基)嘧啶-4-基}[1-苄基-(4-哌啶基)]胺；{5-苯基-2-[(4-吡啶基甲基)氨基)嘧啶-4-基}[1-苄基(4-哌啶基-1-)]胺；{5-(4-氯苯基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基)嘧啶-4-基}[1-苄基(4-哌啶基)]胺；{5-(4-(N，N-二甲氨基)苯基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基)嘧啶-4-基}[1-苄基(4-哌啶基)]胺；{5-(苯基-4-甲酰氨)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基)嘧啶-4-基}[1-苄基(4-哌啶基)]-胺；{5-(4-羧基苯基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基)嘧啶-4-基}[1-苄基-(-4-哌啶基)]胺；{5-(2-噻吩基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基)嘧啶-4-基}[1-苄基(4-哌啶基)]胺；{5-(2-呋喃基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基)嘧啶-4-基}[1-苄基(4-哌啶基)]胺；{5-(3-呋喃基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基)嘧啶-4-基}[1-苄基(4-哌啶基)]胺；N(4)-(1-苄基-哌啶-4-基)-5-(3-氯-4-氟-苯基)-N(2)-吡啶-2-基甲基-嘧啶-2，4-二胺；N-(3-{4-(1-苄基-哌啶-4-基氨基)-2-[(吡啶-2-基甲基)-氨基]-嘧啶-5-基}苯基)-乙酰胺；3-[4-(1-苄基-哌啶-4-基氨基)-2-[(吡啶-2-基甲基)-氨基]-嘧啶-5-基]-苯酚；和4-{4-(1-苄基哌啶-4-基氨基)-2-[(吡啶-2-基甲基)-氨基]-嘧啶-5-基}-N，N-二甲基苯甲酰胺。
在又一些实施方案中，小分子PKC-θ抑制剂选自如例如由Brunette在美国专利申请公开US2006/0217417中公开的经取代的吡啶化合物，其通过引用整体并入本文。这些化合物由式(XXXXI)表示：
其中X是键或C1-6经取代或未取代的烷基，其中一个或两个亚甲基单元可被氧或硫原子替代；Y是-NH-、-O-或-S-；R1是C3-6经取代或未取代的环烷基、经取代或未取代的芳基、或者经取代或未取代的杂芳基；R2选自以下基团：三氟甲基、氰基、-CONH2、卤素和硝基；并且R3是
其中，p是1至3的整数，1和3包括在内；q是0至3的整数，0和3包括在内；n是0至5的整数，0和5包括在内；R4和R5各自独立地选自氢、C1-6经取代或未取代的烷基，或者其中R4和R5一起构成亚甲基桥，该亚甲基桥连同它们之间的氮原子形成四至六元经取代或未经取代的环，其中所述一个亚甲基任选地被氧、硫或NR基团替代，其中R是氢或C1-6经取代或未取代的烷基；以及由其互变异构体和可药用盐、溶剂合物或氨基保护的衍生物表示。
具有式(XXXXI)的化合物的非限制性实例包括：5-硝基-N4-哌啶-4-基甲基-N2-(2-三氟甲氧基-苄基)-吡啶-2，4-二胺；N2-(2，3-二氯-苄基)-5-硝基-N4-哌啶-4-基甲基-吡啶-2，4-二胺；N2-[2-(3-氯-苯基)-乙基]-5-硝基-N4-哌啶-4-基甲基-吡啶-2，4-二胺；5-硝基-N2-苯乙基-N4-哌啶-4-基甲基-吡啶-2，4-二胺；N4-(4-氨基甲基-环己基甲基)-5-硝基-N2-(2-三氟甲氧基-苄基-)-吡啶-2，4-二胺；N4-(4-氨基甲基-环己基甲基)-N2-(2，3-二氯-苄基)-5-硝基-吡啶-2，4-二胺；N4-(4-氨基甲基-环己基甲基)-5-硝基-N2-苯乙基-吡啶-2，4-二胺；N4-(4-氨基甲基-环己基甲基)-N2-[2-(3-氯-苯基)-乙基]-5-硝基-1-吡啶-2，4-二胺；N4-(4-氨基甲基-环己基甲基)-5-硝基-N2-(2-氯-苄基)-吡啶-2，4-二胺；N4-(4-反式-氨基甲基-环己基甲基)-5-硝基-N-2-(2-三氟甲氧基-苄基)-吡啶-2，4-二胺；N4-(4-反式-氨基-环己基甲基)-5-硝基-N2-(2-三氟甲氧基-苄基-)-吡啶-2，4-二胺；4-[(4-氨基甲基-环己基甲基)-氨基]-6-(2-氯-苄氨基)-烟酰胺；和4-[(4-氨基甲基-环己基甲基)-氨基]-6-(2-氯-苄氨基)-烟腈。
在又一些实施方案中，小分子PKC-θ抑制剂选自如例如由Auberson在美国专利申请公开US2007/0142401中公开的吲哚基-吡咯二酮衍生物，其通过引用整体并入本文。这些化合物由式(XXXXII)表示：
其中
Ra是H；C1-4烷基；或被OH、NH2、NHC1-4烷基或N(二-C1-4烷基)2取代的C1-4烷基；
Rb是H；或C1-4烷基；
R是式(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的基团
(a)(b)(c)(d)(e)(f)
其中每个R1、R4、R7、R8、R11和R14是OH；SH；杂环残基；NR16R17，其中每个R16和R17独立地为H或C1-4烷基，或者R16和R17与它们结合的氮原子一起形成杂环残基；或者式α-X-Rc-Y(α)的基团，其中X是直接键、O、S或NR18，其中R18是H或C1-4烷基，Rc是C1-4亚烷基或其中一个CH2被CRxRy替代的C1-4亚烷基，其中Rx和Ry中的一个是H，另一个是CH3，每个Rx和Ry是CH3，或者Rx和Ry一起形成-CH2CH2-，并且Y与末端碳原子相结合并选自OH、杂环残基和-NR19R20，其中每个R19和R20独立地为H、C3-6环烷基、C3-6环烷基-C1-4烷基、芳基-C1-4烷基，或者在末端碳原子上任选地被OH取代的C1-4烷基，或者R10和R20与它们结合的氮原子一起形成杂环残基；
每个R2、R3、R5、R6、R9、R10、R12、R13、R15和R’15独立地为H、卤素、C1-4烷基、CF3、OH、SH、NH2、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、NHC1-4烷基、N-(二-C1-4烷基)2或CN；
E是-N＝且G是-CH＝，或者E是-CH＝且G是-N＝；以及
环A任选地被取代，
或其盐。
在说明性实例中，如R1、R4、R7、R8、R11、R14或Y或者分别由NR16R17或NR19R20形成的杂环残基是含有1或2个杂原子并且在一个或更多个环碳原子和/或环氮原子(当存在时)上任选地经取代的三至八元饱和、不饱和或芳族杂环。
在一些具体实施方案中，杂环残基是R1、R4、R7、R8、R11、R14或Y或者分别由NR16R17或NR19R20形成的杂环残基是式(γ)残基。
其中
环D是5、6或7元饱和、不饱和或芳族环；
Xb是-N-、-C-或-CH-；
Xc是-N＝、-NRf-、-CRf’＝或-CHRf’-，其中Rf是环氮原子的取代基，并且选自C1-6烷基；酰基；C3-6环烷基；C3-6环烷基-C1-4烷基；苯基；苯基-C1-4烷基；
杂环残基；和式β-R21-Y’(β)的残基
其中R21是被O打断的C1-4亚烷基或C2-4亚烷基，并且Y’是OH、NH2、NH(C1-4烷基)或N(C1-4烷基)2；并且Rf’是环碳原子的取代基并选自C1-4烷基；
任选地进一步被C1-4-烷基取代的C3-环烷基；
其中，p是1、2或3；CF3；
卤素；OH；NH2；-CH2-NH2；-CH2-OH；哌啶-1-基；和吡咯烷基；
C1和C2之间的键是饱和或不饱和的；
每个C1和C2独立地为任选地被一个或两个取代基取代的碳原子，所述取代基选自以上对环碳原子所指出的那些取代基；并且
C3与Xb以及C1与Xb之间的线分别表示得到5、6或7元环D所需要的碳原子数。
在根据式(XXIV)的化合物的另一些非限制性实例中，
Ra是H；CH3；CH2-CH3；或异丙基，
Rb是H；卤素；C1-6-烷氧基；或C1-6烷基，以及任一
I.R是式(a)的基团
其中R1是在3位或4位任选地被CH3取代的哌嗪-1-基；或4，7-二氮杂螺(2.5]辛-7-基；R2是Cl、Br、CF3、或CH3；并且R3是H、CH3、或CF3；当Ra是H或CH3，Rb是H并且R1是4-甲基-1-哌嗪基时，R3不是H；或者
II.R是式(b)的基团
其中R4是在3位和/或4位被CH3取代的哌嗪-1-基；或4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基；当R4是4-甲基-1-哌嗪基时，Ra不是H或CH3；或者
III.R是式(c)的残基
其中R14是在3位和/或4位任选地被CH3取代或者在3位任选地被乙基、苯基-C1-4烷基、C1-4烷氧基-C1-4烷基或卤代-C1-4烷基取代的哌嗪-1-基；或4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基；R15是卤素、CF3、或CH3；当Ra是H或CH3，Rb是H并且R14是4-甲基-1-哌嗪基时，R15不是CH3；并且R16是H、CH3或CF3；当R15是Cl，Ra是H或CH3，Rb是H并且R14是4-甲基-1-哌嗪基时，R16不是H；或者
IV.R是式(d)的基团
其中R8是哌嗪-1-基、3-甲基-哌嗪-1-基或4-苄基-哌嗪-1-基；或者
V.R是式(e)的基团
其中R9是4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基；或在3位被甲基或乙基以及任选地在4位被甲基取代的哌嗪-1-基。
在根据式(XXIV)的化合物的一些实施方案中
当R是式(a)时
R1是-(4-甲基-哌嗪-1-基)、1-哌嗪基、3-甲基-哌嗪-1-基或-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基)
R2是2-Cl或2-CH3
R3是3-CH3、3-CF3或H
Ra是H或CH3
并且当
R是式(b)时
R4是-(4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基)、3-甲基-哌嗪-1-基或4-甲基-3-甲基哌嗪-1-基
Ra是H或CH3
并且当
R是式(c)时
R14是-4-甲基-哌嗪-1-基、3-甲基-哌嗪-1-基、-4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基、1-哌嗪基、4-甲基-3-甲基-哌嗪-基、3-甲氧基乙基-哌嗪-1-基、3-乙基-哌嗪-1-基、3-苄基-哌嗪-1-基或3-CH2F-哌嗪-1-基
R15是Cl、Br、CF3、F
R16是CH3、H、CH2-CH3
Ra是H或CH3
Rb是H、CH2-CH2-CH3、F、CH(CH3)2、Cl、OCH3、CH3或CH2-CH3
并且当
R是式(d)时
R8是3-甲基-哌嗪-1-基、4-苄基-1-哌嗪基或1-哌嗪基
Ra是CH3或H
并且当
R是式(e)时
R9是-4，7-二氮杂螺[2.5]辛-7-基、3-乙基-哌嗪-1-基、3-甲基-哌嗪-1-基、4-甲基-3-甲基-哌嗪-1-基或3-乙基-哌嗪-1-基
Ra是H、CH2-CH3或CH(CH3)2
Rb是CH3、F、CH(CH3)2、OCH3、CH2-CH3或Cl。
根据式(XXXXII)的化合物的一些具体实施方案包括具有下式的3-[2-氯-5-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-三氟甲基-苯基]-4-(1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮
以及
具有下式的3-(1H-吲哚-3-基)-4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-喹唑啉-4-基]-吡咯-2，5-二酮
在另一些实施方案中，PKC-θ抑制剂选自由Ajioka在美国专利申请公开US2013/0225687中公开的选择性PKC-θ小分子化合物，其通过引用整体并入本文。这些化合物由式(XXXXIII)表示：
其中：
Y选自-O-和-S-；
每个R1独立地选自：正丙基、异丙基、叔丁基、叔戊基、CF3、OCF3、环戊基、吡咯基以及CO2H，及其盐、水合物和前药，从而选择性地抑制PKC-θ。
如上文例如关于LSD抑制剂所公开的，本发明不仅包括已知的PKC-θ抑制剂，而且包括通过任何合适的筛选测定鉴定的PKC-θ抑制剂。因此，本发明扩展至筛选可用于以下用途的调节剂的方法：用于抑制PKC-θ并进而用于改变PKC-θ过表达细胞(例如，CSC)的以下特征中的至少一个：(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT、或(v)MET，或者用于治疗或预防癌症(例如，转移性癌症)。在一些实施方案中，筛选方法包括：(1)使制备物与测试药剂相接触，其中所述制备物包含(i)含有对应于至少PKC-θ生物学活性片段的氨基酸序列的多肽，或其变体或衍生物，或者(ii)含有可产生PKC-θ基因之转录物或其一部分的核苷酸序列的多核苷酸，或者(iii)含有调节PKC-θ基因表达之基因序列(例如，转录元件)至少一部分的多核苷酸，其与报道基因有效地连接；以及(2)相对于在测试药剂不存在下的参照水平或功能活性，检测所述多肽、多核苷酸、或报道基因之表达产物的水平或功能活性的变化。相对于在测试药剂不存在下的正常或参照水平和/或功能活性，检测到多肽、转录物或转录物一部分、或者报道基因之表达产物的水平和/或功能活性降低，表明所述药剂可用于改变PKC-θ过表达细胞(例如，CSC)的以下特征中的至少一个：(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT、或(v)MET，或者用于治疗或预防癌症(例如，转移性癌症)。合适地，这通过分析或确定所述测试药剂是否改变PKC-θ过表达细胞以下特征中的至少一个来确认：(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)EMT、或(v)MET，或者是否治疗或预防癌症来确认。
3.治疗和预防用途
根据本发明，提出抑制LSD(例如LSD1或LSD2)功能的药剂以及抑制PKC-θ功能的药剂可用作改变以下至少一个的活性物质：EMT调节基因过表达细胞(例如CSC或非CSC肿瘤细胞)的(i)形成；(ii)增殖；(iii)存活，(iv)生存力，或(v)维持；(vi)EMT调节基因过表达细胞(例如CSC)的EMT；或(vii)EMT调节基因过表达细胞(例如CSC)的MET，或者用于治疗或预防癌症(例如，转移性癌症)。因此，LSD抑制剂可以与PKC-θ抑制剂组合施用(例如，在相同的组合物中或分开的组合物中)(“联合治疗”)，以及任选地与可药用载体一起施用于个体，以抑制以下中的至少一个：EMT调节基因过表达细胞(如CSC或非CS C肿瘤细胞)的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活或(v)生存力，和/或抑制EMT调节基因过表达细胞(例如CSC或非CSC肿瘤细胞)的(vi)EMT，和/或刺激或诱导EMT调节基因过表达细胞(例如CSC或非CSC肿瘤细胞)的(vii)MET，并且更具体地治疗或预防和/或缓解包括非转移性或转移性癌症的癌症的症状，并预防癌症复发。
该方法可以涉及将LSD抑制剂与PKC-θ抑制剂分开、同时或依次施用。在一些实施方案中，这可以通过施用包含这两种类型药剂的单一组合物或药物制剂，或通过同时施用两种单独的组合物或制剂来实现，其中一种组合物包含LSD抑制剂，另一种包含PKC-θ抑制剂。在另一些实施方案中，用LSD抑制剂的处理可以在用PKC-θ抑制剂的处理之前或之后进行，其间隔范围为几分钟至几天。在将LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂单独应用的实施方案中，通常将确保在每次递送时间之间的相当长的时间段不会超期，以使得LSD抑制剂仍然能够如上所述与PKC-θ抑制剂一起对EMT调节基因过表达细胞(例如CSC或非CSC肿瘤细胞)发挥有益的组合作用，特别是维持或增强对象逆转或抑制癌症(例如，非转移性癌症或转移性癌症)发展的能力。在这种情况下，预期在彼此之间约1-12小时内，更合适地在彼此之间约2-6小时内施用这两种形式。在一些情况下，然而可能需要显著延长治疗的时间段，其中在各次施用之间经过几个小时(2、3、4、5、6或7小时)到几天(1、2、3、4、5、6、7或8天)。
可以想象，将期望的是LSD抑制剂或PKC-θ抑制剂的多于一次的施用。可以采用多种组合，其中LSD抑制剂为“A”，PKC-θ抑制剂为“B”，如下所示：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/BA/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B。
也考虑了其他组合。同样，与单独施用相同量的动员剂(mobilizer)相比，这两种药剂都以有效的组合量递送给对象以抑制以下中的至少一种：EMT调节基因过表达细胞(例如CSC或非CS C肿瘤细胞)的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活或(v)生存力，和/或抑制EMT调节基因过表达细胞(例如CSC或非CSC肿瘤细胞)的(vi)EMT，和/或刺激或诱导EMT调节基因过表达细胞(例如CSC或非CSC肿瘤细胞)的(vii)MET，并且更具体地治疗或预防和/或缓解包括非转移性或转移性癌症的癌症的症状，并预防癌症复发。
任何LSD抑制剂或PKC-θ抑制剂都可用于本发明的组合物和方法，只要该抑制剂各自是药学活性的即可。“药学活性”LSD或PKC-θ抑制剂是当向有此需要的个体施用时导致治疗或预防恶性疾病(特别是转移性癌症)(包括预防引起症状，控制此种症状，或治疗与转移性癌症相关的现有症状)和/或导致以下结果的形式：EMT调节基因过表达细胞(例如，CSC或非CSC肿瘤细胞)的(i)形成、(ii)增殖、(iii)存活、(iv)生存力，或(v)维持，或EMT调节基因过表达细胞(例如，CSC)的(vi)EMT的减少、减轻、终止或预防；和/或EMT调节基因过表达细胞(例如，CSC)的(v)MET增强。
用于本发明方法的LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂制剂以及所施用LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂的量、施用模式是常规的并且在本领域技术人员的技术范围内。相比于合适对照，测量指示疾病进程的一个或更多个诊断参数确定恶性疾病(特别是转移性癌症)是否已被治疗。在动物实验的情况下，“合适对照”是不用LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂处理或者用不含LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂的药物组合物处理的动物。在人对象的情况下，“合适对照”可以是处理前的个体，或者可以是用安慰剂处理的人(例如，年龄匹配的或类似的对照)。根据本发明，癌症(包括转移性癌症)的治疗包括并涵盖但不限于：(1)在患者中减轻、终止、减少、预防或阻止以下的发展：EMT调节基因过表达细胞(例如，CSC或非CSC肿瘤细胞)的(i)形成、(ii)增殖、(iii)存活、(iv)生存力或(v)维持；或EMT调节基因过表达细胞(例如，CSC)的(vi)EMT，和/或增强EMT调节基因过表达细胞(例如，CSC)的(vii)MET；(2)在对象中治疗癌症(例如，非转移性癌症或转移性癌症)；(3)在易患癌症但尚未被诊断患有癌症的对象中预防癌症(例如，非转移性癌症或转移性癌症)，包括减少癌症复发，并因此，该治疗构成癌症预防性治疗；或者(iii)使癌症(例如，转移性癌症)消退。
因此，本发明的组合物和方法适合于治疗以下个体：已诊断患有癌症(例如，非转移性癌症或转移性癌症)的个体；怀疑患有癌症(例如，非转移性癌症或转移性癌症)的个体；已知易于发生和认为有可能发生癌症(例如，非转移性癌症或转移性癌症)的个体；或者被认为先前治疗的癌症(例如，非转移性癌症或转移性癌症)有可能发生复发的个体。癌症(例如，非转移性癌症或转移性癌症)可以是激素受体阳性或激素受体阴性的。在一些实施方案中，癌症(例如，非转移性癌症或转移性癌症)是激素受体阴性的，并因此是激素抗性的或内分泌治疗抗性的。在癌症是乳腺癌的一些实施方案中，乳腺癌(例如，非乳腺CMC肿瘤细胞)是激素受体阴性的(例如，雌激素受体(ER)阴性的和/或孕酮受体(PR)阴性的)。
在一些实施方案中，并且根据预期施用模式，含LSD和PKC-θ抑制剂的组合物通常包含按重量计约0.000001％至90％、约0.0001％至50％或约0.01％至约25％的抑制剂，剩余部分是合适的药物载体或稀释剂等。LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂的剂量可取决于多种因素，例如施用模式、受影响对象的物种、年龄、性别、重量和一般健康状况，并且可以容易地由本领域技术人员使用标准方法确定。剂量也将考虑到抑制剂与其靶分子的结合亲合力，其生物利用度以及其体内性质和药代动力学性质。在这个方面，施用药剂的精确量也可取决于执业医生的判断。在确定待施用以治疗或预防转移性癌症的药剂的有效量时，医师或兽医可以评估疾病或病症随时间的进展。在任何情况下，本领域技术人员可容易地确定LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂的合适剂量而无需过度实验。施用于患者的活性物质的剂量应足以在患者中随时间实现诸如以下的有益响应：减轻、终止或预防CMC(例如，乳腺CMC)和/或非CMC肿瘤细胞的形成、增殖、存活、生存力或维持，抑制非CMC肿瘤细胞的EMT，刺激CMC(例如乳腺CMC)的MET；和/或治疗和/或预防转移性癌症。剂量可以以合适的间隔施用以改善恶性疾病的症状。这样的间隔可以使用本领域技术人员已知的常规方法来确定，并且可以根据所采用的活性剂类型及其制剂而不同。例如，所述间隔可以是每天、每隔一天、每周、每两周、每月、每两月、每季度、每半年或每年。
可以对剂量和间隔进行个体调整以提供足以维持LSD/PKC-θ抑制作用的活性剂的血浆水平。全身施用的常用患者剂量为1mg/天至2000mg/天，通常1mg/天至250mg/天，并且典型地为10mg/天至150mg/天。就患者体重而言，常用剂量为0.02mg/kg/天至25mg/kg/天，通常0.02mg/kg/天至3mg/kg/天，典型地为0.2mg/kg/天至1.5mg/kg/天。就患者体表面积而言，常用剂量为0.5mg/m2/天至1200mg/m2/天，通常0.5mg/m2/天至150mg/m2/天，典型地为5mg/m2/天至100mg/m2/天。
根据本发明的实践，通过LSD和PKC-θ抑制剂抑制LSD(例如LSD1和LSD2)和PKC-θ将导致CSC的形成、增殖、存活、生存力或维持减少，进而导致由CSC分化出更少的非CSC肿瘤细胞，以及与辅助的癌症治疗或药剂一起更加有效的治疗非CSC肿瘤细胞。因此，本发明还考虑将抑制非CMC肿瘤细胞增殖、存活或生存力的至少一种癌症治疗与所述LSD和PKC-θ抑制剂共同施用。所述LSD和PKC-θ抑制剂可以在癌症治疗之后用于治疗，或者在施用癌症治疗之前使用，或者与癌症治疗一起使用。因此，本发明考虑联合治疗，其采用LSD抑制剂、PKC-θ抑制剂和癌症治疗的共同施用，所述癌症治疗的非限制性实例包括放射治疗、手术、化学治疗、激素剥夺治疗、促凋亡治疗和免疫治疗。
3.1放射治疗
放射治疗包括诱导DNA损伤的辐射和波，例如，γ辐照、X射线、紫外线辐照、微波、电子发射、放射性同位素等。治疗可以通过用上述形式的辐射照射局部肿瘤部位来实现。最有可能的是，所有这些因素造成大范围的损伤DNA，对DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的装配和维持有影响。
X射线的剂量范围为对于长时间段(3至4周)的50至200伦琴的日剂量，至2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并取决于同位素的半衰期、发射辐射的强度和类型，以及肿瘤细胞的吸收。
放射治疗的非限制性实例包括单次或分次的适形外部束放射治疗(conformalexternal beam radiotherapy)(分次的为50戈瑞至100戈瑞，持续4至8周)，高剂量率近程放射治疗，永久性空隙近程治疗，全身放射性同位素(例如，锶89)。在一些实施方案中，放射治疗可以与放射增敏剂组合施用。放射增敏剂的说明性实例包括但不限于：乙丙昔罗(efaproxiral)、依他硝唑、全氟碳(fiuosol)、米索硝唑、尼莫唑、替莫泊芬(temoporfin)和替拉扎明。
3.2化学治疗
化学治疗剂可以选自以下类别中的任一种或更多种：
(i)用于医学肿瘤学的抗增殖/抗肿瘤药及其组合，例如烷基化剂(例如，顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安和亚硝基脲类)；抗代谢物类(例如，抗叶酸剂诸如氟吡啶，如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和羟基脲)；抗肿瘤抗生素类(例如，蒽环类，如阿霉素、博来霉素、多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、更生霉素和光辉霉素)；抗有丝分裂剂类(例如长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨及紫杉烷类(如紫杉醇和多西他赛)；以及拓扑异构酶抑制剂类(例如，表鬼臼乙毒素，如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康和喜树碱)；
(ii)细胞抑制剂，例如抗雌激素类(例如，他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和艾多昔芬(iodoxyfene))；雌激素受体下调剂(例如，氟维司群)、抗雄激素类(例如，比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙氯地孕酮)；UH拮抗剂类或LHRH激动剂类(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)；孕激素类(例如，醋酸甲地孕酮)；芳香酶抑制剂类(例如，阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)和5α-还原酶抑制剂类(例如非那雄胺)；
(iii)抑制癌细胞侵袭的药剂(例如，金属蛋白酶抑制剂，如马立马司他和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体功能的抑制剂)；
(iv)生长因子功能抑制剂，例如，这样的抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如，抗-erbb2抗体曲妥珠单抗[HerceptinTM]和抗-erbb1抗体西妥昔单抗[C225])、法尼基转移酶抑制剂、MEK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如，表皮生长因子家族的其他抑制剂(例如，其他EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼、AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃罗替尼(erlotinib)、OSI-774)和6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033))，例如，血小板衍生生长因子家族的抑制剂和例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；
(v)抗血管发生剂，例如抑制血管内皮生长因子之作用的那些药剂，(例如，抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[AvastinTM]、例如国际专利申请WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中所公开的那些化合物)和以其他机制起作用的化合物(例如，罗喹美克、整联蛋白αvβ3功能的抑制剂和血管生成抑制素(angiostatin))；
(vi)血管损伤剂，例如考布他汀(Combretastatin)A4和国际专利申请WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434和WO 02/08213中公开的化合物；
(vii)反义治疗(antisense therapy)，例如，针对以上所列靶标的那些，如ISIS2503、抗ras反义；以及
(viii)基因治疗方法，包括例如替代异常基因如异常p53或异常GDEPT(基因导向的酶前药治疗(gene-directed enzyme pro-drug therapy))的方法，例如利用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些方法以及提高患者对化学治疗或放射治疗耐受的方法，例如多抗药性基因治疗。
3.3免疫治疗
免疫治疗方法包括例如提高患者肿瘤细胞免疫原性的离体和体内方法，例如，用细胞因子如白介素2、白介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子转染，降低T细胞无反应性的方法，使用经转染免疫细胞(例如经细胞因子转染的树突细胞)的方法，使用经细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法和使用抗独特型抗体的方法。这些方法通常依赖于使用免疫效应细胞以及靶向并破坏癌细胞的分子。免疫效应物可以是例如对恶性细胞表面上一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可充当治疗效应物，或者其可以募集其他细胞来实际促进细胞杀伤。该抗体也可以与药物或毒素(化学治疗剂(chemotherapeutic)、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，并且仅作为靶向剂。或者，效应物可以是携带表面分子的淋巴细胞，所述表面分子直接或间接地与恶性细胞靶标相互作用。多种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
3.4其他治疗
其他癌症治疗的实例包括光疗、冷冻治疗、毒素治疗或促凋亡治疗。本领域技术人员将知道，该列举不是穷举可用于癌症和其他增生性病变之治疗方式的类型。
众所周知的是，化学治疗和放射治疗靶向快速分裂的细胞和/或破坏细胞周期或细胞分裂。这些治疗作为治疗数种形式癌症的一部分提供，目的在于减缓其进展或通过治愈性治疗逆转疾病的症状。然而，这些癌症治疗可能会导致免疫受损状态和随后的致病性感染，因此本发明还延伸至联合治疗，其采用LSD抑制剂(癌症治疗)和针对感染有效的抗感染剂二者，所述感染由癌症治疗引起的免疫受损状态而导致发生或者由癌症治疗引起的免疫受损状态导致发生的风险增加。抗感染药物合适地选自抗微生物药(其包括但不限于杀死或抑制微生物(例如病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物等)生长的化合物)，并因此包括抗生素、杀阿米巴药、抗真菌药、抗原虫药、抗疟药、抗结核药和抗病毒药物。抗感染药物在其范围内还包括驱肠虫药和杀线虫剂。说明性抗生素包括喹诺酮类(例如，氨氟沙星(amifloxacin)、西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星(fleroxacin)、氟甲喹、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、奥索利酸、培氟沙星、罗索沙星、替马沙星、托氟沙星、司帕沙星、克林沙星、加替沙星、莫西沙星、吉米沙星和加雷沙星(garenoxacin))；四环素类；甘氨环素类(glycylcycline)和唑烷酮类(例如，氯四环素、地美环素、强力霉素、赖甲环素、美他环素、米诺环素、土霉素、四环素、替加环素、利奈唑胺(linezolide)、伊皮唑胺(eperozolid))；糖肽类；氨基糖苷类(例如，阿米卡星、阿贝卡星、丁胺菌素、地贝卡星、阿司米星、庆大霉素、卡那霉素、黄霉素(meomycin)、奈替米星、核糖霉素、西索米星、大观霉素、链霉素、妥布霉素)；β-内酰胺类(例如，亚胺培南、美罗培南、比阿培南、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢曲秦、头孢吡酮、头孢唑啉、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、头孢噻肟、头孢替安、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢泊肟、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢替唑、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢唑喃、氰甲头孢菌素(cephaacetrile)、头孢氨苄、头孢甘酸、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢吡硫、头孢拉定、头孢美唑(cefinetazole)、头孢西丁、头孢替坦、氨曲南、卡芦莫南、氟氧头孢、拉氧头孢、美西林、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、苄青霉素、卡非西林、氯唑西林、双氯西林、甲氧西林、美洛西林、奈夫西林、苯唑西林、青霉素G、哌拉西林、磺苄西林、替莫西林、替卡西林、头孢托仑、SC004、KY-020、头孢地尼、头孢布烯、FK-312、S-1090、CP-0467、BK-218、FK-037、DQ-2556、FK-518、头孢唑兰、ME1228、KP-736、CP-6232、Ro 09-1227、OPC-20000、LY206763)；利福霉素类；大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、竹桃霉素、罗古霉素、蔷薇霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素)；酮内酯类(例如，泰利霉素、喹红霉素(cethromycin))；香豆霉素类；林可酰胺类(例如，克林霉素、林可霉素)和氯霉素。
说明性抗病毒剂包括：硫酸阿巴卡韦、无环鸟苷钠、盐酸金刚烷胺、安普那韦、西多福韦、甲磺酸地拉韦定、地达诺新、依非韦伦、泛昔洛韦、福米韦生钠、膦甲酸钠、更昔洛韦、硫酸茚地那韦、拉米夫定、拉米夫定/齐多夫定、甲磺酸那非那韦、奈韦拉平、磷酸奥塞米韦、利巴韦林、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、甲磺酸沙奎那韦、司他夫定、盐酸伐昔洛韦、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。
杀阿米巴剂或抗原虫剂的非限制性实例包括阿托伐醌、盐酸氯喹、磷酸氯喹、甲硝唑、盐酸甲硝唑、依西酸喷他脒。驱肠虫药可以是选自以下的至少一种：甲苯咪唑、双羟萘酸噻嘧啶、丙硫咪唑、伊维菌素和噻苯哒唑。说明性抗真菌剂可以选自：两性霉素B、两性霉素B胆甾醇硫酸盐复合物、两性霉素B脂质复合物、两性霉素B脂质体、氟康唑、氟胞嘧啶、灰黄霉素微粉(griseofulvin microsize)、灰黄霉超微粉(griseofulvin ultramicrosize)、伊曲康唑、酮康唑、制霉菌素和盐酸特比萘芬。抗疟药的非限制性实例包括：盐酸氯喹、磷酸氯喹、强力霉素、硫酸羟氯喹、盐酸甲氟喹、磷酸伯氨喹、乙胺嘧啶以及乙胺嘧啶与磺胺多辛。抗结核药包括但不限于：氯法齐明、环丝氨酸、氨苯砜、盐酸乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布丁、利福平、利福喷丁和硫酸链霉素。
如上所述，本发明涵盖LSD和PKC-θ抑制剂与另外的药剂一起共施用。应该理解的是，在包括LSD和PKC-θ抑制剂与另外的药剂一起施用的实施方案中，组合中活性物质的剂量可各自包含有效量，并且另外的药剂可以进一步增强对患者的治疗或预防益处。或者，LSD和PKC-θ抑制剂和另外的药剂可以一起包含用于预防或治疗癌症(例如，非转移性或转移性癌症)或抑制或预防癌症复发的有效量。还应当理解的是，有效量可以在特定治疗方案的情境下限定，包括例如施用时机和次数、施用模式、制剂等。在一些实施方案中，LSD和PKC-θ抑制剂和任选的癌症治疗按常规时间表施用。或者，癌症治疗可在症状出现时施用。如本文所使用的“常规时间表”是指预定的指定时间段。常规时间表可以包括长度相同或不相同的时间段，只要时间表是预定的即可。例如，常规时间表可以包括基于如下施用LSD和PKC-θ抑制剂：每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每月或其间任何固定的天数或周数、每两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月等。或者，预定的常规时间表可以包括第一周每天，随后几个月按每月，此后按每三个月同时施用LSD和PKC-θ抑制剂和癌症治疗。常规时间表将涵盖任何特定的组合，只要其在包括在某一天施用的合适时间表的时间之前确定即可。
另外，本发明提供了用于降低或终止CMC细胞的增殖、存活或生存力，以及用于预防或治疗恶性疾病(包括非转移性和继发性(即转移性)癌症)的药物组合物，其包含LSD抑制剂、PKC-θ抑制剂和任选的可用于治疗恶性疾病的癌症治疗药剂。本发明的制剂以可药用溶液施用，其通常包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、助剂和任选的其他治疗成分。根据所治疗的具体病症，制剂可全身或局部施用。制剂和施用的技术可参见“Remington’s Pharmaceutical Sciences，”Mack Publishing Co.，Easton，Pa.的最新版本。合适的途径例如可包括经口、经直肠、经粘膜或经肠施用；肠胃外递送，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。对于注射，可将本发明的活性剂或药物配制在水溶液中，适当地配制在生理学上相容的缓冲液，例如Hanks溶液、林格氏溶液(Ringer′s solution))或生理盐水缓冲液中。对于经粘膜施用，在制剂中使用适于待渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域中通常已知的。
可以使用本领域中公知的可药用载体容易地将药物配制成适用于经口施用的剂型(dosage)。此类载体使得本发明的化合物能够被配制成被待治疗患者经口摄取的剂型，例如片剂、丸剂、胶囊剂、液体剂(liquid)、凝胶剂、糖浆剂、浆剂(slurry)、混悬剂等。这些载体可选自：糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和无热原水。
用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的混悬液可在适当时制备成油性注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射混悬液可以包含提高所述混悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，所述混悬液还可以包含合适的稳定剂或试剂，其提高化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液。
用于经口使用的药物制剂可以通过以下获得：将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地研磨所得混合物，并且在添加合适的助剂(如果需要的话)后加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别地是填充剂，例如糖(包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇)；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐(例如藻酸钠)。这样的组合物可以通过任何药学方法制备，但是所有的方法都包括将上述的一种或更多种药物与载体(其构成一种或更多种必需成分)组合在一起的步骤。通常，本发明的药物组合物可以以其自身已知的方式制备，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸(dragee-making)、研细(levigating)、乳化、包封、包埋或冻干过程来制备。
糖衣丸芯设置有合适的包衣。出于这个目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、或二氧化钛、漆溶液(lacquer solution)以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖衣丸包衣添加染料或色素以辨识或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以经口使用的药物包括由明胶制成的硬胶囊(push-fit capsule)，以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。所述硬胶囊可以包含与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)或润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或混悬在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。
本发明药物的剂型还可包括专门为此目的设计的注射或植入控制释放装置，或者修饰成以这种方式附加地起作用的其他形式的植入物。本发明药剂的控制释放可通过例如用疏水性聚合物(包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸以及某些纤维素衍生物(例如羟丙基甲基纤维素))包被所述药剂来实现。另外，控制释放可通过使用另一些聚合物基质、脂质体或微球来实现。
本发明的药物可以作为具有药学相容抗衡离子的盐提供。药学相容盐可以用许多酸形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐倾向于更溶于水或为相应游离碱形式的其他质子溶剂中。
对于本发明方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以首先由细胞培养物测定来估计。例如，剂量可以在动物模型中配制以达到包括如在细胞培养物中测定的IC50(例如，实现LSD多肽活性的半数最大抑制的活性剂浓度)的循环浓度范围。这样的信息可用于更准确地确定在人中的可用剂量。
这类药物的毒性和治疗功效可通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中确定，例如，用于确定LD50(群体50％致死的剂量)和ED50(群体50％治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养物测定和动物研究获得的数据可用于配制在人中使用的剂量范围。这类化合物的剂量优选地在包括ED50的循环浓度范围内，具有很少毒性或无毒性。剂量可以在该范围内根据所采用的剂型和所利用的施用途径而不同。精确制剂、施用途径和剂量可以由个体医生考虑患者的病症来选择。(参见例如Fingl等，1975，在“ThePharmacological Basis of Therapeutics”中，第1章，第1页)。
或者，可以以局部方式而不是全身方式施用化合物，例如，通过向组织(优选皮下组织或网膜组织)直接注射化合物，常常以贮库(depot)制剂或持续释放制剂。
此外，可以通过靶向性药物递送系统施用药物，例如在包被有组织特异性抗体的脂质体中递送。脂质体将靶向组织并被组织选择性地吸收。
在局部施用或选择性吸收的情况下，药剂的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。
为了使本发明可以被容易地理解并付诸实际效果，现将通过以下非限制性实施例来描述一些特别优选的实施方案。
实施例
实施例1
CSC和表观遗传调节
CSC具有多个重要的体外特性。首先，乳腺CSC的特征在于关键的表面标志物CD44高CD24低(图1A)。第二，CSC富集群能够在悬浮培养物中形成球形集落(对于乳腺CSC称为乳腺球)(图1C)。第三，CSC富集群显示出对化学治疗和电离辐射的抗性增强。第四，其显示出不同的转录物组谱(图1B)。因此，CSC代表具有保持其独特体外特性的特殊分子机制的特殊癌细胞群。
实施例2
LSD1作为人乳腺CSC的表观遗传调节剂起作用
在三个人CSC模型(EC，MCF-7上皮细胞系；BC，MDA-MB231基底细胞系)中的CD44启动子区中进行H3K4me1和LSD1 ChIP测定。在图2中显示的结果表明，LSD1、H3K4me1和H3K9me1组蛋白修饰在其转录物显著在乳腺CSC中富集(例如，CD44、UPAR、层粘连蛋白)的关键基因上富集。
实施例3
人正常组织和乳腺癌组织中的LSD1核染色
正常组织和人乳腺癌组织的核染色使用抗LSD1抗体进行。图3中显示的结果表明：正常乳腺组织在正常导管上皮和邻近基质细胞中显示出对LSD1(Abcam；1/50稀释)的强核免疫反应性(参见图3中的分图A)；并且3级侵袭性导管癌(ER/PR-Her2+)示出了对LSD1的强核免疫反应性(参见图3中的分图B)。正常乳腺组织的显微照片检查(参见图3中的分图C)示出了在正常导管上皮中对CD44(BD Pharmingen；1/50稀释)斑块状的弱膜染色。相比之下，同样的3级侵袭性导管癌用靶向CD44的抗体显示出强周膜染色(参见图3中的分图D)。
实施例4
人乳腺CSC模型中的LSD1 siRNA敲低消除CSC
使用根据已公开方案的经验证合并siRNA(Santa Cruz)，本发明人在所有其CSC模型(参见，图1)中成功地敲低了LSD1。在这些系统中观察到大于85％的LSD1敲低(图4A)。LSD1敲低导致：在基底/转移模型(图4B)和MCF-IM模型(图4C)中如由FACS测量的CSC减少；CSC标志物基因如CD44的转录减少(图4D)；如由乳腺球测定测量的乳腺球减少(数据未示出)；由染色质免疫沉淀(ChIP)测量的LSD1和H3K4me1标记减少(图4E)；由FAIRE测量的CD44活性染色质结构域抑制(图4F)。
总体上，这些数据表明，LSD1作为人乳腺CSC的表观遗传调节剂起作用。
实施例5
人乳腺CSC模型中的LSD2 siRNA敲低消除CSC
使用经验证的合并siRNA(Santa Cruz)，本发明人在乳腺CSC模型中也成功地敲低了LSD2。此外，在CD44高CD24低乳腺癌细胞中观察到＞85％的敲低，如由流式细胞术所评估的(参见，图5A和B)。LSD1敲低也导致：如由乳腺球测定所测量的乳腺球减少(图5C)。
总体上，这些数据表明，LSD2作为人乳腺CSC的表观遗传调节剂起作用。
实施例6
通过特异性抑制剂抑制LSD1减少CSC形成
如通过FACS(图6A和B)和乳腺球测定(图1C和D)所监测的，LSD1特异性抑制剂NCD-38在MCF-IM模型中导致CSC形成的抑制。
实施例7
抑制LSD1导致间充质向上皮转变(MET)
用LSD1特异性抑制剂NCD-38处理基底转移模型(MDA-MB 231)导致CSC形成减少(图7A和B)和间充质细胞向上皮细胞的转变减少(图7C)。
实施例8
通过LSD1抑制剂与化学治疗联合减小肿瘤大小
在小鼠异种移植模型中，LSD1抑制剂帕吉林与化学治疗剂多西他赛联合导致肿瘤大小减小(图8A、8B，图9A、9B)。
实施例9
通过化学治疗与LSD1抑制剂联合抑制CSC亚群
如通过FACS(图10A)和转录物(图10B)所测量的，用LSD1抑制剂帕吉林与化学治疗剂多西他赛一起治疗小鼠导致了CSC亚群减少。
实施例10
PKC途径：EMT和CSC
利用多种细胞测定使PKC途径与EMT和CSC相关联。首先，如通过形态学变化(图11A和B)、EMT标志物层粘连蛋白-5的细胞内染色(图11B)以及伤口愈合(迁移测定)(图11C)所观察的，PKC途径诱导物PMA在MCF-IM模型中引起最高的EMT变化。其次，在MCF-IM和基底/转移模型中，PKC在细胞质和核中都是有活性的(图11D)。第三，如通过流式细胞术(FACS)分析(图11E和F)、乳腺球测定(图11G)以及CSC诱导型基因(图11H)和MicroRNA(图11I)的转录物分析中观察的，通过PMA诱导PKC途径导致CD44高/CD24低-CSC样细胞的产生。
总体上，这些结果表明，PKC途径对EMT和CSC形成是重要的。
实施例11
PKC活性的抑制减少EMT和CSC形成
在如通过形态学(图12A)、FACS(图12B和C)、乳腺球测定(图12D和E)和CSC诱导型基因的转录物分析(图12F和G)检测的MCF-IM模型中以及在基底转移模型(图12I，J和K)中，广谱PKC途径抑制剂导致EMT和CSC形成的抑制。与此相反，用常规PKC抑制剂Go6976预孵育不阻止PMA诱导的EMT样形态学变化或CSC形成(图12C和H)。
总体上，这些结果表明，PKC活性是EMT和CSC形成所必需的。
实施例12
PKC-θ信号传导和核作用的抑制导致EMT和CSC的消除
如通过形态学(图13A)、FACS(图13B)以及转录物分析(图13C)所监测的，PKC-θ特异性肽抑制剂在MCF-IM模型中消除EMT和CSC。PKC-θ而不是PKC-β的敲低在MCF-IM模型中导致EMT和CSC的抑制(图13D、E和F)。与MCF-IM模型中PKC-θ野生型载体的作用相比，PKC-θNLS(核定位信号)突变的过表达降低PKC-θ进入到核中，因此导致EMT和CSC作用降低(图13G、H和I)。
总体上，这些结果表明，PKC-θ是EMT和CSC形成的主调节剂。此外，核PKC-θ对EMT和CSC形成是重要的。
实施例13
在CSC中诱导型基因启动子上核PKC-θ的直接结合
染色质免疫沉淀测定(ChIP)PKC-θ显示在多种CSC模型中PKC-θ直接与CSC诱导型基因CD44的启动子相结合(tether)(图14A)。PKC-θ(PKC-θ-磷酸)的活性形式与MCF-IM模型中CSC诱导型基因-uPAR和CD44上的染色质相缔合(图14B&C)，并且该活性形式存在于活性转录标记RNA聚合酶-II(POL II)中(图14D)。PKC抑制剂以及PKC-θ的敲低导致CD44基因启动子上PKC-θ的结合降低。
总体上，这些结果表明，活性PKC-θ是EMT和CSC形成的表观遗传学调节剂。
实施例14
核活性PKC-θ：侵袭性乳腺癌的标志物
在乳腺癌发展中，通过探究正常乳腺组织和来自患者的侵袭性乳腺癌中的PKC-θ蛋白质表达来分析PKC-θ的临床相关性。与来自健康个体的乳腺组织相比，在ER/PR+/Her-2-侵袭性癌亚型中观察到PKC-θ的强细胞质表达。此外，ER/PR+/Her-2-侵袭性癌亚型具有微弱的活性PKC-θ核染色(图15)。不管受体状态如何，所有乳腺癌类型对于活性PKC-θ显示出弱的细胞质免疫反应性，同时在经历有丝分裂的乳腺癌细胞中观察到强核染色。
总体上，这些结果表明，核中的活性PKC-θ是侵略性/侵袭性乳腺癌的诊断标志物。
实施例15
与单独使用任一途径抑制剂相比，通过组合特异性抑制剂同时抑制LSD1和PKC-θ途径在这两种抑制剂的更低剂量下减少CSC形成
在MCF-IM模型中，单独的LSD1抑制剂NCD-38在两种不同的测试抑制剂剂量(分别为2.5μM和5μM)下导致约50-60％的CSC抑制(图16A和B)。
在MCF-IM模型中，单独的PKC-θ抑制剂C27在100nM下导致约30％的抑制(图16A和B)。相比之下，在MCF-IM模型中，更高剂量的单独C27(500nM)导致约90％的CSC抑制(图16A和B)。
在MCF-IM模型中，由FACS(图16A和B)以及CSC基因如CD44和uPAR上的转录物分析(图16C和D)监测到，100nM的C27抑制剂与2.5μM的NCD-38组合导致约85％的CSC抑制。因此，对CSC中PKC-θ和LSD1途径进行同时抑制允许利用更低剂量的这两种抑制剂。
实施例1-9的材料与方法
一般试剂
化学品
使用的所有试剂被分类为分子生物学级或分析级。
来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细胞系
粘附人乳腺腺癌细胞系，包括MCF-7(编号HTB-22)、MDA-MB-231(编号HTB-26)、MDA-MB-468(编号HTB-132)、人粘附乳腺导管癌T-47D(编号HTB-133)和包括HeLa(编号CCL-2)的人宫颈癌获自ATCC(VA，USA)。原液在包含45％热灭活胎牛血清(FCS；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和9％二甲基亚砜(DMSO)溶液(Cambridge Isotope Laboratories，Inc.，Andover，MA)的RPMI或DMEM完全培养基中以5×106细胞/mL等分试样在-196℃下储存。将细胞原液在完全培养基(RPMI或DMEM)中解冻，并检查支原体污染。细胞系在冷冻管(NUNC，Roskilde，Denmark)中在-70℃下过夜冻结为所述原液，并移出到液氮中长期储存。
培养基、缓冲剂和溶液
所有的培养基、缓冲剂和溶液都获自JCSMR Media/Wash-up Facility，ANU，Canberra，Australia或者购买自Gibco(Invitrogen Corporation，NY)。RPMI-1640(Gibco#11875-093)或Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(1×，液体，低葡萄糖，Gibco#12320-32)完全细胞培养基是新鲜配制的，根据实验要求通过向RPMI/DMEM和HEPES补充10％热灭活FCS、0.1％PSN抗生素和2mM L-谷氨酰胺用于组织培养。
抗生素
将抗生素原液溶于通过0.22μm过滤器(Millipore，NSW，Australia)过滤并由JCSMR Media Facility，ANU，Canberra，Australia制备的DDW中。青霉素、链霉素和新霉素(PSN)抗生素(1000×原液)：30.07g/L青霉素G钠(MP Biomedicals，LLC)，50g/L硫酸链霉素(Sigma-Aidrich，St.Louis，MO)和50g/L硫酸新霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。除非另有说明，将PSN添加到所有RPMI/DMEM完全培养基。
寡核苷酸
用于基因表达分析的引物/探针组在线购买自基因表达测定(Applied Biosystems，Foster City，CA)。用于定量cDNA实时PCR的人探针组包含层粘连蛋白-5、纤连蛋白、整联蛋白-β、snail-1、uPAR、E-钙粘蛋白、波形蛋白、MMP-1、Zeb1、CD44、CD24、LSD1、PKC-θ和亲环蛋白A。用于转录物的定量实时PCR分析的所有引物序列列于表3中。
所有基因组DNA寡核苷酸作为100μM原液从EasyOligoes Australia(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)以Guaranteed Oligos在线购买。对引物浓度进行优化以实现用于相同基因的不同引物组之间相似的扩增效率。用于定量实时PCR的所有寡核苷酸引物序列列于表4中。
抗体和缀合物
用于本研究的所有抗体均购买自商业来源。所有商业购买的抗体的详情列于表5中。
试剂盒
100mM dNTP组(4×25μmol)试剂盒(Astral scientific Pty.Ltd.，NSW，Australia)
Taqman DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)
血液小型试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)
SuperscriptTM III RNaseH-逆转录酶试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)
PowerSYBER Green PCR主体混合物(Applied Biosystems，Foster City，CA)
通用PCR主体混合物(Applied Biosystems，Foster City，CA)
MicroRNA逆转录试剂盒
酶和标志物
完全蛋白酶抑制剂混合片(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)DNAse I，无RNase(Roche Diagnostics，Man nheim，Germany)蛋白酶K(溶液)，RNA级(Invitrogen，Carlsbad，CA)SuperscriptTM III RNaseH-逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)细胞培养物
哺乳动物细胞系
粘附人乳腺腺癌MCF-7细胞系在DMEM完全培养基中生长。解冻后，使细胞在第一次分传(split)之前在无菌75cm2瓶中的DMEM完全培养基中保持2天。一旦汇合(2天后)，用10mL的预热D-PBS(Gibco BRL，Gaitherburg，MA)洗涤细胞，然后再向洗过的细胞上添加1mL0.05％胰蛋白酶-EDTA(1×)(Gibco-BRL，Gaitherburg，MA)。然后将细胞在37℃孵育3分钟以脱离细胞，随后添加另外的10mL DMEM培养基。然后将细胞在300×g下离心10分钟，之后将重悬于1mL的新鲜完全DMEM培养基中，随后通过Vi-CELL-XR计数器计数，然后以期望的细胞密度分传。随后根据实验要求使细胞每2至3天传代，并且当达到80％汇合时进行继代培养。对于大多数实验，除非另有说明，否则在实验前1天进行接种：24孔板4×104个细胞/孔，4×105个细胞/75cm2瓶或4×106个细胞/375cm2烧瓶。使MDA-MB-231所有细胞在5％CO2/O2的潮湿环境中生长，并且在经Hepa过滤的红外线(IR)培养箱(Forma Scientific Inc.，Materietta，OH)中在37℃下孵育。使用的所有其他细胞系以相同的方式生长和传代，不同之处在于使用RPMI-1640完全培养基。
表3
来自的用于实时PCR的人引物/探针组
表4
来自EasyOligo的用于实时PCR的人引物/探针组
表5
抗体详情
细胞生存力和密度计数
通过使用vi-CELL-XR计数器(Beckman Coulter Ireland Inc.，Galway，Ireland)来测定细胞生存力。市售的Vi-CELL计数器试剂包商购自Beckman Coulter Ireland Inc.，Galway，Ireland。将重悬细胞(1mL培养基中)的50μL等分试样在450μL培养基中以1∶10稀释，并且装填到Vi-CELL计数器杯中以进行细胞计数和生存力检查。除非另有说明，否则细胞生存力计数恒定＞98％。
支原体检测
在冷冻之前和解冻细胞之后，总是检查支原体污染，并且只有不含支原体的细胞用于所有实验。支原体检测使用MycoAlert Q支原体检测试剂盒(Lonza，ME USA)进行。
刺激条件
在刺激前一天以根据实验要求设定的密度接种MCF-7细胞。在如表6指定的不同浓度和孵育长度下测试了EMT的潜在诱导物，包括佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和TGFβ(R&D systems，Minneapolis，MN)。
LSD1抑制条件
表7中描述了所使用的商业化LSD1抑制剂和供应商信息。对于每个实验，还包括相应对照样品，其具有同等浓度的溶解培养基或载剂，通常是DMSO(除非另有说明)。
上皮向间充质转变(EMT)测定
EMT测定在24孔板(Costar，Corning Inc.，Corning，NY，USA)中进行。对于该测定，除非另有说明，否则通常MCF-7细胞在该实验前一天以4×104个/孔/500μL培养基接种。第二天，用在温热培养基中制备的多种EMT刺激物刺激细胞，并在下面指定的显微镜下监测EMT变化。一般基于在显微镜下每个场中计数100个细胞的表型来计算EMT的百分比。表6中描述了本文中所使用的所有潜在EMT刺激物，并且其按照供应商说明书制备和储存。
表6
潜在EMT刺激物的详情
表7
LSD1抑制剂信息
乳腺球测定
以下的乳腺球培养基组分购买自StemCell Technologies Inc.，BC，Canada：Mammocult基础培养基(人)(产品编号-05621)；Mammocult增殖补充剂(人)(产品编号-05622)；肝素(产品编号-07904)和氢化可的松(产品编号-07904)。在实验当天将氢化可的松粉末新鲜溶于mammocult基础培养基中以获得10-4M溶液。然后通过添加45mL Mammocult基础培养基、5mL mammocult增殖补充剂、100μL的0.2％肝素原液、500μL 10-4M的氢化可的松原液和50μL PNS制备50mL的Mammocult完全培养基。Mammocult完全培养基在同一天使用或者在4℃下储存不多于7天。
使MCF-7细胞在175cm2细胞培养瓶中生长，并使用细胞刮(Zellschaber，Switzerland)收获或按以下指定进行FACS分选。重要的是，从未使用胰蛋白酶处理来收获细胞，因为其干扰乳腺球测定。然后将收获的细胞重悬于1mL mammocult完全培养基中，并且在20℃下在500×g离心3分钟。然后对细胞在Vi-CELL计数器上计数之前，将细胞沉淀物(cell pellet)重悬于1mL mammocult完全培养基中。然后制备细胞稀释液以染色40,000个细胞/2mL，并且将2mL细胞接种在6孔-超低粘附的平底板(Costar，Corning Inc，Corning，NY，USA)中。根据实验方案刺激细胞或不对细胞进行处理，并在经Hepa过滤的红外线(IR)的孵育箱(Forma Scientific Inc.，Materietta，OH)中在37℃下在5％CO2孵育7天。在第7天对每孔中大于60μm的乳腺球进行计数，并用Olympus显微镜拍摄图片。所有乳腺球测定在一式两份的孔中进行，并且整个过程重复至少两次。
免疫荧光
荧光激活细胞分选(FACS)
通过胰蛋白酶处理，接着用PBS洗涤两次，收获每个孔/瓶中的细胞。然后将经洗涤的细胞重悬于抗体混合物中，所述抗体混合物由在1％FCS-PBS溶液中的抗CD44-APC、抗CD24-PE抗体(详情在表5中)和Hoechst 33258染料(1∶1000的最终稀释度)(Invitrogen，Carlsbad，CA)组成。将重悬于抗体混合物中的细胞在4℃下孵育20分钟。接着用PBS洗涤细胞两次并将其重悬于1％FCS-PBS溶液(基于细胞数目的体积数)中且保持在冰上直至通过FACS进行分析。用由488nm氩离子激光激发的FITC荧光染料，由488nm激发的PE荧光染料和由350nm氦-镉紫外激光激发的Hoechst荧光染料选择前向散射(Forward scatter，FSC)和侧向散射参数。
使用BD FACS LSR流式细胞仪(Becton Dickinson Biosciences)或BD FACSAriaTM II流式细胞仪(Becton Dickinson Biosciences)得到流式细胞术数据，并在MCRF设备JCSMR，ANU，Canberra，Australia上，使用数据采集软件CellQuest Pro(BectonDickinson Biosciences)和FlowJo(Tree Star Inc.，Ashland，OR)软件进行分析。使用单色对照来设定补偿参数。在每个实验中同种型对照被用于所有相应的一抗。
在MCF-7细胞中的CD44和CD24染色优化
采用在本文中所使用的FACS设门策略，并由开创性的乳腺癌干细胞公开(Al-Hajj等，2003)改良，其基于CD44高和CD24低表达对细胞进行分选。CD44高和CD24低的表达已显示出与人乳腺癌干细胞有关(Al-Hajj等，2003；Sleeman等，2006，Mani.等，2008)。为了证实抗CD44-APC和抗CD24-PE抗体是特异性的，使用同种型对照抗体。用于抗CD24-PE的同种型(阴性对照)是PE小鼠抗人IgG2aK，用于抗CD44-APC的同种型(阴性对照)是APC-小鼠抗人IgG2bK。首先，将所有细胞用Hoechst33258染色以监测细胞生存力。另外，将细胞用不同浓度的APC或PE同种型对照进行染色。
显微术
荧光显微术
如上所述对细胞进行染色并封在盖玻片上。使用Olympus荧光1×71显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)在油浸下在×100倍放大或60倍放大下或Leica共聚焦显微镜(Leica microsystems)，观察经染色的细胞。使用DPController相机软件1.2.1.108版(2002Olympus optical Co.，LTD)捕捉Olympus荧光1×71显微镜上的图像，并使用Leica应用程序套件2.0.0程序捕捉Leica共聚焦显微镜上的图像。使用Photoshop CS3(AdobeSystems Inv.，San Jose，CA)对图像进行分析。使用FITC激发滤光片(excitation filter)406-495nm滤光器(WIB)在Olympus荧光1×71显微镜下观察GFP/FAM载体转染的孔或瓶。
相差显微术
在Olympus荧光1×71显微镜的10×或20×放大倍数下，相差显微术用于EMT和伤口愈合测定。如上所述地捕捉和分析图像，不同之处在于还通过Image J软件(由NIH开发的公共领域内的免费软件)分析伤口愈合测定照片。
转染
DNA转染
通过使用可商购转染试剂FuGENE 6(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)(FuGENE 6的详细方法描述如下)对用于在MCF-7和T-47D细胞中DNA转染的条件进行了优化。为了达到最大转染效率，首先，以不同的试剂比：DNA/寡核苷酸(oligo)(用于优化的GFP表达载体)对转染试剂进行检查。对于所有的DNA转染，在24孔板中的转染开始之前24小时，将细胞以每孔1×105个细胞接种在500μL不含抗生素的培养基中，并且按照制造商的指导进行转染。用于转染的稀释培养基是 I Reduced-Serum培养基(1X)液体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。如上所述，通过FACS在36至48小时之后检查转染百分比。
使用FuGENE 6试剂的DNA转染
对于500μL总体积(24孔板的每孔)中的单个反应，向含有10μL IReduced-Scrum培养基的1.5mL Eppendorf管中添加0.9μL FuGENE 6，充分混合，并在室温下孵育5分钟。5分钟后，向该管中添加0.4μg或0.3μg GFP标记的DNA(根据所使用的特定DNA寡核苷酸的浓度计算DNA的体积)，以分别得到2.25∶1或3∶1比率的FuGENE 6。然后将DNA和复合物在室温下孵育45分钟。在45分钟后，在细胞顶部逐滴地添加20μL的FuGENE-DNA复合物，并通过使板旋转而混合，并将板在37℃下孵育36至48小时。
siRNA转染
冻干的 FITC缀合物阴性对照siRNA(模拟物)(sc-36869)；经验证的LSD1 siRNA(sc-60970)和LSD2 siRNA(sc-95467)购买自Santa Cruz Biotechnologies，California。这些siRNA的特异性先前已公开(Sutcliffe等2011.Molecular Cell 6：704-719；Yang等，2010.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107：21499-21504)。通过使用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)在MCF-7细胞中进行10nM siRNA的正向转染(Forwardtransfection)。对于EMT测定和对于转录物分析，正向转染方法在24孔板(4×104个细胞)中进行，而对于需要大量细胞的染色质免疫沉淀(ChIP)测定，转染在25cm2烧瓶(4×105个细胞)中进行。
简单地说，为了在24孔板中建立正向转染反应，在转染之前24小时将MCF-7细胞以每孔4×104个接种在500μL不含抗生素的培养基中。向20nmol冻干的siRNA贮存物(stock)添加250μL DEPC-水以得到20μM浓度的原液。为了实现10nM的最终siRNA浓度(对于一个反应，在24孔板的一个孔中500μL的培养基总体积中)，将3μL的20μM siRNA原液在50μL I中进一步稀释并在室温下孵育5分钟。此步骤后立即通过将1μLLipofectamine(对于一个反应)添加到50μL I来对Lipofectamine进行进一步稀释，接着在室温下孵育5分钟。然后将50μL的经稀释siRNA和50μL的经稀释Lipofectamine溶液混合在一起，以得到100μL的siRNA-Lipofectamine复合物。随后将此复合物在黑暗中在室温下孵育20分钟。小心地用移液管将所得siRNA-Lipofectamine复合物移吸到细胞表面上，并通过来回地轻摇板进行混合。将板孵育48至72小时并通过流式细胞术(参见以上流式细胞术分析的详细方法)检查转染效率。用三种方法来检查敲低：(1)对目的基因进行转录物分析，以确认特定的基因的敲低，例如，使用来自TaqMan的用于实时PCR的LSD1寡核苷酸(在表3中描述)通过LSD1定向的siRNA的LSD1敲低；(2)在ChIP水平下(请参考特定基因的ChIP结果)；(3)对每个siRNA进行优化实验以在MCF-7中确认最大转染效率(70％至80％)。因此，本文所示结果是可重复的。每个模拟物(对照)和基因特异性siRNA敲低实验独立地进行三次，并且在本章节中只显示一个代表性实验。
分子生物学技术
对于RNA分离过程，通常用RNase Zap(Ambion，VIC，Australia)对所有移液管、管架和手套进行预处理。在本章节描述的所有分子生物学工作常规地使用无RNAse、DNAse、热原的无菌微管(Axygen Scientific，Inc.，Union City)和预灭菌的耐气溶胶枪头(tip)和清洁的工作台外罩。
总RNA分离
对于大多数实验，除非另有说明，否则从5×105至1×106个MCF-7细胞提取总RNA。首先使细胞在1mL的试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)中在室温下解冻5分钟以使RNase灭活，随后研磨以去除细胞沉淀。将悬浮于Tizol(1mL)中的解离细胞转移至1.5mLEppendorf管中保持5分钟以均质化。然后通过以下提取RNA：添加200μL氯仿并剧烈地混合，然后将样品以8000×g在4℃下离心30分钟。然后将水层收集到一个新的1.5mL Eppendorf管中并向水层添加等体积的异丙醇，并轻轻混合。在室温下5分钟后，将样品在干冰上快速冷冻并在-70℃下储存过夜或者直到分离过程可以重新开始。在迅速解冻样品后，将样品再次以8,000×g在4℃下离心30分钟以沉淀RNA。为了除去所有痕量的异丙醇，接着用1mL冰冷的80％乙醇(Analytical UNIVAR，Seattle，WA)洗涤RNA沉淀物，然后以3,600×g在4℃下离心10分钟。然后除去所有乙醇，并使沉淀物空气干燥5分钟。然后通过将RNA样品重悬于50μL不含核酸酶的DEPC(焦碳酸二乙酯处理过的)水(Ambion，VIC，Australia)中使RNA样品溶解。接着，取出2μL样品以在分光光度计ND1000(Nanodrop Technologies，Inc.，Wilmington，DE，USA)上使用ND-1000 V3.30软件测量RNA质量和数量。发现所有RNA样品都是纯的，原因是其A260/A280比率为1.9至2.1，并且该比率提供了相对于污染物(例如在紫外光谱中吸收的蛋白质)的RNA纯度的估计。
第一链cDNA合成
Superscript III试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于cDNA合成。通过添加1μL的5μM寡核苷酸(dT)和1μL的100mM dNTP并通过轻弹混合制备了主体混合物-1(Master mix-1)。通过添加2μL的RT缓冲液、2μL的3mM mgCl2、2μL的DTT混合物、1μL的RNAseout、1μL的Superscript III并通过轻弹混合制备了主体混合物-2。对于1μg的RNA，将2μL的主体混合物-1添加到样品，混合并在65℃下孵育5分钟，然后将样品置于冰上以终止反应。该步骤之后，向每个样品添加10μL的主体混合物-2，并将样品在50℃下孵育50分钟。然后通过在85℃下孵育样品5分钟，随后通过将样品置于冰上2分钟以终止反应。最后，向每个样品添加1μL的RNaseH，并将样品在37℃下孵育20分钟。所有样品在干冰上快速冷冻或立即用于定量实时PCR分析。
定量实时PCR(qRT-PCR)分析
使用基因表达测定(Applied Biosystems，Foster City，CA)在ABIPRISM 7900HT快速实时PCR序列检测器(PerkinElmer/PE，Applied Biosystems，FosterCity，CA)上使用FAM探针通道进行qRT-PCR。使用10μL的总反应体积用DEPC水以1∶20稀释的cDNA进行PCR，详见制造商的指南(PerkinElmer/PE，Applied Biosystems，方案PN4333458)。对于所有基因组DNA，进行Power SYBR Green实时PCR(PerkinElmer/PE，AppliedBiosystems，Foster City，CA)反应，并将ChIp样品以1∶5进行稀释。每个PCR反应使用如下的热循环仪条件在孔中进行，一式两份：阶段1-50℃持续2分钟，进行1个循环；阶段2-95℃持续10分钟，进行1个循环；阶段3-95℃持续15秒和60℃持续1分钟，进行40个循环。对于所有的引物组，总是包括无模板对照以测试PCR混合物中任何污染DNA的PCR扩增。使用以下PCR条件对于每个引物组完成解离曲线以确认单一产物的扩增：阶段1-95℃持续15秒；阶段2-60℃持续20秒；以最小的倾斜速度达到阶段3-95℃持续15秒。使用光学PCR 384孔反应板(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行PCR反应。
cDNA实验的数据分析
在Microsoft excel电子表格中使用公式100000/2^(Ct-17)将来自PCR扩增图的所有阈值循环(Ct)值转化成任意拷贝数，其中17的Ct值被设定为105个拷贝，并假设每个循环增加等同于输入DNA增加2倍。将所有引物对照扩增子标准曲线进行检查，表明上述公式产生的结果与用扩增标准曲线法获得的结果相似。对每个实验同时进行亲环蛋白A引物(部分0)PCR反应以使RNA输入和cDNA合成的差异归一化。所有实验一式两份进行。
微RNA的cDNA合成
使用 MicroRNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)用特异性 miRNA引物测定将总RNA转化为用于微RNA分析的cDNA。使 MicroRNA逆转录试剂盒的试剂在冰上完全解冻后，通过每15μL反应体积添加以下组分来制备RT主体混合物：0.15μL dNTP混合物(100mM)、1μL MultiscribeTM RT酶(50U/μL)、1.5μL 10×RT缓冲液、0.19μL RNase抑制剂(20U/μL)和4.16μL无核酸酶的水，以得到7μL的总体积。将所有组分轻轻混合，短暂离心，然后将此RT主体混合物置于冰上直至制备了RT反应板。然后制备RT反应板；首先通过将总RNA(每15μL反应1ng至10ng)与RT主体混合物以5μL RNA∶7μL RT主体混合物的比率组合。然后将微RNA RT引物在冰上解冻，并用适当编号对待用于RT反应的管进行标记。接着，在将12μL含总RNA的RT主体混合物分配到各管中后，向适当的管添加3μL的5×RT引物以使得每个管的总体积为15μL。然后将所有管轻轻混合，短暂离心并在冰上孵育5分钟或直至准备上样到热循环仪上以在15μL的反应体积按照以下热循环进行逆转录：保持在16℃，持续30分钟，进行1个循环；循环2，保持在42℃，持续30分钟；循环3，保持在85℃，持续5分钟；以及循环4，在4℃持续无限久。在运行完成之后，将样品保存在-20℃或立即用于qPCR。
微RNA cDNA的qPCR扩增
qPCR反应通过将以下组分添加到适当管中来制备20μL qPCR反应混合物来进行：1μL的小RNA测定(20x)、1.33μL的来自RT反应的产物、10μL 通用PCR主体混合物II(2X，不含UNG)和7.67μL无核酸酶的水。然后将组分轻轻混合开短暂离心。所有qPCR反应一式三份进行。然后将20μL的完全qPCR反应混合物(包括测定和RT产物)转移到384孔板的每三个孔中。随后将板密封，短暂离心，并按照第2.5.2节中所述进行PCR扩增。
染色质测定
染色质免疫沉淀(ChIP)测定
根据实验要求在多种处理之后收获1×106至5×106个细胞并在室温下将其重悬于10mL DMEM完全培养基中，之后在Vi-CELL计数器上计数。然后在连续但缓慢旋转的旋转轮上用新鲜制备的1％多聚甲醛(PFA)(Analytical UNIVAR，Seattle，WA)在室温下交联细胞10分钟。接着，通过添加2M甘氨酸溶液(AnalaR，Merck，Darmstadt，Germany)使反应淬灭以得到125mM的最终浓度，并在旋转轮上于室温下进一步混合10分钟。然后将细胞用10mL冰冷PBS洗涤三次，并将细胞沉淀物在干冰上快速冷冻或随后立即使用。通过添加1×完全蛋白酶抑制剂溶液(1片溶于1mL DEPC水中)(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)制备SDS裂解缓冲液(Upstate Biotechnology，Billerica，MA)，然后将细胞沉淀物在室温下重悬于250μL的SDS裂解缓冲液中10分钟。使用Cole Palmer超声处理器(Cole PIamer，VernonHills，IL)对细胞进行超声(在与冰混合的1L冰冷水中，10秒脉冲，持续2分钟，70％最大输出)以剪切染色质，从而获得250bp至500bp的平均DNA片段大小。超声后，将样品在室温下以10,2000×g离心5分钟，以清除细胞碎片，然后将上清液用ChIP稀释缓冲液(UpstateBiotechnology，Billerica，MA)稀释至1∶10。按照实验要求将抗体等分至1.5mL Eppendorf管中后，添加在稀释缓冲液中稀释的来自0.5×106至1×106个细胞的经超声染色质，并将ChIP混合物与抗体一起在旋转轮上在4℃下孵育过夜。对于所有实验，对于每个条件，不含任何抗体的总基因组DNA(称为总输入)被迅速冷冻并在-70℃储存，不含任何抗体的样品(称为无抗体)也并行地与ChIP样品进行处理。接着，通过添加60μL的鲑鱼精子DNA/蛋白质A琼脂糖珠结合免疫复合物，在4℃在旋转轮上持续1小时。然后将样品在4℃以2500×g离心2分钟，丢弃上清液，然后用来自Upstate Biotechnology(Billerica，MA)的以下洗涤缓冲液的每一种按所述的相同顺序在旋转轮上在4℃洗涤珠5分钟：第一次洗涤-500μL的低盐免疫复合物洗涤缓冲液；第二次洗涤-500μL的高盐免疫复合物洗涤缓冲液；第三次洗涤-500μL的LiCl免疫复合物洗涤缓冲液；第四次洗涤-500μL的低盐免疫复合物洗涤缓冲液以及第四次洗涤-1mL TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)。临使用前向所有的洗涤缓冲液添加1×的完全蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)。然后用400μL新鲜制备的洗脱缓冲液(1％(w/v)SDS，100mM NaHCO3)在旋转轮上在室温下将DNA-蛋白复合物从珠洗脱，持续30分钟。然后，在添加16μL的5M氯化钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)之后，对样品和总输入对照进行孵育以在66℃水解交联(或逆交联)过夜。次日，将样品用1μL的蛋白酶K溶液(20μg/μL)(Invitrogen，Carlsbad，CA)在45℃下处理1小时。如下从ChIP样品移出被消化的蛋白质：添加等体积的经10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA饱和的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，混合样品，并随后在室温下以10,200×g离心20分钟以收集水性层。通过添加2.5体积的冰冷无水乙醇(Analytical UNIVAR，Seattle，WA)、0.1体积pH 5.2的3M乙酸钠缓冲溶液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和25μg的GeneEluteTM线性聚丙烯酰胺(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，在-20℃持续至少24小时，以使基因组DNA从水性级分沉淀出来。接着，通过离心使样品沉淀并用80％冰冷乙醇洗涤，并使沉淀物在悬浮于20μL DEPC水中以进行实时PCR分析之前空气干燥。用于对ChIP样品进行实时PCR的寡核苷酸已列于表4中。
顺序ChIP
如上所述进行初次ChIP直至TE缓冲液洗涤步骤。因此，将来自初次ChIP的免疫沉淀物溶解在DEPC水中含有10mM DTT(SuperscriptTM III RNaseH-逆转录酶试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA))的60μL洗脱缓冲液中，并在37℃水浴中孵育1小时。在此孵育期间每15分钟轻弹管。接着，将样品用1∶40的ChIP稀释缓冲液稀释，然后取400μL的样品在-70℃冷冻以用作二次ChIP的总基因组输入。向这些样品添加二抗，并按照ChIP方案(如上所限定)再次进行免疫沉淀，不同之处在于在4℃下使免疫复合物与60μL的鲑鱼精子DNA/蛋白质A琼脂糖珠结合2小时。然后洗脱顺序ChIP样品，使交联逆转，并通过如上述的方法使基因组DNA沉淀。使用下述的ChIP富集比方法进行书序ChIP分析，然后表示为相对于未刺激样品的倍数变化。
ChIP实验的数据分析
所有ChIP测定在存在无抗体对照(non-antibody control)以及同种型特异性对照抗体的情况下进行。阴性对照是无抗体对照，来自这些的富集值通常是低的并且包括在计算ChIP富集比中的背景减除中。首先使用公式100000/2^(Ct-17)将来自实时PCR扩增图的Ct值转化为任意拷贝数。将样品数据归一化以相应的总输入任意拷贝数进行归一化。然后计算高于无抗体对照的倍数变化，以得到ChIP富集比。除了组蛋白修饰的ChIP富集比值，ChIP富集比值都乘以因子10。这种分析方法改编自Pokholok等(2006.Science 313：533-536)，其证实了以线性刻度示出的ChIP富集比与对数刻度的ChlP-on-ChIP数据显示中的噪音相比更好地突出了信号(Pokholok等，同上)。因此，本文中的所有ChIP数据以线性刻度示出。所有的ChIP测定表示三次独立实验的平均数±标准误差(SE)，并通过实时PCR分析，一式两份。在一些情况下，相对于未刺激样品(将其设置为1)计算倍数变化。使用Windows的GaraphPad Prism 5.03，通过双尾配对t检验来确定统计学显著性。
通常以每个相应样品的总输入(TI)使所有ChIP样品归一化。如果在刺激的细胞和CSC子集中ChIP样品的回收率低，则在实时PCR分析中获得的任意拷贝将低，但这里并非如此，来自样品的任意拷贝与其他在相同的Ct范围中。因为“ChIP富集比”方法已被用于分析不同样品中ChIPDNA的回收率，所以不同样品不影响数据的分析和解释。这种通过使用“ChIP富集比”的ChIP分析方法被认为是用于计算ChIP数据的最佳方法(Pokholok等，同上)。因此，结果不太可能由于ChIP回收率不良而受到影响。
对于顺序ChIP分析，使用uPAR或miR 200c启动子区特异的引物，通过SYBR Green实时PCR对从顺序ChIP实验中回收的基因组DNA进行定量。使用公式100000/2^(Ct-17)将来自PCR扩增图的Ct值转化为任意拷贝数。从每个样品的数据中减去无抗体对照，然后将其以第一次免疫沉淀之前获得的相应总输入(TI-1)进行归一化。然后将所产生的数据以其各自的第二次总免疫沉淀输入(TI-2)进行归一化。最后，相对于未刺激样品(将其设定为1)计算倍数变化。然后，这些值用于绘制图中所示的顺序ChIP图。这种顺序ChIP分析的方法改编自Sutcliffe等，2009。使用Windows的GraphPad Prism 5.03，通过双尾配对t检验来确定统计学显著性。这种顺序ChIP分析的方法改编自Sutcliffe等，2009。
体内鼠异种移植模型
为了监测LSD1抑制剂在体内对肿瘤复发的作用，使用乳腺癌复发的体内鼠异种移植模型。在6周龄的BALB/c雌性裸鼠中使用MDA-MB231细胞系模型，其是最稳健的公认模型之一。在每只小鼠的乳腺脂肪垫中注射5×106个MDA MB 231细胞。观察小鼠的肿瘤外观和生长。一旦肿瘤达到50mm3的体积大小(由卡尺测量确定)，开始处理。对小鼠进行监测直至肿瘤达到500mm3，处死小鼠以收集肿瘤。每个处理组由14只小鼠组成(5只小鼠用于肿瘤生长曲线；+用于在以下3个时间点进行肿瘤收集的各3只小鼠：处理开始当天-第0周，化学治疗肿瘤减小-约第4周，以及直至肿瘤达到500mm3-约第7周)。每周测量肿瘤体积，并且在上述提到的三个时间点将来自各组的三只小鼠处死以进行IHC、FACS和RNA提取。
肿瘤的产生
1.从批量标记的MDA-MB-231(9/2/14)解冻细胞。
2.将细胞扩展到54×150cm2瓶中。
3.然后将细胞悬液在室温下以1500rpm旋转沉降5分钟。
4.然后弃去上清液，并将细胞沉淀物重悬于2.5mL冷PBS和2.5mL冷MatrigelTM中(注意：Matrigel只有当保持在冰上时是液态)。
5.然后使用26”针和作为麻醉剂的异氟烷向小鼠注射50μL的MatrigelTM+5×106个细胞的PBS悬液。每50μL的混合物含有2×106个MDA-MB-231细胞。
6.监测小鼠并称重，每天监测直到2014年5月15日。
7.在注射MDA-MB-231后第7天开始测量肿瘤体积。然后每天测量肿瘤体积直到2014年5月15日。
小鼠的处理在注射MDA-MB-231后第16天开始，其中肿瘤大致达到50mm3的体积。
小鼠的处理
组A：对照-20μL的DMSO
组B：4mg/kg多西他赛(11只小鼠)
组C：100mg/kg的帕吉林(11只小鼠)
组D：4mg/kg的多西他赛+100mg/kg的帕吉林(11只小鼠)
样品的收集
将肿瘤、脾、肝、肺和肾收集到(1)用于IHC的固定试剂中以及(2)2个不同的无RNase的1.5mL Eppendorf管中以在第0天被冷冻于-80冷冻箱中(1只小鼠/组A-C)。
在处理后第四周，收集肿瘤样品(3只小鼠/组；取最大、最小和平均大小的肿瘤)以用CD44、CD24和Hoechst染色进行流式细胞术。使来自每个样品的1mL各单一细胞悬液旋转沉降，并收集细胞沉淀物用于RNA。
在处理后第7周，收集剩余的肿瘤样品以用CD44、CD24和Hoechst染色进行流式细胞术。剩余的样品用于RNA提取。
单细胞悬液和流式细胞术染色
1.将肿瘤收集在15mL管中补充有2.5％FCS的5mL DMEM中。
2.然后将肿瘤单独称重以确定要添加的胶原酶的量。注意：使用1mg的胶原酶/1g的肿瘤，DMEM中胶原酶的浓度＝100mg/mL。
3.使用手术刀片将肿瘤在培养皿中精细地切碎，然后用适量的培养基转移回15mL管中，例如，如果肿瘤为1g，则所述培养基为至多10mL并添加100μL的胶原酶原液。
4.然后每5分钟通过摇晃/倾斜管使样品在37℃下孵育1小时。
5.然后在1小时后，将样品在室温下以500×g旋转沉降5分钟。
6.然后将细胞重悬于10mL的2.5％FCS+DMEM中，并使用过滤器过滤到50mL管中。
7.然后使用台盼蓝染色对细胞进行计数。
8.对总数为2×105的细胞进行CD44-APC、CD24-PE和Hoechst染色。
在黑暗中在4℃下旋转35分钟的1.5ml Eppendorf管中，用100mL的CD44-APC(1∶50)、CD24(1∶50)和Hoechst(1∶1000)完成染色。
然后用1mL的FACS缓冲液(1％FCS+PBS)洗涤细胞，并将其以100μL重悬于小FACS管中用于获得。
使用JCSMR，ANU的LSR II完成流式细胞术。
实施例10-14的材料与方法
CSC从NCSC的细胞培养和分离
将粘附的人乳腺腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞在低葡萄糖DMEM(Gibco)中培养，并都补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺和0.1％PSN抗生素。将细胞用0.65ng/ml的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(Sigma-Aldrich)或20ng/ml的TGF-β(R&D systems)刺激指定的时间。对于双吲哚马来酰亚胺-I(Bisindolylmaleimide-I)(Calbiochem)或PKC-θ肽抑制剂(Calbiochem)研究，在MCF-7细胞中刺激之前，将细胞分别用1μM或30μM的抑制剂预处理1小时。在MDA-MB-231的情况下，将细胞分别用4μM或30μM双吲哚马来酰亚胺-I或PKC-θ肽抑制剂处理。
为了从非CSC(NCSC)中分离CSC，对用抗CD44-APC(559942，BD Biosciences)和抗CD24-PE抗体(555428，BD Biosciences)连同Hoechst 33258一起染色的单细胞悬液进行荧光激活细胞分选FACS)以监测细胞生存力。如在本工作中所使用，CSC定义为少数CD44高/CD24低，而NCSC定义为其余细胞群。
乳腺球培养基组分购买自StemCell Technologies，并且如制造商指南推荐的进行乳腺球测定。简单地说，然后制备40,000个细胞/2ml细胞稀释液，并将2ml细胞接种在6孔-超低粘附的平底板(Costar)中。在第7天对每孔中大于60μm的乳腺球进行计数，并拍摄照片。
相差显微术
在使用Olympus荧光lX71显微镜(Olympus)将细胞放大4倍(伤口愈合测定)或10倍(EMT)来观察的情况下进行相差显微术，并使用DPController软件(2002 Olympus opticalCo.，LTD)捕捉图像，并使用Photoshop CS3(Adobe Systems Inc.)进行分析。扫描使用10μm的比例尺。
伤口愈合测定
用无菌塑料尖端(tip)使MCF-7细胞单层受伤。将细胞用PBS洗涤两次并用DMEM洗涤一次。对于每个孔在皿上做参照标记并通过显微术获得时间零点图像。将细胞用PMA(0.65ng/ml)处理60小时，并在匹配区域中拍摄第二图像。使用Photoshop CS3(AdobeSystems Inc.)绘出伤口单层两侧的边缘并使其重叠。
质粒
在全长PKC-θ野生型基因序列内使核定位位点(NLS)突变，并将其框内克隆进具有如前所述(Sutcliffe等，2012.Front Immunol.3：260)的C末端HA标签的pTracer-CMV载体中。
引物
所使用的人TaqManTM引物组为：CD44、Hs00153304、CD24、Hs00273561、uPAR、Hs00182181、层粘连蛋白-5、Hs00194333、Zeb-1、Hs00611018、纤连蛋白、Hs00415006和整联蛋白-β、Hs00168458(Applied Biosystems)。用于SYBR Green实时PCR的引物是：Zeb1(正义：5′-GTGCTGTAAGTGCCATTTCTCAGTA-3′和反义：5′-CAAGAGACAAATCAACAAATGCTAGTT-3′)和亲环蛋白A(正义：5’-CTCCTTTGAGCTGTTTGCAG-3′和反义：5′-CACCACATGCTTGCCATCC-3′)。
转染条件
人PKC-θsiRNA(SC-36252)、p50 siRNA(sc-44211)和p65 siRNA(sc-44212)购自Santa Cruz Biotechnologies，并通过使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用10nMsiRNA进行正向转染。
总RNA分离和定量实时PCR分析
使用试剂(Invitrogen)提取总RNA，并使用SuperscriptTMIII RNaseH-逆转录酶试剂盒(Invitrogen)合成第一链cDNA。如前所述(Sutcliffe等，2009.Molecular and Cellular Biology.29：1972-86)进行基因表达测定和SYBR Green实时PCR。用 MicroRNA逆转录试剂盒(ABI 4366596)进行微RNA测定，并如Sutcliffe等(2010，Molecular Cell.41：704-719)中先前所述将数据以RNU6B进行归一化。
ChIP和顺序ChIP测定
ChIP缓冲液购买自Upstate Biotechnology，并如前所述(Sutcliffe等，2011.Molecular Cell.41：704-719)根据由Upstate Biotechnology提供的方案进行ChIP测定。所使用的抗体为：抗PKC-θ(Santa Cruz，sc-212)、抗PKC-θ磷酸化s695(Abcam，ab76568)和Pol II c-21(Abcam，ab817)。用于RT-PCR的启动子引物是人CD44(正向：TGAGCTCTCCCTCTTTCCAC，反向：TTGGATATCCTGGGAGAGGA)、uPAR(正向：GGGAAGCAAAGCAAGGGTTA，反向：GTTTTGTCAGGAGGGATACTGG)和IL-6(正向：CTCACCCTCCAACAAAGATTT，反向：CAGAATGAGCCTCAGACATC)。如由Sutcliffe等(2010，Molecular Cell.41：704-719)先前所述的进行顺序ChIP测定。
PKC活性测定
PKC活性测定购买自Enzo Life Sciences(DI-EKS-420A)，并如先前所述(Sutcliffe，2012.同上)根据制造商的方案进行测定。
免疫荧光
在Bond自动化系统(Vision Biosystems)上按照标准方案进行免疫组织化学。简单地说，使5μM组织切片脱蜡，通过分级乙醇再水化，并分别用抗PKC-θ或抗PKC-θ磷酸化抗体(如0539中所述)染色。使用在pH 8下的加热修复28分钟。Chromogen Fast Red(LeicaBiosystems)和DAKO Envision试剂盒被用于使信号显现。苏木精复染色被用于使核显现。在每次运行中，在每个载玻片上包含阳性和阴性同种型匹配的对照以确保不存在假阳性染色。
如在Sutcliffe等，2011.Molecular Cell.41：704-719中先前所述的进行细胞内染色。
数据分析
使用Microsoft Excel(Microsoft)分析数据，并使用Prism(5.0版，GraphPad软件)生成图表。
实施例15的材料与方法
细胞培养和FACS
将粘附的人乳腺腺癌细胞系MCF-7在低葡萄糖DMEM(Gibco)中培养，并补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺和0.1％PSN抗生素。用0.65ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(Sigma-Aldrich)刺激细胞60小时。对用抗CD44-APC(559942，BD Biosciences)和抗CD24-PE抗体(555428，BD Biosciences)以及Hoechst 33258(561908，BD Biosciences)染色的单细胞悬液进行FACS，以如前详述地监测细胞生存力(Zafar等，Chromatinized PKC-theta directly regulates inducible genes in epithelial to mesenchymaltransition and breast cancer stem cells.Molecular and Cellular Biology，2014，34：162961-2980)。本研究中采用的FACS设门策略根据在先的乳腺CSC公开内容(Al-Hajj等，Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.Proc NatlAcad Sci U S A.2003 100：3983-3988)进行调整和修改，其根据CD44高/CD24低表型分选细胞，显示出与人乳腺CSC相关，并且通常用作CSC表面标志物(Mani等，The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.Cell，2008，133：704-715)。
转录物分析
如前所述进行总RNA提取、cDNA合成和RT-PCR(Sutcliffe等，Dynamic histonevariant exchange accompanies gene induction in T cells.Molecular and CellularBiollogy，2009，29：1972-1986和Zafar等，Chromatinized PKC-theta directlyregulates inducible genes in epithelial to mesenchymal transition and breastcancer stem cells.Molecular and Cellular Biology，2014，34：162961-2980)。
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Claims (90)

1.组合物，其包含LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂、由其组成或基本上由其组成。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述LSD抑制剂是LSD1抑制剂。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述LSD抑制剂是LSD2抑制剂。
4.根据权利要求2的组合物，其中所述LSD1抑制剂是选择性LSD1抑制剂。
5.根据权利要求3的组合物，其中所述LSD2抑制剂是选择性LSD2抑制剂。
6.根据权利要求1的组合物，其中所述LSD抑制剂是Pan-LSD抑制剂。
7.根据权利要求1的组合物，其中所述LSD抑制剂是非选择性LSD抑制剂。
8.根据权利要求1至7中任一项的组合物，其中所述PKC-θ抑制剂是选择性PKC-θ抑制剂。
9.根据权利要求1至7中任一项的组合物，其中所述PKC-θ抑制剂是非选择性PKC-θ抑制剂。
10.根据权利要求1至7中任一项的组合物，其还包含可药用载体。
11.LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂用于改变EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种的用途，所述EMT调节基因过表达细胞选自LSD过表达细胞、PKC-θ过表达细胞以及LSD和PKC-θ过表达细胞。
12.LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂用于治疗或预防癌症的用途。
13.根据权利要求12的用途，其中所述癌症是非转移性癌症。
14.根据权利要求12的用途，其中所述癌症是转移性癌症。
15.LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂用于抑制或预防癌症复发的用途。
16.根据权利要求15的用途，其中所述癌症是非转移性癌症。
17.根据权利要求15的用途，其中所述癌症是转移性癌症。
18.根据权利要求11至17中任一项的用途，其中所述LSD抑制剂是LSD1抑制剂。
19.根据权利要求11至17中任一项的用途，其中所述LSD抑制剂是LSD2抑制剂。
20.根据权利要求18的用途，其中所述LSD1抑制剂是选择性LSD1抑制剂。
21.根据权利要求19的用途，其中所述LSD2抑制剂是选择性LSD2抑制剂。
22.根据权利要求11至17中任一项的用途，其中所述LSD抑制剂是Pan-LSD抑制剂。
23.根据权利要求11至17中任一项的用途，其中所述LSD抑制剂是非选择性LSD抑制剂。
24.根据权利要求11至23中任一项的用途，其中所述PKC-θ抑制剂是选择性PKC-θ抑制剂。
25.根据权利要求11至23中任一项的用途，其中所述PKC-θ抑制剂是非选择性PKC-θ抑制剂。
26.根据权利要求11至25中任一项的用途，其中所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂被制备或制造为用于那些应用的药物。
27.用于改变EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种的方法，所述EMT调节基因过表达细胞选自LSD过表达细胞、PKC-θ过表达细胞以及LSD和PKC-θ过表达细胞，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：使所述细胞与足以调节所述EMT调节基因过表达细胞形成、增殖、维持、存活、生存力、EMT或MET的量的LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂相接触。
28.根据权利要求27的方法，其中所述EMT调节基因过表达细胞选自CSC和非CSC肿瘤细胞。
29.根据权利要求28的方法，其中所述CSC和/或非CSC肿瘤细胞选自乳腺、前列腺、肺、膀胱、胰腺、结肠、黑素瘤、肝或神经胶质瘤CSC和非CSC肿瘤细胞。
30.根据权利要求28的方法，其中所述CSC和/或非CSC肿瘤细胞是乳腺CSC或非CSC肿瘤细胞(例如，乳腺上皮CSC或非CSC肿瘤细胞，包括乳腺导管上皮CSC或非CSC肿瘤细胞)。
31.根据权利要求27至30中任一项的方法，其中在所述EMT调节基因过表达细胞中PKC-θ的过表达包括在所述EMT调节基因过表达细胞的核中PKC-θ的存在或量提高。
32.根据权利要求27至30的方法，其还包括在使所述EMT调节基因过表达细胞与所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂相接触之前，检测在所述EMT调节基因过表达细胞中的所述EMT调节基因(例如LSD(例如LSD1和/或LSD2)和/或PKC-θ)的过表达(例如，相对于正常细胞(例如，正常乳腺细胞)中所述EMT调节基因的表达)。
33.根据权利要求32的方法，其包括检测所述EMT调节基因在CSC中的过表达。
34.根据权利要求32的方法，其包括检测所述EMT调节基因在非CSC肿瘤细胞中的过表达。
35.根据权利要求32的方法，其包括检测所述EMT调节基因在CSC和非CSC肿瘤细胞中的过表达。
36.根据权利要求27至30的方法，其还包括在使所述EMT调节基因过表达细胞与所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂相接触之前，检测所述PKC-θ过表达细胞的核中PKC-θ的存在或量的提高(例如，相对于正常细胞(例如，正常乳腺细胞)核中的PKC-θ的量)。
37.根据权利要求36的方法，其包括检测CSC的核中PKC-θ的存在或量的提高。
38.根据权利要求36的方法，其包括检测非CSC肿瘤细胞的核中PKC-θ的存在或量的提高。
39.根据权利要求36的方法，其包括检测CSC和非CSC肿瘤细胞的核中PKC-θ的存在或量的提高。
40.根据权利要求27至30的方法，其还包括在使所述EMT调节基因过表达细胞与所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂相接触之前，检测所述EMT调节基因过表达细胞中PKC-θ与CD44或uPAR启动子的结合。
41.根据权利要求40的方法，其包括检测CSC中PKC-θ与所述CD44或uPAR启动子的结合。
42.根据权利要求40的方法，所述方法包括检测非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与所述CD44或uPAR启动子的结合。
43.根据权利要求40的方法，所述方法包括检测CSC和非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与所述CD44或uPAR启动子的结合。
44.根据权利要求27至30的方法，其还包括在使所述EMT调节基因过表达细胞与所述PKC-θ抑制剂相接触之前，检测所述EMT调节基因过表达细胞中PKC-θ与染色质的结合。
45.根据权利要求44的方法，其包括检测CSC中PKC-θ与染色质的结合。
46.根据权利要求44的方法，其包括检测非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与染色质的结合。
47.根据权利要求44的方法，其包括检测CSC和非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与染色质的结合。
48.根据权利要求27至47的方法，其还包括对所述EMT调节基因过表达细胞表达一种或更多种CSC标志物进行检测。
49.根据权利要求48的方法，其中所述CSC标志物选自：ABCB5、ALDH1、ABCG2、α6整联蛋白、α2β1整联蛋白、β-联蛋白活性、CD15、CD13、CD20、CD24、CD26、CD29、CD44、CD90、CD133、CD166、CD271、c-Met、Hedgehog-Gli、巢蛋白、CXCR4、LGR5、Trop2和Nodal激活蛋白。
50.根据权利要求49的方法，其中所述CSC表达选自以下的一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8或更多种)CSC标志物：ALDH1、CD24、CD44、CD90、CD133、Hedgehog-Gli、α6整联蛋白。
51.根据权利要求49或权利要求48的方法，其中所述CSC表达CD24和CD44(例如，CD44高、CD24低)。
52.根据权利要求27至51的方法，其中所述CSC选自乳腺、前列腺、肺、膀胱、胰腺、结肠、黑素瘤、肝或神经胶质瘤CSC。
53.根据权利要求27至51的方法，其中所述CSC是乳腺癌CSC。
54.根据权利要求27至53的方法，其中所述CSC具有受损或终止的多能干细胞标志物Oct4或Sox2的表达，或以小于多能干细胞上那些标志物的水平或功能活性的约1/5、1/10、1/20、1/50、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14或约10-15的水平或功能活性表达这些标志物中的一种或全部两种。
55.用于在对象中治疗或预防癌症(例如原发性癌症或转移性癌症)包括减少癌症复发的方法，其中所述癌症包含至少一种EMT调节基因过表达细胞，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：以有效量向所述对象共同施用LSD(例如LSD1和/或LSD2)抑制剂和PKC-θ抑制剂，以改变所述EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力、(vi)EMT或(vii)MET中的至少一种。
56.根据权利要求55的方法，其中以有效量向所述对象共同施用所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂，以抑制所述至少一种EMT调节基因过表达细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活、(v)生存力和/或(vi)EMT，和/或刺激或诱导所述至少一种EMT调节基因过表达细胞的(vii)MET。
57.根据权利要求55或权利要求56的方法，其中所述LSD抑制剂是选择性LSD抑制剂(例如选择性LSD1抑制剂或选择性LSD2抑制剂)。
58.根据权利要求55或权利要求56的方法，其中所述LSD抑制剂是Pan-LSD抑制剂。
59.根据权利要求55或权利要求56的方法，其中所述LSD抑制剂是非选择性LSD抑制剂。
60.根据权利要求55至59中任一项的方法，其中所述PKC-θ抑制剂是选择性PKC-θ抑制剂。
61.根据权利要求55至59中任一项的方法，其中所述PKC-θ抑制剂是非选择性PKC-θ抑制剂。
62.根据权利要求55至59中任一项的方法，其中所述至少一种EMT调节基因过表达细胞选自CSC和非CSC肿瘤细胞。
63.根据权利要求55至62中任一项的方法，其中所述癌症选自乳腺、前列腺、肺、膀胱、胰腺、结肠、黑素瘤、肝或神经胶质瘤癌症。
64.根据权利要求55至62中任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
65.根据权利要求55至64中任一项的方法，其中所述CSC产生具有激素抗性的非CSC肿瘤细胞。
66.根据权利要求65的方法，其中所述非CSC肿瘤细胞的一种或更多种(例如1或2种)激素受体的表达减少或终止，所述激素受体选自雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)。
67.根据权利要求55至66中任一项的方法，其还包括在向所述对象共同施用所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂之前，检测从所述对象获得的肿瘤样品中EMT调节基因(例如LSD(例如LSD1和/或LSD2)和/或PKC-θ)的过表达(例如，相对于正常或非肿瘤样品中所述EMT调节基因的表达)，其中所述肿瘤样品包含所述至少一种EMT调节基因过表达细胞(例如CSC和/或非CSC肿瘤细胞)。
68.根据权利要求55至67中任一项的方法，其还包括在向所述对象共同施用所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂之前，检测从所述对象获得的肿瘤样品中一种或更多种CSC标志物的表达，其中所述肿瘤样品包含所述至少一种EMT调节基因过表达细胞。
69.根据权利要求55至68中任一项的方法，其中以协同有效量施用所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂。
70.用于在对象中治疗或预防癌症(例如原发性癌症或转移性癌症)包括减少癌症复发的方法，其中所述癌症包含CSC和非CSC肿瘤细胞，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：以有效量向所述对象共同施用(1)LSD(例如LSD1和/或LSD2)抑制剂和(2)PKC-θ抑制剂，以抑制所述CSC和/或所述非CSC肿瘤细胞的(i)形成、(ii)增殖、(iii)维持、(iv)存活或(v)生存力中的至少一种，和/或抑制所述CSC的(vi)EMT，和/或刺激或诱导所述CSC的(vii)MET，和(3)抑制所述非CSC肿瘤细胞的增殖、存活或生存力的癌症治疗或药剂，从而治疗或预防所述癌症。
71.根据权利要求70的方法，其中所述LSD抑制剂是选择性LSD抑制剂(例如选择性LSD1抑制剂或选择性LSD2抑制剂)。
72.根据权利要求70的方法，其中所述LSD抑制剂是Pan-LSD抑制剂。
73.根据权利要求70的方法，其中所述LSD抑制剂是非选择性LSD抑制剂。
74.根据权利要求70至73中任一项的方法，其中所述PKC-θ抑制剂是选择性PKC-θ抑制剂。
75.根据权利要求70至73中任一项的方法，其中所述PKC-θ抑制剂是非选择性PKC-θ抑制剂。
76.根据权利要求70至75中任一项的方法，其中所述癌症治疗或药剂选自放射治疗、手术、化学治疗、激素剥夺治疗、促凋亡治疗和免疫治疗。
77.根据权利要求70至76中任一项的方法，其中所述癌症治疗或药剂靶向快速分裂的细胞，或者破坏细胞周期或细胞分裂。
78.根据权利要求70至77中任一项的方法，其还包括在所述共同施用之前确定所述对象患有包含所述CSC和非CSC肿瘤细胞的癌症或处于发生所述癌症的风险下。
79.根据权利要求70至78中任一项的方法，其中所述癌症选自乳腺、前列腺、肺、膀胱、胰腺、结肠、黑素瘤、肝或神经胶质瘤癌症。
80.根据权利要求70至78中任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
81.根据权利要求70至80中任一项的方法，其中所述CSC产生具有激素抗性的非CSC肿瘤细胞。
82.根据权利要求81的方法，其中所述非CSC肿瘤细胞的一种或更多种(例如1或2种)激素受体的表达减少或终止，所述激素受体选自雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)。
83.根据权利要求70至82中任一项的方法，其还包括在所述共同施用之前检测从所述对象获得的肿瘤样品中EMT调节基因(例如LSD(例如LSD1和/或LSD2)和/或PKC-θ)的过表达(例如，相对于正常或非肿瘤样品中所述EMT调节基因的表达)，其中所述肿瘤样品包含所述CSC或所述非CSC肿瘤细胞或两者。
84.根据权利要求70至83中任一项的方法，其还包括在所述共同施用之前检测从所述对象获得的肿瘤样品中CSC和/或非CSC肿瘤细胞的核中PKC-θ的存在或量的提高(例如，相对于正常细胞(例如正常乳腺细胞)的核中PKC-θ的量)，其中所述肿瘤样品包含所述CSC或所述非CSC肿瘤细胞或两者。
85.根据权利要求70至84中任一项的方法，其还包括在所述共同施用之前检测从所述对象获得的肿瘤样品的CSC和/或非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与CD44或uPAR启动子的结合，其中所述肿瘤样品包含所述CSC或所述非CSC肿瘤细胞或两者。
86.根据权利要求70至85中任一项的方法，其还包括在所述共同施用之前检测从所述对象获得的肿瘤样品的CSC和/或非CSC肿瘤细胞中PKC-θ与染色质的结合，其中所述肿瘤样品包含所述CSC或所述非CSC肿瘤细胞或两者。
87.根据权利要求70至86中任一项的方法，其还包括在所述共同施用之前对所述CSC表达一种或更多种CSC标志物进行检测。
88.根据权利要求70至87中任一项的方法，其中以协同有效量施用所述LSD抑制剂和PKC-θ抑制剂。
89.根据权利要求70至87中任一项的方法，其中以协同有效量施用所述LSD抑制剂、所述PKC-θ抑制剂和所述癌症治疗药剂。
90.根据权利要求70至89中任一项的方法，其还包括与所述LSD抑制剂和所述PKC-θ抑制剂以及任选地所述癌症治疗/药剂同时、先后或分开地施用至少一种抗感染剂，所述抗感染剂有效对抗由于施用所述癌症治疗或药剂而发生的感染或发生风险提高的感染，其中所述抗感染剂选自抗微生物剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、驱肠虫药、抗原虫剂和杀线虫剂。
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