ITTO20130532A1 - Nuovo biomarcatore prognostico nell'infarto acuto del miocardio - Google Patents
Nuovo biomarcatore prognostico nell'infarto acuto del miocardioInfo
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:
"Nuovo biomarcatore prognostico nell'infarto acuto del miocardo"
TESTO DELIA DESCRIZIONE
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce a un nuovo biomarcatore prognostico nell'infarto miocardico acuto.
TECNICA PRECEDENTE
Dopo un infarto miocardico acuto (IMA), il tessuto cardiaco danneggiato inizia una serie complessa di processi mirati alla riparazione, ed infine alla sostituzione, della lesione con tessuto cicatriziale [1].
Durante questo periodo, l'area colpita dall'infarto à ̈ biologicamente molto attiva. Un rapido turnover di cellule e di componenti strutturali contribuisce a creare nuova matrice extracellulare (ECM). Le preesistenti proteine della ECM (per esempio collagene) vengono digerite da parte delle metalloproteasi (MMP) ed una nuova matrice viene depositata. Contestualmente, la migrazione e la differenziazione di nuove cellule contribuiscono al recupero del miocardio dopo la lesione [1,2].
Partendo dalle prime fasi della riparazione della ferita, tentata mediante estesi cambiamenti dell'architettura tessutale, la ferita vulnerabile à ̈ esposta alla sollecitazione meccanica dei continui cicli del battito cardiaco. D'altra parte, questo à ̈ responsabile di drastici cambiamenti del volume e della pressione intraventricolare . Durante i processi di guarigione, la contrazione del miocardio non può venire evitata, quindi la lesione non può mai guarire in modo appropriato, rispetto ad altre lesioni tessutali in cui la sollecitazione meccanica risulta assai minore e che possono anche venire contenute mediante impalcatura/supporti provvisori rigidi (per esempio lesioni della pelle, fratture ossee, ecc.).
Nonostante tutti i processi di riparazione specifici risultino potenzialmente appropriati e tempestivi, molto spesso non riescono ad evitare un rimodellamento svantaggioso e una perdita delle prestazioni miocardiche per effetto di una formazione della cicatrice non ottimale in corrispondenza del sito della lesione o perfino della rottura della cicatrice.
La prima fase (tentativo) dei processi di riparazione dopo il verificarsi di una ferita consiste nella formazione di un reticolo tridimensionale di fibrina che mira a bloccare l'espansione della lesione e a fornire una impalcatura/piattaforma provvisoria per la formazione di neovasi endogeni, il reclutamento e la diffusione di nuove cellule. Prima inizia il processo, migliore à ̈ la guarigione per effetto di una tempestiva formazione della cicatrice. Inoltre, le fasi di guarigione ottimali non dovrebbero venire interrotte od impedite da azioni enzimatiche e/oppure meccaniche (per esempio la rottura del reticolo di fibrina per effetto della libera attività proteolitica o del battito cardiaco), specialmente nelle primissime fasi della guarigione.
Generalmente, una elevata resistenza insieme ad una straordinaria estensibilità ed elasticità del reticolo di fibrina viene garantita dall'azione di una transglutaminasi in circolazione, il fattore XIII (FXIII), che mediante legami crociati covalenti lega le catene di fibrina e diversi altri componenti della ECM modificando notevolmente le loro proprietà originarie [3]. Questo fatto permette all'impalcatura di fibrina di funzionare opportunamente ostacolando l'espansione della lesione e fornendo lo sfondo e la tempistica migliore per ottenere un processo di riparazione ottimale. Infine, la migrazione/differenziazione cellulare e la formazione di neovasi sono processi FXIII-dipendenti e contribuiscono fortemente alla guarigione e al recupero del miocardio dopo una lesione.
FXIII à ̈ un pro-enzima della famiglia delle transglutaminasi piasmatiche, che à ̈ costituito da due subunità enzimatiche A (FXIII-A) e due subunità noncatalitiche B (FXIII-B) [3]. Ricopre un ruolo critico nella generazione di un coagulo emostatico stabile, nella guarigione delle ferite, nella riparazione tessutale, e nell'angiogenesi . FXIII à ̈ presente nel plasma, nelle piastrine, nei monociti, e nei macrofagi, tutti componenti profondamente implicati nella guarigione post-infarto. Il suo ruolo chiave nella guarigione à ̈ dimostrato da quanto segue:
(1) emorragia ritardata in soggetti con deficienza di FXIII congenita;
(2) guarigione ritardata di una ferita in casi FXIII-deficienti dimostrata in modelli umani e animali;
(3) effetti positivi dell'applicazione topica di FXIII sulla guarigione di una ferita dimostrati da studi in vitro e in vivo;
(4) proprietà antiapoptotiche e proangiogeniche; (5) effetti sulla migrazione/differenziazione cellulare nella ferita;
(6) modulazione della sintesi e deposizione di fibrina e nuovo collagene nella ECM;
(7) forti effetti positivi in animali che hanno subito un trapianto di cuore.
Straordinarie prove dirette del ruolo essenziale di FXIII sulla stabilità della cicatrice da infarto acuto e cronico provengono da un modello sperimentale con livelli di FXIII geneticamente ridotti in animali. Nahrendorf e coll, nel 2006 [4], in topi deficienti del (FXIII-/-), oppure eterozigoti per (FXIII-/+) il gene FXIII-A (rispettivamente livelli di FXIII del 5% e del 70%), per effetto della legatura delle coronarie ed MRI cardiaca ad alto campo, hanno seguito la formazione della cicatrice miocardica e il conseguente processo di rimodellamento del cuore. Gli autori hanno rilavato che tutti i topi FXIII-/-e FXIII-/+ morivano entro 5 giorni dall'MI a causa della rottura del ventricolo sinistro. Al contrario, i topi FXIII-/- sottoposti per 5 giorni a terapia sostitutiva intravenosa con FXIII mostravano normali tassi di sopravvivenza; tuttavia, la loro RMI cardiaca ha dimostrato un peggiore rimodellamento del ventricolo sinistro. Inoltre, usando una sonda di imaging molecolare sensibile a FXIII, hanno rilevato un'attività di FXIII significativamente maggiore in topi di tipo selvatico e in topi FXIII-/- ricostituiti rispetto a topi FXIII-/- non ricostituiti. Contestualmente, la migrazione delle cellule neutrofile nella cicatrice post-MI era diminuita nei topi FXIII-/- ma non nei topi FXIII-/- ricostituiti, e l'aumento fisiologico di MMP-9, normalmente osservato dopo un MI, era del 650% più elevato [4]. in topi FXIII-/- non ricostituiti. Questo, insieme all'osservazione che il livello di collagene-1 era più basso del 53% nei topi FXIII-/-, dimostra uno squilibrio nel turnover della ECM e fornisce una possibile spiegazione per la rottura cardiaca osservata nel 100% dei topi FXIII-deficienti. A conferma di quanto precede, topi KO per il gene della MMP-9 sono stati protetti dalla rottura cardiaca e sono sopravvissuti. Quindi, la prevenzione di una libera sovraregolazione di MMP-9 da parte di FXIII contribuisce efficacemente alla protezione contro una rottura cardiaca post-MI.
Dopo la pubblicazione di Nahrendorf [4], diversi altri scritti hanno riportato dati a favore del ruolo straordinario di FXIII nel destino di guarigione post-MI. Molti di questi riguardano una scarsa guarigione e uno svantaggioso rimodellamento come causa principale di insufficienza cardiaca [5,6]. Altri hanno suggerito FXIII come "Il cemento del cuore dopo un infarto miocardico" [7], capace di contrastare l'espansione dell'infarto e suggerendo che FXIII rappresenta una terapia sostitutiva utile nei pazienti con rottura del ventricolo [5].
Le proprietà pro-guarigione dirette di FXIII in un cuore post-infarto (cioà ̈ angiogenesi e differenziazione/proliferazione cellulare), e quelle mediate dalla matrice stabilizzata mediante FXIII nella ferita (cioà ̈ modulazione della sintesi/deposizione di fibrina e nuovo collagene), hanno spinto i ricercatori a proporre anche iniezioni intramiocardiche di componenti di biomateriale polimerico o l'utilizzo di una impalcatura inseminata con fibrina e cellule nelle prime fasi di MI. Questo favorirebbe la riduzione della dimensione dell'infarto e la facilitazione della distribuzione delle cellule staminali o dei fattori di crescita portando a sua volta ad una migliore guarigione del cuore e ad una più elevata sopravvivenza [8,9].
Infine, il ruolo recentemente riconosciuto della risposta immunitaria cellulare come essenziale nella guarigione del miocardio, attribuisce ai neutrofili, e ai monociti/macrofagi funzioni chiave nella guarigione post-MI [10-13]
neutrofili si accumulano nel miocardio colpito da infarto e raggiungono il picco entro circa 24 ore; dopodiché, i monociti/macrofagi invadono la lesione. Durante le complesse fasi di guarigione, sono state associate funzioni divergenti e complementari a differenti sottogruppi di monociti. Nella fase infiammatoria, i neutrofili e i monociti migrano nel miocardio colpito da infarto per eliminare cellule morte e frammenti e favoriscono la degradazione della ECM mediante MMP attivate; successivamente, i monociti/macrofagi producono citochine per reprimere i segnali infiammatori e regolare la formazione del tessuto di granulazione, essenziale per la fase di proliferazione. A questo punto, i nuovi vasi sanguigni, la proliferazione dei fibroblasti, e la formazione della ECM, favoriscono la fase di maturazione in cui questo tessuto viene sostituito da una cicatrice matura a base di collagene.
FXIII prende parte a tutte queste funzioni, essendo sezione tra coagulazione, infiammazione come pure guarigione di una ferita [3]. In effetti, il reclutamento di macrofagi e neutrofili à ̈ ridotto nel cuore colpito da infarto di topi KO FXIII-/-fagocitaria. FXIII à ̈ anche contenuto in queste particolari cellule infiammatorie, e fornisce fondamentalmente un reticolo tridimensionale più forte con aumentate proprietà di elasticità ed estensione. Questo facilita la formazione di nuovi vasi e la differenziazione cellulare evitando uno squilibrio nel turnover della ECM ed attenuando la risposta infiammatoria alla lesione.
Tutti i dati precedentemente descritti sono a favore del fatto che avere livelli appropriati di FXIII nel sito della lesione à ̈ un requisito essenziale per la quariqione ottimale di una ferita in particolare nelle primissime fasi. Di consequenza, recenti pubblicazioni suqqeriscono fortemente la necessità di esplorare nuove strateqie di trattamento per riparare il cuore danneqqiato aumentando la quariqione intrinseca di una ferita che avviene durante le prime 1 a 2 settimane dall'MI. Questo si rende necessario poiché, da una parte, l'esistenza di un'efficiente terapia intensiva (anqioplastica, trombolisi ecc.) ha ridotto drasticamente la mortalità da infarto acuto, e dall'altro lato le inadequate opzioni per il trattamento del numero aumentato di sopravvissuti ad un infarto ha contribuito alla crescita di complicazioni croniche post-MI in particolare insufficienza cardiaca [1].
Di consequenza, altri studi suqqeriscono che una tempestiva inteqrazione con FXIII potrebbe aiutare il cuore nella quariqione di per sé, poiché la mancanza/deficienza di questo enzima porta inevitabilmente a una proqnosi neqativa di quariqione dopo una lesione miocardica [5,6,14]. Sebbene l'intervento in questa fase venqa considerato una finestra temporale utile promettente, ma poco sfruttata, tra qli sforzi di riperfusione acuta e la terapia contro un anomalo rimodellamento cardiaco/insufficienza cardiaca cronica, bisoqna essere cauti e tenere in considerazione che FXIII stabilizza il coaqulo di sanque (trombo) la cui presenza nelle coronarie à ̈ appunto responsabile dell'occlusione/infarto [4].
La qualità della guarigione da infarto subito dopo la lesione miocardica segna il destino del paziente per gli anni a venire. Ad oggi, non esistono test di laboratorio dedicati per prevedere efficacemente il risultato della guarigione post-MI e/oppure per avere informazioni prognostiche per aiutare i clinici nell'applicare prima un trattamento personalizzato per evitare un anomalo rimodellamento del ventricolo e una insufficienza cardiaca o altri eventi cardiaci avversi maggiori (MACE).
SCOPO E SINTESI DELL'INVENZIONE
Lo scopo della presente invenzione consiste nel fornire un nuovo biomarcatore per determinare la prognosi di un paziente colpito da infarto miocardico.
Secondo l'invenzione, il suddetto scopo viene ottenuto grazie alle composizioni specificate nelle rivendicazioni seguenti, che devono venire intese come facenti parte integrante della presente descrizione.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione fornisce un kit diagnostico per la valutazione dei livelli di FXIII in un paziente colpito da infarto miocardico, avendo i livelli di FXIII un valore prognostico circa il recupero del paziente, in cui il kit comprende mezzi per rivelare i livelli di FXIII in campioni biologici di detto paziente, e almeno quattro provette per la raccolta dei campioni adatte per raccogliere almeno quattro campioni biologici del paziente prelevati il giorno dell'infarto miocardico (tO) ed almeno nei tre giorni successivi (tl-13).
Un'ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione si riferisce a un procedimento diagnostico per determinare la prognosi di un paziente colpito da infarto miocardico, in cui i livelli di proteina FXIII vengono determinati il giorno dell'infarto miocardico (t0) ed almeno nei tre giorni successivi (da t1 a t3), in cui un abbassamento del livello di FXIII in uno qualsiasi di t0 a t3 al disotto di un valore di soglia à ̈ indicativo di una prognosi negativa.
La presente invenzione fornisce la prova che il monitoraggio dei livelli di FXIII nelle primissime fasi di un infarto miocardico aiuta i clinici nella previsione dell'evoluzione dell'infarto con particolare interesse verso la determinazione dei possibili eventi cardiaci avversi maggiori post-infarto miocardico e conseguentemente nella determinazione dei trattamenti terapeutici .
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI ALLEGATI
Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell'invenzione risulteranno evidenti dopo la descrizione dettagliata che segue e che viene data solo a titolo di esempi non limitativi facendo riferimento alle figure dei disegni allegate. Questi disegni sono sostanzialmente in forma di diagrammi che mostrano profili di rilascio di esempio di vari agenti attivi che possono venire ottenuti usando composizioni come descritte in questa sede.
Specificamente:
- Figura 1: valori Medi e Mediani dei livelli di FXIII al tempo prefissato nell'intera coorte di pazienti colpiti da MI analizzati.
- Figura 2: Confronto di valori Medi e Mediani dei livelli di FXIII al tempo prefissato in quei casi che hanno sviluppato durante il follow-up qualsiasi tipo di MACE (destra) rispetto a quei casi che non hanno sviluppato nessun tipo di MACE (sinistra).
- Figura 3: Confronti di valori Medi e Mediani dei livelli di FXIII al tempo prefissato tra pazienti che hanno sviluppato AMI (re-infarto) come primo punto finale nel follow-up dopo il primo MI acuto (destra) rispetto al sottogruppo MACE rimanente (sinistra).
- Figura 4: valori Medi e Mediani dei livelli di FXIII al tempo prefissato in quei pazienti che hanno sviluppato insufficienza cardiaca (HF) e in quelli che sono deceduti durante il follow-up. Nel gruppo dei deceduti (destra), t30 non à ̈ stato riportato per la parziale e scarsa disponibilità di campioni (vedere i risultati).
- Figura 5: valori Medi e Mediani dei livelli di FXIII al tempo prefissato in quei pazienti che hanno sviluppato angina instabile come sintomo principale durante il followup.
- Figura 6: Curva ROC dei livelli di FXIII al 4° giorno (t4*); i dettagli informativi associati sono riportati nella Tabella 1. ;;Nella seguente descrizione, sono forniti numerosi dettagli specifici per permettere una completa comprensione delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono venire messe in pratica senza uno o più dei dettagli specifici, o mediante altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali, o procedure ben noti, non vengono mostrati o descritti nel dettaglio per evitare di confondere aspetti delle forme di realizzazione. ;Il riferimento in tutta la presente a (aggettivo numerale) forma di realizzazione" o "una (articolo indeterminativo) forma di realizzazione" indica che un/una particolare aspetto, struttura, o caratteristica descritto/descritta in relazione alla forma di realizzazione à ̈ incluso/inclusa in almeno una forma di realizzazione. Quindi, le forme delle espressioni "in una (aggettivo numerale) forma di realizzazione" o "in una (articolo indeterminativo) forma di realizzazione" in vari punti in tutta la presente descrizione non si riferiscono necessariamente tutte alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i/le particolari aspetti, strutture, o caratteristiche possono venire combinati/combinate in qualsiasi modo adatto in una o più forme di realizzazione. ;I titoli inclusi nella presente sono solo per praticità , e non interpretano l'ambito o il significato della forma di realizzazione. ;La presente invenzione si riferisce alla identificazione di un nuovo biomarcatore utile nel determinare il recupero potenziale di pazienti colpiti da un infarto miocardico. ;In una forma di realizzazione la presente descrizione contempla un kit diagnostico per la valutazione delle quantità di FXIII in un paziente colpito da infarto miocardico, avendo le quantità di FXIII un valore prognostico circa il recupero del paziente, in cui il kit comprende mezzi per rivelare la quantità di proteina FXIII in almeno quattro, preferibilmente sei, campioni biologici e in almeno quattro, preferibilmente sei, provette per la raccolta di campioni adatte per raccogliere almeno quattro, preferibilmente sei, campioni biologici del paziente ottenuti nel giorno dell'infarto miocardico (t0) e almeno nei tre fino a cinque giorni successivi (da t1 a t3 o da t1 a t5). ;Ancora una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione si riferisce a un procedimento diagnostico per determinare la prognosi di un paziente colpito da infarto miocardico, in cui le quantità di proteina FXIII vengono determinate nel giorno dell'infarto miocardico (t0) e almeno nei tre giorni successivi (da t1 a t3), in cui un abbassamento della quantità di FXIII in uno qualsiasi di t0 a t3 al disotto di un valore di soglia à ̈ indicativo di prognosi negativa. ;In un'ulteriore forma di realizzazione, il valore di soglia della quantità di proteina FXIII viene valutato come percentuale di un valore di riferimento della proteina FXIII convenzionalmente fissato al 100% (se non diversamente riportato) di un campione di riferimento (controllo normale), in cui tale campione di riferimento viene ottenuto da materiali di riferimento standard come, per esempio, plasma riunito liofilizzato per calibrazione di riferimento. ;Come esempio, il valore di soglia (o valore di taglio), al disotto del quale il paziente à ̈ a rischio di prognosi negativa (cioà ̈ insufficienza cardiaca o morte), varia a seconda del tempo considerato (10-15). Tutte le soglie sono espresse come percentuale della quantità di proteina FXIII del controllo normale (riferimento). I valori di soglia per t0 a t5 (determinati utilizzando l'analisi ROC), hanno fornito risultati apprezzabili e significativi, cioà ̈ hanno permesso di determinare correttamente la prognosi di un paziente colpito da infarto. Di conseguenza, nell'esempio seguente, i pazienti che hanno sviluppato insufficienza cardiaca o quelli che sono deceduti dopo AMI vengono raggruppati insieme poiché i loro comportamenti (nel consumo di FXIII) sono molto simili. Quindi, eseguendo il confronto mediante la procedura ROC dei livelli di FXIII di questo sottogruppo MACE+ con i livelli di FXIII di tutto il gruppo MACE-, i risultati erano statisticamente significativi. ;Nella Tabella 1 sono mostrati i valori di soglia della quantità della proteina FXIII in qualsiasi di t0 a t5. ;;Tabella 1 ;Taglio Sensibilità / ;Tempo FXIII% Specificità P AUC CI (95%) (ROC) (%) ;t0 88,0 69,23/70,43 <0,0001 0,720 0,663-0,769 t1 87,7 65,45/66,67 <0,0001 0,700 0,638-0,754 t2 85,8 65,31/67,05 <0,0001 0,710 0,644-0,768 t3 75,6 64,44/75,94 <0,0001 0,760 0,709-0,800 t4* 74,9 74,29/67,01 <0,0001 0,740 0,677-0,787 t5 63,0 73,33/76,00 <0,0001 0,770 0,660-0,855 ROC = Caratteristiche Operative del Ricevente; AUC = Area Sotto la Curva; CI (95%) = Intervallo di confidenza (95%).
Le soglie riportate sono state ottenute confrontando i livelli di FXIII del sottogruppo MACE+ (insufficienza cardiaca e morte)
-.
Il contenuto della Tabella 1 indica che il valore prognostico di FXIII à ̈ già informativo nei primissimi tempi (t0-t3). In ogni caso, si raccomanda il monitoraggio di FXIII il più possibile completo (t0-t5), poiché à ̈ difficile prevedere esattamente il grado di consumo di proteina FXIII per ogni paziente colpito da infarto. Come esempio, nella Figura 6 si mostra la curva ROC al giorno 4 (t4; taglio di FXIII = 74,9%).
Attualmente, vengono eseguiti saggi di FXIII per determinare
enzima nel sangue per comprendere se il livello di enzima può essere responsabile o meno per una determinata condizione patologica/clinica, generalmente una emorragia.
una emorragia), deve essere sempre confermata in una condizione allo stato stazionario lontana dall'evento acuto. Il saggio viene eseguito come singolo saggio individuale, che risulta sufficiente per una diagnosi definita.
Al contrario, la presente descrizione fornisce dati circa il valore prognostico dei livelli di FXIII in pazienti post-infarto: il monitoraggio in fase acuta dei livelli di FXIII in una finestra temporale di quattro, preferibilmente sei, giorni (cioà ̈ il giorno dell'infarto miocardico acuto (t0) e i successivi tre a cinque giorni (da t1 a t3 o da t0 a t5)) permette di prevedere il potenziale di guarigione (il grado di guarigione) di tale paziente, a prescindere da altri fattori interferenti/confondenti associati e/oppure concomitanti.
I dati sperimentali qui raccolti forniscono la prova che la diminuzione dei livelli acuti di FXIII, per una lesione del cuore, accade praticamente in quasi tutti i pazienti colpiti da infarto miocardico seppure con grado differente. Questo à ̈ dovuto alla formazione di trombi coronarici e alla guarigione del tessuto/formazione di una cicatrice miocardica. Nel dettaglio, il presente inventore ha scoperto che un paziente che va incontro a eccessivo consumo di FXIII al momento di un infarto miocardico (MI) à ̈ più propenso a sviluppare una grave insufficienza cardiaca o a morire, mentre un meno drastico consumo di FXIII si riscontra in pazienti recidivanti con re-infarto o uangina.
Avere bassi/non ottimali livelli di FXIII durante la fase critica di formazione della cicatrice ostacola la guarigione del cuore restituendo una non idonea riparazione tessutale con conseguenze future croniche sulle prestazioni miocardiche. In questo limitato periodo di tempo, la qualità della guarigione dall'infarto determina il destino del paziente per gli anni a venire.
Il monitoraggio dei livelli di FXIII durante l'MI acuto consente ai clinici di individuare in anticipo quei pazienti a rischio di prognosi negativa post-MI fornendo la possibilità di intervenire con trattamenti mirati.
Inoltre, il monitoraggio di FXIII permette il riconoscimento in anticipo di quei pazienti che realmente necessitano di ricevere una possibile terapia con infusione di FXIII (al fine di migliorare la guarigione del miocardio); una indiscriminata infusione di FXIII à ̈, infatti, responsabile di una indesiderata funzione procoagulante prima di ristabilire completamente una idonea riperfusione coronarica dopo l'infarto, e deve quindi venire eseguita esclusivamente in quei pazienti con effettiva necessità .
Complessivamente, queste osservazioni indicano che il FXIII Ã ̈ un utile biomarcatore prognostico con un potenziale possibile nella guarigione terapeutica di un paziente dopo MI.
La presente invenzione descrive come differenti gradi della diminuzione dei livelli di FXIII consentono di prevedere il rischio di sviluppare gli eventi cardiovascolari avversi maggiori post-MI.
Quindi, il monitoraggio della quantità diminuita di FXIII osservata nella fasi acute di MI consente di prevedere se tale paziente à ̈ a rischio di sviluppare incidenti futuri.
La necessità di avere una prova prognostica efficace à ̈ principalmente dovuta al fatto che, dall'inizio degli anni settanta, la maggior parte degli sforzi nel campo cardiovascolare sono stati indirizzati verso procedure diagnostiche e chirurgiche (intervento) raggiungendo risultati eccezionali. Per queste azioni efficaci, la percentuale di pazienti sopravvissuti a un MI à ̈ drasticamente migliorata e continua a crescere.
La presente invenzione si riferisce a una prova in grado di riconoscere in anticipo quei pazienti ad aumentato rischio di sviluppare ulteriori incidenti cardiovascolari con la finalità di approcciarli con un trattamento terapeutico personalizzato.
Attualmente, non esiste una prova prognostica o un trattamento specifico in grado di scongiurare efficacemente gli eventi indesiderati secondari ad un MI; esiste, in realtà , un limitato periodo di tempo in cui à ̈ possibile intervenire (1-2 settimane dal verificarsi di un MI) durante il quale à ̈ possibile agire per potenziare il potere di guarigione intrinseco del cuore e salvare quindi i pazienti dalla morte.
Per queste ragioni, la presente descrizione si riferisce alla valutazione e al monitoraggio dei livelli di FXIII nel profilo di prove di laboratorio ordinarie per la rivelazione di un infarto miocardico acuto (AMI). Le prove
indicatori passivi di un danneggiamento del cuore, sebbene siano mezzi diagnostici molto preziosi e informativi. Al contrario, la complessa valutazione di prove combinate qui descritta porta a informazioni prognostiche preziose molto utili per i clinici. Una volta confermata la diminuzione dei livelli di FXIII, sarebbe possibile intervenire con trattamenti aggiuntivi (anche terapeutici). La valutazione e il monitoraggio dei livelli di FXIII possono anche venire combinati con i marcatori ischemici classici.
Materiali e Metodi
Pazienti e Metodi
Sono stati reclutati 350 pazienti colpiti da MI acuto (gruppo intero; età media 68,2 ± 12,95 anni; 72,8% maschi) ammessi al Pronto Soccorso Azienda Ospedaliera Universitaria di Ferrara.
I criteri di inclusione erano: dolore toracico prolungato a riposo accompagnato da variazioni ischemiche secondo elettrocardiogramma (ECG). I valori di CK-MB e/oppure Troponina-I erano maggiori del limite di riferimento superiore in due campioni di sangue separati.
Tutte le caratteristiche degne di nota dei pazienti sono riportate nella Tabella 2.
Tabella 2
Totale STEMI NSTEMI
(n=350) (n=252) (n=98)<P>Età (y, DS, 68,2 12,95 67,1 13,50 71,05 11,33
range) (31-80) (31-80) (38-80)<<0,05>Maschi (n, %) 255 (72,8) 186 (73,8) 69 (70,4) NS PCI (n, %) 316 (90,3) 235 (93,25) 81 (82,6) <0,05 PCI = intervento coronarico percutaneo; STEMI = pazienti che mostrano ; NSTEMI = pazienti arruolamento;
Campioni di sangue
Il sangue à ̈ stato raccolto in provette Anti-Coagulazione contenenti Citrato Trisodico al momento e h per ulteriori cinque giorni (t1- MI acuto. Campioni di controllo sono stati prelevati almeno dopo 30 giorni (t30) per avere i livelli basali di FXIII lontano dagli eventi ischemici acuti.
Per escludere una possibile ulteriore degradazione/attivazione in vitro, ulteriori campioni comparativi sono stati prelevati in provette contenenti EDTA più Aprotinina.
Il plasma à ̈ stato ottenuto mediante centrifugazione del sangue a 2500 g x 10 min a temperatura ambiente, e differenti aliquote sono state congelate a -80°C.
Per verificare, in effetti, quanto le provette di raccolta possano influenzare i risultati, sono stati reclutati addizionali pazienti colpiti da MI (n = 45) e il sangue à ̈ stato prelevato in duplicato con le provette classiche Anti-Coagulazione contenenti Citrato Trisodico e le provette contenenti EDTA più Aprotinina. Lo schema di reclutamento era uguale a quello precedentemente descritto (t0-t5, t30) e il plasma ottenuto à ̈ stato congelato (-80°C) fino alla valutazione.
Misurazione dei livelli di FXIII
I livelli valutati mediante un Reagente a base di Lattice che à ̈ una sospensione di particelle di lattice di polistirene di dimensione uniforme rivestite con anticorpi policlonali di coniglio, altamente specifici per la subunità A di FXIII secondo le specifiche della casa produttrice (Instrumentation Laboratory, Milano, Italia). In breve, il procedimento si basa sul principio che quando un campione (plasma) contenente la subunità A di FXIII viene mescolato con il reagente a base di Lattice incluso nel kit, le particelle di lattice rivestite si agglutinano. Il grado di agglutinazione à ̈ direttamente proporzionale alla concentrazione di antigene
e viene determinato misurando la diminuzione di luce trasmessa causata dagli aggregati. La prova à ̈ semplice da eseguire, molto rapida, e ordinariamente praticabile.
Follow-up (FU) e Statistica
Il punto finale primario era un composito di morte cardiovascolare, re-infarto, insufficienza cardiaca (HF) o angina instabile (u-angina) valutati ad un anno. Gli eventi cardiaci avversi maggiori (MACE), sono stati retrospettivamente analizzati come variabile singola o combinati. I dati continui sono stati presentati come media ± DS, con la significatività delle differenze giudicata mediante il test t. Le variabili categoriche sono state sintetizzate in termini di numero e percentuale con la significatività delle differenze giudicata mediante il testi del Chi-Quadrato. Il riconoscimento della(e) soglia (e) di FXIII in qualsiasi periodo di tempo considerato (t0-t5) à ̈ stato ottenuto mediante l'analisi delle Caratteristiche Operative del Ricevente (ROC). La probabilità à ̈ stata considerata significativa a un livello di P < 0,05.
Risultati
FXIII Ã ̈ stato testato all'arruolamento (t0) e ogni 24 h per ulteriori cinque giorni (t1-t5) dall'evento di MI acuto. Campioni di controllo sono stati prelevati almeno dopo 30 giorni (t30) per avere i livelli basali di FXIII lontani dall'evento ischemico acuto.
La Tabella 3 mostra i risultati del monitoraggio di FXIII in pazienti colpiti da MI acuto ottenuti utilizzando provette standard per la raccolta di campioni (indicate con provette Anti-Coagulazione contenenti Citrato Trisodico) e provette per la raccolta di campioni contenenti almeno un agente antiproteolitico e almeno un agente anticoagulante (indicate con provette contenenti EDTA più Aprotinina).
Sebbene valori leggermente più bassi siano stati ottenuti dalle provette contenenti EDTA più Aprotinina, nessuna differenza significativa à ̈ stata ottenuta confrontando le due differenti fialette in cui il sangue à ̈ stato raccolto. In ogni modo, l'utilizzo di provette contenenti almeno un agente antiproteolitico e almeno un agente anticoagulante à ̈ raccomandato in quelle situazioni in cui non può essere possibile una valutazione così rapida della prova (ritardo ≥ 4 ore dal momento in cui viene prelevato il sangue).
L'agente antiproteolitico può venire scelto tra aprotinina, eparina, antitrombina, irudina, EDTA (acido Etilendiamminotetraacetico ), EGTA (acido Etilenglicolbis (β-amminoetil-etere)-tetraacetico), Leupeptina, iodoacetammide, APMSF ((4-Ammidino-fenil)-metan-solfonilfluoruro), 4- (2-Amminoetil)-benzensolfonil-fluoruro cloridrato, a2-Macroglobulina.
L'utilizzo di provette di raccolta contenenti almeno un agente antiproteolitico permette, infatti, di determinare l'effettiva quantità di proteina FXIII nel paziente colpito da infarto evitando un ulteriore consumo di proteina FXIII contenuta nella provetta di raccolta poiché la presenza dello/degli antiproteolitico/i blocca completamente qualsiasi ulteriore attivazione dell'enzima (in vitro). Questa precauzione garantisce una più attendibile rivelazione di FXIII, riflettendo meglio quel particolare stato in vivo.
Tabella 3
t0 t1 t2 t3 t4 t5 t30
Provette Anti -Coagulazione contenenti Citrato Trisodico
Medio 99,48 97,68 94,72 90,72 85,24 76,51 110,15 Mediano 98,4 95,30 94,20 88,70 83,20 74,05 108,20 DS 30,57 28,06 29,12 30,30 24,93 27,02 20,34 min 40,60 39,90 32,80 29,5 20,90 20,00 60,00 max 186,40 181,10 179,80 169,10 136,20 138,25 147,90
Provette contenenti EDTA più Aprotinina
Medio 98,34 96,87 93,61 89,16 83,08 75,45 107,34 Mediano 94,40 95,15 92,30 87,90 72,65 74,00 105,90 DS 31,87 32,34 34,40 31,25 28,72 29,19 27,37 min 41,05 38,75 34,70 30,5 22,05 21,90 61,25 max 193,90 190,90 182,50 178,20 139,60 135,25 152,70
P 0,92 0,32 0,30 0,35 0,28 0,84 0,80
La Figura 1 mostra i livelli medi e mediani di FXIII durante
Le Figure 2 a 5 mostrano i livelli di FXIII in differenti sottogruppi di pazienti durante i sei giorni (t0-t5) e al controllo finale (t30).
Complessivamente, una significativa diminuzione dei livelli di FXIII Ã ̈ stato chiaramente osservato a t4-t5 come medi e mediani a prescindere dal fatto che i pazienti abbiano sviluppato o meno eventi cardiaci avversi maggiori (MACE) (rispettivamente, Figura 2B e 2A).
Cosa i punto finale combinato ha dimostrato che la diminuzione di FXIII era significativamente più accentuata se si consideravano quei pazienti colpiti da eventi cardiaci avversi maggiori (MACE) (MACE+; n = 101; 28,8%) rispetto al resto dei pazienti senza eventi maggiori post-MI (MACE ; n = 249; 71,1%).
È degna di nota i
presentavano con livelli di FXIII significativamente più bassi a t0 e in qualsiasi altro momento considerati in quanto medi e mediani. I dati dei livelli di FXIII nella finestra temporale da t0 a t5 per pazienti MACE- e MACE+ sono forniti rispettivamente nelle Tabelle 4 e 5.
Tabella 4
= 249)
t0 t1 t2 t3 t4 t5 t30 Medio 103,73 102,10 101,31 98,02 89,34 83,37 109,53 Mediano 102,20 100,53 97,80 94,05 85,20 91,00 108,35
DS 28,77 29,17 31,55 29,74 25,58 23,53 24,95
min 46,30 42,60 42,40 40,60 38,30 37,00 54,80 max 236,80 201,20 198,90 193,90 149,60 136,60 172,70
Tabella 5
MACE+ (n = 101)
t0 t1 t2 t3 t4 t5 t30 Medio 88,69 86,22 82,68 76,28 71,00 65,07 91,94 Mediana 81,00 81,00 78,00 72,00 66,00 60,55 88,95
DS 29,41 29,87 29,71 29,10 29,01 31,12 24,28
min 35 32,8 31,5 30,5 20,9 18 54 max 167,2 160,5 158,4 151 148 136,6 159
Cosa interessante, il grado di diminuzione di FXIII à ̈ diventato addirittura più accentuato nel sottogruppo MACE+ (Figura 3A) quando sono stati esclusi quei pazienti che sono stati colpiti da infarto miocardico acuto (AMI) come primo punto finale nel follow-up. In verità , in questi ultimi pazienti (AMI), il comportamento medio della diminuzione di FXIII divergeva fortemente dagli altri gruppi considerati, che non sono stati evidentemente colpiti da una brusca diminuzione di FXIII (Figura 3B).
Contrariamente a quanto à ̈ accaduto nei pazienti precedentemente descritti (sottogruppi caratterizzati da insufficienza cardiaca o decesso), qui i pazienti che hanno sviluppato IMA, divergono dagli altri pazienti che sono persino se confrontati con il gruppo MACE-. Per questo motivo non abbiamo calcolato mediante analisi ROC questo tipo di risultati, ma sottolineiamo fortemente la loro importanza suggerendo di prenderli in considerazione e di rimandare la loro interpretazione finale.
Da notare, questi pazienti (AMI) si presentavano con più elevati livelli medi di FXIII a t0, e non sono mai scesi al disotto di un valore medio del 94,0% (t4).
Secondo la letteratura sul ruolo di FXIII nel recupero di danneggiamenti tessutali, vale a dire bassi livelli di FXIII sarebbero responsabili di un anomalo rimodellamento delle pareti del cuore post-MI causando insufficienza cardiaca o addirittura la morte (per una formazione inefficiente/scarsa della cicatrice miocardica in corrispondenza del sito della lesione), il presente inventore ha analizzato nello specifico quali erano i livelli di FXIII in quei pazienti colpiti da insufficienza cardiaca (HF) o morte post-MI.
I pazienti colpiti da
riduzione media di FXIII e la loro tendenza era caratterizzata da una inclinazione più brusca. Sebbene essi raggiunsero livelli medi di FXIII molto bassi (Fig. 4A), hanno mostrato un apprezzabile e normale recupero di FXIII a t30. Al contrario, quei pazienti che sono deceduti in seguito a complicazioni cardiovascolari correlate a MI subito in forma acuta (Figura 4B), presentavano a t0 livelli leggermente inferiori e hanno raggiunto t4-5 con valori medi e mediani di FXIII confrontabili con quelli del sottogruppo HF. Sfortunatamente, t30 non à ̈ stato raccolto poiché la maggior parte di questi pazienti à ̈ deceduta prima/oppure attorno a quel tempo oppure era irrimediabilmente non disponibile a causa di trattamenti o complicazioni concomitanti.
Infine, quei pazienti che hanno sviluppato u-angina come sintomo prevalente durante il follow-up (Fig. 5), sebbene abbiano mostrato una ridotta velocità di diminuzione di FXIII, non hanno mostrato a t30 il classico recupero dei livelli di FXIII. Questo potrebbe indicare che essi "continuano" a impiegare/consumare FXIII anche lontano dall'evento d'infarto acuto, probabilmente a causa del ricorrere cronico di attacchi di angina.
Analogamente a quanto abbiamo fatto per i precedenti pazienti AMI caratterizzati da un minore "consumo di FXIII", anche i dati dai casi anginosi non sono stati calcolati mediante analisi ROC . Sottolineiamo anche fortemente la loro importanza suggerendo di prenderli in considerazione e di rimandare la loro interpretazione finale.
Riassumendo, la prova/procedura presentata in questa sede fornisce risultati molto informativi come indicatore prognostico di quei MACE associati ad un eccessivo consumo di FXIII (HF o morte). Al contrario, sebbene degno di nota, il "basso" consumo di FXIII osservato in pazienti anginosi e colpiti da AMI merita ricerche future e definite, attribuendogli comunque una forte importanza clinica potenziale.
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Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Kit diagnostico per la determinazione dei livelli di proteina FXIII in campioni biologici di un paziente colpito da infarto miocardico, il kit comprendendo: - mezzi per rivelare la quantità di proteina FXIII nei campioni biologici, e - almeno quattro provette per la raccolta di campioni adatte per raccogliere gli almeno quattro campioni biologici del paziente prelevati nel miocardico (t0) e almeno nei successivi tre giorni (da t1 a t3).
- 2. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 1, in cui il kit comprende almeno due ulteriori provette per la raccolta di campioni adatte per raccogliere almeno due ulteriori campioni biologici del paziente prelevati almeno il quarto e il quinto giorno dopo miocardico (da t4 a t5).
- 3. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui le provette per la raccolta dei campioni contengono ciascuna almeno un agente antiproteolitico e un agente anticoagulante.
- 4. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 3, in aprotinina, eparina, antitrombina, irudina, EDTA (acido Etilendiamminotetraacetico), EGTA (acido Etilenglicolbis( -amminoetil-etere)-tetraacetico), Leupeptina, iodoacetammide, APMSF ((4-Ammidino-fenil)-metan-solfonilfluoruro), 4-(2-Amminoetil)-benzensolfonil-fluoruro cloridrato, a2-Macroglobulina.
- 5. Kit diagnostico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui i mezzi per la rivelazione della quantità di proteina FXIII comprendono un ligando di legame specifico della proteina FXIII, il ligando di legame specifico della proteina FXIII essendo preferibilmente rivestito su una fase solida.
- 6. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 5, in cui il ligando di legame specifico viene scelto tra anticorpo monoclonale e policlonale anti-FXIII.
- 7. Kit diagnostico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il kit comprenda almeno un controllo normale, in cui il controllo normale comprende una quantità fissa di proteina FXIII.
- 8. Procedimento per prevedere la prognosi di un paziente colpito da infarto miocardico, il procedimento comprendendo: - fornire almeno quattro campioni biologici del paziente colpito da infarto, gli almeno quattro campioni e almeno nei successivi tre giorni (da t1 a t3); - determinare le quantità di proteina FXIII in ogni campione biologico; in cui una riduzione della quantità di proteina FXIII in uno qualsiasi dei campioni biologici t0 a t3 al disotto di un valore di soglia à ̈ indicativa di prognosi negativa.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui il procedimento comprende inoltre: - fornire almeno due ulteriori campioni biologici del paziente colpito da infarto, gli almeno due ulteriori campioni venendo raccolti almeno il quarto e quinto giorno a t5); - determinare le quantità di proteina FXIII in un campione biologico t4 e t5; in cui una riduzione della quantità di proteina FXIII in uno qualsiasi dei campioni biologici t4 e t5 al disotto di un valore di soglia à ̈ indicativa di prognosi negativa.
- 10. Procedimento secondo la rivendicazione 8 o la rivendicazione 9, in cui il valore di soglia della quantità di proteina FXIII viene valutato come percentuale della quantità di FXIII di un controllo positivo.
- 11. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 10, in cui il valore di soglia della quantità di proteina FXIII per ciascun campione biologico t0 a t5 à ̈ espresso come percentuale della quantità di proteina FXIII di un controllo normale, tale quantità essendo fissata al 100%, in cui i valori di soglia sono: campione<soglia> (FXIII %) t0 88,0 t1 87,7 t2 85,8 t3 75,6 t4 74,9 t5 63,0
- 12. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 11, in cui i campioni biologici del paziente vengono raccolti in provette per la raccolta di campioni contenenti almeno un agente antiproteolitico e un agente anticoagulante.
- 13. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 11, in cui i campioni biologici del paziente sono campioni di sangue intero, plasma o siero.
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