KR20050048647A

KR20050048647A - 폰 빌레브란트 인자 특이적 절단 효소에 대한 항체 및그것을 이용한 분석계

Info

Publication number: KR20050048647A
Application number: KR1020057005108A
Authority: KR
Inventors: 겐지 소에지마; 노리꼬 미무라; 히로아끼 마에다; 지까떼루 노자끼; 다까요시 하마모또; 도모히로 나까가끼
Original assignee: 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
Priority date: 2002-09-25
Filing date: 2003-09-25
Publication date: 2005-05-24
Also published as: AU2008202992A1; CA2499926C; WO2004029242A1; AU2008202992B2; CN1701117B; US20060251655A1; ATE460479T1; DE60331666D1; JP2013078319A; KR101154550B1; EP1544293A4; CN1701117A; JP2009236925A; JPWO2004029242A1; EP2157178A1; CA2499926A1; EP1544293A1; US7575872B2; AU2003266632A1; EP1544293B1

Abstract

ADAMTS-13에 대하여 선택적으로 면역 반응성을 나타내는 항체의 제공, 및 당해 항체의 에피토프 해석, 또는 ADAMTS-13 자기 항체 양성 환자의 진단에의 이용을 목적으로 한다. 또는 의약품으로서의 이용을 목적으로 한 부분 결실 ADAMTS-13 개변 분자의 제조 방법 및 용도를 제공한다. ADAMTS-13의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리펩티드로 면역 감작한 온혈 동물로부터 얻을 수 있는 ADAMTS-13에 특이적인 항체. ADAMTS-13의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리펩티드로 온혈 동물을 면역 감작하는 공정을 포함하는 항체의 제조 방법. ADAMTS-13의 검출 방법 및 정제 방법을 포함하는 당해 항체의 용도, 및 부분 결실 ADAMTS-13 개변 분자를 제공한다.

Description

폰 빌레브란트 인자 특이적 절단 효소에 대한 항체 및 그것을 이용한 분석계{Antibody Against Enzyme Specifically Cleaving Von Villebrand Factor and Assay System Using the Same}

본원 발명은 의료용 의약품 분야에 관한 단백질에 관한 것이다. 상세하게는 혈액 응고에 관여하는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor: 이하, vWF라고도 함)의 특이적 절단 효소(이하, ADAMTS-13이라고도 함)의 전장 또는 부분 단편, 및 이들에 대한 항체에 관한 것이다. 본원 발명에서 제공되는 ADAMTS-13에 대한 항체에 의해 혈전성 혈소판 감소성 자반병(thrombotic thrombocytopenic purpura: 이하, TTP라고도 함) 등을 포함하는 당해 효소의 결손ㆍ저하(하나의 가능성으로서 이하의 보고가 있다; 예를 들면 비특허 문헌 1 참조)의 진단 또는 본 효소 단백질에 대한 자기 항체 양성 환자의 진단, 및 그에 수반하는 질병 환자에의 해당 효소의 보충 요법을 위한 효율적이고 순도높은 해당 효소의 조제 가능성이 개척된다. 또는 Disseminated intravascular coagulation(이하 DIC라고 약칭하기도 함) 등에 의한 혈소판 감소와 선천성ㆍ후천성 TTP에 의한 혈소판 감소의 구별이 가능해져, 혈소판 주사시의 지표를 얻을 수 있게 된다. 나아가 신규한 항ADAMTS-13제로서의 이용도 고려될 수 있다.

vWF는 혈관 내피 세포나 골수 거핵구에서 생산되며, 2050 아미노산 잔기(단량체 약 250 kDa)를 포함하는 단일 서브유닛이 S-S 결합으로 연결된 멀티머 구조(분자량 500 내지 20,000 kDa)로서 존재하는 지혈 인자이다. 혈중 농도는 약 10 ㎍/㎖이며, 일반적으로 고분자량의 것일수록 비활성이 높다.

vWF에는 2개의 큰 지혈 인자로서의 기능이 있는데, 하나는 혈액 응고 제VIII 인자와 결합하여 이것을 안정화시키는 캐리어 단백질로서의 기능, 또 하나는 상해 혈관벽의 혈관 내피 세포하 조직에 혈소판을 점착ㆍ응집시켜 혈소판 혈전을 형성하는 기능이다.

혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP)은 전신의 체조직 세동맥과 모세 혈관에 혈소판 혈전을 일으키는 질환이며, 오늘날 의료 기술의 진보에도 불구하고 당해 질환에서의 관련 사망률은 1971에서 1991년에 걸쳐 약 3배로 증가하고 있다. 병리학적으로 TTP는 혈관 내피 세포 장해나 혈관내 혈소판 응집에 의해 야기된다고 여겨지고 있으며, 면역 조직학적으로는 생성된 혈소판 혈전 중에 다량의 vWF의 존재가 확인되어 vWF가 이 성인(成因)에 큰 역할을 한다고 여겨지고 있다. TTP 환자의 vWF의 멀티머 구조는 정상 또는 고분자량이 우위로 되어 있으며, 특히 통상적으로는 보여지지 않는 초고분자량의 vWF(unusually large vWF multimer: ULvWFM)나 고분자량 vWF 중합체(1arge vWF multimer: LvWFM)가 고전단 응력하에서의 혈소판 응집의 촉진과 미소 혈전 형성에 큰 역할을 한다는 것이 추정된다. 한편, vWF는 정상인의 순환 혈액 중에서 고전단 응력하에 vWF 절단 효소(vWF-cleaving protease)의 작용에 의해 842Tyr-843Met의 위치에서 분해되는 것이 알려져 있다. 따라서, TTP는 혈장 중의 당해 효소 활성이 어떠한 원인에 의해 저하되고 ULvWFM 내지 LvWFM이 증가하여 혈소판 응집이 항진되며, 혈관내에 혈소판 혈전이 형성된다는 시나리오가 그려진다.

2001년 이러한 효소 활성을 갖는 활성 본체인 vWF 절단 효소, 별명 ADAMTS-13을 코드하는 유전자가 본원 출원인에 의해 클로닝되었다(WO02/088366). 이하, ADAMTS-13의 분자 구조에 대한 지식을 정리한다.

ADAMTS-13의 도메인 구성은 시그널펩티드에 연속하여 프로펩티드가 존재하고, 이어서 푸린(Furin)의 절단 모티프의 RQRR 서열이 존재하며, HEXXHXXGXXHD의 컨센서스 서열을 포함하는 리프로리신(Reprolysin) 형의 아연 킬레이트 영역을 포함하는 메탈로프로테아제 도메인이 이어진다(P285 stop까지). 또한, 뱀독 메탈로프로테아제에서 발견되는 디스인테그린-유사 도메인을 거쳐(W387 stop까지), 일반적으로 분자 인식에 중요하다고 여겨지고 있는 약 50 내지 60 잔기를 포함하는 최초의 Tsp1 모티프(Tsp1-1)(Q449 stop까지)로 연결되고, 나아가 세포 접착 모티프 중 하나인 RGDS 서열이 포함되는 Cys-풍부 영역(T581 stop까지)으로 이어진다. 이어서, 시스테인 잔기를 전혀 포함하지 않는 약 130 아미노산 잔기를 포함하는 스페이서 도메인(W688 stop까지)을 거쳐 다시 Tsp1 모티프의 반복(Tsp1-2 내지 8) 후, 보체 성분 Clr 또는 Cls 중에서 처음 발견되었다고 여겨지는 CUB 도메인-1, 2가 이어진다.

그런데, 본 효소의 효율적, 고순도의 정제법 또는 본 효소의 존재량에 대하여 정성적, 정량적인 진단 방법은 확립되어 있지 않다. 또한, 본 효소에 대한 자기 항체 양성 환자의 진단법도 확립되어 있지 않으며, 본 효소의 활성 발현의 필수 도메인도 특정되어 있지 않다.

도 1은 항체의 에피토프를 결정하기 위한 C 말단 결실 변이체의 제조 방법을 나타내는 도면이다.

도 2는 제조된 C 말단 결실 변이체의 일시 발현을 항FLAG 항체를 이용하여 비환원하의 웨스턴 블롯으로 확인한 도면이다.

도 3은 제조된 C 말단 결실 변이체의 일시 발현의 vWF 절단 활성을 환원하의 SDS-PAGE로 확인한 도면이다.

도 4는 PoAb1의 에피토프를 확인한 결과를 나타내는 비환원하의 웨스턴 블롯의 도면이다.

도 5는 PoAb2의 에피토프를 확인한 결과를 나타내는 비환원하의 웨스턴 블롯의 도면이다.

도 6은 MoAb Pep4-34-1의 에피토프를 확인한 결과를 나타내는 비환원하의 웨스턴 블롯의 도면이다.

도 7은 MoAb WH10의 에피토프를 확인한 결과를 나타내는 비환원하의 웨스턴 블롯의 도면이다.

도 8은 MoAb WH63-1의 에피토프를 확인한 결과를 나타내는 비환원하의 웨스턴 블롯의 도면이다.

도 9는 MoAb WHS40-3의 에피토프를 확인한 결과를 나타내는 비환원하의 웨스턴 블롯의 도면이다.

도 10은 각종 항체의 인식 영역과 활성 발현에 중요한 영역을 정리한 도면이다.

도 11은 vWF 절단 효소의 부분 합성 펩티드를 면역시켜 얻어진 토끼 항혈청을 이용한 정상인 혈장 및 TTP 환자 혈장 중의 ADAMTS-13의 확인을, 환원하의 웨스턴 블롯법으로 행한 결과를 나타내는 도면이다.

도 12는 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체를 조합하여 구축한 ELISA계의 모식도와 분석 흐름도이다.

도 13은 도메인별로 제조된 항체에 의해 구축된 ELISA법의 개념도이다.

도 14는 모노클로날 항체와 모노클로날 항체를 조합하여 구축한 ELISA계의 모식도와 분석 흐름도이다.

도 15는 인간 태아 신장 세포주 293을 숙주로 한 배양 상청으로부터 항체 칼럼에 의해 어피니티 정제된 유전자 재조합 ADAMTS-13의 SDS-PAGE의 영동 도면이다.

도 16은 인간 풀 혈장의 FI 페이스트로부터 항체 칼럼에 의해 어피니티 정제된 ADAMTS-13의 SDS-PAGE의 영동 도면이다.

도 17은 항체를 이용한 중화 활성능의 평가(비환원하의 vWF 절단 활성의 SDS-PAGE)를 나타낸 도면이다.

도 18은 후천성 TTP 환자 혈장 중의 항ADAMTS-13 항체의 검출(ELISA법)을 나타내는 도면이다.

도 19는 마우스 혈장 중의 ADAMTS-13의 검출(웨스턴 블롯법)을 나타내는 도면이다.

이러한 상황을 감안하여, 본원 발명의 제1의 과제는 높은 선택성으로 ADAMTS-13에 대하여 면역 반응성을 나타내는 항체를 제공하는 데 있다.

본원 발명의 제2의 과제는, 이러한 항체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본원 발명의 제3의 과제는, 이러한 항체의 용도를 제공하는 데 있다.

본원 발명의 제4의 과제는, 상술한 항체 또는 자기 항체 양성 환자 유래의 항체의 존재 또는 인식 영역을 특정하는 것이 가능하게 하는 전장 또는 부분 결실시킨 ADAMTS-13 분자를 제공하는 데 있다.

본원 발명의 제5의 과제는, 이러한 전장 또는 개변 분자의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본원 발명의 제6의 과제는, 이러한 전장 또는 개변 분자의 용도를 제공하는 데 있다.

vWF 특이적 절단 효소의 선천적 결손 환자 및 당해 효소에 대한 항체의 후천성 양성 환자의 치료법으로서, 현재까지 플라즈마 교환 요법이 실시되고 있으며, 당해 효소의 정제품 또는 유전자 재조합체 등 순품(purified product)에 의한 보충 요법의 확립이 요구되고 있다. 가족성 TTP 환자는 선천적으로 vWF 특이적 절단 효소가 결손되어 있으며, 비가족성에서는 후천적으로 당해 효소에 대한 자기 항체의 생산이 원인이라고 보고되어 있다. 따라서, 가족성 TTP 환자에게는 본 효소의 보충 요법이 바람직하며(현실적으로는 혈장 투여가 행해지고 있음), 비가족성에서는 혈장 교환에 의한 자기 항체의 제거와 본 효소의 보충이 필요하다.

따라서, 본 효소의 효율적인 제조 방법 또는 진단 등이 필요하게 되지만, vWF 절단 효소는 본원 출원인에 의한 선출원에 기재된 방법(W0 02/088366) 또는 그 밖의 방법(예를 들면, Kokame, K 등 "Proc.N.A.S. USA", 2002년, 제99권, p.11902-11907; Fujikawa, K. 등, "Blood", 2001년, 제98권, p.1662-1666 참조)에 의해 혈장 또는 재조합체 발현 상청 중에서 정제되는 방법에서는 충분한 순도 및 수량을 기대할 수 없다. 또한, 본 효소의 존재량, 특히 항원량으로서의 효소량을 측정하는 기술은 지금까지 존재하지 않았다. 또한, 특히 혈소판 감소증에 있어서 DIC 등이 원인인 경우와 달리 TTP가 기초 질환으로서 존재하는 경우의 혈소판 주사에 의한 증상 악화 등의 위험이 있었다.

따라서, 본 발명은 이들 문제점을 해결하기 위한 vWF 절단 효소에 대한 항체의 제공을 목적으로 한다. 상기 항체에 의해 vWF의 정량이나 정제가 가능해진다.

상술한 상황하에서 본원 발명자들은 vWF 절단 효소의 단리 동정을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 종래 보고된 적이 없는 목적 vWF 절단 효소의 정제 단리에 성공하고, 그 성숙형 단백질의 아미노산 서열 및 당해 아미노산 서열을 코드하는 유전자를 동정하기에 이르렀다(WO 02/088366).

그리고, 활성 발현에 필수적이라고 여겨지는 영역을 특정하기 위해, C 말단측 CUB 도메인으로부터 순차적으로 결실시킨 개변 분자를 제조하고, 그 vWF 절단 활성을 측정하였다. 그에 따라 스페이서 영역이라고 불리우는 서열번호 1의 아미노산 번호 688 위치 근방으로부터 N 말단측으로 구성되는 분자에 있어서도 그 정성적인 효소 활성은 유지되는 것이 확인되었다. 한편, 581 위치 근방까지로 구성되는 분자에서는 정상적인 분비가 저해되고, 449 위치 근방까지로 구성되는 분자에서는 배양 상청 중으로의 분비가 확인되었지만, 그 효소 활성은 미약하거나 또는 활성이 확인되지 않는 것이 발견되었으며, 이들 사실에 의해 본 효소 분자의 활성 발현에 필수적인 영역이 표시되었다. 이들로부터 본 효소 활성을 중화할 수 있는 항체의 제조에 필요한 에피토프 영역, 또는 활성을 갖는 본 효소 분자의 검출이 가능한 항체의 제조가 가능해졌다.

그리고, 얻어지는 ADAMTS-13의 아미노산 서열을 기초로 제조되는 펩티드 등을 항원으로 하여, 통상적인 면역 방법(Current Protocols in Molecular Biology, Edited by F. M. Ausbel et al.(1987), Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J.McCAFFERTY et al.(1996), Antibodies: A Laboratory Mannual, Edited by Harlow David Lane(1988) 또는 ANTIBODY ENGINEERING second edition Edited by Carl A. K. BORREBAECK(1995))에 의해 모노클로날 및 폴리클로날 항체 등의 제조가 가능하다. 또는, 파지 디스플레이 기술을 이용한 항체 제조 기술(Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al.(1996), Antibody Engineering: A PRACTlCAL APPROACH Edited by J.McCAFFERTY et al.(1996), 또는 ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK(1995))에 의해 당해 단백질과 결합하는 항체의 제조가 가능하다. 또는, 이들 기술에 기초하여 본 효소에 대한 자기 항체 양성인 TTP 환자 검체로부터 본 효소 활성의 중화 항체 또는 단순한 결합 항체의 단리도 가능하다. 그리고, 이들 항체를 이용함으로써 본 효소량 변동에 따른 질병, 예를 들면 TTP 등의 질환 진단 및 치료에의 응용이 가능해진다. 또는 제조된 항체를 이용하여 예를 들면 마우스의 ADAMTS-13에 대한 항체를 제조하여 마우스에 이입하거나, 이 항체의 유전자를 삽입한 발현 벡터를 마우스에 이입함으로써, 자기 항체 양성의 모델 마우스가 제조된다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 폰 빌레브란트 인자 특이적 절단 효소(이하, ADAMTS-13이라고도 함)를 구성하는 아미노산 서열의 전장, 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 상기 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 단백질 또는 펩티드에 대한 항체,

[2] 상기 [1]에 있어서, ADAMTS-13이 영장류 또는 설치류(齧齒類)를 기원으로 하는 것인 항체,

[3] 서열번호 1에 기재된 ADAMTS-13을 구성하는 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 상기 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 단백질에 대한 항체,

[4] 서열번호 1에 기재된 ADAMTS-13을 구성하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 당해 폴리펩티드의 스페이서 영역으로부터 N 말단측, 또는 메탈로프로테아제 영역, 디스인테그린-유사 영역, Tsp1-1 영역, Cys-풍부 영역으로부터 스페이서 영역의 사이를 인식하는 항체,

[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 항체로서, ADAMTS-13을 구성하는 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 상기 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 단백질의 어피니티 정제에 사용될 수 있는 항체,

[6] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 항체이며, ADAMTS-13을 구성하는 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 상기 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 단백질이 갖는 효소 활성을 저해 또는 중화할 수 있는 항체,

[7] 상기 [6]에 있어서, ADAMTS-13의 스페이서 영역으로부터 N 말단측, 메탈로프로테아제 영역 또는 디스인테그린-유사 영역을 인식하는 항체,

[8] 서열번호 2 및 3의 ADAMTS-13 부분 펩티드를 함유하는 면역원에 의해 제조된 항체,

[9] 서열번호 1에 기재된 폴리펩티드쇄의 전장 또는 그 일부의 발현물로 면역시키거나, 또는 그것을 발현하는 발현 벡터를 직접 동물에게 트랜스펙트하여 얻어지는 항체,

[10] 폴리클로날 항체인 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 항체,

[11] 모노클로날 항체인 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 항체, 및 그 항체를 코드하는 유전자,

[12] 하이브리도마 WH10, WH63.1, WHS40.3, Pep4-34.1, WH2-22-1A, WH2-1-1, WH2-11-1, Pep6-6A 및 Pep4-5B-1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하이브리도마가 생산하는 항체인 [9]의 모노클로날 항체 및 그 항체를 코드하는 유전자[여기서 WH10, WH63.1, WHS40.3 및 Pep4-34.1은 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1 쥬오 다이6)에 각각 수탁 번호 FERM BP-8174, FERM BP-8175, FERM BP-8176 및 FERM BP-8177로서 2002년 9월 4일에 기탁되어 있다. WH2-22-1A, WH2-1-1, WH2-11-1, Pep6-6A 및 Pep4-5B-1은 각각 수탁 번호 FERM BP-8483, FERM BP-8484, FERM BP-8485, FERM BP-8474 및 FERM BP-8475로서 2003년 4월 22일 및 2003년 9월 10일에 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1 쥬오 다이6)에 기탁되어 있음],

[13] 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 항체에 의해 인식되는 ADAMTS-13의 에피토프에 결합 또는 경합적으로 결합할 수 있는 항체,

[14] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체를 포함하는 의약품 조성물 또는 진단약,

[15] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체를 구성 성분으로 하는 표지 단백질,

[16] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체를 생산할 수 있는 단리된 세포,

[17] 하이브리도마인 상기 [16]의 세포,

[18] 하이브리도마주 WH10(수탁 번호 FERM BP-8174), 하이브리도마주 WH63.1(수탁 번호 FERM BP-8175), 하이브리도마주 WHS40.3(수탁 번호 FERM BP-8176), 하이브리도마주 Pep4-34.1(수탁 번호 FERM BP-8177), 하이브리도마주 WH2-22-1A(수탁 번호 FERM BP-8483), 하이브리도마주 WH2-1-1(수탁 번호 FERM BP-8484), 하이브리도마주 WH2-11-1(수탁 번호 FERM BP-8485), 하이브리도마주 Pep6-6A(수탁 번호 FERM BP-8474) 및 하이브리도마주 Pep4-5B-1(수탁 번호 FERM BP-8475)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 [17]의 세포,

[19] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체를 포함하는 면역 측정 키트,

[2O] ADAMTS-13의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리펩티드로 온혈 동물을 면역 감작하는 공정, 및 상기 면역 감작된 온혈 동물의 체액으로부터 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체를 채취하는 공정을 포함하는 항체의 제조 방법,

[21] 온혈 동물을 면역 감작하기 위한 폴리펩티드가 ADAMTS-13의 일부로서 서열표의 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 포함하는, 상기 [20]의 항체의 제조 방법,

[22] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체를 생산할 수 있는 단리된 세포를 생체내 또는 생체외에서 배양하는 공정, 및 그 체액 또는 배양물로부터 상기 항체를 채취하는 공정을 포함하는 항체의 제조 방법,

[23] 항체를 생산할 수 있는 단리된 세포가 하이브리도마인 상기 [22]의 항체의 제조 방법,

[24] 염석, 투석, 여과, 농축, 원심 분리, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 겔 전기 영동 및 등전점 전기 영동으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 포함하는 정제 방법에 의해 항체를 채취하는, 상기 [20] 내지 [23] 중 어느 하나의 항체의 제조 방법,

[25] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체를 피검 시료에 접촉시켜 면역 반응에 의해 ADAMTS-13을 검출하는 것을 특징으로 하는 ADAMTS-13의 검출 방법,

[26] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체를 이용하는 방사선 면역 분석법, 효소 면역 분석법 또는 형광 면역 분석법인 상기 [25]의 검출 방법,

[27] 피검 시료가 생체로부터 채취한 생물학적 시료인 상기 [25] 또는 [26]의 검출 방법,

[28] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체를 ADAMTS-13과 불순 물질을 포함하는 혼합물에 접촉시켜 항체에 당해 단백질을 흡착시키는 공정, 및 흡착된 당해 단백질을 항체로부터 탈착시키는 공정을 포함하는 ADAMTS-13의 정제 방법,

[29] 항체가 수불용성 담체에 결합되어 있는 상기 [28]의 정제 방법,

[3O] ADAMTS-13의 전장 또는 부분 결실 변이체를 주성분으로 하는 진단약 또는 의약품,

[31] ADAMTS-13의 스페이서로부터 N 말단측, 또는 메탈로프로테아제 영역, 디스인테그린-유사 영역, Tsp1-1 영역, Cys-풍부 영역으로부터 스페이서 영역을 주성분으로 하는 상기 [30]의 진단약 또는 의약품,

[32] ADAMTS-13의 전장 또는 부분 결실 변이체를 주성분으로 한 당해 폴리펩티드쇄에 대한 항체 검출용 시약ㆍ진단약 또는 의약품, 및

[33] ADAMTS-13의 전장 또는 부분 결실 변이체를 주성분으로 한 항체 검출 또는 에피토프 해석용 항원의 이용 및 그의 제조법이다.

ADAMTS-13에 결합할 수 있는 항체를 이하에 개시한다. 이들 항체는 당해 분야의 표준 기술을 이용하여 개변할 수 있다. 또한, 여기서 최초로 예시하는 항체와 유사한 항체를, 여기서 교시하는 방법과 공지된 방법을 조합하여 제조할 수도 있다. 항체를 생성하는 이들 방법은 포유 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 말, 염소, 양 또는 원숭이)을 ADAMTS-13 또는 이들의 프래그먼트로 면역시키거나, 또는 ADAMTS-13을 유전자 재조합적으로 발현할 수 있는 발현 벡터를 피하, 피내 또는 근육내에 트랜스펙트하는 것을 포함한다. 항체는 당해 분야에 공지된 여러가지 기술을 이용하여 면역시킨 동물로부터 얻을 수 있고, 바람직하게는 흥미로운 항원에 대한 항체의 결합을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 항체 및(또는) 항체 생성 세포의 동물로부터의 단리는 동물을 도살하는 공정에 의해 행할 수 있다.

ADAMTS-13으로 포유 동물을 면역시키는 대체법 또는 보충법으로서, ADAMTS-13에 대한 특이 항체를 예를 들면, 람다 박테리오파지 또는 표면에 기능적인 면역 글로불린 결합 도메인을 나타내는 박테리오파지 필라멘트를 이용하여 발현시킨 면역 글로불린 가변 도메인의 재조합 생성 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 라이브러리는 어떠한 ADAMTS-13(또는 프래그먼트)에 의해서도 면역되지 않는 생물로부터 얻어진 서열로 구축된 천연의 것, 또는 흥미로운 항원에 노출된 생물로부터 얻어진 서열을 이용하여 구축된 것으로 할 수 있다.

여기서 사용되는 모노클로날 항체는 문헌[Kohler와 Milstein, Nature, 256: 495, 1975]에 의해 최초로 기재된 방법, 또는 재조합 방법(Mage와 Lamoyi, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 79-97쪽, Marcel Dekker사, New York, 1987 참조)에 의해 제조할 수 있다.

하이브리도마법에 있어서, 면역을 위해 사용되는 ADAMTS-13과 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 피하, 복강내, 또는 근육내 경로로 마우스, 래트, 토끼, 말, 염소, 양 또는 원숭이 등의 적합한 숙주 온혈 동물을 항원으로 면역시킨다. 또는, 림프구를 시험관내에서 면역시킬 수 있다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜 등을 이용하여 미엘로마 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다[Goding, Monoclonal antibodies: Principles and Practice, pp.59-103(Academic Press, 1986) 참조].

면역에 사용하는 항원으로는 인간 또는 비인간 포유류의 혈액으로부터 단리한 천연의 vWF 절단 효소, 유전자 공학 수법을 이용하여 제조한 재조합체(리콤비넌트)의 vWF 절단 효소를 들 수 있으며, 유래는 인간일 수도 있고 다른 포유류일 수도 있다. 전장 vWF 절단 효소를 이용할 수도 있으며, 효소적으로 절단한 프래그먼트 또는 vWF 절단 효소를 코드하는 DNA의 프래그먼트를 이용하여 유전자 공학적으로 제조한, 재조합체의 vWF 절단 효소의 부분 펩티드를 사용할 수 있다. vWF의 단편으로는 예를 들면, 스페이서 영역으로부터 N 말단측 또는 메탈로프로테아제 영역, 디스인테그린-유사 영역, Tsp1-1 영역, Cys-풍부 영역에서 스페이서 영역의 사이를 포함하는 단편을 들 수 있다.

이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 바람직하게는, 미융합된 친미엘로마 세포의 증식 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배지 중에 파종하여 배양할 수 있다. 예를 들면, 친미엘로마 세포가 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라제(HGPRT 또는 HPRT)를 결한 경우, 하이브리도마용 배지는 전형적으로는 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하고(HAT 배지), 이들 물질이 HGPRT 결손 세포의 증식을 저해한다.

바람직한 미엘로마 세포는 유효하게 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의해 안정된 고수준의 항체 발현이 지지되며, HAT 배지 등의 배지에 감수성을 갖는 것이다.

하이브리도마 세포를 배양하는 배지는 ADAMTS-13에 대한 모노클로날 항체의 생성으로 분석한다. 바람직하게는, 특이 결합은 고상 효소 면역 검정 분석법(ELISA)에 의해 측정된다. 본 발명의 모노클로날 항체는 ADAMTS-13 또는 그의 부분 단편에 특이적으로 결합하는 것이다.

항체가 결합하는 에피토프는 후술하는 C 말단 결실 개변 ADAMTS-13 분자를 발현시킴으로써 맵핑할 수 있다. 따라서, 본 발명은 예시된 항체가 결합하는 ADAMTS-13 에피토프와 결합할 수 있는 항체를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시 양태에 있어서, 모노클로날 항체는 마이크로몰을 초과하는 친화성, 또는 예를 들면 스캣차드 분석에 의해 측정되었을 때(Munson과 Pollard, Anal. Biochem. 107:220, 1980 참조)에 보다 큰 친화성(즉, 10^-6몰보다도 큰 친화성)을 가질 것이다.

목적하는 특이성과 친화성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 클론을 한계 희석법에 의해 서브클로닝하여 표준 방법으로 배양한다. 이 목적을 위해 적합한 배지는 둘베코스(Dulbecco's) 개변 이글 배지 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서의 복수 종양으로 하여 생체내에서 증식시킬 수 있다.

상기 하이브리도마 세포를 시험관내에서 배양함으로써, 목적하는 항체를 포함하는 배양 상청을 얻을 수 있다. 또한, 상기 하이브리도마를 마우스 등의 포유류 복강에 이식함으로써 목적하는 항체를 포함하는 복수(服水)를 얻을 수 있다.

하이브리도마에 의해 분비된 모노클로날 항체는 종래의 면역 글로불린 정제법, 예를 들면 프로테인 A 세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기 영동, 투석, 또는 어피니티-크로마토그래피 등에 의해 바람직하게 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 분리된다.

본 발명의 모노클로날 항체를 코드하는 핵산은 당해 분야에서 공지된 방법, 예를 들면 설치류 항체의 중쇄 및 경쇄를 코드하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 쉽게 단리되고 서열 결정된다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 항체 또는 이들의 프래그먼트를 코드하는 핵산의 바람직한 공급원이다. 단리 후, 핵산은 발현 벡터 또는 클로닝 벡터에 결찰하고, 이어서 이것을 숙주 세포에로 형질 전환하여, 재조합 숙주 배양 세포에 있어서 모노클로날 항체가 생성되도록 배양할 수 있다.

목적하는 결합 특성을 갖는 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마는 항체(항체 프래그먼트를 포함함)를 코드하는 핵산을 포함하며, 이들을 발현할 수 있는 숙주 세포는 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 본 발명은 항체가 생성되고, 바람직하게는 분비되는 조건하에서 항체를 생성할 수 있는 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체의 생성 방법을 제공한다.

본 발명의 항체는 여러가지 방법으로 개변시킬 수 있다. 다시 말하면, 「항체」라는 용어는 필요시되는 특이성을 나타내는 결합 도메인을 갖는 모든 결합 물질을 망라하는 것으로서 해석되어야 한다. 따라서, 본 발명은 항원 또는 에피토프, 여기서는 ADAMTS-13에 결합할 수 있는 항체와 유사한 형상을 갖는 합성 분자와 분자를 포함하는 항체 프래그먼트, 유도체, 항체의 기능적 균등물 및 상동체를 망라하는 것이다.

항원 또는 다른 결합쌍을 결합할 수 있는 항체 프래그먼트의 실시예는 VL, VH, C1 및 CH1 도메인을 포함하는 Fab 프래그먼트; VH와 CH1 도메인을 포함하는 Fd 프래그먼트; 항체의 단일 아암(arm)의 VL과 VH 도메인을 포함하는 Fv 프래그먼트; VH 도메인을 포함하는 dAb 프래그먼트; 단리된 CDR 영역과 F(ab')2 프래그먼트, 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 프래그먼트를 포함하는 2가 프래그먼트이다. 또한, 단일쇄 Fv 프래그먼트도 포함된다.

본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마에는 유전 변이 또는 그 밖의 변이를 가할 수 있다. 또한, 당업자에 의해 모노클로날 항체는 원래 항체의 특이성을 유지하는 그 밖의 항체, 인간화 항체 또는 키메라 분자를 제조하기 위한 재조합 DNA 테크놀러지의 기술이 가해질 수 있다고 해석될 것이다. 그러한 기술은, 항체의 면역 글로불린의 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 코드하는 DNA를 다른 면역 글로불린의 정상 영역 또는 틀 영역을 연결한 정상 영역에 도입하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서 제공되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로서 WH10, WH63.1, WHS40.3, Pep4-34.1, WH2-22-1A, WH2-1-1, WH2-11-1, Pep6-6A 및 Pep4-5B-1을 들 수 있다.

-면역 분석법

본 발명의 항체는 여러가지 분석 형식으로 본 발명의 검출 또는 진단 방법에서 사용할 수 있다. 항체는 ADAMTS-13에 특이적으로 결합할 수 있는 결합제로서 사용할 수 있으며, 예를 들면 시험관내에서 시료 중의 ADAMTS-13의 검출을 가능하게 한다. 또는 시험 시료와 접촉시킨 후, 시험 시료 중의 피검체(분석 대상물)인 vWF 절단 효소에 의해 점유된 결합제의 결합 부위의 분획을 측정하기 위한 현상제로서 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 항체가 그 결합 부위에서 분석 대상물과 결합하고, 분석 대상물에 결합된 항체의 양을 측정함으로써 분석 대상물의 양도 알 수 있으며, 본 발명의 항체를 마치 피검체의 존재를 명확하게 하는 현상제와 같이 이용할 수 있다.

항체의 사용, 특히 분석에 있어서 현상제로서 항체의 사용은, 검출 가능하고 바람직하게는, 측정할 수 있는 시그널을 직접적 또는 간접적으로 산출할 수 있는, 표지 물질 또는 리포터 분자로 그들을 표지하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체에는 표지한 항체도 포함된다. 표지는 표지 물질 또는 리포터 분자와 항체를 연결시킴으로써 행하며, 이 연결은 직접적 또는 간접적으로, 예를 들면 펩티드 결합을 통한 공유 결합 또는 비공유 결합으로 할 수 있다. 펩티드 결합을 통한 연결은 항체와 리포터 분자를 코드하는 유전자 융합체의 재조합 발현에 의해 얻을 수 있다. 문헌[Hunter 등, Nature, 144:945, 1962; David 등, Biochemistry 13:1014, 1974; Pain 등, J. Immunol. Meth. 40:219, 1981: 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407, 1982]에 기재된 방법을 포함하는, 항체를 검출 가능 부분에 별개로 결합시키기 위한 해당 분야의 공지된 모든 방법을 이용할 수 있다.

표지 물질 또는 리포터 분자로서는 스펙트럼적으로 단리된 흡광 또는 발광 특성을 갖는 각 형광 색소, 형광체 또는 레이저 염료 등을 들 수 있으며, 이들과 항체를 공유 결합에 의해 연결하는 것이 바람직하다. 적합한 형광 색소는 플루오로레세인(fluorscein), 로다민, 루시페린, 피코에리트린 및 텍사스레드를 포함한다. 적합한 발색성 염료는 디아미노벤지딘을 포함한다. 다른 검출할 수 있는 표지는 방사성 동위 원소 표지, 예를 들면 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I 또는 ^99mTc와, 검출할 수 있는 반응 생성물을 초래하는 반응을 촉매하고 시그널을 증폭시킬 수 있는 효소 표지, 예를 들면 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 서양 와사비 퍼옥시다제를 포함한다. 또한, 이들 효소의 표지에는 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙트아비딘 결합을 이용하는 등, 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 행할 수 있다.

다른 리포터 분자는 시각적으로 관찰되고, 전기적으로 검출되며, 또는 그 밖의 수단에 의해 기록되고, 검출 가능한 시그널을 직접적 또는 간접적으로 야기할 수 있으며, 착색된 고분자 콜로이드 입자, 또는 예를 들면 라텍스 비드 등의 미립자 물질을 포함한다. 또한, 자성 또는 상자성의 미립자도 사용할 수 있다. 또한, 리포터 분자는 예를 들면 착색 반응, 변색 반응, 또는 전기적 특성을 변화시키는 반응을 촉매하는 효소일 수도 있다. 이들은 에너지 상태간의 전기적 전이에 의해 특징적인 스펙트럼 흡수 또는 발광을 일으키는 분자 반응성을 가질 수도 있다. 또한, 이들은 바이오센서와 결합하여 사용된 화학적인 존재(entity)를 포함할 수 있다.

또한, 항체는 시료 중에 존재하는 다른 물질에 우선하여 ADAMTS-13과 특이적으로 결합할 수 있기 때문에 항체를 결합제로서 사용할 수 있다. 바람직하게는 결합제는 분석 중에 그것들을 쉽게 조작할 수 있도록 고체 지지체 상에, 예를 들면 특정한 부위에서 고정화한다. 고정화는 물리 흡착 또는 화학 흡착 등의 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 행할 수 있으며, 예를 들면 고형 지지물(고체 지지체)에 항체를 화학적으로 결합시키기 위한 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙트아비딘을 사용할 수 있다. 통상 시료 중에 존재하는 ADAMTS-13이 결합제에 결합될 수 있도록 적절한 조건하에서 결합 시약과 시료를 접촉시킨다. 이어서, 결합제의 결합 부위의 분획 점유율을 현상제를 이용하여 측정할 수 있다. 즉, 시료 중의 분석 대상물과 결합된 항체의 양을 측정함으로써 분석 대상물의 양을 측정할 수 있다.

본 발명의 항체를 상기한 현상제로서 사용하는 경우, 현상제는 당해 분야에 있어서 공지된 기술을 이용하여 검출할 수 있도록(예를 들면, 방사능 표지, 형광 표지 또는 효소 표지로) 표지한다. 따라서, 방사능 표지는 섬광 계수기 또는 다른 방사선 계수 장치를 이용하여 검출할 수 있고, 형광 표지는 레이저 또는 공초점 현미경을 이용하여 검출할 수 있으며, 효소 표지는 기질에서 효소 표지의 작용, 전형적으로는 색의 변화를 일으키는 작용에 의해 검출할 수 있다. 결합제의 점유 결합 부위에 대하여 현상제가 피검체와 경합하는 경합적 방법에 있어서, 또는 결합제와 결합한, 또는 점유 결합 부위에 결합한 피검체와 표지화 현상제가 결합하는 비경합적 방법에 있어서 현상제를 사용할 수 있다. 두 방법에 의해 피검체에 의해 점유된 결합 부위의 분획이 표시되고, 그에 따라 시료 중의 피검체 농도가 예를 들면, 피검체의 공지 농도를 포함하는 시료를 이용하여 얻어진 표준 농도와 비교 표시된다.

진단적 분석은 환자로부터의 생물학적 시료를 이용하여 행해진다. 이들 시료는 전처리없이 직접적으로 사용될 수도 있고, 분석을 행하기 전에 예를 들면, 원심 분리나 여과에 의해 간섭할 가능성이 있는 시료 중의 물질을 제거하는 등의 처리를 행할 수도 있다. 적합한 생물학적 시료의 예로서는 혈액, 뇨, 땀, 조직 또는 그의 추출액 또는 혈청을 들 수 있다.

일실시 양태에 있어서, 본 발명은 TTP, TTP 형태의 질환 또는 vWF 의존성 혈전증(vWF에 의해 초래되는 혈전증)의 우려가 있는 환자가 이들 질환에 걸렸는지의 여부를 진단하는 방법, 또는 병에 걸릴 위험이 있는가를 평가하는 방법에 관하여 이하의 공정을 포함한다:

(a) 환자로부터 얻어진 생물학적 시료를 ADAMTS-13과 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 고정화한 고형 지지물과 접촉시키는 것;

(b) 항체를 고정화하고 추가로 시료를 접촉시킨 고형 지지물을 항체의 미점유 결합 부위, 항체에 결합된 결합 ADAMTS-13 또는 항체의 점유 결합 부위에 결합할 수 있는 표지화 현상제와 접촉시키는 것; 및

(c) 시료 중의 ADAMTS-13의 농도에 상응하는 값을 얻기 위해, 공정 (b)에서 특이적으로 결합한 현상제의 표지를 검출하는 것.

또 다른 실시 양태에 있어서, 본 발명은 환자에게 있어서 vWF 의존성 혈전에 관한 진단을 행하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 이하의 공정을 포함한다:

(a) 환자의 생물학적 시료를 청구항에 기재된 어느 하나의 항ADAMTS-13 항체와 접촉시키는 것; 및

(b) 시료 중의 ADAMTS-13의 항ADAMTS-13 항체에 대한 결합을 측정하는 것.

그리고 추가로, 시료 중의 ADAMTS-13 농도에 상응하는 값을 공지된 표준으로부터 얻어진 값과 연관시키는 공정, 예를 들면 농도가 알려진 표준 물질을 측정하여 표준 곡선을 작성하고, 농도를 모르는 물질의 측정에서 얻어진 측정치를 표준 곡선과 비교하여 농도를 산출하는 공정을 포함한다.

본 발명의 항체는 모든 공지된 면역학적 측정 방법, 예를 들면 경합적 결합 분석법, 직접적 및 간접적 샌드위치 분석법, 및 면역 침강 분석법[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp147-158(CRC Press사, 1987) 참조]에서 이용될 수 있다.

샌드위치 분석법은 각각 검출되는 ADAMTS-13의 상이한 면역성 부위 또는 에피토프에 결합할 수 있는 2종의 항체를 사용한다. 샌드위치 분석법에 있어서, 시험 시료의 피검체를 고형 지지물 상에 고정화되어 있는 1차 항체와 결합시킨 후, 상기 피검체에 2차 항체를 결합시켜 불용성의 3부 복합체(항원, 1차 항체 및 2차 항체)를 형성시킨다. 2차 항체는 검출할 수 있는 부분(표지 물질 또는 리포터 분자)로 표지할 수 있거나, 또는 검출할 수 있는 부분으로 표지한 항면역 글로불린 항체를 이용하여 측정할 수 있다(간접적 샌드위치 분석법). 예를 들면, 샌드위치 분석법의 하나의 형태는 검출할 수 있는 부분이 효소인 ELISA 분석법이다.

본 발명의 항체를 포함하는 면역 측정 키트도 본 발명에 포함된다. 상기 키트가 효소 면역 측정법에 기초하는 경우에는 항체를 고상화한 담체를 포함할 수도 있고, 항체가 미리 담체에 결합될 수도 있다. 상기 키트가 라텍스 등의 담체를 이용한 응집법에 기초하는 경우에는, 항체가 흡착된 담체를 포함할 수도 있다. 또한, 상기 키트는 적절하게 표준 시료, 블록킹 용액, 반응 용액, 반응 정지액, 시료를 처리하기 위한 시약 등을 포함할 수도 있다.

또한, 본 발명의 항체는 생체내에서의 이미징에 유용하며, 여기서 항체는 방사성 동위 원소 등의 검출할 수 있는 부분으로 표지되고 숙주에, 바람직하게는 혈류 중에 투여되어 숙주에 있어서 표지화 항체의 존재와 국재화가 측정된다. 항체는 vWF 절단 효소가 존재 또는 국재화하는 조직, 기관 등에 결합할 수 있다. 항체는 핵자기 공명, X선 투시, 또는 당해 분야에서 공지된 그 밖의 검출 수단에 의해 검출할 수 있는 모든 부분에서 표지할 수 있고, 검출할 수 있는 부분에 따라 특정한 검출 수단을 이용함으로써 표지 항체의 존재 또는 국재화를 측정할 수 있으며, 즉 vWF의 존재 또는 국재화를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 어피니티 크로마토그래피에서의 어피니티 정제용 시약으로서도 유용하다. 이 방법에 있어서, 항체는 셀룰로파인(cellulofine) 수지 등의 합성 수지, 여과지 등의 지지물 상에 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 고정화한다. 이어서, 정제해야 할 ADAMTS-13을 포함하는 시료와 고정화한 항체를 접촉시킨 후, 고정화 항체에 결합하는 ADAMTS-13 이외의 시료 중의 전체 물질을 완전히 제거할 수 있는 용제로 지지물을 세정한다. 마지막으로 지지물을 항체로부터 ADAMTS-13을 유리시킬 수 있는 용제, 예를 들면 글리신 완충액으로 pH 3 내지 5로 세정함으로써 vWF 절단 효소를 단리ㆍ정제할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 ADAMTS-13 분자 또는 그의 변이체는 약학적 조성물 중에 배합할 수 있다. 즉, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 ADAMTS-13 분자 또는 그의 변이체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 여기서, 변이체란 분자 전체 중에서 약학적 효과를 발휘하는 부분을 포함하는 프래그먼트, 또는 ADAMTS-13 분자의 아미노산 서열에 있어서 1개 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 분자이다(반드시 활성을 유지한 개변으로 한정되지 않음).

본 발명의 항체는 ADAMTS-13이 갖는 효소 활성을 저해하거나, 또는 중화할 수 있는 항체를 포함한다. 상기 항체는 바람직하게는, ADAMTS-13의 도메인 구조 중의 스페이서 영역으로부터 N 말단측에 존재하는 에피토프를 인식하여 결합한다. 또한, 상기 항체는 메탈로프로테아제 영역, 디스인테그린-유사 영역, Tsp1-1 영역, 또는 Cys-스페이서 영역에 존재하는 에피토프를 인식하여 결합한다.

약학적 조성물은 상기한 항체 또는 ADAMTS-13 분자 또는 그의 변이체에 추가하여 약학적으로 수용할 수 있는 부형제, 담체, 완충액, 안정제 또는 당해 분야에서 공지된 그 밖의 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 무독성이고, 활성 성분 효능에 간섭하지 않는 것이다. 담체 또는 그 밖의 물질의 엄밀한 성질은 투여 경로, 예를 들면 입, 정맥, 피부 또는 피하, 코, 근육내, 복강내 경로에 의존하며, 투여 경로에 따라 적절한 것을 선택할 수 있다.

경구 투여를 위한 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형상일 수 있다. 정제는 젤라틴 또는 보조제(adjuvant) 등의 고형 담체를 포함할 수 있다. 액체의 약학적 조성물은 통상 액체의 담체, 예를 들면 물, 석유, 동물성유, 식물성유, 광물성유, 또는 합성유일 수 있다. 생리 식염수, 포도당 또는 다른 사카라이드 용액 또는 글리콜, 예를 들면 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 또는 폴리에틸렌글리콜이 포함된다.

정맥, 피부 또는 피하 주사 또는 고통 부위에의 주사의 경우에는 활성 성분이 발열성 인자를 포함하지 않으며, 바람직한 pH, 등장성 및 안정성을 갖고, 장관외에서 수용할 수 있는 수용액의 형상일 수 있다. 당업자는 적절한 용액을 예를 들면 등장성의 매체, 예를 들어 염화나트륨액, 링겔액, 락트산 첨가 링겔액 등을 이용하여 제조할 수 있다. 방부제, 안정제, 완충액, 항산화제 및(또는) 그 밖의 첨가제를 필요에 따라 포함할 수 있다.

본 발명의 ADAMTS-13에 대한 항체 또는 ADAMTS-13 분자 또는 그의 변이체를 생리 식염수, 완충액 등으로 희석하고 제제화하여, 의약 조성물을 얻을 수도 있다. 제제의 pH는 체액의 pH에 가까운 약산성 내지 중성역의 pH가 바람직하며, 그 하한은 5.0 내지 6.4가 바람직하고, 그 상한은 pH 6.4 내지 8.0이 바람직하다. 또한, 동결 건조 형태 등의 장기간 보존이 가능한 형태로 제공할 수도 있으며, 이 경우 사용시에 물, 생리 식염수, 완충액 등으로 원하는 농도가 되도록 용해하여 사용할 수 있다. 본 발명의 제제는 통상 의약품에 사용되는 약리적으로 허용되는 첨가제(예를 들면 담체, 부형제, 희석제 등), 안정화제 또는 제약상 필요한 성분을 함유할 수도 있다. 안정화제로서는 글루코스 등의 단당류, 사카로스, 말토스 등의 이당류, 만니톨, 소르비톨 등의 당 알코올, 염화나트륨 등의 중성염, 글리신 등의 아미노산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(플루로닉), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(트윈) 등의 비이온계 계면활성제, 인간 알부민 등이 예시되며, 1 내지 10 w/v ％ 정도가 첨가되는 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물은 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사 등에 의해 유효량으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여된다. 그 투여량은 증상, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 1회당 0.001 mg 내지 100 mg이 바람직하다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2002-279924호 및 제2002-377569호의 명세서 및(또는) 도면에 기재된 내용을 포함한다.

이하, 실시예에 따라 본원 발명을 상세하게 설명하지만, 본원 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

(폴리클로날 항체(PoAb)의 제조)

마우스 또는 토끼에게 통상법에 의해(Current Protocols in Molecular Biology: Chapter 11 immunology, Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al. 또는 ANTIB0DY ENGINEERING second edition Edited by Carl A. K. BORREBAECK 등), 인간 플라즈마로부터 부분 정제한 항원 단백, 또는 그 일부의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드(예로서 서열번호 2 또는 서열번호 3에 기재된 펩티드)를 적절한 캐리어 물질(KLH 등)에 결합시킨 것(KLH를 부가하기 쉽게 하기 위해 Cys를 N 말단 또는 C 말단 등에 부가한 것), 또는 유전자 재조합 단백질 또는 그것을 코드하는 유전자를 도입한 발현 벡터를 피하ㆍ피내 또는 근육내에 트랜스펙트하고, 모노클로날 항체 발현 하이브리도마의 확립 및 폴리클로날 항체(PoAb)의 제조를 행하였다. PoAb에 관해서는 전장 또는 후술하는 Q449 stop 또는 P285 stop을 발현하는 벡터의 트랜스펙트에 의해 PoAb1, PoAb2 및 PoAb3의 3종을 제조하였다.

<실시예 2>

(모노클로날 항체(MoAb)의 제조)

Balb/c 마우스에게 초기 면역 감작으로서 뒷다리에 프로인트 완전 보조제(adjuvant)의 존재하에 유전자 재조합 유래의 ADAMTS-13, 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 기재된 펩티드를, KLH를 캐리어로 하여 부가한 것을 제조하였다. ADAMTS-13은 WO 02/088366에 기재된 방법으로 제조하는 것이 바람직하다.

제조한 항원의 1 ㎍ 내지 10 ㎍ 상당량을 1회 접종한 후, 1 주일 후에 통상법에 따라 마우스 뒷다리 대퇴부의 림프절 또는 비장으로부터 세포를 채취하였다. 각각 마우스 2마리로부터 얻어진 세포를 미엘로마 세포 P3X63Ag 8U.1(P3U1)(ATCC 기탁 번호 CRL-1597: Curr. Top. Microbiol. Immunol., vol. 81, p.1(1978))과 세포수 1 대 1 내지 2의 비율로 혼합하고, 원심 처리(1,500 rpm, 5 분)하여 상청을 제거하고, 침전된 세포 덩어리를 충분히 푼 후, 미리 37 ℃로 가온해 둔 1 ㎖의 폴리에틸렌글리콜 용액(45 ％ 폴리에틸렌글리콜 4000, 55 ％ RPMI 배지)을 교반하면서 첨가하였다. 37 ℃에서 5 분간 배양한 후, 액체 전량이 50 ㎖가 되도록 천천히 RPMI 배지를 첨가하였다. 원심 분리(1,300 rpm, 7 분) 후, 상청을 제거하고 천천히 세포를 풀었다. 여기에 에스클론 CM-B 배지(산꼬 쥰야꾸사 제조) 50 ㎖를 첨가하고, 메스피펫을 이용하여 천천히 세포를 현탁하였다. 이 세포 현탁액을 4 내지 5장의 96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 분주하고, 5 ％ 탄산 가스를 포함하는 37 ℃의 CO₂ 인큐베이터내에서 배양하였다. 다음날, HAT 배지(에스클론 CM-B 배지에 히포크산틴 1×10^-4 M, 티미딘 1.5×10^-3 M, 아미노프테린 4×10^-7 M이 되도록 첨가한 것)를 각 웰에 100 ㎕씩 분주하고, 5 ％ 탄산 가스를 포함하는 37 ℃의 CO₂ 인큐베이터 내에서 배양하였다. 하이브리도마의 콜로니가 충분히 생육된 것부터 HT 배지(상기 HAT 배지로부터 아미노프테린을 제거한 것)로 교환하고, 배양 상청의 일부를 분취하여 이하에 진술하는 스크리닝법으로 목적하는 하이브리도마를 선별하였다.

목적하는 하이브리도마의 선별은 하기의 ELISA법, 웨스턴ㆍ블롯팅법을 조합하여 실시하였다.

(1) ELISA법

96웰의 마이크로 테스트 플레이트에 상기와 같이 제조한 합성 펩티드 항원, 또는 정제 항원(단백질 농도 0.5 내지 2 ㎍/㎖)을 50 ㎕/웰로 첨가하고, 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이션함으로써 고상화하였다. 또한, 1 ％ BSA(소 혈청 알부민) 용액 300 ㎕를 첨가하고, 마찬가지로 인큐베이션하여 마스킹하였다. 이와 같이 하여 제조한 항원 고상화 플레이트에 세포 융합법에 의해 얻어진 하이브리도마 및 클로닝 후의 하이브리도마의 배양 상청을 첨가하여, 4 ℃에서 1 시간 인큐베이션한 후 TBS로 3회 세정하고, 퍼옥시다제 표지 항마우스 면역 글로불린 항체 용액(카펠사 제조, 5,000배 희석) 100 ㎕/웰을 첨가하였다. 4 ℃에서 1 시간 인큐베이션한 후 TBS로 3회 세정하고, 그 후 TMBZ 기질 용액을 첨가하여 통상법에 의해 발색시키고, 그 흡광도를 파장 450 nm에서 측정하였다. 이렇게 해서 정제 항원과 반응하는 하이브리도마 클론을 선택하였다. 또한, 이 방법은 인간 혈장 중의 ADAMTS-13에 대한 자기 항체 검출에의 응용도 가능하였다.

(2) 웨스턴ㆍ블롯팅법

ELISA법으로 얻어진 양성 콜로니에 대하여 웨스턴ㆍ블롯팅법에 의한 스크리닝을 행하였다. 정제 항원을 8 ％의 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기 영동하고, PVDF막 상에 이행시켜 막을 0.4 내지 0.5 cm의 폭으로 절단하였다. 각 세편을 하이브리도마 배양 상청액에 침지하여 1 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 세편을 TBST(0.05 ％ Tween 포함)로 3회 세정한 후, 알칼리포스파타제 표지 항마우스 IgG(타고사 제조)의 1:2000 희석액 중에서 37 ℃로 1 시간 인큐베이션하였다. TBST로 3회 세정한 후 BCIP/NBT를 이용하는 발색 시약(바이오-래드사 제조)으로 발색시키고, 정제 항원의 발색 밴드를 나타내는 하이브리도마를 선택하여 클로닝하였다. 클로닝 후의 하이브리도마 클론에 대해서도 동일한 수법으로 선별하였다. 상기한 선별 방법에 의해 원하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마가 대략 30 클론 얻어졌다. 또한, 이 방법은 인간 혈장 중의 ADAMTS-13에 대한 자기 항체 검출에의 응용도 가능하였다.

<실시예 3>

(ADAMTS-13 C 말단 결실 변이체의 제조)

도 1에 나타낸 방법에 의해 전장의 vWF 절단 효소 유전자 클로닝 벡터(pCR2.1 vWFCP)를 이용하여, 전장 및 서열번호표 4 내지 18에 나타낸 프라이머로 C 말단으로부터 순차적으로 도메인을 결실시킨 변이체(Full 1427 stop, T1135 stop, W1016 stop, W897 stop, W808 stop, W746 stop, W688 stop, T581 stop, Q449 stop, W387 stop, P285 stop: 각각의 숫자는 개시 코돈 ATG가 코드하는 Met에서부터 종결 코돈까지의 아미노산의 잔기수를 나타내고, FLAG 에피토프(DNA 서열: gactacaaggacgatgacgataagtga(서열번호표 19), 아미노산 서열: Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys(서열번호표 20))를 부가한 부위를 나타냄)를 발현하는 유전자를 제조하고, pCAG 발현 벡터(Niwa, H., et al. Gene vol. 108, 193-199)에 삽입하여, Hela 세포를 이용해서 이하의 순서로 트랜스펙트하였다.

전장의 vWF 절단 효소 유전자 클로닝 벡터(pCR2.1 vWFCP)는 WO 02/088366에 기재된 방법에 의해 입수 가능하다.

우선, 처음에 1-3×10⁵개/35 mm 접시로 세포를 뿌리고, 그 다음날 상기 발현 벡터를 2 ㎍당 10 ㎕의 폴리아민 트랜스펙션 시약인 TransIT(다까라사 제조)를 취하여 0pti-MEM 등의 무혈청 배지 200 ㎕에 첨가하고, 시약에 첨부된 문서에 따라 DNA와의 복합물을 제조한 후, 준비해 둔 상기 각종 세포에 적하하여 6 시간 인큐베이션하고, 그 후 배지를 ASF104 무혈청 배지(아지노모또사 제조)로 변경한 후, 72 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션한 후, 그 상청을 회수하였다. 검출은 항FLAG-M2 항체(코닥사 제조)를 이용한 웨스턴 블롯법에 의해, 항마우스 Ig-알칼리포스파타제 효소 표지 항체계로 염색하여 행하였다(도 2에 발현 상태를 확인한 결과를 나타냄). 또한, 본 개변 분자군은 FLAG 태그를 부가하고 있으며, 통상법인 항FLAG 태그 항체 고정화 아가로스 등을 이용하여 쉽게 정제가 가능하였다.

<실시예 4>

(ADAMTS-13 C 말단 결실 변이체의 vWF 절단 활성 확인)

vWF의 제조

vWF는 세파크릴 S-500HR(아마샴 파마시아)의 2.6×90 cm 칼럼에 의해, 플라즈마 냉동(cryo) 분획 2 g을 20 ㎖의 완충액(0.01 ％ 트윈-80/50 mM Tris-HCl/100 mM NaCl pH 7.4)에 용해한 것을 겔 여과함으로써 제조하였다(WO 02/088366 참조).

vWF 절단 반응

vWF 절단 활성의 분석은 W0 02/088366에 기재된 방법으로 행하였다. 즉, 최종 농도 10 mM의 염화바륨을 첨가한 샘플을 37 ℃에서 5 분간 예비 인큐베이션하여 프로테아제를 활성화하였다. 50 ㎖의 팔콘 튜브에 완충액(1.5 M의 요소 15 내지 20 ㎖/5 mM Tris-HCl pH 8.0)을 넣었다. 이어서, 밀리포어사 제조의 멤브레인 필터(0.025 ㎛)를 부유시키고, 50 ㎕의 vWF 기질 용액을 첨가하여 혼합한 활성화 샘플을 100 ㎕ 첨가하였다. 37 ℃의 인큐베이터에 하룻밤 정치하여 다음날 필터로부터 회수하였다. 회수한 샘플을 이하의 SDS-PAGE의 항에 나타낸 vWF의 절단 패턴에 의해 평가하였다.

SDS-PAGE

SDS-5 ％ 폴리아크릴아미드 겔을 자체 제조하여 사용하였다. vWF 절단 활성의 분석항에서 설명한 샘플 10 ㎕에 SDS 영동 완충액(환원제 2-머캅토에탄올의 존재하 또는 비존재하) 2 ㎕를 첨가하여 3 분간 끓인 것을 영동 샘플로 하였다. 30 mA로 1 시간 전기 영동한 후, 겔은 CBB 염색을 이용한 겔 코드 블루 염색 시약(피어스사 제조)으로 염색하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 전장의 분자로부터 W688 stop까지의 분자에서 분명한 vWF 절단 활성이 확인되었다. 또한, 상기 항FLAG 항체에 의한 상청 중으로의 발현 패턴을 고려했을 경우 T581 stop에서의 발현이 상청 중에 확인되지 않았기 때문에, 그 근방(Cys-풍부 영역에서부터 스페이서 영역)에서의 절단이 분비 장해를 일으키는 경우가 있다는 것이 확인되며, 본 효소 활성을 유지하기 위해서는 이 영역을 포함하는 것이 중요하다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 5>

(웨스턴 블롯을 이용한 항체의 에피토프 해석)

통상법에 의해 웨스턴 블롯을 행하여 확립된 폴리클로날 항체(PoAb1, PoAb2) 및 상호 인식 부위가 경합하지 않는다고 여겨진 모노클로날 항체 수종[본 발명자들이 앞서 제조한 Clone No. WH10(FERM BP-8174)에 추가하여 WH63.1(FERM BP-8175), WHS40.3(FERM BP-8176), Pep4-34.1(FERM BP-8177)]에 대한 인식 영역을 특정하기 위해, 실시예 4에 기재된 부분 결실 개변 분자의 일시 발현 배양 상청을 이용하여 웨스턴 블롯을 행하였다(도 4 내지 9).

이에 추가하여 새롭게 확립된 클론 WH2-22-1A(FERM BP-8483), WH2-1-1(FERM BP-8484), WH2-11-1(FERM BP-8485), Pep6-6A(FERM BP-8474), Pep4-5B-1(FERM BP-8475)에 대해서도 동일한 해석을 행하였다. 결정된 항체의 인식 영역 및 활성 발현에 중요하다고 여겨지는 영역을 도 10에 정리하였다. PoAb1의 인식 영역은 도 4의 Q449 stop 이후 W688 stop까지의 사이, 또는 전장 부분에 걸쳐 있다는 것이 추정되고, PoAb2는 도 5의 P285 stop 이후 W387 stop, 또는 그 이후 Tsp1-을 인식하고 있으며, 본 폴리클로날 항체 PoAb1이 중화 활성을 갖는 것(후술) 및 PoAb2 나아가 PoAb3도 ADAMTS-13의 효소 활성을 중화했기 때문에, 이들 사실을 함께 감안하면 스페이서 영역으로부터 N 말단측, 메탈로프로테아제 영역, 디스인테그린-유사 영역, Tsp1-1 영역, Cys-스페이서 영역 등이 시험관내의 분석에서 기능적으로 중요하며, 중화 영역이 될 수 있다는 것이 확인되었다.

<실시예 6>

(ELISA법을 이용한 항ADAMTS-13 항체의 에피토프 영역의 확인)

면역 모듈 96웰 플레이트에 항FLAG 항체 10 ㎍/㎖ 100 ㎕를 고상화한 후, FLAG를 폴리펩티드쇄에 부가한 ADAMTS-13 야생형 또는 각종 상기 결실 변이체를 고상화, 또는 FLAG의 부가에 무관하게 직접 플레이트에 본 효소 변이체를 고상화하고, 공지된 방법에 의해 블록킹 조작을 실시한 플레이트에 적당하게 희석된 MoAb 100 ㎕를 반응시킨 후, 플레이트를 트윈 등의 계면활성제를 함유하는 완충액으로 세정한 후, 항마우스 IgHRP 콘쥬게이트와 37 ℃에서 1 시간 인큐베이션시켜 세정한 후, TMBZ 등으로 발색시킴으로써 실시예 5와 동일한 에피토프 영역을 엄선하였다. 그 결과, 실시예 5에 나타낸 결과가 지지되었다. 또한, 이 방법은 인간 혈장 중에 존재하는 항ADAMTS-13 항체의 검출 및 에피토프 해석에 유효하다고 여겨졌다.

<실시예 7>

(확립된 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의한 인간 혈장 중의 ADAMTS-13의 검출)

이어서, 상기의 여러가지 방법에 의해 제조된 항체를 이용하여, 통상법에 의해 (Current Protocols in Molecular Biology: Chapter 10 analysis of proteins, Chapter 11 immunology 등) 본 효소의 웨스턴 블롯법에 의한 검출을 행하였다. 본 효소의 C 말단 영역의 펩티드 서열(서열번호 2) Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser을 KLH에 결합한 것을 면역원으로 하여 얻어진 펩티드 항체에 의해, 환원 조건하에 정상인의 혈장, TTP 환자의 혈장으로부터 본 효소를 검출했더니, 일부 TTP 환자의 혈장에서는 명확하지 않지만 대략 250 kDa 정도의 본 효소 유래의 시그널이라고 상정되는 밴드가 확인되었다(도 11).

<실시예 8>

(확립된 항체를 이용한 효소 면역 측정법에 의한 인간 혈장 중의 ADAMTS-13의 검출ㆍ측정 1)

얻어진 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체의 조합(MoAb-PoAb의 계)에 의해 (인식 에피토프는 도 10 참조) 구축되는 효소 면역 측정법(ELISA)을 이용하여(도 12), 여러가지 검체에서의 본 효소를 정량하였다. 측정 방법의 공정을 이하에 나타낸다.

1. 각 시약류를 실온으로 되돌린다.

2. WH10 MoAb 고정화 플레이트에 샘플을 100 ㎕/웰 첨가

37 ℃ 1 시간

3. 0.05 ％ 트윈-20-TBS로 플레이트 세정 3회

4. PoAb1 또는 PoAb2를 1 ㎍/㎖가 되도록 희석액(1 ％ BSA-TBS)으로 희석하고, 100 ㎕/웰 첨가

37 ℃ 1 시간

5. 0.05 ％ 트윈-20-TBS로 플레이트 세정 3회

6. 항토끼 IgG-HRP 표지 콘쥬게이트를 희석액(1 ％ BSA-TBS)으로 10000배 희석하고, 100 ㎕/웰 첨가

37 ℃ 1 시간

7. 0.05 ％ 트윈-20-TBS로 플레이트 세정 3회

8. TMB 기질액(직전에 실온에서 2액을 혼합한 것) 100 ㎕/웰 첨가(포지티브 웰은 청색으로) 실온에서 10 분 정도(표준으로서 동봉한 조합품 100 ng/㎖의 색이 반응 정지 후 최종적으로 OD450 nm=1 정도가 되도록)

반응 정지액(0.5 M 황산)을 100 ㎕/웰 첨가(포지티브 웰은 황색으로)

9. 플레이트 판독기로 450 nm 및 650 nm 측정

정량을 위한 표준은 후술하는 항체에 의한 어피니티 정제에 의해 얻어진 유전자 재조합 ADAMTS-13을 사용하였다. 그 결과, 정상인 혈장 중의 ADAMTS-13 농도는 사용하는 항체에 따라 변화하는 것으로 밝혀졌고, 이것은 혈장 중에서 본 효소가 다양한 분자 형태로 존재한다는 것을 시사하는 것이었다(표 1). 이로부터 이상적인 ELISA계로서, 적극적으로 분해 패턴을 해석할 수 있는 도메인별로 인식하는 항체군을 이용한 계, 또는 표 2에 나타낸 이들의 영향이 적다고 여겨지는 PoAb-PoAb(프로테인 G 등으로 정제한 PoAb를 직접 ELISA 플레이트에 고상화하고, 비오틴화 PoAb-스트렙트아비딘 HRP)에 의한 계의 구축이 바람직하다고 여겨졌다(도 13). 도 13에 나타낸 계에 있어서, 폴리클로날 항체(PoAb) 또는 N 말단으로부터 (메탈로프로테아제 도메인 등)의 인식 에피토프를 갖는 모노클로날 항체(MoAb)를 고상화에 이용하여, 검출측의 2차 항체에 도메인별로 다른 에피토프의 MoAb를 사용함으로써 모든 변종(variation)의 ADAMTS-13을 트랩한다. 또는, 그 반대로 다양한 에피토프의 MoAb를 고상화에 사용하거나, 또는 PoAb와 PoAb에서의 샌드위치 ELISA 등이 상정된다. 도면에 나타낸 바와 같이 샘플 중의 ADAMTS-13은 다양한 변종이 존재한다. 이들 계에서 병태와 혈장 중에 존재하는 분자 형태와의 상관 관계를 발견할 수 있게 된다.

	MoAb(WH10)-PoAb1	MoAb(WH10)-PoAb2
혈장 1	0.39 ㎍/㎖	1.2 ㎍/㎖
혈장 2	0.27 ㎍/㎖	1.1 ㎍/㎖
혈장 3	0.25 ㎍/㎖	0.9 ㎍/㎖
TTP 혈장	0 ㎍/㎖	0 ㎍/㎖

	PoAb1-PoAb1
혈장 4	1.0 ㎍/㎖
혈장 5	1.0 ㎍/㎖
혈장 6	0.9 ㎍/㎖
혈장 7	1.1 ㎍/㎖
혈장 8	0.9 ㎍/㎖
혈장 9	0.8 ㎍/㎖

<실시예 9>

(확립된 항체를 이용한 효소 면역 측정법에 의한 인간 혈장 중의 ADAMTS-13의 검출ㆍ측정 2)

얻어진 모노클로날 항체를 조합함으로써 구축되는 효소 면역 측정법(MoAb-MoAb 계)(도 14)에 의해, 몇 검체의 인간 혈장 중의 본 효소를 정량하였다. 측정 방법의 공정을 이하에 나타낸다.

1. 각 시약류를 실온으로 되돌린다.

2. WH10 MoAb 고정화 플레이트에 샘플을 100 ㎕/웰 첨가

37 ℃ 1 시간

3. 0.05 ％ 트윈-20-TBS로 플레이트 세정 3회

4. 비오틴화 항체를 1 ㎍/㎖가 되도록 희석액(1 ％ BSA-TBS)으로 희석하고, 100 ㎕/웰 첨가

37 ℃ 1 시간

5. 0.05 ％ 트윈-20-TBS로 플레이트 세정 3회

6. 스트렙트아비딘-HRP 표지 콘쥬게이트를 희석액(1 ％ BSA-TBS)으로 10000배 희석하고, 100 ㎕/웰 첨가

37 ℃ 1 시간

7. 0.05 ％ 트윈-20-TBS로 플레이트 세정 3회

8. TMB 기질액(직전에 실온에서 2액을 혼합한 것) 100 ㎕/웰 첨가(포지티브 웰은 청색으로) 실온에서 10 분 정도(표준으로서 동봉한 조합품 100 ng/㎖의 색이 반응 정지 후 최종적으로 OD450nm=1 정도가 되도록)

9. 플레이트 판독기로 450 nm 및 650 nm 측정

상기 결과를 전술한 실시예 5에 나타낸 결과와 비교하면, 이 조합의 계는 가장 낮은 정량치를 나타내었다(표 3). 또한, 이 조합에서는 후술하는 인간 풀 혈장의 FI 페이스트로부터 정제한 본 효소를 검출할 수는 없었다. 이것은 항체의 조합에 의해 정량치가 변동한다는 사실을 고려하면, 항체의 조합을 변경한 여러가지 계의 구축(도 13)이 중요하다는 것을 나타낸다.

	MoAb(WH10)-PoAb1	MoAb(WH10)-PoAb2	MoAb(WH10)-MoAb(WH63-1)
혈장 1	0.39 ㎍/㎖	1.2 ㎍/㎖	0.13 ㎍/㎖
혈장 2	0.27 ㎍/㎖	1.1 ㎍/㎖	0.09 ㎍/㎖
혈장 3	0.25 ㎍/㎖	0.9 ㎍/㎖	0.09 ㎍/㎖
TTP 혈장	0 ㎍/㎖	0 ㎍/㎖	0 ㎍/㎖

<실시예 10>

(유전자 재조합 ADAMTS-13의 발현)

인간 태아 신장 세포주인 293 세포를 이용하여 재조합 ADAMTS-13의 안정 발현주를 이하의 방법으로 제조하였다(WO 02/088366). 개략적으로 이하의 순서로 트랜스펙트하였다. 우선, 처음에 1-3×10⁵개/35 mm 접시로 세포를 뿌리고, 그 다음날 상기 발현 벡터를 2 ㎍당 10 ㎕의 폴리아민 트랜스펙션 시약인 TransIT(다까라사 제조)를 취하여, Opti-MEM 등의 무혈청 배지 200 ㎕에 첨가하고, 시약에 첨부된 문서에 따라 DNA와의 복합물을 제조한 후, 준비해 둔 상기 각종 세포에 적하하여 6 시간 인큐베이션하고, 그 후 배지를 교환하여 추가로 3일 후 G418 첨가 선택 배지로 교환하였다. 그로부터 3일마다 배지 교환을 행하고, 선택된 콜로니군으로부터 한계 희석법 및 상기의 MoAb(WH10)-PoAb1의 ELISA계를 이용하여 발현 클론(Clone No. VWFCP-293-35 및 293-2-4)을 확립하였다.

<실시예 11>

(항체를 이용한 유전자 재조합체의 배양 상청으로부터 유전자 재조합 ADAMTS-13의 정제)

얻어진 항체의 일례로서 WH10을 사용한 예를 나타내었다. 이 항체를 적당한 고정화 담체에 결합시킴으로써 어피니티 칼럼을 제조하고, 당해 효소의 정제에 사용하였다. 어피니티 칼럼의 제조에는 칙소사(Chisso Corp.) 제조의 NHS 활성화 셀룰로파인을 사용하고, 첨부 문서에 따라 항체를 고정화하였다. 이에 따라 제조한 약 1 ㎖의 팽윤 담체를 사용하여, 실시예 9에 나타낸 당해 효소의 293 세포를 숙주로 한 유전자 재조합체의 발현 배양 상청을 어플라이한 뒤, 50 mM Tris-HCl 0.1 M NaCl pH 7.5(이하, TBS)로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M 글리신 pH 3 완충액으로 용출하였다. 용출된 분획을 1 M Tris-HCl pH 8.5로 중화하고, TBS에 대하여 투석하였다. 얻어진 정제 효소의 SDS-PAGE를 도 15에 나타내었다. 또한, 얻어진 정제 분획에 vWF를 절단하는 활성이 존재한다는 것도 확인되었다. 또한, 상기 재조합 효소에 의해 단편화된 vWF의 절단점은, 그 단편의 N 말단 아미노산의 서열 해석으로부터 842Tyr-843Met의 위치인 것이 확인되었다.

이어서, 정제된 재조합체 유래의 ADAMTS-13의 부분 아미노산 서열을 결정하였다. 통상법에 의해 SDS-PAGE 후, PVDF막으로 전이시켜 풍건한 후, PE 어플라이드 바이오시스템즈사의 오토프로테인 시켄서(sequencer) 492로 해석하였다. 그 결과, 부분 N 말단 서열로서 Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-을 갖는 것이 명확해졌다. 이 서열은 유전자 구조로부터 추정된 당해 효소의 성숙체의 N 말단 서열과 일치하였다.

<실시예 12>

(항체를 이용한 인간 풀 혈장 유래 FI 페이스트로부터의 ADAMTS-13의 정제)

FI 페이스트의 가용화

FI 페이스트는 12 g씩 소분류하여 동결 보존하였다. 사용하기 전날 4 ℃에서 꺼내 융해시키고, 다음날 가용화 완충액(0.05 ％ 아자이드, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM NaCl)를 10 mg/㎖가 되도록 120 ㎖를 첨가하여 37 ℃에서 2 시간 교반하였다. 10000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후, 상청을 회수하고 예비필터(prefilter), 5.0 ㎛ 필터, 0.8 ㎛ 필터의 순서로 여과한 것을 가용화 샘플로 하였다.

vWF 절단 효소의 겔 여과 크로마토그래피

가용화한 FI 페이스트를 세파크릴 S-300HR(아마샴 파마시아) 5×90 cm 칼럼에 걸어 1회째의 겔 여과를 행하였다. 가용화 완충액과 동일한 0.05 ％ 아자이드, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM NaCl(이하, 용출 완충액이라고 함)을 사용하여, 유속은 5 ㎖/분, 분취는 추정 분자량 100 kDa 내지 300 kDa에 상당하는 분획을 수집하고, 여기에 최종 농도 33 ％ 포화가 되도록 포화 황산암모늄을 소량씩 적하하였다. 이것을 다시 4 ℃에서 하룻밤 정치하였다. 다음날, 10000 rpm으로 10 분간 원심분리하여 목적하는 활성 분획을 침전으로서 회수하였다. 이상의 가용화ㆍ겔 여과ㆍ황산암모늄 침전 조작을 5 배치 행하고, -20 ℃에서 동결 보존하였다.

1회째의 겔 여과에 의해 얻어진 황산암모늄 침전물 2 내지 3 배치분을 용출 완충액 50 ㎖에 용해하고, 1회째와 동일한 세파크릴 S-300HR 칼럼(5×90 cm)에 통액하여 2회째의 겔 여과를 행하였다. 용출 완충액, 조건, 조작 등에 대해서는 1회째와 동일하다. 이 조작을 2회 실시하였다.

2회째의 겔 여과에 의해 얻어진 황산암모늄 침전물 2회분을 용출 완충액 50 ㎖에 용해하고, 1, 2회째와 마찬가지로 세파크릴 S-300HR 칼럼(5×90 cm)에 걸어 3회째의 겔 여과를 실시하였다. 용출 완충액, 조건, 조작 등에 대해서는 1, 2회째와 동일하다. 그리고, 추정 분자량 100 kDa 내지 300 kDa에 상당하는 분획을 수집하였다. 이 풀 샘플을 전술한 재조합체 ADAMTS-13의 정제와 동일한 순서로 Clone No. WH10 모노클로날 항체 고정화 칼럼을 이용하여 정제하였다. 그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 SDS-PAGE에서 105 kDa 내지 160 kDa의 크기를 갖는 거의 단일한 ADAMTS-13이 정제되었다. 그의 N 말단 아미노산 서열을 해석했더니, 재조합체와 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

<실시예 13>

(항체에 의한 본 효소 활성의 중화)

상술한 집토끼 폴리클로날 항체에 의한 vWF 절단 효소의 중화 활성을 평가하였다. 유전자 재조합 ADAMTS-13의 1 내지 10 ㎍/㎖(브래드포드법으로 개략 계산)에 대하여 정상 집토끼 혈청, C 말단 영역의 펩티드 서열(서열번호 2) Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser를 KLH에 결합한 것을 면역원으로 하여 얻어진 집토끼 항혈청, 및 전장 ADAMTS-13 발현 벡터에 의해 발현된 단백질에 의해 면역 유도된 항혈청(PoAb1)의 각각을 부피비 1:1 또는 10배로 희석한 항혈청을 1:1로 미리 37 ℃에서 1 시간 반응시킨 후, 전술한 vWF 절단 활성의 분석에 사용하고, 그 활성의 저해를 평가하였다.

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이 본 효소의 저해 활성을 갖는 것이 제조되었다(메탈로프로테아제의 억제제인 EDTA를 저해의 양성 대조군으로 함). 또한, 중화 활성을 갖는 폴리클로날 항체(PoAb1)의 에피토프 해석의 결과(도 4)로부터, ADAMTS-13의 도메인 구조 중의 스페이서 영역으로부터 N 말단측에 중화 에피토프가 존재하는 것이 추정되었다. 또한, PoAb2 및 PoAb3에 있어서도 중화능을 갖는 것이 확인되었다. 이러한 점으로부터 중화 가능 영역으로서 메탈로프로테아제 영역, 디스인테그린-유사 영역 등도 상정되었다. 이와 같이 중화 항체를 제조할 수 있는 것은, vWF 절단 효소에 대한 자기 항체 양성의 후천적 TTP 환자-유사 모델을 구축할 수 있다는 가능성도 시사하고 있다.

<실시예 14>

(인간 혈장 중의 항ADAMTS-13 항체의 검출)

실시예 6에 나타낸 방법을 이용하여, 후천성 TTP 환자 혈장 중의 항ADAMTS-13 항체를 검출하였다. 면역 모듈 96웰 플레이트에 항FLAG 항체 2 ㎍/㎖ 100 ㎕를 고상화한 후, FLAG를 폴리펩티드쇄에 부가한 ADAMTS-13 야생형을 반응시키고, 그 후 5, 10, 50배 희석된 검체 100 ㎕를 37 ℃에서 1 시간 반응시킨 후, 플레이트를 0.05 ％ 트윈 20을 포함하는 트리스 완충액으로 세정한 후, 항인간 IgHRP 콘쥬게이트와 37 ℃에서 1 시간 반응시켜 세정한 후, TMBZ 등으로 발색시켰다. 그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 후천성의 TTP 환자 혈장(Acquired)만이 정상 혈장(Normal) 및 선천성 TTP 혈장(Congenital)과 비교하여 450 nm의 흡광도에 있어서 돌출된 값을 나타내고, 항ADAMTS-13 항체를 갖는 것이 확인되었다.

<실시예 15>

(항마우스 ADAMTS-13 폴리클로날 항체(PoAb)의 제조)

인간과 마찬가지로 마우스의 본 효소를 코드하는 유전자(W0 02/088366)를 통상법에 따라 도입한 발현 벡터를 토끼의 피하ㆍ피내 또는 근육내에 트랜스펙트하고, 폴리클로날 항체(PoAb)를 제조하였다. 얻어진 항체를 이용하여 마우스 혈장 으로부터 본 효소를 면역 침강시켜 검출하였다(도 19). 마우스의 계통에 따라 본 효소의 분자 크기가 다르다는 것이 확인되었다. 또한, 본 폴리클로날 항체를 플레이트에 고상화하고 추가로 비오틴화함으로써, PoAb-PoAb의 샌드위치 ELISA를 구축하였다(표 4). 그에 따라, 본 효소의 혈중 존재량 측정이 마우스에서도 가능해졌다.

450nm-650nm 값	x5	x10	x20	x40	완충액(블랭크)
재조합체 발현 농축 상청	0.809	0.554	0.341		0.087
Balb/c 플라즈마			0.257	0.180
ICR 플라즈마			0.375	0.279

본 명세서에 인용된 모든 간행물은 그 전체 내용을 본 명세서에 삽입하기로 한다. 또한, 첨부된 청구 범위에 기재된 기술 사상 및 발명의 범위를 일탈하지 않는 범위내에서 본 발명의 여러가지 변형 및 변경이 가능하다는 것은 당업자에게 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 이러한 변형 및 변경도 포함하는 것을 의도한다.

본원 발명의 항체는 ADAMTS-13에 대하여 특이적으로 면역 반응성을 나타낸다. 따라서, ADAMTS-13 효소량의 신속한 검출, 본 효소 변동에 따른 질병의 진단, 및 ADAMTS-13의 효율적인 정제 또는 ADAMTS-13의 효소 활성의 중화가 가능해진다. 이와 같이, 본원 발명의 항체는 ADAMTS-13의 검출 및 정제를 비롯하여 다양한 용도를 갖는 것이기도 하다. 이와 같이 유용한 본 발명의 항체는 본 발명에 의한 항체의 제조 방법에 의해 목적량을 쉽게 얻을 수 있다.

본원 발명은 이와 같이 현저한 작용 효과를 발휘하는 것이며, 업계에 공헌하는 바가 실로 큰 의미있는 발명이라고 할 수 있다. 또한, 본원 발명의 ADAMTS-13 부분 결실체도 기능상 중요한 영역의 결정 등에 이용할 수 있다. 또한, 이들 효소 분자를 이용한 시료 중의 본 효소에 대한 항체의 존재 유무의 판정이 가능해져, 혈소판 감소증의 보다 상세한 원인 규명의 수단을 제공하며, 그에 따라 잘못된 혈소판 주사의 위험성을 피할 수 있도록 하는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110>JURIDICAL FOUNDATION THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE <120>Antibody against von Willebrand Factor cleaving protease and the assay method using the antibody thereof <130>PH-1893-PCT <150> JP 2002/279924 <151> 2002-09-25 <150> JP 2002/377569 <151> 2002-12-26 <160>19 <210>1 <211>1427 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>1 Met His Gln Arg His Pro Arg Ala Arg Cys Pro Pro Leu Cys Val 1 5 10 15 Ala Gly Ile Leu Ala Cys Gly Phe Leu Leu Gly Cys Trp Gly Pro 20 25 30 Ser His Phe Gln Gln Ser Cys Leu Gln Ala Leu Glu Pro Gln Ala 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ser Pro Gly Ala Pro Leu Lys Gly Arg Pro 50 55 60 Pro Ser Pro Gly Phe Gln Arg Gln Arg Gln Arg Gln Arg Arg Ala 65 70 75 Ala Gly Gly Ile Leu His Leu Glu Leu Leu Val Ala Val Gly Pro 80 85 90 Asp Val Phe Gln Ala His Gln Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Val Leu 95 100 105 Thr Asn Leu Asn Ile Gly Ala Glu Leu Leu Arg Asp Pro Ser Leu 110 115 120 Gly Ala Gln Phe Arg Val His Leu Val Lys Met Val Ile Leu Thr 125 130 135 Glu Pro Glu Gly Ala Pro Asn Ile Thr Ala Asn Leu Thr Ser Ser 140 145 150 Leu Leu Ser Val Cys Gly Trp Ser Gln Thr Ile Asn Pro Glu Asp 155 160 165 Asp Thr Asp Pro Gly His Ala Asp Leu Val Leu Tyr Ile Thr Arg 170 175 180 Phe Asp Leu Glu Leu Pro Asp Gly Asn Arg Gln Val Arg Gly Val 185 190 195 Thr Gln Leu Gly Gly Ala Cys Ser Pro Thr Trp Ser Cys Leu Ile 200 205 210 Thr Glu Asp Thr Gly Phe Asp Leu Gly Val Thr Ile Ala His Glu 215 220 225 Ile Gly His Ser Phe Gly Leu Glu His Asp Gly Ala Pro Gly Ser 230 235 240 Gly Cys Gly Pro Ser Gly His Val Met Ala Ser Asp Gly Ala Ala 245 250 255 Pro Arg Ala Gly Leu Ala Trp Ser Pro Cys Ser Arg Arg Gln Leu 260 265 270 Leu Ser Leu Leu Ser Ala Gly Arg Ala Arg Cys Val Trp Asp Pro 275 280 285 Pro Arg Pro Gln Pro Gly Ser Ala Gly His Pro Pro Asp Ala Gln 290 295 300 Pro Gly Leu Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Gln Cys Arg Val Ala Phe 305 310 315 Gly Pro Lys Ala Val Ala Cys Thr Phe Ala Arg Glu His Leu Asp 320 325 330 Met Cys Gln Ala Leu Ser Cys His Thr Asp Pro Leu Asp Gln Ser 335 340 345 Ser Cys Ser Arg Leu Leu Val Pro Leu Leu Asp Gly Thr Glu Cys 350 355 360 Gly Val Glu Lys Trp Cys Ser Lys Gly Arg Cys Arg Ser Leu Val 365 370 375 Glu Leu Thr Pro Ile Ala Ala Val His Gly Arg Trp Ser Ser Trp 380 385 390 Gly Pro Arg Ser Pro Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Val 395 400 405 Thr Arg Arg Arg Gln Cys Asn Asn Pro Arg Pro Ala Phe Gly Gly 410 415 420 Arg Ala Cys Val Gly Ala Asp Leu Gln Ala Glu Met Cys Asn Thr 425 430 435 Gln Ala Cys Glu Lys Thr Gln Leu Glu Phe Met Ser Gln Gln Cys 440 445 450 Ala Arg Thr Asp Gly Gln Pro Leu Arg Ser Ser Pro Gly Gly Ala 455 460 465 Ser Phe Tyr His Trp Gly Ala Ala Val Pro His Ser Gln Gly Asp 470 475 480 Ala Leu Cys Arg His Met Cys Arg Ala Ile Gly Glu Ser Phe Ile 485 490 495 Met Lys Arg Gly Asp Ser Phe Leu Asp Gly Thr Arg Cys Met Pro 500 505 510 Ser Gly Pro Arg Glu Asp Gly Thr Leu Ser Leu Cys Val Ser Gly 515 520 525 Ser Cys Arg Thr Phe Gly Cys Asp Gly Arg Met Asp Ser Gln Gln 530 535 540 Val Trp Asp Arg Cys Gln Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Thr Cys 545 550 555 Ser Pro Arg Lys Gly Ser Phe Thr Ala Gly Arg Ala Arg Glu Tyr 560 565 570 Val Thr Phe Leu Thr Val Thr Pro Asn Leu Thr Ser Val Tyr Ile 575 580 585 Ala Asn His Arg Pro Leu Phe Thr His Leu Ala Val Arg Ile Gly 590 595 600 Gly Arg Tyr Val Val Ala Gly Lys Met Ser Ile Ser Pro Asn Thr 605 610 615 Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Asp Gly Arg Val Glu Tyr Arg Val 620 625 630 Ala Leu Thr Glu Asp Arg Leu Pro Arg Leu Glu Glu Ile Arg Ile 635 640 645 Trp Gly Pro Leu Gln Glu Asp Ala Asp Ile Gln Val Tyr Arg Arg 650 655 660 Tyr Gly Glu Glu Tyr Gly Asn Leu Thr Arg Pro Asp Ile Thr Phe 665 670 675 Thr Tyr Phe Gln Pro Lys Pro Arg Gln Ala Trp Val Trp Ala Ala 680 685 690 Val Arg Gly Pro Cys Ser Val Ser Cys Gly Ala Gly Leu Arg Trp 695 700 705 Val Asn Tyr Ser Cys Leu Asp Gln Ala Arg Lys Glu Leu Val Glu 710 715 720 Thr Val Gln Cys Gln Gly Ser Gln Gln Pro Pro Ala Trp Pro Glu 725 730 735 Ala Cys Val Leu Glu Pro Cys Pro Pro Tyr Trp Ala Val Gly Asp 740 745 750 Phe Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly Leu Arg Glu Arg 755 760 765 Pro Val Arg Cys Val Glu Ala Gln Gly Ser Leu Leu Lys Thr Leu 770 775 780 Pro Pro Ala Arg Cys Arg Ala Gly Ala Gln Gln Pro Ala Val Ala 785 790 795 Leu Glu Thr Cys Asn Pro Gln Pro Cys Pro Ala Arg Trp Glu Val 800 805 810 Ser Glu Pro Ser Ser Cys Thr Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala 815 820 825 Leu Glu Asn Glu Thr Cys Val Pro Gly Ala Asp Gly Leu Glu Ala 830 835 840 Pro Val Thr Glu Gly Pro Gly Ser Val Asp Glu Lys Leu Pro Ala 845 850 855 Pro Glu Pro Cys Val Gly Met Ser Cys Pro Pro Gly Trp Gly His 860 865 870 Leu Asp Ala Thr Ser Ala Gly Glu Lys Ala Pro Ser Pro Trp Gly 875 880 885 Ser Ile Arg Thr Gly Ala Gln Ala Ala His Val Trp Thr Pro Ala 890 895 900 Ala Gly Ser Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Leu Met Glu Leu 905 910 915 Arg Phe Leu Cys Met Asp Ser Ala Leu Arg Val Pro Val Gln Glu 920 925 930 Glu Leu Cys Gly Leu Ala Ser Lys Pro Gly Ser Arg Arg Glu Val 935 940 945 Cys Gln Ala Val Pro Cys Pro Ala Arg Trp Gln Tyr Lys Leu Ala 950 955 960 Ala Cys Ser Val Ser Cys Gly Arg Gly Val Val Arg Arg Ile Leu 965 970 975 Tyr Cys Ala Arg Ala His Gly Glu Asp Asp Gly Glu Glu Ile Leu 980 985 990 Leu Asp Thr Gln Cys Gln Gly Leu Pro Arg Pro Glu Pro Gln Glu 995 1000 1005 Ala Cys Ser Leu Glu Pro Cys Pro Pro Arg Trp Lys Val Met Ser 1010 1015 1020 Leu Gly Pro Cys Ser Ala Ser Cys Gly Leu Gly Thr Ala Arg Arg 1025 1030 1035 Ser Val Ala Cys Val Gln Leu Asp Gln Gly Gln Asp Val Glu Val 1040 1045 1050 Asp Glu Ala Ala Cys Ala Ala Leu Val Arg Pro Glu Ala Ser Val 1055 1060 1065 Pro Cys Leu Ile Ala Asp Cys Thr Tyr Arg Trp His Val Gly Thr 1070 1075 1080 Trp Met Glu Cys Ser Val Ser Cys Gly Asp Gly Ile Gln Arg Arg 1085 1090 1095 Arg Asp Thr Cys Leu Gly Pro Gln Ala Gln Ala Pro Val Pro Ala 1100 1105 1110 Asp Phe Cys Gln His Leu Pro Lys Pro Val Thr Val Arg Gly Cys 1115 1120 1125 Trp Ala Gly Pro Cys Val Gly Gln Gly Thr Pro Ser Leu Val Pro 1130 1135 1140 His Glu Glu Ala Ala Ala Pro Gly Arg Thr Thr Ala Thr Pro Ala 1145 1150 1155 Gly Ala Ser Leu Glu Trp Ser Gln Ala Arg Gly Leu Leu Phe Ser 1160 1165 1170 Pro Ala Pro Gln Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gly Pro Gln Glu Asn 1175 1180 1185 Ser Val Gln Ser Ser Ala Cys Gly Arg Gln His Leu Glu Pro Thr 1190 1195 1200 Gly Thr Ile Asp Met Arg Gly Pro Gly Gln Ala Asp Cys Ala Val 1205 1210 1215 Ala Ile Gly Arg Pro Leu Gly Glu Val Val Thr Leu Arg Val Leu 1220 1225 1230 Glu Ser Ser Leu Asn Cys Ser Ala Gly Asp Met Leu Leu Leu Trp 1235 1240 1245 Gly Arg Leu Thr Trp Arg Lys Met Cys Arg Lys Leu Leu Asp Met 1250 1255 1260 Thr Phe Ser Ser Lys Thr Asn Thr Leu Val Val Arg Gln Arg Cys 1265 1270 1275 Gly Arg Pro Gly Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Gly Ser Gln Leu 1280 1285 1290 Ala Pro Glu Thr Phe Tyr Arg Glu Cys Asp Met Gln Leu Phe Gly 1295 1300 1305 Pro Trp Gly Glu Ile Val Ser Pro Ser Leu Ser Pro Ala Thr Ser 1310 1315 1320 Asn Ala Gly Gly Cys Arg Leu Phe Ile Asn Val Ala Pro His Ala 1325 1330 1335 Arg Ile Ala Ile His Ala Leu Ala Thr Asn Met Gly Ala Gly Thr 1340 1345 1350 Glu Gly Ala Asn Ala Ser Tyr Ile Leu Ile Arg Asp Thr His Ser 1355 1360 1365 Leu Arg Thr Thr Ala Phe His Gly Gln Gln Val Leu Tyr Trp Glu 1370 1375 1380 Ser Glu Ser Ser Gln Ala Glu Met Glu Phe Ser Glu Gly Phe Leu 1385 1390 1395 Lys Ala Gln Ala Ser Leu Arg Gly Gln Tyr Trp Thr Leu Gln Ser 1400 1405 1410 Trp Val Pro Glu Met Gln Asp Pro Gln Ser Trp Lys Gly Lys Glu 1415 1420 1425 Gly Thr 1427 <210>2 <211>22 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>2 Phe Ser Pro Ala Pro Gln Pro Arg Arg Leu Leu Pro Gly Pro Gln 1 5 10 15 Glu Asn Ser Val Gln Ser Ser 20 <210>3 <211>18 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>3 Asp Arg Leu Pro Arg Leu Glu Glu Ile Arg Ile Trp Gly Pro Leu 1 5 10 15 Gl굨 Glu Asp <210>4 <211>30 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>4 ctggagcacg acggcgcgcc cggcagcggc 30 <210>5 <211>30 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>5 atgtgcaaca ctcaggcctg cgagaagacc 30 <210>6 <211>30 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>6 ccaacctgac cagtgtctac attgccaacc 30 <210>7 <211>21 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>7 ctggagccct gcccacctag g 21 <210>8 <211>62 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>8 tccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt cgtcccacac gcagcgcgcc 60 cg 62 <210>9 <211>62 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>9 tccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt cgcgcccatg cactgctgct 60 at 62 <210>10 <211>62 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>10 gccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt cttgcgacat gaactccagc 60 tg 62 <210>11 <211>62 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>11 gccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt ccaggttggg ggtaactgtc 60 ag 62 <210>12 <211>62 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>12 tccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt ccacccaggc ctgccgtggc 60 tt 62 <210>13 <211>62 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>13 tccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt cgtagggagg gcagggttcg 60 ag 62 <210>14 <211>62 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>14 tccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt ccctggcagg gcagggctgg 60 gg 62 <210>15 <211>62 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>15 gccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt ccacgtgtgc agcttgagcc 60 cc 62 <210>16 <211>62 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>16 gccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt ccctaggtgg gcagggctcc 60 ag 62 <210>17 <211>62 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>17 gccgtcgact cttatcactt atcgtcatcg tccttgtagt caccctgtcc cacacagggc 60 cc 62 <210>18 <211>60 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>18 tccaagcttg tcgactctta tcacttatcg tcatcgtcct tgtagtcggt tccttccttt 60 <210>19 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400>19 gactacaagg acgatgacga taagtga 27 <210>20 <211>8 <212>RPT <213>Artificial Sequence <220> <223>Description of Artificial Sequence:Synthetic <400>20 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims

폰 빌레브란트 인자 특이적 절단 효소(이하, ADAMTS-13이라고도 칭함)를 구성하는 아미노산 서열의 전장, 그 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 상기 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 단백질 또는 펩티드에 대한 항체.
제1항에 있어서, ADAMTS-13이 영장류 또는 설치류를 기원으로 하는 것인 항체.
서열번호 1에 기재된 ADAMTS-13을 구성하는 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 상기 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 단백질에 대한 항체.
서열번호 1에 기재된 ADAMTS-13을 구성하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 당해 폴리펩티드의 스페이서 영역으로부터 N 말단측, 또는 메탈로프로테아제 영역, 디스인테그린-유사 영역, Tsp1-1 영역, Cys-풍부 영역으로부터 스페이서 영역의 사이를 인식하는 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ADAMTS-13을 구성하는 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 상기 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 단백질의 어피니티 정제에 사용될 수 있는 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ADAMTS-13을 구성하는 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 또는 상기 중 어느 하나의 아미노산 서열의 부분 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드쇄를 포함하는 단백질이 갖는 효소 활성을 저해 또는 중화할 수 있는 항체.
제6항에 있어서, ADAMTS-13의 스페이서 영역으로부터 N 말단측, 메탈로프로테아제 영역 또는 디스인테그린-유사 영역을 인식하는 항체.
서열번호 2 및 3의 ADAMTS-13 부분 펩티드를 함유하는 면역원에 의해 제조된 항체.
서열번호 1에 기재된 폴리펩티드쇄의 전장 또는 그 일부의 발현물로 면역시키거나, 또는 그것을 발현하는 발현 벡터를 직접 동물에게 트랜스펙트하여 얻어지는 항체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리클로날 항체인 항체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체 및 그 항체를 코드하는 유전자.
제9항에 있어서, 하이브리도마주 WH10(수탁 번호 FERM BP-8174), 하이브리도마주 WH63.1(수탁 번호 FERM BP-8175), 하이브리도마주 WHS40.3(수탁 번호 FERM BP-8176), 하이브리도마주 Pep4-34.1(수탁 번호 FERM BP-8177), 하이브리도마주 WH2-22-1A(수탁 번호 FERM BP-8483), 하이브리도마주 WH2-1-1(수탁 번호 FERM BP-8484), 하이브리도마주 WH2-11-1(수탁 번호 FERM BP-8485), 하이브리도마주 Pep6-6A(수탁 번호 FERM BP-8474) 및 하이브리도마주 Pep4-5B-1(수탁 번호 FERM BP-8475)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체 및 이 항체를 코드하는 유전자.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체에 의해 인식되는 ADAMTS-13의 에피토프에 결합 또는 경합적으로 결합할 수 있는 항체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 포함하는 의약품 조성물 또는 진단약.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 구성 성분으로 하는 표지 단백질.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 생산할 수 있는 단리된 세포.
제16항에 있어서, 하이브리도마인 세포.
제17항에 있어서, 하이브리도마주 WH10(수탁 번호 FERM BP-8174), 하이브리도마주 WH63.1(수탁 번호 FERM BP-8175), 하이브리도마주 WHS40.3(수탁 번호 FERM BP-8176), 하이브리도마주 Pep4-34.1(수탁 번호 FERM BP-8177), 하이브리도마주 WH2-22-1A(수탁 번호 FERM BP-8483), 하이브리도마주 WH2-1-1(수탁 번호 FERM BP-8484), 하이브리도마주 WH2-11-1(수탁 번호 FERM BP-8485), 하이브리도마주 Pep6-6A(수탁 번호 FERM BP-8474) 및 하이브리도마주 Pep4-5B-1(수탁 번호 FERM BP-8475)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 포함하는 면역 측정 키트.
ADAMTS-13의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리펩티드로 온혈 동물을 면역 감작하는 공정, 및 상기 면역 감작된 온혈 동물의 체액으로부터 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 채취하는 공정을 포함하는 항체의 제조 방법.
제20항에 있어서, 온혈 동물을 면역 감작하기 위한 폴리펩티드가 ADAMTS-13의 일부로서 서열표의 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 항체의 제조 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 생산할 수 있는 단리된 세포를 생체내 또는 생체외에서 배양하는 공정, 및 그 체액 또는 배양물로부터 상기 항체를 채취하는 공정을 포함하는 항체의 제조 방법.
제22항에 있어서, 항체를 생산할 수 있는 단리된 세포가 하이브리도마인 항체의 제조 방법.
제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 염석, 투석, 여과, 농축, 원심 분리, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 겔 전기 영동 및 등전점 전기 영동으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 포함하는 정제 방법에 의해 항체를 채취하는 항체의 제조 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 피검 시료에 접촉시켜, 면역 반응에 의해 ADAMTS-13을 검출하는 것을 특징으로 하는 ADAMTS-13의 검출 방법.
제25항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 이용하는 방사선 면역 분석법, 효소 면역 분석법 또는 형광 면역 분석법인 검출 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서, 피검 시료가 생체로부터 채취한 생물학적 시료인 검출 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 ADAMTS-13과 불순 물질을 포함하는 혼합물에 접촉시켜 항체에 당해 단백질을 흡착시키는 공정, 및 흡착된 당해 단백질을 항체로부터 탈착시키는 공정을 포함하는 ADAMTS-13의 정제 방법.
제28항에 있어서, 항체가 수불용성 담체에 결합되어 있는 정제 방법.
ADAMTS-13의 전장 또는 부분 결실 변이체를 주성분으로 하는 진단약 또는 의약품.
제30항에 있어서, ADAMTS-13의 스페이서로부터 N 말단측, 또는 메탈로프로테아제 영역, 디스인테그린-유사 영역, Tsp1-1 영역, Cys-풍부 영역으로부터 스페이서 영역을 주성분으로 하는 진단약 또는 의약품.
ADAMTS-13의 전장 또는 부분 결실 변이체를 주성분으로 한 당해 폴리펩티드쇄에 대한 항체 검출용 시약ㆍ진단약 또는 의약품.
ADAMTS-13의 전장 또는 부분 결실 변이체를 주성분으로 한 항체 검출 또는 에피토프 해석용 항원의 용도 및 그의 제조법.