ES2344180T3

ES2344180T3 - Ensayo para la deteccion de una pareja de union.

Info

Publication number: ES2344180T3
Application number: ES99966795T
Authority: ES
Inventors: Richard Ian University of Sydney CHRISTOPHERSON; Cristobal G. University of Sydney DOS REMEDIOS
Original assignee: Medsaic Pty Ltd
Current assignee: Medsaic Pty Ltd
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2010-08-19
Anticipated expiration: 2019-12-23
Also published as: NZ525421A; CN1334922A; JP4763135B2; DE69942314D1; KR20010093221A; ATE466280T1; DK1151300T3; HK1041922A1; JP2002533723A; US20020019018A1; KR100795757B1; EP1151300B1; EP1151300A1; EP1151300A4; PT1151300E; US7560226B2; CN1231761C; WO2000039580A1; CA2356286A1; CA2356286C

Abstract

Dispositivo de ensayo que puede distinguir entre la leucemia de linfocitos T CCRF-CEM y el linfoma de linfocitos B Raji, comprendiendo dicho dispositivo: un soporte sólido, y una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicho ensayo de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 y CD56.

Description

Ensayo para la detección de una pareja de unión.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a un ensayo para la detección de una pareja de unión. La presencia o ausencia de una pareja de unión puede utilizarse como indicador de un estado normal o de un estado de enfermedad o trastorno, o de la tendencia a que se desarrolle un estado de enfermedad o trastorno, o de la presencia de un tipo celular particular, o agente microbiano, vírico, parasitario u otro agente patogénico en un animal, especie de ave o planta, o de la presencia de una entidad química particular en una muestra, tal como una biblioteca química, espécimen biológico o muestra ambiental o biblioteca de expresión fágica. Se da a conocer en la presente invención una matriz de moléculas que presentan una pareja de unión en una muestra biológica procedente o derivada de dicho animal, especie de ave o planta, en la que el patrón de unión de las parejas de unión a las moléculas respectivas en la matriz, incluyendo la ausencia de unión o la densidad de interacción de la pareja, proporciona una indicación de un estado normal o estado de enfermedad o trastorno, o de la tendencia a que se desarrolle un estado de enfermedad o trastorno, o de la presencia de un tipo celular particular o agente microbiano, vírico, parasitario u otro agente patogénico. La pareja de unión puede encontrarse en una muestra química, ambiental o de biblioteca de expresión fágica, y el patrón de unión, incluyendo la ausencia de unión o la densidad de interacción de la pareja, es indicativo de la presencia, tipo y/o concentración de una pareja de unión particular o de una familia de parejas de unión. El ensayo resulta útil, inter alia, para la detección de cánceres y neoplasias, así como de trastornos no neoplásicos en animales, incluyendo seres humanos, así como en especies de ave y en plantas. El ensayo también resulta útil para detectar tipos celulares, agentes microbianos, víricos, parasitarios u otros agentes patogénicos y entidades químicas en muestras químicas, ambientales y de expresión fágica. Las moléculas de la matriz comprenden inmunoglobulinas que pueden interactuar con antígenos solubles unidos a células o con antígenos sintéticos particulares. El patrón de unión en la matriz, incluyendo la presencia, ausencia o nivel de unión a los antígenos respectivos, proporciona una indicación de la expresión de los antígenos sobre las células o de la expresión de los antígenos por parte de las mismas, que, a su vez, proporciona una indicación de la existencia de un estado normal o de un estado de enfermedad o trastorno, tal como cáncer, en un animal, especie de ave o planta. El patrón de unión también proporciona una indicación de la presencia y/o concentración
de antígenos en una biblioteca química, en una muestra ambiental o en una biblioteca de expresión fágica.

Antecedentes de la invención

Al final de la descripción se recogen los datos bibliográficos de las publicaciones a las que hace referencia el autor de la presente memoria.

La creciente sofisticación de las técnicas inmunológicas está facilitando en gran medida la investigación y desarrollo en los campos médico, veterinario, hortícola y medioambiental. La especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno es de importancia fundamental. A través de esta interacción puede determinarse la expresión de genes codificantes de antígenos particulares.

Muchos estados de enfermedad en especies de aves, plantas y, en particular, animales, tales como seres humanos, presentan una base genética, y pueden caracterizarse a partir de cambios en los patrones y/o niveles de expresión de diversos genes. Por ejemplo, algunos cánceres están asociados a cambios de la expresión de oncogenes y genes de supresión tumoral. Además, los estados de enfermedad o trastornos asociados a cambios en el ciclo celular y en el desarrollo pueden atribuirse a cambios en la regulación transcripcional de genes particulares.

Aunque se encuentran disponibles varios ensayos genéticos para evaluar mutaciones, la identificación de determinados cambios genéticos no siempre puede ser directamente indicativa de un estado de enfermedad o trastorno.

Algunos cambios genéticos se expresan mediante alteraciones de antígenos de la superficie celular. Nuevamente, sin embargo, los intentos anteriores para desarrollar un ensayo diagnóstico para estados de enfermedad o trastornos complejos, tales como el cáncer, basados en la identificación de un único antígeno no siempre han tenido éxito.

Las leucemias y linfomas causan una mortalidad y morbilidad significativas en el ser humano. Estos cánceres resultan de la proliferación continua de células que de otro modo se encontrarían bloqueadas en diversos estadios de la diferenciación normal hacia tipos celulares especializados. Las leucemias surgen de células formadoras de sangre presentes en la médula ósea debido a mutaciones en cualquiera de los precursores en los diversos linajes de diferenciación (ver la figura 1). Los linfomas se desarrollan a partir de linfocitos o macrófagos en el tejido linfático.

Los linfocitos en la sangre periférica expresan un gran número de diferentes antígenos sobre sus membranas plasmáticas externas, muchos de los cuales son receptores de factores de crecimiento, interacciones célula-célula e inmunoglobulinas, moléculas para la adhesión celular o estimulación del complemento, enzimas y canales iónicos. Se ha desarrollado una nomenclatura sistemática única para clasificar los anticuerpos monoclonales contra los antígenos de superficie celular de los leucocitos en el ser humano, conocidos como grupo de antígenos de diferenciación (CD) (Kishimoto et al., 1997). Puede encontrarse información detallada sobre los antígenos CD en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/cd/index_molecules.htm. La expresión de estos antígenos de superficie celular permite distinguir entre diferentes tipos de células sanguíneas maduras presentes en el sistema circulatorio periférico.

Las células en la sangre periférica son producidas en la médula ósea mediante la proliferación y diferenciación en linajes específicos a partir de células madre precursoras mieloides o linfoides que expresan el antígeno de superficie CD34 (ver la figura 2).

En la actualidad, una leucemia se diagnostica basándose en la morfología, expresión de CD específicos, antígenos linfoides (LY) y mieloides (MY), actividades enzimáticas y anormalidades citogenéticas, tales como las translocaciones cromosómicas. El diagnóstico de la leucemia mieloide aguda (AML) se realiza, por ejemplo, utilizando dichos cuatro criterios. La expresión de hasta tres antígenos CD en células de leucemia en la actualidad se determina utilizando anticuerpos marcados fluorescentemente contra antígenos CD particulares mediante análisis de citometría de flujo. De esta manera, el cribado de células de leucemia de pacientes para la expresión de los 166 antígenos CD no resulta de utilización práctica mediante la utilización de esta laboriosa técnica. Recientemente, de Matos y Vale, (1996), han desarrollado un procedimiento de citometría de flujo para la cuantificación simultánea en una única medición de los tipos principales de linfocitos humanos y sus subgrupos. En este procedimiento, se incuban poblaciones mixtas de linfocitos humanos con anticuerpos monoclonales contra CD3, CD4, CD8, CD19 y CD56 conjugados con tres fluorocromos diferentes. La medición de las tres emisiones fluorescentes diferentes mediante citometría de flujo permite la cuantificación de los tipos principales de linfocitos humanos, linfocitos T y B y células asesinas naturales (NK). Debido a que la mayoría de citómetros de flujo únicamente pueden utilizar tres láseres diferentes simultáneamente para el análisis celular, este procedimiento representa la utilización actual máxima de esta técnica.

Chang (1983) preparó series ordenadas de tipo matriz de anticuerpos de diferentes especificidades sobre cubreobjetos de vidrio que actuaban a modo de minúsculos inmunoadsorbentes específicos para células que expresaban los antígenos correspondientes sobre su superficie. Este procedimiento se basó en observaciones anteriores de que las células son capaces de unirse a superficies recubiertas con anticuerpos específicos para los antígenos sobre la superficie de las células (Mage et al., 1977; Wysocki y Sato, 1978). Chang (1983), demostró la unión específica de células mononucleares de sangre periférica al anticuerpo de ratón antiHLA-A2 humano adsorbido sobre cubreobjetos de vidrio, y de timocitos de ratón a los anticuerpos antiLyt 2.1 y antiLyt 2.2 inmovilizados.

En el trabajo que ha conducido a la presente invención, se ha determinado que la detección de determinadas parejas de unión puede utilizarse para diagnosticar estados de enfermedad y trastornos, tales como cánceres y trastornos neoplásicos, así como la presencia de un estado normal. El sistema de detección también puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un abanico de antígenos y puede utilizarse para cuantificar sus cantidades relativas. Esto resulta particularmente importante en muestras químicas, bibliotecas y medioambientales y en bibliotecas de expresión fágica.

Sumario de la invención

En la presente memoria se da a conocer un dispositivo de ensayo que comprende una matriz de moléculas en la que cada molécula en la matriz, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con su pareja de unión respectiva, putativamente presente en una muestra biológica de un animal, especie de ave o planta, en la que el patrón de interacción entre las moléculas y las parejas de unión es indicativo de un estado normal o de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a que se desarrolle un estado de enfermedad o trastorno.

En la presente memoria se da a conocer un dispositivo de ensayo que comprende una matriz de moléculas en la que cada molécula en la matriz, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con su pareja de unión respectiva, putativamente presente en una muestra química o de biblioteca de expresión fágica o en una muestra medioambiental, en la que el patrón de interacción entre las moléculas y las parejas de unión es indicativa de la presencia, tipo y/o cantidad de una pareja de unión particular en dicha muestra.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el diagnóstico de un estado normal o de cáncer o de una tendencia al desarrollo de cáncer en un animal, tal como un ser humano, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una matriz de moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, en la que cada molécula en la matriz, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja de unión respectiva, en caso de encontrarse presente en una muestra biológica de dicho animal, de manera que el patrón de interacción entre las moléculas inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas es indicativo de la presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el diagnóstico de un trastorno no neoplásico o de una tendencia a desarrollar un trastorno no neoplásico en un animal, tal como un ser humano, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una matriz de moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, en el que cada molécula del ensayo, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja de unión respectiva en caso de encontrarse presente en una muestra biológica procedente de dicho animal, en la que el patrón de interacción entre las moléculas inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas es indicativo de la presencia de un trastorno no neoplásico o de una tendencia a desarrollar un trastorno no neoplásico.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para la detección de un tipo celular o agente microbiano, vírico o parasitario, o de un patógeno, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una matriz de moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, en el que cada molécula de la matriz, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja de unión respectiva en caso de encontrarse presente en dicho tipo celular, agente microbiano o vírico o parasitario o patógeno, en la que el patrón de interacción entre las moléculas inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas es indicativo de dicho tipo celular, agente microbiano o vírico o parasitario o
patógeno.

Se da a conocer en la presente memoria una matriz de moléculas inmovilizadas sobre un soporte sólido, estando dicha matriz definida por la fórmula siguiente:

1

en la que:

P es un elemento de un grupo de unión capaz de interactuar con una pareja de unión,

n_{1}, n_{2}, ..., n_{i} representan diferentes elementos del grupo de unión,

x_{1}, x_{2}, ..., x_{j} representan diferentes grupos de unión,

b, c y d representan el número de diferentes elementos de los grupos de unión x_{1}, x_{2}, ..., x_{j}, respectivamente, y en donde b, c y d pueden ser iguales o diferentes y cada uno presenta un valor entre aproximadamente 0 y aproximadamente 100, con la condición de que por lo menos uno de entre b, c o d no sea 0,

z es el número de grupos de moléculas en la matriz y es un número entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2.000,

en la que el patrón de interacción entre las moléculas inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas es indicativo de un estado normal o de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de enfermedad o trastorno, o de la presencia, tipo y/o cantidad de una pareja de unión.

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Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizadas en regiones discretas de un soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, y en el que los antígenos se expresan sobre la superficie de células normales o de células cancerosas o resultan liberados por células normales o cancerosas, en el que el patrón de unión de las inmunoglobulinas inmovilizadas con sus antígenos respectivos es indicativo de la presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer o de la presencia de un estado normal.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para un trastorno no neoplásico, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas inmunoglobulinas o derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, y en el que los antígenos se expresan sobre la superficie de células no neoplásicas o resultan liberados por células no neoplásicos, en el que el patrón de unión de las inmunoglobulinas inmovilizadas con sus antígenos respectivos es indicativo de un trastorno no neoplásico o de una tendencia a desarrollar un trastorno no neoplásico.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para un agente microbiano, vírico, parasitario u otro agente patogénico, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, y en el que los antígenos se expresan sobre la superficie de dichos agentes microbianos, víricos, parasitarios o patógenos o resultan liberados por los mismos, y el patrón de unión de los antígenos a las inmunoglobulinas inmovilizadas es indicativo de la presencia o ausencia de dicho microbio, virus, parásito o patógeno.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para una pareja de unión en una biblioteca química, muestra medioambiental o biblioteca de expresión fágica, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de los mismos inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, en el que el patrón de unión de los antígenos a las inmunoglobulinas inmovilizadas es indicativo de la presencia, tipo y/o cantidad de dicho antígeno.

Se da a conocer en la presente memoria una matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de las mismas, específicas para antígenos expresados sobre célula normales o células cancerosas o liberados por células normales o cancerosas o expresados sobre microbios, virus, parásitos, patógenos o antígenos putativamente presentes en una biblioteca química o muestra medioambiental, en los que cada grupo de inmunoglobulinas específico para cada antígeno o parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:

2

en la que:

q es una inmunoglobulina específica de un antígeno expresado sobre una célula normal o cancerosa, o de un antígeno liberado por una célula normal o cancerosa, o expresado sobre microbios, virus, parásitos, patógenos o antígenos putativamente presentes en una biblioteca química, muestra medioambiental o biblioteca de expresión fágica,

m_{1}, m_{2}, ..., m_{i} representan elementos del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a diferentes partes del mismo antígeno,

o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan diferentes grupos de inmunoglobulinas definidos por la especificidad para diferentes antígenos.

e, f y g representan el número de diferentes inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2}, ..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser iguales o diferentes

y cada uno presenta un valor entre 0 y 100, con la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0; y es el número de grupos de inmunoglobulinas en la matriz y es un número entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2.000,

en la que el patrón de interacción entre las inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos resulta indicativo de un estado normal o del desarrollo de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer o de la presencia de un microbio, virus, parasitario o patógeno o de la presencia, tipo y/o cantidad de una pareja de unión en dicha muestra química o medioambiental o biblioteca de expresión fágica.

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Se da a conocer en la presente memoria una matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de las mismas específicos para antígenos expresados sobre células no neoplásicas o derivados de células no neoplásicas, en los que cada grupo de inmunoglobulinas específico para cada antígeno o parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:

3

en la que:

q es una inmunoglobulina específica para el antígeno,

e, f y g representan el número de diferentes inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2}, ..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser iguales o diferentes y cada uno presenta un valor entre 0 y 100 con la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,

y es el número de grupos de inmunoglobulina en el ensayo y es un número entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2.000,

en la que el patrón de interacción entre las inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos es indicativo del desarrollo de un trastorno no neoplásico o de una tendencia a desarrollar un trastorno no neoplásico o de la presencia de un microbio, parásito, virus o patógeno particular.

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Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina, o de derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizados sobre regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para un grupo diferente de antígenos de diferenciación y/o de antígenos mieloides y/o de antígenos linfoides, expresados sobre células leucémicas, en la que el patrón de unión de las inmunoglobulinas inmovilizadas a sus antígenos respectivos es indicativo de la presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo diagnóstico que comprende una matriz de moléculas, en la que cada molécula en el ensayo, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con su pareja de unión respectiva putativamente en una muestra biológica de un animal, especie de ave o planta, en la que las moléculas se encuentran en una disposición en dicha matriz que permite que, al interactuar las moléculas con las parejas de unión, un patrón diferencial de densidad proporciona una señal identificable que es indicativa de un estado de enfermedad o trastorno o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o trastorno.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el diagnóstico del cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer en un animal, tal como un ser humano, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una matriz de moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, en el que cada molécula de la matriz, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja de unión respectiva en caso de encontrarse presente en una muestra biológica de dicho animal, en la que las moléculas se encuentran dispuestas en dicho ensayo de manera que, al interactuar las moléculas inmovilizadas con sus parejas de unión respectivas, un patrón diferencial de densidad proporciona una señal identificable que es indicativa de la presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

Se da a conocer en la presente memoria una matriz de moléculas inmovilizadas sobre un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:

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4

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en la que:

n_{1}, n_{2}, ..., n_{i} representan diferentes elementos del grupo de unión,

x_{1}, x_{2}, ..., x_{j} representan diferentes grupos de unión,

b, c y d representan los números de diferentes elementos de los grupos de unión x_{1}, x_{2}, ..., x_{j}, respectivamente, y en los que b, c y d pueden ser iguales o diferentes y cada uno presenta un valor de entre aproximadamente 0 y aproximadamente 100 con la condición de que por lo menos uno de entre b, c o d no sea 0,

z es el número total de grupos de moléculas en la matriz y es un número entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2.000,

en la que las moléculas se encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que, al interactuar las moléculas inmovilizadas con sus parejas de unión respectivas, un patrón diferencial de densidades en un grupo de unión proporciona una señal identificable que es indicativa de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de enfermedad o trastorno.

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Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos y en las que los antígenos se expresan sobre la superficie de células normales o cancerosas o resultan liberadas por células normales o cancerosas, en las que las inmunoglobulinas unidas se encuentran dispuestas en dicha matriz de manera que el patrón de las inmunoglobulinas inmovilizadas unidas a sus antígenos respectivas proporciona un patrón diferencial de densidad que presenta la forma de una señal identificable y que resulta indicativo de la presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

Se da a conocer en la presente memoria es una matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de las mismas específicos de antígenos expresados sobre células normales o cancerosas o liberados por células normales o cancerosas, en las que cada grupo de inmunoglobulinas específicas de cada antígeno o de parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:

5

en la que:

q es una inmunoglobulina específica de un antígeno expresado sobre una célula normal o cancerosa, o antígeno liberado por una célula normal o cancerosa,

e, f y g representan el número de diferentes inmunoglobulinas en cada uno de los grupos o_{1}, o_{2}, ..., o_{k}, respectivamente, y en las que e, f y g pueden ser iguales o diferentes, y cada uno presenta un valor entre 0 y 100, con la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,

y es el número total de grupos de inmunoglobulinas en la matriz y es un número entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2.000,

en la que las moléculas se encuentran en una disposición en dicha matriz que permite que, al interactuar las inmunoglobulinas inmovilizadas con sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de densidad proporcione una señal identificable que es indicativa del desarrollo de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

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La presente invención contempla un dispositivo de ensayo tal como se da a conocer en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

Se da a conocer en la presente memoria un método para determinar la presencia de un estado de enfermedad o trastorno o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o trastorno, tal como, aunque de manera no limitativa, cáncer en un animal, especie de ave o planta, comprendiendo dicho método la obtención de una muestra biológica de dicho animal, especie de ave o planta, que comprende parejas de unión libres o parejas de unión unidas a una superficie celular, encontrándose dichas parejas de unión asociadas directa o indirectamente a dicho estado de enfermedad o trastorno, y la puesta en contacto de dicha muestra biológica con un soporte sólido que comprende una matriz de moléculas capaces de unirse a dichas parejas de unión, en la que las moléculas se encuentran dispuestas en dicha matriz de manera que, al interactuar con las parejas de unión, un patrón diferencial de densidad proporciona una señal identificable que resulta indicativa del estado de enfermedad o trastorno o de una tendencia a desarrollar dicho estado de enfermedad o trastorno.

Se da a conocer en la presente memoria un método para detectar cáncer o una tendencia a desarrollar cáncer en un ser humano o animal no humano, comprendiendo dicho método la obtención de una muestra biológica de dicho ser humano o animal no humano y la puesta en contacto de dicha muestra biológica con una matriz de inmunoglobulinas, o derivados o equivalentes químicos de las mismas, específicas para los antígenos expresados sobre las células normales o cancerosas, o liberados por células normales o cancerosas, en la que cada grupo de inmunoglobulinas específicas para cada antígeno o parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido, estando definido dicho ensayo por la fórmula siguiente:

6

en la que:

q es una inmunoglobulina específica para un antígeno expresado sobre una célula normal o cancerosa, o para un antígeno liberado por una célula normal o cancerosa,

o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan diferentes grupos de inmunoglobulinas definidas por la especificidad para diferentes antígenos,

e, f y g representan el número de diferentes inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2}, ..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser iguales o diferentes, y cada uno presenta un valor entre 0 y 100, con la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no es 0,

y es el número total de grupos de inmunoglobulinas en la matriz y es un número entre aproximadamente 2 y aproximadamente 2.000,

en la que las moléculas se encuentran dispuestas en dicha matriz de manera que, al interactuar las inmunoglobulinas inmovilizadas con sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de densidad proporciona una señal identificable que es indicativo del desarrollo de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

\vskip1.000000\baselineskip

Se da a conocer en la presente memoria un método para determinar la presencia de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o trastorno, tal como, aunque sin limitación, cáncer en un animal, especie de ave o planta, comprendiendo dicho método la obtención de una muestra biológica de dicho animal, especie de ave o planta que comprende parejas de unión libres o parejas de unión unidas a una superficie celular, encontrándose dichas parejas de unión asociadas directa o indirectamente a dicho estado de enfermedad o trastorno, y la puesta en contacto de dicha muestra biológica con un soporte sólido que comprende una matriz de moléculas capaces de unirse a dichas parejas de unión, en el que el patrón de interacción con las parejas de unión es indicativo del estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de enfermedad o trastorno.

Se da a conocer en la presente memoria un método para detectar cáncer o una tendencia a desarrollar cáncer en un ser humano o animal no humano, comprendiendo dicho método la obtención de una muestra biológica de dicho ser humano o animal no humano, y la puesta en contacto de dicha muestra biológica con una matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de las mismas específicos para los antígenos expresados sobre células normales o cancerosas, o liberados por células normales o cancerosas, en la que cada grupo de inmunoglobulinas específicas para cada antígeno o parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:

7

en la que:

m_{1}, m_{2}, ..., m_{j} representan elementos del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a diferentes partes del mismo antígeno,

o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan diferentes grupos de inmunoglobulinas definidos por la especificada para diferentes antígenos,

e, f y g representan el número de diferentes inmunoglobulinas en cada uno de los grupos o_{1}, o_{2}, ..., o_{k}, respectivamente, y los que e, f y g pueden ser iguales o diferentes y cada uno es un número entre 0 y 100, con la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,

en la que el patrón de interacción entre las inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos es indicativo del desarrollo de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

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Se da a conocer en la presente memoria la utilización de una matriz de moléculas capaz de interactuar con una pareja de unión respectiva putativamente presente en una muestra biológica, con el fin de determinar la presencia de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o trastorno.

Se da a conocer en la presente memoria un método para el tratamiento del cáncer en un ser humano o animal no humano, comprendiendo dicho método la obtención de una muestra biológica de dicho ser humano o animal humano, y la puesta en contacto de dicha muestra con una matriz de moléculas de inmunoglobulina, o de derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizados en regiones discretas del soporte sólido de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, y en el que los antígenos se expresan sobre la superficie de células normales o cancerosas, o resultan liberados por células normales o cancerosas, la determinación del patrón de unión de las inmunoglobulinas inmovilizadas a sus antígenos respectivos, y posteriormente la realización de inmunoterapia, tal como con, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales humanizados correspondiente a un antígeno sustancialmente expresado sobre células cancerosas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación diagramática que muestra linajes de diferenciación de células sanguíneas con tipos de célula precursora a partir de los que surgen diversos tipos de leucemia. La determinación de la expresión completa de antígenos permitiría un diagnóstico inequívoco de la leucemia (ver la figura 2). CML: leucemia mieloide crónica, AMML: leucemia mielomonocítica aguda, ALL: leucemia linfocítica aguda, AEL: leucemia eritrocítica aguda, AmegL: leucemia megacariocítica aguda, AMoL: leucemia monocítica aguda, AML: leucemia mieloide aguda, CLL: leucemia linfocítica crónica, NHL: linfoma no de Hodgkin, APL: leucemia promielocítica aguda. Adaptado de Cooper, (1993).

La figura 2 es una representación diagramática que muestra linajes para la diferenciación de células sanguíneas en la médula ósea. Se indican algunos antígenos expresados sobre células precursoras y células sanguíneas maduras. Adaptado de van Dongen et al., (1988).

La figura 3 es una representación diagramática de: (a) una vista superior, y (b) una vista en perspectiva, de un dispositivo de inmunoensayo que comprende una matriz de manchas discretas de anticuerpo.

La figura 4 es una representación diagramática que muestra un procedimiento de matriz de anticuerpos.

La figura 5 muestra micrografías de Nomarski de células CCRF-CEM humanas de leucemia y de linfoma de Raji unidas a algunas de las manchas de una matriz de anticuerpos (Coulter Beckman) adsorbida a una película de nitrocelulosa sobre un portaobjetos de microscopía de vidrio (Molecular Probes). Los procedimientos utilizados se describen en los Ejemplos 1 y 2, con la excepción de que se los anticuerpos se aplicaron en un volumen de 0,4 FL. A: células CCRF-CEM, B: células Raji.

La figura 6 es una representación fotográfica de células CCRF-CEM unidas a un punto de anticuerpos CD4 y marcadas con anticuerpo CD45 conjugado con Alexa-488.

La figura 7 es una representación de una matriz de anticuerpos sometida a ensayo con líneas celulares.

(a) clave tabulada para la posición de los puntos de anticuerpos en la matriz; (b) leucemia de células T CCRF-CEM, (c) linfoma de células B de Raji, (d) células mieloides NB4. Se suspendieron las células en PBS. MIgG1, mIgG2a, b mIgM son anticuerpos de isotipo de control. Los números indican anticuerpos contra la molécula CD relevante (por ejemplo, "2" indica antiCD2). GPA es la antiglucoforina A, un marcador presente sobre los glóbulos rojos en el ser humano, HLA-DR es antiHLA-DR clase II, KOR es un anticuerpo contra el antígeno KOR-SA3544 de granulocitos, FMC7 es un anticuerpo contra un marcador que distingue entre diversas leucemias de células B.

La figura 8 es una representación fotográfica de matrices de anticuerpos sometidas a ensayo utilizando leucocitos purificados a partir de sangre periférica, que muestra: (a) una clave para la posición de los puntos de anticuerpos en la matriz, (b) PBL RIC2 normales, (c) CLL, paciente KB (recuento WBC: 10 x 10^{9} células/ml), (d) CLL, paciente EH2 (recuento WBC: 30 x 10^{9} células/ml), (e) HCL, paciente RD, (f) AML, paciente GT, (g) linfoma de células B (BCL), paciente KR. Las células se unieron a matrices en PBS con EDTA y suero AB humano al 10% v/v. Todos los resultados son de muestras celulares congeladas.

La figura 9 es una representación gráfica que muestra la relación entre la densidad de células Raji y el número de células unidas a puntos de células con anticuerpos.

La figura 10 es una representación gráfica que muestra la relación entre la concentración de anticuerpos y el número de células Raji unidas a membranas con anticuerpos.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo, que comprende una matriz de moléculas capaz de interactuar con parejas de unión potencialmente presentes en una muestra que debe someterse a ensayo. En una forma de realización, la presencia o ausencia de interacción de las moléculas del ensayo con parejas de unión, o la interacción relativa entre moléculas del ensayo y parejas de unión proporciona una indicación de un estado normal o estado de enfermedad o trastorno en el animal, especie de ave o planta a partir del que se deriva la muestra. El dispositivo de ensayo también resulta útil para detectar cambios en poblaciones celulares no neoplásicas, tales como cambios en poblaciones de linfocitos, indicativos de, por ejemplo, trastornos no neoplásicos del sistema inmunológico. Este último aspecto comprende, por lo tanto, la utilización de un dispositivo de ensayo para detectar directa o indirectamente tipos celulares y patógenos, incluyendo parásitos, virus y microorganismo. En una forma de realización adicional, la muestra es una biblioteca química, una muestra medioambiental o una biblioteca de expresión fágica. El patrón de unión proporciona un indicador de la presencia, tipo y/o cantidad de una pareja de unión particular. Esto resulta particularmente útil en el cribado para contaminantes ambientales o el cribado de productos naturales o bibliotecas químicas para agentes que presentan afinidades particulares. También resulta importante para cribar bibliotecas de expresión fágica para péptidos que presentan afinidades o perfiles de unión particulares. La identificación de este tipo de moléculas resulta útil para desarrollar miméticos de péptidos.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo que comprende una matriz de moléculas, en la que cada molécula en la matriz, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con su pareja de unión respectiva, putativamente presente en una muestra biológica de un animal, especie de ave o planta, en la que el patrón de interacción entre las moléculas y las parejas de unión es indicativo de un estado normal o de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o trastorno.

El estado de enfermedad o trastorno es preferentemente en un animal, tal como un ser humano, primate, animal experimental de laboratorio (por ejemplo ratón, conejo, cobaya, hámster), animal de compañía (por ejemplo perro, gato) o animal salvaje en cautividad.

El animal preferente es el ser humano.

Sin embargo, la presente invención también se extiende a la detección de estados de enfermedad o trastornos en especies de aves y de plantas. Entre los ejemplos de especies de ave se incluyen aves de corral (por ejemplo pollos, patos, pavos, gansos), aves de caza (por ejemplo faisanes, patos salvajes, pavos reales) y aves no voladoras (por ejemplo emúes, avestruces). Entre los ejemplos de plantas se incluyen plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo plantas hortícolas, árboles frutales, plantas ornamentales y árboles de plantación. En la presente memoria la referencia a una "planta" incluye la referencia a parte de una planta, tal como hojas, flores, tallos y raíces.

Un tipo de enfermedad o trastorno aplicable a la detección es el cáncer en animales tales como seres humanos. El término "cáncer" se utiliza en su sentido más amplio e incluye leucemias benignas y malignas, sarcomas y carcinomas, así como otras neoplasias. Las neoplasias pueden ser malignas o benignas. Los cánceres y neoplasias comprendidos en la presente invención pueden ser simples (monoclonales, es decir compuestos de un único tipo celular neoplásico), mixtos (policlonales, es decir compuestos de más de un tipo celular neoplásico) o compuestos (es decir, compuestos de más de un tipo celular neoplásico y derivados de más de una capa germinal). Entre los ejemplos de cánceres simples comprendidos en la presente invención se incluyen tumores de origen mesenquimatoso (por ejemplo tumores del tejido conectivo, tejido endotelial, células sanguíneas, células musculares) y tumores de origen epitelial. Entre los cánceres particulares comprendidos en la presente invención están comprendidos de manera no limitativa fibrosarcoma, mixosarcoma, sarcoma de Ewing, leucemia granulocítica, carcinoma de células basales, cáncer de colon, cáncer gástrico y una diversidad de cánceres de piel. Todavía más particularmente, entre los cánceres contemplados por la presente invención se incluyen, aunque sin limitación, CML, leucemia mieloide crónica; AMML, leucemia mielomonocítica aguda; ALL, leucemia linfocítica aguda; AEL, leucemia eritrocítica aguda; AmegL, leucemia megacariocítica aguda; AMoL, leucemia monocítica aguda; AML, leucemia mieloide aguda; CLL, leucemia linfocítica crónica; NHL, leucemia no de Hodgkin; APL, leucemia promielocítica aguda, y HCL, leucemia de células pilosas.

La referencia a una condición "normal" incluye la presencia y/o cantidades de tipos celulares o antígenos particulares, incluyendo, por ejemplo, receptores, canales iónicos, moléculas de interacción célula-célula, moléculas de señalización que, basándose en el análisis estadístico, más probablemente puede esperarse en una población sustancialmente sana de individuos. Este aspecto de la presente invención resulta útil, por ejemplo, en el seguimiento de pacientes tras la terapia química o inmunológica, o el cribado para un estado de salud en un individuo de riesgo o grupo o población de individuos de riesgo. La referencia a determinar una condición "normal" incluye, por lo tanto, detectar un estado "anormal".

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo que comprende una matriz de moléculas, en la que cada molécula en el ensayo, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con su pareja de unión respectiva, putativamente presente en una muestra química, de biblioteca de expresión fágica o medioambiental, en la que el patrón de interacción entre las moléculas y las parejas de unión es indicativo de la presencia, tipo y/o cantidad de una pareja de unión particular en dicha muestra.

Una "muestra química" incluye una biblioteca química, tal como una biblioteca de moléculas sintéticas, moléculas biológicas o moléculas producidas por medios combinatoriales. La biblioteca química también puede sintetizarse utilizando tecnología de pines (por ejemplo Chiron). La referencia a una biblioteca química incluye una biblioteca de moléculas naturales para el cribado de productos naturales.

Una "muestra medioambiental" incluye una muestra de un ambiente acuático, aéreo o terrestre, así como muestras de plantas, microorganismos y coral. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, una muestra ambiental incluye una muestra para cribar productos naturales para la utilización, por ejemplo, como agentes farmacéuticos o diagnósticos. También incluye muestras tales como muestras de suelo, agua y aire que posiblemente contengan un contaminante.

La expresión "biblioteca de expresión fágica" se utiliza en su sentido más amplio e incluye dos o más partículas fágicas que presentan uno o más péptidos, polipéptidos o proteínas heterólogos sobre la cubierta fágica. Generalmente, sin embargo, cada fago produce un péptido, polipéptido o proteína particular fusionado con una proteína de cubierta o parte funcional de la misma. Las partículas fágicas se ponen en contacto con las moléculas inmovilizadas. En el caso de que una partícula fágica comprenda un péptido, polipéptido o proteína sobre su cubierta capaz de unirse a una molécula inmovilizada, el fago resulta inmovilizado. El fago inmovilizado se eluye a continuación y el material genético codificante del péptido, polipéptido o proteína se aísla y se clona. Éste es un método particularmente potente para aislar miméticos de péptido, polipéptido o proteína. Por ejemplo, pueden aislarse miméticos basándose en sus características de unión análogas.

En un ejemplo particular, si la molécula inmovilizada es un anticuerpo contra el ligando CD40, y un péptido, polipéptido o proteína en una biblioteca de expresión fágica o de otro tipo se une al anticuerpo, dicho péptido, polipéptido o proteína se convierte en una molécula candidata a actuar como activador de los linfocitos B o como un antagonista. De manera similar, la molécula inmovilizada puede ser un anticuerpo contra CD154 que presenta un nivel elevado en pacientes que sufren de lupus. Una rueda de identidad molecular que puede unirse a un anticuerpo CD154 o de un ligando de CD154 sería un candidato a antagonista de CD154 que resultaría útil en el tratamiento del lupus. Resulta aplicable un razonamiento similar para todas las demás bibliotecas, tales como las bibliotecas químicas o de producto naturales.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el diagnóstico de un estado normal o cáncer o una tendencia al desarrollo de cáncer en un animal, tal como un ser humano, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una matriz de moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, en el que cada molécula de la matriz, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja de unión respectiva en caso de encontrarse presentes en una muestra biológica de dicho animal, en la que el patrón de interacción entre las moléculas inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas es indicativo de la presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

Otro tipo de estado o trastorno contemplado para la detección incluye los trastornos no neoplásicos. En la presente memoria se considera que entre los trastornos no neoplásicos se incluye cualquier trastorno o enfermedad no caracterizado por la proliferación celular descontrolada, e incluye los trastornos no neoplásicos del sistema inmunológico. Entre dichos trastornos se incluyen enfermedades autoinmunológicas, incluyendo la diabetes de tipo 1, la esclerosis múltiple, la soriasis, la artritis reumatoide, el escleroderma y el lupus sistémico eritematoso. Estos trastornos están causados por subgrupos de células T que pueden expresar CD4 y/o por la producción de anticuerpos contra autoantígenos por parte de subgrupos de células B que pueden expresar CD19. Por ejemplo, las anormalidades de las poblaciones de linfocitos, tales como una reducción de los linfocitos T CD4+ y CD45+, y un incremento de los linfocitos T CD8+ y CD57+, son características de los pacientes que presentan lupus sistémico eritematoso.

Entre otros trastornos no neoplásicos se incluyen la inmunodeficiencia congénita en niños que resulta en infecciones recurrentes. El inmunofenotipado mediante citometría de flujo se utiliza para detectar deficiencias de subgrupos linfocitarios. El síndrome de la inmunodeficiencia combinada severa (SCIDS) está causado por una deficiencia del enzima adenosina desaminasa, con niveles muy bajos de linfocitos de sangre periférica, tales como células T (CD3) y B (CD19) y células asesinas naturales (CD16). Una deficiencia de nucleósido purina fosforilasa resulta en una deficiencia de células B. La matriz de anticuerpos de la presente invención proporciona información definitiva sobre los subgrupos de linfocitos que son deficientes. Lo expuesto anteriormente facilita el diagnóstico de la afección.

La presente matriz de anticuerpos también resulta útil para el cribado de infecciones por agentes patogénicos, tales como virus, bacterias y parásitos, incluyendo parásitos palúdicos. Por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) infecta principalmente a los linfocitos CD4+ debido a que la proteína gp120 del VIH se une a CD4. Durante el curso del desarrollo del SIDA, se produce un agotamiento de los linfocitos CD4+. Sin embargo, muchos otros tipos celulares resultan infectados por VIH, incluyendo macrófagos, linfocitos B y células microgliales. En la actualidad, se realizan seguimientos de la población de linfocitos CD4 en pacientes con VIH, aunque el inmunofenotipado debería encontrarse más generalizado, según recomienda el Centre for Disease Control (CDC, Atlanta, USA). Los ensayos de doble marcaje siguientes se realizan actualmente mediante citometría de flujo: controles negativos, CD45/CD14, CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD19, CD3/CD16, CD3/CD56 y CD4/CD8. Este procedimiento laborioso puede sustituirse, de acuerdo con la presente invención, por un procedimiento de una única etapa utilizando una matriz que contenga anticuerpos contra dichos antígenos CD y antígenos adicionales que definen adicionalmente los subgrupos de linfocitos afectados. Al resultar un paciente infectado por VIH, se produce una rápida reducción de los linfocitos CD4+ hasta un valor mínimo aproximadamente a los 6 meses, seguido de una recuperación parcial de sus niveles alcanzadas las 12 semanas. A largo plazo, se produce una reducción progresiva de los linfocitos CD4+, conduciendo a la muerte tras aproximadamente 11 años (Shinton 1998). El tratamiento con zidovudina (AZT) induce un incremento transitorio de los linfocitos CD4+; se propone determinar los efectos de la quimioterapia sobre diversos subgrupos de linfocitos, de acuerdo con la presente invención, utilizando una matriz de anticuerpos para realizar un seguimiento de la evolución clínica de los pacientes de VIH.

El inmunofenotipado también resulta útil para el trasplante de médula ósea y de órganos para la determinación del grado de inmunosupresión y complicaciones tales como el rechazo o la infección. Se utiliza la citometría de flujo antes del trasplante para el tipado de tejidos utilizando anticuerpos monoclonales para detectar antígenos de HLA, o para ensayos cruzados. La tolerancia a tejidos trasplantados resulta inducida por la administración de ciclosporina en el paciente. El tratamiento en el momento del trasplante fuerza el nivel de linfocitos sanguíneos periféricos hasta prácticamente cero. Se realiza un seguimiento de la desaparición de las células T de la sangre mediante citometría de flujo para las células CD3+. Tras el trasplante, un incremento de las células CD8+ señala a un posible rechazo. Los incrementos de las células CD8+ y CD16+, CD56+ y/o CD57+ podrían indicar infección vírica. Esta vigilancia del estado inmunológico del paciente de trasplante se propone que se realice de manera más rápida y extensiva utilizando una matriz de anticuerpos de la presente invención.

Algunos pacientes de cáncer reciben quimioterapia de dosis elevada y después requieren un trasplante de médula ósea para regenerar su sistema inmunológico destruido. La médula trasplantada induce la reconstitución hematopoyética, aunque aparecen conjuntos no habituales de linfocitos, tales como células T CD5+. Pueden producirse infecciones oportunistas y enfermedad de injerto contra huésped en dichos pacientes, resultando en un incremento de las células CD8+ y en una elevación de las células asesinas naturales. La sustitución de la citometría de flujo por una matriz de anticuerpos para los antígenos CD simplifica el seguimiento de los pacientes y proporciona información más exhaustiva.

Las matrices de anticuerpos para antígenos CD también resultan útiles para el seguimiento de los cambios de los subgrupos de linfocitos durante la terapia de desensibilización al veneno de insectos o de arañas, por ejemplo en el caso de que el número de linfocitos CD4+ CD45RA se incremente y el número de linfocitos CD4+ CD45RO+ se reduzca desde niveles elevados.

Los pacientes con síndrome de fatiga crónica pueden presentar anormalidades inmunológicas que concuerdan con una infección vírica por linfocitos CD8+ activados. Un análisis detallado de los subgrupos de linfocitos establece criterios diagnósticos ampliados y proporciona información exhaustiva sobre este trastorno.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el diagnóstico de un trastorno no neoplásico o de una tendencia al desarrollo de un trastorno no neoplásico en un animal, tal como un ser humano, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una matriz de moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, en el que cada molécula del ensayo, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja de unión respectiva en el caso de encontrarse presentes en una muestra biológica procedente de dicho animal, en la que el patrón de interacción entre las moléculas inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas es indicativo de la presencia de una trastorno no neoplásico o de una tendencia a desarrollar un trastorno no neoplásico.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para la detección de un tipo celular o agente microbiano o vírico o de un patógeno, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una matriz de molécula inmovilizadas en un soporte sólido, en la que cada molécula de la matriz, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja de unión respectiva en caso de encontrarse presente sobre dicho tipo celular, agente microbiano, vírico o parasitario o patógeno, en la que el patrón de interacción entre las moléculas inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas es indicativo de la presencia de dicho tipo celular, agente microbiano, vírico o parasitario o patógeno.

En otra forma de realización, la muestra cribada es una biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o muestra medioambiental. El patrón de interacción proporciona la presencia, tipo y/o cantidad de pareja de unión. Este aspecto de la presente invención resulta particularmente útil para el cribado de contaminantes ambientales o el cribado de una biblioteca química o biológica de moléculas para una molécula que presente una afinidad, perfil de unión, perfil inmunológico y/o concentración particulares. Una biblioteca química o biológica incluye una biblioteca de expresión fágica u otra forma de biblioteca. Una biblioteca química puede ser sintética o natural.

La expresión "patrón de interacción" se utiliza en su contexto más amplio para que incluya: la presencia o ausencia de interacción respecto a la interacción de fondo, la densidad relativa de interacción, tal como la densidad relativa de células unidas a un punto discreto de la matriz respecto al fondo, el patrón de morfología de las células que se encuentran unidas a un punto discreto de la matriz, la presencia o ausencia de moléculas internas en células lisadas en un punto discreto de la matriz, el número relativo de células o antígenos en la matriz, la expresión diferencial de antígenos particulares y el número de antígenos por célula. Cualquiera o la totalidad de los criterios anteriores puede utilizarse para evaluar la interacción entre una molécula inmovilizada y su pareja de unión. El patrón de expresión también puede someterse a cuantificación.

El soporte sólido típicamente es vidrio o un polímero, tal como, aunque sin limitación, celulosa, material cerámico, nitrocelulosa, poliacrilamida, nilón, poliestireno y sus derivados, difluoruro de polivinilideno (PVDF), metacrilato y sus derivados, cloruro de polivinilo o polipropileno. La nitrocelulosa resulta particularmente útil y preferida según la presente invención. Un soporte sólido también puede ser un híbrido, tal como una película de nitrocelulosa soportada sobre una matriz de vidrio o polímero. La referencia a un "híbrido" incluye la referencia a una disposición en capas de dos o más de las superficies de vidrio o polímero indicadas anteriormente. El soporte sólido puede presentar la forma de una membrana o de tubos, perlas, discos o microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para llevar a cabo un ensayo. Los procedimientos de unión para inmovilizar las moléculas son bien conocidos de la técnica y generalmente consisten en unir covalentemente (por ejemplo reticular) o adsorber físicamente las moléculas a un sustrato sólido.

La molécula inmovilizada en el soporte sólido se denomina en la presente memoria "P". La molécula P generalmente se selecciona de un grupo de unión denominado "x". Se puede seleccionar un número de n de moléculas P de cada grupo de unión o puede seleccionarse una molécula P de cada grupo de unión. Las moléculas P pueden disponerse en cualquier forma geométrica sobre el soporte sólido, tal como una mancha, punto, o grupo de puntos o manchas, o en un formato extendido o en capas. Generalmente, el formato de mancha o punto resulta preferente. Los grupos de unión se seleccionan basándose en el estado normal o de enfermedad o trastorno que se diagnostica o la pareja de unión que se busca detectar o cuantificar. En el caso del cáncer, por ejemplo, puede determinarse un cáncer particular o el desarrollo del cáncer en general basándose en la expresión de determinados ligandos (y más particularmente antígenos) de superficie celular, o la liberación de ligandos solubles (por ejemplo antígenos solubles). Las moléculas P se seleccionan a continuación como parejas de unión a la superficie celular, o como ligandos solubles. El patrón de interacción entre las moléculas P y sus parejas de unión respectivas es indicativo del desarrollo, o de la tendencia a desarrollar, de cáncer o de otros estados de enfermedad o trastornos. En el caso de la detección de un agente microbiano, vírico o parasitario, o de un patógeno, las moléculas P generalmente se seleccionan como parejas de unión a las moléculas de superficie celular, tales como azúcares, proteínas, lipoproteínas, flagelos, pili, receptores o componentes de pared celular. En el caso de un biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o muestra medioambiental, las moléculas P generalmente, aunque no necesariamente, se seleccionan basándose en una estructura o afinidad supuesta en la muestra. En el caso de una biblioteca de expresión fágica, por ejemplo, el ensayo busca un péptido, polipéptido o proteína sobre el fago que se une a una molécula inmovilizada, que de esta manera se convierte en un mimético de afinidad. Dichas moléculas se convierten entonces en candidatos para análogos adicionales en forma de potenciales miméticos de proteína.

La matriz también puede comprender un control positivo y/o negativo para ayudar a mantener el control de calidad del procedimiento de ensayo. Un control positivo, por ejemplo, puede ser una molécula P capaz de interactuar con una pareja de unión que es conocido que se encuentra presente en la muestra biológica o química.

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en la que:

n_{1}, n_{2}, ..., n_{i} representan diferentes elementos del grupo de unión,

x_{1}, x_{2}, ..., x_{j} representan diferentes grupos de unión,

b, c y d representan el número de diferentes elementos de los grupos de unión x_{1}, x_{2}, ..., x_{j}, respectivamente, y en la que b, c y d pueden ser iguales o diferentes, y cada uno presenta un valor entre aproximadamente 0 y aproximadamente 100, con la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,

z es el número total de grupos de moléculas en la matriz y es un número entre aproximadamente 2 y aproximadamente 2.000,

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Preferentemente, el estado de enfermedad o trastorno es cáncer.

Preferentemente, las moléculas en la matriz se encuentran dispuestas en manchas discretas. z es el número de manchas discretas de diferentes tipos de molécula. Convenientemente, las manchas se disponen por duplicado, por lo tanto el número total de manchas en la matriz es 2z. La representación "..." se refiere a opcionalmente elementos adicionales en el grupo entre, por ejemplo,

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La representación de la matriz mediante la fórmula no pretende implicar ninguna limitación respecto a la forma o secuencia de la matriz.

Las moléculas P son inmunoglobulinas y sus parejas de unión son antígenos. Sin embargo, también se dan a conocer en la presente memoria otras clases de moléculas P, tales como, aunque sin limitación, receptores, ligandos de receptores, moléculas ligantes de antígeno derivadas de células T (TABM) u otras moléculas que presentan afinidad para determinados ligandos, tales como lectinas, proteínas ligantes de ácidos nucleicos, entre otras. Más preferentemente, la molécula P es una inmunoglobulina capaz de interactuar con un antígeno presente, por ejemplo, sobre la superficie de una célula normal o cancerosa, o un antígeno soluble liberado por una célula normal o cancerosa, o presente en una biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o muestra medioambiental.

La matriz de moléculas P, y más particularmente las moléculas de inmunoglobulina, se seleccionan basándose en los antígenos que probablemente se expresarán durante un estado de enfermedad o trastorno, tal como cáncer, o un antígeno generalmente presente sobre una célula normal, o un antígeno presente en un agente microbiano, vírico o parasitario, o patógeno. El "antígeno" también puede ser una parte de una biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o puede encontrarse en una muestra medioambiental. El término "antígeno" se utiliza en su sentido más amplio e incluye las proteínas asociadas a la membrana plasmática con dominios extracelulares, proteínas asociadas a canales iónicos, así como receptores, grupos carbohidrato y similares. El patrón de unión de las moléculas de inmunoglobulina a antígenos diana ayuda, de esta manera, en el diagnóstico del estado de enfermedad o en la determinación de un estado normal. La matriz más preferentemente comprende además controles internos positivo y negativo.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, y en el que los antígenos se expresan sobre la superficie de células normales o cancerosas o resultan liberados por células normales o cancerosas, en la que el patrón de unión de las inmunoglobulinas inmovilizadas a sus antígenos respectivos es indicativo de la presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer, o de la presencia de un estado normal.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para un trastorno no neoplásico, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos y en el que los antígenos se expresan sobre la superficie de células no neoplásicas o resultan liberados por células no neoplásicas, en la que el patrón de unión de las inmunoglobulinas inmovilizadas a sus antígenos respectivos es indicativo de la presencia de un trastorno no neoplásico o de una tendencia a desarrollar un trastorno no neoplásico.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para un agente microbiano, vírico u otro agente patógeno, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, y en la que los antígenos se expresan sobre la superficie de dicho agente microbiano, vírico o parasitario, o patógeno, o resultan liberados por los mismos, y el patrón de unión de los antígenos a las inmunoglobulinas inmovilizadas es indicativo de la presencia o ausencia de dicho microbio, virus, parásito o patógeno.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para una pareja de unión en una biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o muestra medioambiental, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, en la que el patrón de unión de los antígenos a las inmunoglobulinas inmovilizadas es indicativo de la presencia, tipo y/o cantidad de dicha pareja de unión.

Generalmente, se selecciona un abanico de inmunoglobulinas basándose en los antígenos expresados sobre células normales, células cancerosas, células cancerosas potenciales, microbios, virus, parásitos u otros patógenos, células infectadas o afectadas por un patógeno, o antígenos encontrados en una biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o muestra medioambiental. Cada grupo de inmunoglobulinas específicas para un antígeno diferente se define como x_{1}, x_{2}, ..., x_{j}. En una forma de realización, una muestra contiene una población mixta de células y las moléculas de inmunoglobulina en la matriz están diseñadas para unirse selectivamente a antígenos sobre tipos celulares particulares. En otra forma de realización, la muestra es una mezcla de moléculas químicas, incluyendo compuestos sintéticos (por ejemplo alcanos, alquenos, aromáticos, polímeros, moléculas cíclicas), oligosacáridos, proteínas, lípidos, lipoproteínas y carbohidratos. Las inmunoglobulinas también pueden reconocer específicamente diferentes epítopos en el mismo antígeno. Una mancha discreta de anticuerpos puede comprender inmunoglobulinas con una única especificidad epitópica o las inmunoglobulinas pueden ser un grupo heterogéneo de múltiples epítopos sobre el mismo antígeno. Una mancha discreta de anticuerpos también puede contener múltiples anticuerpos contra diferentes antígenos aunque se expresen todos, por ejemplo, sobre una célula particular. Lo expuesto anteriormente resulta útil en el caso de que se importe la captura de la célula para el análisis posterior.

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Dentro de cada uno de los grupos x_{1}, x_{2}, ..., x_{j}, pueden encontrarse varios subgrupos de inmunoglobulinas que son específicas para diferentes partes del mismo antígeno definidas por los grupos x_{1}, x_{2}, ..., x_{j}. Dichos subgrupos se definen como n_{1}, n_{2}, ..., n_{j}.

Se da a conocer en la presente memoria una matriz de inmunoglobulinas o derivados, o equivalentes químicos de los mismos, específicos para antígenos expresados sobre células normales o cancerosas o liberados por células normales o cancerosas o expresados sobre microbios, virus, parásitos o patógenos, o antígenos putativamente presentes en una biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o muestra medioambiental, en la que cada grupo de inmunoglobulinas específicas para cada antígeno o parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:

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en la que:

q es una inmunoglobulina específica para un antígeno expresado sobre una célula normal o cancerosa, o para un antígeno liberado por una célula normal o cancerosa, o expresado sobre microbios, virus, parásitos o patógenos, o antígenos putativamente presentes en una biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o muestra medioam-
biental,

e, f y g representan los números de diferentes inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2}, ..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser iguales o diferentes y cada uno presenta un valor entre 0 y 100,

y es el número total de grupos de inmunoglobulinas en la matriz y presenta un valor entre aproximadamente 2 y aproximadamente 2.000,

en la que el patrón de interacción entre las inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos es indicativo de un estado normal o del desarrollo de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer, o de la presencia de un microbio, virus, parásito o patógeno, o de la presencia, tipo y/o cantidad de una pareja de unión en dicha muestra química o medioambiental.

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Tal como se ha indicado anteriormente, la matriz también puede contener un control positivo y/o negativo. Generalmente, las inmunoglobulinas se disponen en manchas discretas, en donde y es el número total de manchas discretas de diferentes tipos de inmunoglobulina. Preferentemente, las manchas se disponen por duplicado. La representación "..." es tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria.

Las inmunoglobulinas interactúan con antígenos de grupo de diferenciación o de denominación de grupo (CD) o antígenos mieloides (MY) o linfoides (LY) expresados sobre las células leucémicas. El cáncer o la tendencia a desarrollar cáncer se detecta a partir de un incremento de la población o proporción de células que portan antígenos particulares.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de denominación de grupo y/o antígenos mieloides y/o linfoides expresados sobre células leucémicas, en las que el patrón de unión de las inmunoglobulinas inmovilizadas a sus antígenos respectivos es indicativo de la presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

Preferentemente, las inmunoglobulinas son anticuerpos monoclonales, aunque la presente invención se extiende a los anticuerpos policlonales o partes ligantes de antígeno (por ejemplo fragmentos Fab), derivados, homólogos o análogos de los mismos, así como a los anticuerpos de fusión o híbridos, anticuerpos sintéticos o anticuerpos recombinantes.

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Se da a conocer en la presente memoria una matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de los mismos, específicos para antígenos expresados sobre células no neoplásicas, o liberados por células no neoplásicas, o expresados sobre células microbianas o parasitarias, o patógenos, o sobre virus, en las que cada grupo de inmunoglobulinas específicas para cada antígeno o parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:

11

en la que:

q es una inmunoglobulina específica para el antígeno,

m_{1}, m_{2}, ..., m_{i} representan miembros del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a diferentes partes del mismo antígeno,

o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan diferentes grupos de inmunoglobulinas definidas por la especificidad para diferentes antígenos.

e, f y g representan los números de diferentes inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2}, ..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser iguales o diferentes y cada uno presenta un valor entre 0 y 100, con la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,

y es el número de grupos de inmunoglobulinas en la matriz y presenta un valor entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2.000,

en la que el patrón de interacción entre las inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos es indicativo del desarrollo de un trastorno no neoplásico o de una tendencia a desarrollar un trastorno no neoplásico o de la presencia de un microbio, parásito, patógeno o virus particular.

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La detección de la unión antígeno-inmunoglobulina puede llevarse a cabo de varias maneras. Por ejemplo, en el caso de que los antígenos sean antígenos de superficie celular, la matriz puede diseñarse para permitir la unión de las células a las inmunoglobulinas inmovilizadas. Las células capturas seguidamente pueden analizarse mediante microscopía, utilizando diversas tinciones, bioquímicamente o inmunológicamente.

Alternativamente, las inmunoglobulinas inmovilizadas actúan a modo de moléculas de captura para tipos celulares particulares y la expresión de otros antígenos sobre células normales o cancerosas se determina seguidamente utilizando anticuerpos marcados (por ejemplo anticuerpos marcados fluorescentemente o radioactivamente) o mediante otros medios convenientes. Preferentemente, los anticuerpos se encuentran libres en solución. Las moléculas de captura también puede ser para antígenos solubles o para células desprendidas de tumores sólidos. En relación a este último caso, convenientemente se producen suspensiones celulares a partir de biopsias de tumor sólido y las suspensiones celulares se ponen en contacto con la matriz de inmunoglobulinas.

En el caso de que la matriz de inmunoglobulinas inmovilizadas se haya diseñado para unirse a antígeno libre (es decir, antígeno soluble), el antígeno captura puede detectarse inmunológicamente o por otros medios.

El dispositivo de ensayo de la presente invención preferentemente es un soporte sólido que presenta una superficie plana lisa. Entre los ejemplos de soporte sólidos adecuados se incluyen membranas, cubreobjetos de plástico, portaobjetos de vidrio o los pocillos de placas de microtitulación. Resulta particularmente preferida la nitrocelulosa. El soporte sólido comprende una matriz de regiones recubiertas de inmunoglobulina, preferentemente en forma de manchas u otro patrón geométrico. Las manchas son discretas y se encuentran circundadas por regiones que no contienen ninguna molécula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas dentro de una región dada o mancha generalmente se inmovilizan mediante enlaces covalentes o no covalentes. Las inmunoglobulinas preferentes son los anticuerpos monoclonales.

Preferentemente, las manchas de la matriz se disponen en una secuencia, tal como una matriz rectangular, triangular o esférica, en la que la posición de una región de inmunoglobulina está definida por coordenadas de, por ejemplo, fila y columna. La matriz de inmunoglobulinas puede cubrir cualquier región conveniente, tal como entre aproximadamente 0,1 mm^{2} y aproximadamente 100 mm^{2}, preferentemente entre aproximadamente 0,5 mm^{2} y aproximadamente 15 mm^{2}. Generalmente, cada región o mancha está formada de inmunoglobulinas que presentan una única especificidad diferenciada. La especificidad en el presente contexto se refiere a diferentes antígenos o a diferentes regiones de un solo antígeno. El número preferido de manchas de inmunoglobulina es de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 1.000, y más preferentemente de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 1.000. Más preferentemente, las inmunoglobulinas se disponen en múltiples, tal como por duplicado, por triplicado o superior.

La matriz inmovilizada de inmunoglobulinas se pone a continuación en contacto con una muestra biológica que comprende células, residuos celulares, extractos celulares, líquido tisular, suero, sangre, líquido cerebroespinal, orina, líquido linfático, aspirado, aspirado de médula ósea, moco u otro tejido o líquido corporal. Alternativamente, la muestra es una muestra química o una muestra medioambiental, tal como una biblioteca química, muestra acuática o muestra terrestre. Preferentemente, la muestra contiene una población mixta de células. El contacto se lleva a cabo durante un periodo de tiempo y bajo condiciones suficientes para que las células que portan antígenos particulares resulten capturadas por las inmunoglobulinas inmovilizadas o para que los antígenos libres resulten capturados por las inmunoglobulinas inmovilizadas. Las células y antígenos capturados seguidamente pueden detectarse mediante cualquier medio conveniente, tal como bioquímicamente, histoquímicamente, inmunológicamente o microscópicamente. La detección inmunológica resulta particularmente conveniente. Por ejemplo, puede añadirse una segunda inmunoglobulina específica para un antígeno o célula capturada, marcada con una molécula informadora. La identificación de la molécula informadora indica que el antígeno ha sido capturado. Alternativamente, tras la adición de la segunda inmunoglobulina, ésta forma un complejo con el antígeno capturado, se añade una inmunoglobulina antiinmunoglobulina marcada con una molécula informadora y se determina la presencia de una señal procedente de la molécula informadora.

La expresión "molécula informadora", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula que, debido a su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable que permite la detección de antígeno unido a inmunoglobulina. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa. Las moléculas informadas utilizadas más comúnmente en este tipo de ensayo son enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radionucleidos (es decir, isótopos radioactivos). En el caso de un inmunoensayo enzimático, se conjuga un enzima con la segunda o tercera inmunoglobulina, generalmente por medio de glutaraldehído o peryodato. Sin embargo, tal como se reconocerá fácilmente, existe una amplia diversidad de diferentes técnicas de conjugación que se encuentran fácilmente disponibles para el experto en la materia. Entre los enzimas utilizados comúnmente se utilizan peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, \beta-galactosidasa y alcalina fosfatasa, entre otros. Los sustratos que se utilizarán con enzimas específicos generalmente se seleccionan para la producción, tras la hidrólisis por el enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. También resulta posible utilizar sustratos fluorogénicos que proporcionan un producto
fluorescente.

Alternativamente, pueden acoplarse químicamente compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, a inmunoglobulinas sin alterar su capacidad de unión. Al resultar activadas por la iluminación con luz de una longitud de onda particular, la inmunoglobulina marcada con fluorocromo absorbe la energía lumínica, induciendo un estado de excitabilidad de la molécula, seguido de la emisión de luz de un color característico visualmente detectable microscópicamente o utilizando otros dispositivos de obtención de imágenes, tales como un microscopio confocal o un escáner láser bidimensional (por ejemplo FluorImager o Typhoon, Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale,
USA).

La presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer, o la presencia de un estado de enfermedad no cáncer puede indicarse por un cambio de un número o proporción particular de células que portan antígenos particulares. Por ejemplo, un incremento de determinados tipos celulares será indicativo de condiciones particulares.

Se da a conocer en la presente memoria un método para determinar la presencia de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o trastorno, tal como, aunque sin limitación, cáncer en un animal, especie de ave o planta, comprendiendo dicho método obtener una muestra biológica de dicho animal, especie de ave o planta, que comprende parejas de unión libres o parejas de unión unidas a una superficie celular, estando dichas parejas de unión asociadas directa o indirectamente a dicho estado de enfermedad o trastorno, y la puesta en contacto de dicha muestra biológica con un soporte sólido que comprende una matriz de moléculas capaces de unirse a dichas parejas de unión, en la que el patrón de interacción con las parejas de unión resulta indicativo del estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de enfermedad o
trastorno.

Preferentemente, las parejas de unión comprenden dos o más antígenos diferentes asociados al estado de enfermedad o trastorno, y la matriz de moléculas es una matriz de inmunoglobulinas que presentan especificidad para los diferentes grupos de antígenos.

El patrón de interacción puede determinarse mediante cualquier medio convencional, tal como mediante inmunoensayo, examen microscopio o técnicas histológicas o bioquímicas. El patrón de interacción también puede determinarse mediante impulso eléctrico, emisiones electrónicas y/o emisiones radioactivas.

Se da a conocer en la presente memoria un método para detectar cáncer o una tendencia a desarrollar cáncer en un ser humano o animal no humano, comprendiendo dicho método la obtención de una muestra biológica de dicho ser humano o animal no humano y poner en contacto dicha muestra biológica con una matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de los mismos específicos para antígenos expresados sobre células normales o cancerosas o liberados por células normales o cancerosas, en la que cada grupo de inmunoglobulinas específicas para cada antígeno o parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:

12

en la que:

e, f y g representan los números de diferentes inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2}, ..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g puede ser iguales o diferentes y cada uno presenta un valor entre 0 y 100, con la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,

y es el número total de grupos de inmunoglobulinas en la matriz y presenta un valor de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 2.000,

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Se da a conocer en la presente memoria una matriz de moléculas capaces de interactuar con una pareja de unión respectiva putativamente en una muestra biológica, para determinar la presencia de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o trastorno.

Preferentemente las moléculas son inmunoglobulinas.

Preferentemente, las inmunoglobulinas son específicas para todos los antígenos unidos o solubles, tales como antígenos sobre células cancerosas o liberados por las mismas.

En una forma de realización particularmente preferida, el patrón de interacción se mide cualitativa o cuantitativamente como patrón de densidad de las células unidas a las moléculas en la matriz o de antígenos libres de las células, que se han unido a las moléculas de la matriz. El patrón de densidad puede determinarse, por ejemplo, macroscópica o microscópicamente, o puede obtenerse con la ayuda de inteligencia artificial, tal como mediante la utilización de un densitómetro guiado por ordenador. Además, la presente invención comprende la cuantificación del patrón de unión. Entre los aspectos computacionales de las matrices de anticuerpos se incluyen, por ejemplo, el número de células, los patrones de unión de antígenos o de células, las densidades de células unidas por mancha, o el numero de antígenos por célula.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo que comprende una matriz de moléculas en la que cada molécula en la matriz, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con su pareja de unión respectiva, putativamente presente en una muestra biológica de un animal, especie de ave o planta, en la que las moléculas se encuentran dispuestas en dicha matriz de manera que, al interactuar las moléculas y las parejas de unión, un patrón diferencial de densidad proporciona una señal identificable que es indicativo de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o trastorno.

Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el diagnóstico del cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer, en un animal, tal como un ser humano, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una matriz de moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, en la que cada molécula en la matriz, con la excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja de unión respectiva en el caso de encontrarse presente en una muestra biológica de dicho animal, en la que las moléculas se encuentran dispuestas en dicha matriz de manera que, al interactuar las moléculas inmovilizadas con sus parejas de unión respectivas, un patrón diferencial de densidad proporciona una señal identificable que es indicativo de la presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar
cáncer.

Preferentemente, las moléculas inmovilizadas son inmunoglobulinas y las parejas de unión son antígenos unidos a células, antígenos celulares internos o antígenos solubles (es decir, libres).

En una forma de realización particularmente preferida, las inmunoglobulinas se disponen en una matriz de manera que, en el caso de que se encuentre presente un cáncer para el que se cribe, el patrón de interacción proporciona una densidad diferencial que proporciona una forma identificable, tal como una letra, número o diseño geométrico que puede detectarse fácilmente.

Por ejemplo, los antígenos que probablemente se expresan durante la leucemia mieloide aguda (AML) pueden disponerse de manera que la letra "A" se muestra preferentemente en forma de puntos más densos respecto al fondo. La letra "A" se utiliza meramente con fines de ejemplificación, debido a que puede utilizarse cualquier forma o disposición geométricas.

Se da a conocer en la presente memoria una matriz de moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:

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en la que:

P es un miembro de un grupo de unión capaz de interactuar con una pareja de unión,

n_{1}, n_{2}, ..., n_{i} representan diferentes miembros del grupo de unión,

x_{1}, x_{2}, ..., x_{j} representan diferentes grupos de unión,

b, c y d representan el número de diferentes elementos de los grupos de unión x_{1}, x_{2}, ..., x_{j}, respectivamente, y en los que b, c y d pueden ser iguales o diferentes y cada uno presenta un valor entre aproximadamente 0 y aproximadamente 100, con la condición de que por lo menos uno de entre b, c o d no sea 0,

z es el número total de grupos moléculas en la matriz y es un número entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2.000,

en la que las moléculas se encuentran dispuestas en dicha matriz de manera que al interactuar las moléculas inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas, un patrón diferencial de densidades dentro de un grupo de unión proporciona una señal identificable que es indicativa de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de enfermedad o trastorno.

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Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, y en la que los antígenos se expresan sobre la superficie de células normales o cancerosas o resultan liberados por células normales o cancerosas, en las que las inmunoglobulinas ligantes se encuentran en una disposición en dicha matriz en la que el patrón de inmunoglobulinas inmovilizadas con sus antígenos respectivos proporciona un patrón diferencial de densidad que presenta la forma de una señal identificable que es indicativa de la presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

Se da a conocer en la presente memoria una matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de los mismos, específicos para antígenos expresados sobre células normales o cancerosas, o liberados por células normales o cancerosas, en las que cada grupo de inmunoglobulinas específicas para cada antígeno o parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:

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en la que:

e, f y g representan los números de diferentes inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2}, ..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser iguales o diferentes, y cada uno presenta un valor de entre 0 y 100, con la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,

en la que las moléculas se encuentran dispuestas en dicha matriz de manera que, al interactuar las inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de densidad proporciona una señal identificable que es indicativa del desarrollo de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

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Se da a conocer en la presente memoria un dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizados en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos linfoides (LY) y/o mieloides (MY) expresados sobre células leucémicas, en las que las moléculas se encuentran dispuestas en dicha matriz de manera que, al unirse las inmunoglobulinas inmovilizadas a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de densidad proporciona una señal identificable que es indicativa de la presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.

Se da a conocer en la presente memoria un método para determinar la presencia de un estado de enfermedad o trastorno, o una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o trastorno, tal como, aunque sin limitación, cáncer en un animal, especie de ave o planta, comprendiendo dicho método la obtención de una muestra biológica de dicho animal, especie de ave o planta, que comprende parejas de unión libres o parejas de unión unidas a una superficie celular, encontrándose dichas parejas de unión asociadas directa o indirectamente a dicho estado de enfermedad o trastorno, y la puesta en contacto de dicha muestra biológica con un soporte sólido que comprende una matriz de moléculas capaces de unirse a dichas parejas de unión, en la que las moléculas se encuentran dispuestas en dicha matriz de manera que, al interactuar las parejas de unión, un patrón diferencial de densidad proporciona una señal identificable que es indicativa del estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de enfermedad o trastorno.

Se da a conocer en la presente memoria un método para tratar el cáncer en un ser humano o animal no humano, comprendiendo dicho método la obtención de una muestra biológica de dicho ser humano o animal no humano y la puesta en contacto de dicha muestra con una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, y en las que los antígenos se expresan sobre la superficie de células normales o cancerosas o resultan liberados por células normales o cancerosas, y la determinación del patrón de unión de las inmunoglobulinas inmovilizadas a sus antígenos respectivos, y después llevar a cabo la inmunoterapia utilizando los anticuerpos contra los antígenos expresados. Estos anticuerpos preferentemente son anticuerpos monoclonales humanizados. También puede utilizarse un método similar para tratar las condiciones no neoplásicas.

El dispositivo de ensayo y los métodos para llevar a cabo los ensayos de la presente invención se adaptan con facilidad para la automatización. Por ejemplo, pueden utilizarse sistemas robóticos para administrar cantidades apropiadas, incluyendo volúmenes de nanolitros de inmunoglobulinas, a un soporte sólido, tal como una película de nitrocelulosa o una placa de microtitulación. Tras el tratamiento apropiado, las inmunoglobulinas inmovilizadas seguidamente pueden utilizarse en cualquier ensayo. Nuevamente, éste puede automatizarse o llevarse acabo utilizando sistemas robóticos.

Se da a conocer en la presente memoria la utilización de una matriz de anticuerpos tal como se describe en la presente memoria en la fabricación de un dispositivo de ensayo para la detección de un estado de enfermedad o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad, o para la detección de un microbio, virus, parásito o patógeno o para el cribado de una biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o muestra medioambiental.

La matriz de la presente invención también puede adaptarse para la utilización en un microchip. La tecnología de microchips permite la generación de miles de patrones de anticuerpos para un rango de condiciones y permite además la automatización y/o el análisis por ordenador. Un "microchip" incluye un soporte de matriz que comprende una serie organizada de moléculas adaptadoras, ligandos o parejas de unión potenciales.

Se da a conocer en la presente memoria un método de tratamiento que comprende identificar un antígeno utilizando una matriz de anticuerpos que es específica de una célula enfermedad o que es específica de un estado de enfermedad, o que actúa como mimético de una proteína, preparar un anticuerpo contra dicho antígeno o un agente citotóxico específico para dicho antígeno, y después administrar dicho anticuerpo o agente citotóxico durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para llevar a cabo dicho tratamiento.

En una forma de realización, el anticuerpo es una forma humanizada de un anticuerpo no derivado del ser humano. En otra forma de realización, el antígeno humano o humanizado se conjuga con una molécula citotóxica. Se describen en la presente memoria composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo, agente citotóxico o mimético de proteína. Dicha composición también puede contener uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

A título de ejemplo únicamente, a continuación se describe la presente invención haciendo referencia a una forma de realización particular, es decir la utilización de una matriz para detectar antígenos CD. La descripción siguiente de ningún modo pretende limitar la presente invención a una forma de realización particular.

La matriz de anticuerpos del presente aspecto de la presente invención permite la detección rápida y simultánea de la expresión de antígenos CD sobre la superficie de leucocitos aislados a partir de la sangre. Los anticuerpos contra 51 antígenos CD, 4 anticuerpos de control de isotipo murino (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgM) y anticuerpos contra 7 otros marcadores de superficie que resultan importantes en el diagnóstico de leucemias (glicoforina A, HLA-DR, KOR-SA3544, FMC7, inmunoglobulinas kappa y lambda) se unen en forma de puntos de 5 nl a una película de nitrocelulosa sobre portaobjetos de microscopía. Únicamente los leucocitos que expresan antígenos CD particulares se unen al punto de anticuerpos correspondiente. Se identifican categorías particulares de leucocitos que expresan subgrupos específicos de antígenos CD a partir del patrón de puntos obtenidos de la unión de las células a la matriz de anticuerpos de CD. Se identifican diversos tipos de leucocitos y leucemias con un elevado grado de certidumbre a partir del patrón de expresión de los antígenos CD, en el que diferentes subgrupos de leucocitos expresan diferentes combinaciones de aproximadamente 12 a 20 de los antígenos representados en la matriz (figuras 1 y 2). Esta forma de análisis multifactorial se basa en el reconocimiento de patrones para diferentes leucocitos y leucemias. La presente invención permite utilizar un gran número de anticuerpos, provocando que esta identificación resulte bastante robusta, ya que tolera variaciones de la expresión entre diferentes muestras o individuos.

Los leucocitos maduros se diferencian a partir de células madre en la médula ósea siguiendo linajes particulares hasta células mieloides y linfocitos T y B. La expresión de los antígenos CD cambia a medida que se diferencian las células precursoras a partir de las células madre siguiendo los diversos linajes hasta formar subpoblaciones de leucocitos maduros que expresan un subconjunto particular de antígenos CD. De esta manera, el subconjunto de antígenos CD expresados en una leucemia puede ser similar al de una célula precursora en un linaje particular. Alternativamente, el bloqueo de un linaje particular mediante mutación puede resultar en la diferenciación de precursores para formar células que expresan una combinación no habitual de antígenos CD.

La aplicación de la matriz de anticuerpos de la invención se ilustra mediante la determinación de la expresión de los antígenos CD sobre leucocitos de sangre periférica (PBL) normales y sobre células de leucemia linfocítica crónica (CLL). Las células CLL se unen a los puntos de anticuerpos con una intensidad uniforme. Además, las células CCL se unen a menos puntos de anticuerpos que las PBL normales. Se sometieron a ensayo muestras de sangre procedentes de pacientes de CLL con enfermedad avanzada con recuentos de glóbulos blancos (WBC) de entre 30x10^{9} y 86x10^{9} células/l, y también de pacientes con recuentos WBC comparables a la densidad de PBL normales (10x10^{9} células/l). El patrón de la matriz de anticuerpos para esta CLL de bajo nivel todavía podía distinguirse del de las PBL normales (ver los resultados para el paciente de CLL denominado KB, representado en la figura 8c).

En resumen, se utilizó una matriz prototipo de 62 anticuerpos (se muestran matrices de 54 y 60 puntos en las figuras 7 y 8, respectivamente) para permitir la identificación rápida y reproducible de subgrupos de antígenos CD sobre células PBL y CLL normales. Esta matriz permite el diagnóstico de diferentes tipos de leucemias y linfomas basándose en la expresión de los antígenos CD. La identificación de antígenos CD no habituales en la leucemia o en un linfoma proporciona una diana para el tratamiento del paciente con un anticuerpo monoclonal humanizado contra ese antígeno. Por ejemplo, el rituximab es antiCD20 utilizado para tratar los linfomas de células B, tales como el linfoma no de Hodgkins (NHL). Campath-1H es antiCD52 utilizado para tratar las leucemias crónicas de células T y B, tales como T-PLL y B-CLL. Las matrices de anticuerpos de CD de este tipo también resultan útiles para el diagnóstico y tratamiento de trastornos no neoplásicos que implican leucocitos, tales como las enfermedades autoinmunológicas e inmunodeficientes, VIH y mononucleosis. Además, el método podría utilizarse para el análisis de leucocitos en sangre del cordón y aspirados de médula ósea.

La descripción siguiente proporciona el método más preferido para la preparación de las matrices de anticuerpos. El panel de anticuerpos se utiliza generalmente para construir matrices de anticuerpos con el sistema Aspirate and Dispense PixSys^{TM} 3200 de Cartesian Technologies. Se seleccionan los anticuerpos para la utilización en un diagnóstico o protocolo de detección particular. Cada anticuerpo se aplica generalmente en un volumen de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 nanolitros en un formato de puntos a intervalos aproximados de entre 0,5 y 1,5 mm para crear una matriz apropiada sobre una película de nitrocelulosa generalmente sobre un soporte sólido, tal como, aunque sin limitación, un portaobjetos de microscopía. Tras la creación de los puntos, se evalúan los soportes en una caja de luz y se marcan ligeramente las esquinas de las matrices utilizando, por ejemplo, un lápiz de plomo. A continuación, se sumergen las matrices de anticuerpos en un agente de bloqueo, tal como, aunque sin limitación, leche desnatada, extracto de musgo irlandés u otra fuente de carragenano o gelatina. Resulta particularmente útil la leche desnatada en polvo aproximadamente entre el 2% y aproximadamente el 15% p/v en PBS a 4ºC durante la noche, o a 37ºC durante entre aproximadamente 60 y 120 minutos. Tras la aplicación del agente de bloqueo, los soportes sólidos se lavan suavemente con agua purificada y se dejan secar a temperatura ambiente durante 60 a 120 minutos. A continuación, se almacenan los soportes sólidos en una bolsa hermética al aire a 4ºC en la oscuridad.

Las células que deben someterse a ensayo en las matrices de anticuerpos se recolectan frescas o se reconstituyen a partir de muestras almacenadas en nitrógeno líquido. Las células se lavan en PBS y se resuspenden a una densidad de entre aproximadamente 1x10^{5} y 1x10^{9} células/ml. A continuación, se preparan soporte sólidos mediante calentamiento de los mismos a temperatura ambiente y se humectan con PBS. Seguidamente se secan los bordes de la nitrocelulosa siguiendo el límite de la matriz marcada y se introduce en un ambiente húmedo, tal como una placa de Petri revestida de celulosa húmeda. Se pipetean entre aproximadamente 100 \mul y aproximadamente 500 \mul de suspensión celular sobre el portaobjetos dentro de los bordes secos de la matriz. A continuación, se incuba la matriz con las células en la placa de Petri cerrada humidificada durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. El tiempo y temperatura de la incubación en este punto pueden modificarse para adaptarse a las condiciones particulares a conveniencia de la persona que realiza el ensayo.

Tras la incubación con las células, los soporte sólidos se sumergen cuidadosamente en PBS, después se introducen en una placa de Petri de PBS y se agitan suavemente para lavar las células no unidas específicamente a la matriz. En el caso de que se haya producido unión de fondo significativa según se observa mediante examen microscópico, se repite la etapa de lavado.

A continuación se observa al microscopio la matriz utilizando, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia Olympus BX60 (Olympus Optical Company, Japón) con un objetivo UPLan 4x con el condensador fijado en la posición de la fase 1 y un filtro verde tapando la fuente lumínica. Se capturan imágenes y se analizan utilizando una cámara CCD enfriada digital SenSys (1.317 x 1.035 píxeles, Photometrics), capturador de imágenes PCI y programas informáticos de procesamiento y análisis de imágenes de Windows (Digital Optics). Se procesan las imágenes para la presentación utilizando el programa informático Adobe Photoshop versión 3.0. Las intensidades para la unión específica de células para cada punto de anticuerpo también se registran utilizando una escala relativa de +/-, +, ++, +++.

Tras registrar lo resultados en forma de archivos de ordenador, las células unidas a la matriz de anticuerpos se fijan mediante el baño del portaobjetos en fijador FACS (formaldehído al 0,94% v/v, D-glucosa al 2%, NaN_{3} al 0,03% v/v, PBS (pH 7,3)) durante 30 minutos. Tras el enjuague en PBS, las células unidas se tiñen durante 5 minutos con contratinción de hematoxilina (Immunotech, Marseille, Francia), que tiñe los núcleos de las células de color azul. A continuación, los soportes sólidos se enjuagan en PBS, se secan y se almacenan a temperatura ambiente. Seguidamente los soportes sólidos pueden humectarse posteriormente con PBS y examinarse nuevamente al microscopio.

Aunque la presente invención se ejemplifica particularmente con respecto a la utilización del ensayo para detectar el cáncer, tal como se ha indicado anteriormente, el ensayo también puede utilizarse para detectar o cuantificar una molécula particular o clase o familia de moléculas en una muestra química, tal como una biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o en una muestra medioambiental. También puede utilizarse para detectar o cuantificar microbios, virus, parásitos u otros patógenos particulares.

Se da a conocer en la presente memoria la utilización de medios genéticos para llevar a cabo los ensayos. En este caso, las moléculas P serían oligonucleótidos. La pareja de unión sería una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo ARNm) capaz de hibridarse a una molécula P. En una forma de realización particularmente preferida, la pareja de unión es ADN producido por una transcriptasa inversa, tal como mediante la utilización de RT-PCR.

En un ejemplo particular, la matriz puede utilizarse para detectar la expresión de antígenos CD sobre leucocitos, leucemias y linfomas. La matriz comprende una micromatriz de oligonucleótidos correspondientes a la totalidad de los antígenos CD (2.166 o un subconjunto particular). Esta matriz microscópica consiste de minúsculos puntos (pl) de oligonucleótidos complementarios (\sim20 nucleótidos [nt]) unidos covalentemente a un soporte sólido. El ARNm se extrae de 5.000 a 10.000 leucocitos y se amplifica mediante RT-PCR con marcaje de los extremos de los transcritos de ADN resultantes con biotina o ^{32}P. Los ADN marcados se hibridan a continuación con la matriz de oligonucleótidos y se desprende el ADN no unido mediante lavado. La presencia de transcritos de ADN de los ARNm se detecta utilizando un escáner de fluorescencia o de radioactividad de alta resolución, proporcionando un patrón de puntos para la expresión de los ARNm de CD. Este patrón de puntos correspondería al obtenido con la matriz de anticuerpos con leucocitos unidos.

Este procedimiento alternativo para la detección de la expresión de antígenos CD es más sensible que la utilización de células intactas, aunque requiere instrumentación más sofisticada. Este procedimiento resulta particularmente útil para la detección de enfermedad residual mínima en pacientes en remisión.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los Ejemplos no limitativos siguientes.

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Ejemplo 1 Preparación de una matriz de anticuerpos

Los anticuerpos pueden unirse covalentemente a una membrana adecuada, tal como una membrana Immobilon-P (PVDF, Millipore Corporation). Resulta preferido el bloqueo posterior con un exceso de una solución de proteínas, tal como una preparación de leche desnatada. El agente de bloqueo se diseña para eliminar las uniones no específicas a la superficie ligante. Otros agentes de bloqueo adecuados son el extracto de musgo irlandés u otra fuente de carragenano o gelatina. Los anticuerpos también se adsorben a una película de nitrocelulosa sobre un portaobjetos de microscopía de vidrio (Schleicher y Schuell, NH, USA) y seguidamente la nitrocelulosa no unida se bloquea con leche desnatada. También se adsorben anticuerpos a membranas de nilón. Para incrementar la accesibilidad de los anticuerpos antiCD unidos a los antígenos presentes sobre las células, el soporte sólido utilizado para la matriz se recubre inicialmente con una forma truncada recombinante de proteína G de Streptococcus que conserva su afinidad para la parte Fc de IgG, pero que no presenta albúmina, sitios de unión de Fab ni regiones de unión a membrana (Goward et al., 1990). Se aplican anticuerpos a esta capa de proteína G y se unen mediante sus dominios Fc, dejando los dominios Fab libres para que interactúen con células. Los dominios Fab también se encuentran más alejados del soporte sólido, proporcionando a los anticuerpos mayor accesibilidad a los antígenos CD situados sobre las membranas
celulares.

La matriz de anticuerpos también se construye sobre una membrana o un cubreobjetos. En este caso, los anticuerpos se unen covalentemente a la membrana en forma de manchas por duplicado en una matriz bidimensional. Las manchas se disponen en una matriz tal como, aunque sin limitación, una matriz 15x15. Los anticuerpos son monoclonales y son específicos para los antígenos de grupo de diferenciación (grupo de denominación) (antígenos CD) y antígenos mieloides (MY) expresados sobre células de leucemia. También pueden incluirse anticuerpos específicos para los antígenos LY. Se encuentran disponibles datos de los antígenos CD en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/cd/index molecule.htm. Las manchas son de tamaño microscópico y se producen mediante la aplicación de una gota (\sim10 nanolitros) de solución de anticuerpos (por ejemplo 10 proteínas Fg/ml) sobre partes determinadas de una membrana o superficie de vidrio, tal como un cubreobjetos, en primer lugar se lavan con un absorbente no específico de proteínas, tal como leche desnatada al 30% p/v (Dutch Jug, Bonlac Foods Ltd., Melbourne, Australia) y después se enjuagan. También pueden utilizarse otras soluciones de proteínas y otras marcas de leche desnatada. Los anticuerpos pueden acoplarse covalentemente al soporte sólido, tal como mediante grupos amino de los residuos de lisina, los grupos carboxilato de los residuos de aspartato o de ácido glutámico, o los grupos sulfhidrilo de los residuos de cisteína. La matriz de anticuerpos se une selectivamente a células de líquidos corporales que expresan los antígenos respectivos o pueden unirse a antígenos libres. Se incluye un control positivo y/o negativo, tal como un anticuerpo para moléculas superficiales o moléculas solubles que es conocido que se encuentran presentes en la muestra. Un ejemplo de una forma del dispositivo de ensayo se muestra en la figura 3. El soporte sólido convenientemente es de tamaño y forma similares a un portaobjetos de microscopía y puede construirse de vidrio o de otro material polimérico. En la figura representada, se observan 40 manchas discretas por duplicado, un total de 80 manchas. Puede añadirse separadamente o moldearse con el portaobjetos una pared circundante al portaobjetos de microscopía, facilitando la retención del material líquido.

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Ejemplo 2 Preparación de muestras

Se utilizan muestras de sangre como fuente de antígenos o de antígenos expresados sobre la superficie celular tras el tratamiento para evitar la formación de coágulos. Los linfocitos de sangre periférica pueden fraccionarse mediante centrifugación para producir una "capa leucocitaria", o más específicamente, mediante medio de densidad Ficoll-Hypaque. Puede llevarse a cabo el fraccionamiento adicional de los linfocitos u otras subpoblaciones celulares utilizando perlas Dynabeads, que son perlas magnéticas unidas covalentemente a un anticuerpo específico. Generalmente, las células se resuspenden en solución de Hank a una densidad de 2x10^{6} células/ml y se aplican a una matriz de anticuerpos en forma de una suspensión uniforme de 200 \mul. La solución de Hank es isotónica y contiene glucosa, que mantiene la viabilidad e integridad de las células durante esta etapa de unión. Tras la incubación de la suspensión celular con la matriz de anticuerpos durante 30 a 60 minutos (por ejemplo 30 minutos) a 37ºC en una atmósfera húmeda, las células no unidas se lavan de la matriz con solución salina tamponada con fosfato (PBS, dos alícuotas de 20 \mul) que después se decanta. Alternativamente, las células no unidas se suspenden mediante balanceo suave y la matriz se lava con solución de Hank previamente calentada (3x1 ml).

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Ejemplo 3 Método mejorado de preparación de muestras

Se utiliza un panel de anticuerpos (tal como 51 manchas de anticuerpos) para construir matrices de anticuerpos con el sistema Aspirate and Dispense PixSys^{TM} 3200 de Cartesian Technologies. Se seleccionan los anticuerpos monoclonales para el diagnóstico de los tipos comunes de leucemia. Los moldes para las matrices de anticuerpos sobre los portaobjetos se presentan en las figuras 7A y 8A. Se aplican puntos (5 nl) de cada anticuerpo a intervalos de 0,8 mm, creando una matriz de 0,65 cm x 0,45 cm sobre la película de nitrocelulosa sobre el portaobjetos de microscopía. Tras la creación de los puntos, se evalúan los portaobjetos en una caja de luz y se marcan levemente las esquinas de las matrices con un lápiz de plomo.

A continuación, se sumergen las matrices de anticuerpos en agente de bloqueo al 5% p/v, tal como leche desnatada, albúmina de suero bovino (BSA), suero bovino, extracto de musgo irlandés u otra fuente de carragenano o gelatina en PBS a 4ºC durante la noche, equivalente a un bloqueo de 90 minutos a 37ºC. Tras el bloqueo, se lavaron suavemente los portaobjetos con agua purificada y se dejaron hasta secarse totalmente a temperatura ambiente durante 90 minutos. Los portaobjetos se envolvieron a continuación en GladWrap (marca comercial), se sellaron en una bolsa hermética al aire y se almacenaron a 4ºC en la oscuridad.

Las células que debían someterse a ensayo sobre las matrices de anticuerpos se recolectaron frescas o se reconstituyeron a partir de muestras almacenadas en nitrógeno líquido. Las células se lavaron en PBS y se resuspendieron a una densidad de 1x10^{7} células/ml. Se desenvolvieron los portaobjetos que debían someterse a ensayo, se calentaron hasta la temperatura ambiente y se humectaron con PBS. A continuación, se secó la nitrocelulosa en torno a los bordes de la matriz marcada y se introdujo en una placa de Petri revestida de celulosa húmeda. Se pipeteó cuidadosamente la suspensión celular (300 \mul) sobre el portaobjetos dentro de los bordes secos de la matriz. Se incubó la matriz con las células en la placa de Petri cerrada humidificada durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Tras la incubación con las células, el portaobjetos se introdujo cuidadosamente en un tubo de 50 ml de PBS, después se introdujo en una placa de Petri de PBS y se balanceó suavemente para lavar la placa de las células no unidas específicamente. En el caso de que todavía se observase unión de fondo significativa en el examen microscópico del portaobjetos, se repetiría dicha etapa hasta que el patrón de unión resultase evidente.

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Ejemplo 4 Ensayo

Se aplicaron muestras de células o de antígenos a la matriz de anticuerpos-membranas, se incubaron para permitir la unión máxima y se lavó el material no unido utilizando una solución de lavado adecuada. Generalmente, las células unidas se fijaron a los anticuerpos mediante entrecruzamiento químico. Las células unidas a anticuerpos en la matriz se visualizaron microscópicamente para determinar las morfologías. En caso necesario, se fijaron las células a la matriz y se tiñeron, se trataron enzimáticamente y/o se sometieron a ensayo para la actividad enzimática y/o expresión de receptores.

Las células fijadas también pueden hacerse interactuar con un segundo anticuerpo marcado con una molécula informadora (por ejemplo un fluorocromo). Alternativamente, se utilizó una serie de "segundos" anticuerpos, cada uno con un fluorocromo diferente. A continuación, se determinó la expresión de múltiples antígenos sobre las células mediante microscopía confocal de fluorescencia.

Las células fijadas también se tiñeron o se marcaron fluorescentemente para permitir la cuantificación de las densidades celulares en la muestra original de líquido corporal. Esta cuantificación puede automatizarse con un escáner programable que registra las densidades celulares en cada punto de anticuerpos en la matriz. Por ejemplo, un densitómetro láser (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA, USA) que escanea en dos dimensiones (resolución: 50 Fm) resulta particularmente útil. El grado de tinción de las manchas de anticuerpos es proporcional al número de células unido a cada anticuerpo. Para la detección de la fluorescencia, puede utilizarse un FluorImager o un Typhoon (Molecular Dynamics, Inc.) (resolución: 50 im).

La matriz de anticuerpos, tal como una contra antígenos CD y MY, proporciona un patrón de expresión de los antígenos y ésta se compara a continuación con patrones prefijados de expresión de antígenos para diferentes leucemias (por ejemplo la leucemia mieloide aguda [AML]). Para la AML (M4), por ejemplo, se expresan los antígenos siguientes: MY4 (CD14), MY7, MY9 y M01 (CD11b).

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Ejemplo 5 Detección de las líneas celulares T y B humanas

Se aplicaron muestras (0,4 \mul) de soluciones de anticuerpo (10 \mug/ml) para CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 y CD56 (Coulter Beckman) a una película de nitrocelulosa sobre un portaobjetos de microscopía de vidrio (Molecular Probes) y se mantuvieron en una atmósfera húmeda en una placa de Petri. Se aplicaron suspensiones (500 FL) de células CCRF-CEM de leucemia humana y de linfoma B de Raji (10^{7} células/ml) a las matrices, se incubaron y se lavaron con PBS tal como se ha indicado en el Ejemplo 2. Las células CCRF-CEM de leucemia se unieron fuertemente a los anticuerpos antiCD4 y antiCD8, con cierta unión a antiCD3 y ninguna unión a antiCD19. Las células de Raji únicamente se unieron a antiCD19. Estos resultados indican que las células CCRF-CEM, pro ejemplo, expresan niveles elevados de CD4, niveles intermedios de CD8, niveles más bajos de CD3 y niveles despreciables de CD19, CD14 y CD56. A la inversa, las células Raji expresan CD19, pero no CD3, CD4, CD8, CD14 ni CD56. Estos resultados, obtenidos utilizando la matriz de anticuerpos de antígenos CD, se confirmaron mediante citometría de flujo (Becton Dickinson Facscalibur) utilizando anticuerpos marcados con el fluoróforo, FITC. Estos niveles de expresión de los antígenos CD son consistentes con la expresión de antígenos informada para las células T y B (Bene y Martini, 1997). Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 5A y 5B.

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Ejemplo 6 Método mejorado de detección

Se observó la matriz con un microscopio de fluorescencia Olympus BX60 (Olympus Optical Company, Japón) utilizando un objetivo UPLan 4x con el condensador fijado en la posición de fase 1 y un filtro verde tapando la fuente lumínica. Se capturaron imágenes y se analizaron utilizando una cámara CCD enfriada digital SenSys (1.317 x 1.035 píxeles, Photometrics), un capturador de imágenes PCI y programas informáticos de procesamiento y análisis de imágenes de Windows (Digital Optics). Se procesaron las imágenes (6 puntos de anticuerpos por imagen) para la presentación utilizando el programa informático Adobe Photoshop versión 3.0. También se registraron las intensidades para la unión específica de las células a cada punto de anticuerpos utilizando una escala relativa de +/-, +, ++, +++.

Tras registrar los resultados en forma de archivos de ordenador, las matrices de anticuerpos con células unidas se fijaron mediante el baño del portaobjetos en fijador FACS (formaldehído al 0,94% v/v, D-glucosa al 2%, NaN_{3} al 0,03% v/v, PBS (pH 7,3)) durante 30 minutos. Tras enjuagar en PBS, las células unidas se tiñeron durante 5 minutos con contratinción de hematoxilina (Immunotech, Marseille, Francia), que tiñe los núcleos de las células de color azul. Se enjuagaron los portaobjetos en PBS, se secaron y se almacenaron a temperatura ambiente. Los portaobjetos secos posteriormente pueden humectarse con PBS y examinarse nuevamente al microscopio.

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Ejemplo 7 Visualización y cuantificación de células unidas a una matriz de anticuerpos

Existen varias opciones para detectar la unión a una matriz de anticuerpos de células completas o de antígenos en una muestra de sangre.

(i): Las células o antígenos se hacen reaccionar con un reactivo que une covalentemente grupos fluorescentes a grupos amino o sulfhidrilo en todas las proteínas en la muestra. Son fluoróforos adecuados (Molecular Probes, http://www.probes.com) disponibles en forma de kits de marcaje de proteínas: Alexa 488 y 3-(4-carboxibenzoil)-quinolín-2-carboxaldehído (CBQCA), que puede excitarse a 488 nm utilizando un láser de argón. Alternativamente, las células unidas a una matriz se marcan con diacetato de 5-clorometilfluoresceína (CMFDA), una sonda que atraviesa la membrana que resulta desacetilada por las esterasas intracelulares, formando 5-clorometilfluoresceína fluorescente. Este producto experimenta una reacción mediada por glutatión S-transferasas B, produciendo el compuesto pigmento fluorescente glutatión B que no atraviesa la membrana que seguidamente reaccionar con tioles en proteínas y péptidos, formando conjugados. Las células marcadas fluorescentemente unidas a una matriz de anticuerpos se cuantifican utilizando un fluorímetro de barrido (por ejemplo FluorImager o Typhoon, Molecular Dynamics, Inc.) o un microscopio confocal. Preferentemente se utilizan condiciones de reacción suaves, de manera que la mayoría de sitios de unión de antígeno no resulte afectada. Se marcan diferentes células en grados diferentes con un número diferente de fluoróforos. Las células se lavan antes de la reacción con el fluoróforo.

(ii): Las células no marcadas unidas a una matriz se hacen reaccionar con anticuerpos solubles marcados fluorescentemente que se unen a un antígeno CD diferentes sobre las células, permitiendo la cuantificación de las células unidas.

(iii): Para algunas muestras, el nivel celular de antígeno CD puede exceder el número disponible de anticuerpos en una mancha particular. Los antígenos CD que se ha encontrado que se expresan, de un cribado inicial, podría cuantificarse posteriormente utilizando una serie de diluciones de un anticuerpo particular. En el caso de que el número de anticuerpos en una mancha de esta matriz exceda el número de antígenos CD sobre las células aplicadas en la muestra, no se produce ningún incremento adicional de la fluorescencia. Un gráfico de fluorescencia frente a cantidad de anticuerpo proporciona la densidad de células que expresan ese antígeno CD en la muestra de plasma. A partir de estos datos, se calcula el número de un antígeno CD particular por célula. Los niveles de células unidas en esta matriz cuantitativa se determinan utilizando los procedimientos (i) o (ii) anteriores.

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Ejemplo 8 Detección de células fijadas

Las células unidas en la matriz de anticuerpos-membranas se visualizan microscópicamente para determinar sus morfologías. Las células se fijan a la matriz y se tiñen, se hibridan con una sonda oligonucleótida marcada radioactiva o fluorescentemente, se tratan enzimáticamente o se someten a ensayo para actividades enzimáticas, para la determinación de sus morfologías. Las células fijadas también pueden hacerse reaccionar con un segundo anticuerpo soluble marcado (por ejemplo con un fluorocromo unido) o en efecto con varios anticuerpos secundarios solubles diferentes, cada uno con un fluorocromo diferente. La expresión de múltiples antígenos por parte de las células cancerosas unidas mediante la membrana (por ejemplo de leucemia) a la matriz seguidamente pueden determinarse mediante microscopía de fluorescencia, tal como la microscopía confocal.

En un método alternativo, las células fijadas se lisan o se tratan de otra manera para exponer los antígenos intracelulares y después se hacen reaccionar con un segundo anticuerpo soluble marcado (por ejemplo con un fluorocromo unido) específico para un antígeno intracelular, o en efecto con varios anticuerpos secundarios solubles diferentes, cada uno con un fluorocromo diferente. La expresión de múltiples antígenos intracelulares por las células de cáncer (por ejemplo de leucemia) unidas mediante la membrana a las matrices seguidamente se determina mediante microscopía confocal de fluorescencia.

Las células fijadas se tiñen o se marcan fluorescentemente para permitir la cuantificación de las densidades celulares en la muestra original de líquido corporal. Esta cuantificación puede automatizarse con un escáner programable que registra las densidades celulares en cada mancha de anticuerpos en la matriz, para diferentes anticuerpos (por ejemplo CD, MY y/o LY). Para las mezclas celulares que contienen proporciones desconocidas de subtipos celulares, se cuantifican las densidades de las células que expresan un antígeno de superficie particular mediante la unión de las células a una serie de puntos de tamaño uniforme de anticuerpos, que difieren en las densidades del mismo anticuerpo en factores de 10. La densidad de un subtipo celular particular se determina mediante escaneo densitométrico o fluorimétrico de células fijadas o teñidas que se encuentran unidas a estos puntos de anticuerpos diluidos en serie, con el fin de determinar en qué nivel la densidad de anticuerpos de un punto particular excede la densidad de células en la muestra de suspensión celular. Una segunda forma de análisis es correr una suspensión celular que baja una tira de un anticuerpo particular unido a membrana, fijar y teñir las células unidas y después medir la longitud de la tira de células unidas respecto a la longitud de la tira total de anticuerpos. La densidad de células que expresa un antígeno particular seguidamente se calcula a partir de la capacidad de unión conocida de los anticuerpos en la tira. Para los puntos de anticuerpos diluidos en serie o para una tira de anticuerpos, se corre un estándar interno para un antígeno expresado sobre leucocitos normales no relacionados con las células cancerosas.

Mediante la utilización de una matriz de anticuerpos monoclonales (por ejemplo contra los antígenos, CD, MY o LY), se compara el patrón de expresión de antígenos particulares identificados mediante esta matriz a patrones prefijados de expresión de antígenos para diferentes leucemias (por ejemplo M4 AML (leucemia mieloide aguda): MY4(CD14), MY7, MY9, MO1 (CD11b)). La morfología celular proporciona un segundo criterio diagnóstico. El diagnóstico puede automatizarse con el escaneo fluorimétrico o espectrofotométrico de las matrices para determinar qué manchas de anticuerpos se unen a células, con reconocimiento computerizado de los patrones de expresión de antígenos para cánceres particulares. Este método permite el diagnóstico automatizado de una amplia diversidad de leucemias, linfomas y otros cánceres metastásicos. Mediante la utilización de una matriz completa de anticuerpos contra los antígenos CD, MY o LY, podrían descubrirse nuevos tipos de leucemias y linfomas.

La identificación de antígenos particulares sobre células cancerosas proporciona información esencial para la inmunoterapia posterior del paciente con anticuerpos monoclonales humanizados, o inmunotoxinas en las que una toxina o fármaco se encuentra covalentemente unido al anticuerpo. Se realiza un seguimiento de la remisión progresiva inducida por la quimioterapia y/o la radioterapia y la recaída posterior debido al crecimiento de células resistentes a fármaco utilizando muestras celulares periódicas.

Podrían construirse otras matrices de anticuerpos específicos para antígenos expresados por colon metastásico, cáncer mamario, melanoma u otros cánceres, para detectar niveles muy bajos de células metastásicas en líquidos corporales (por ejemplo sangre o líquido cerebroespinal) en pacientes con tumores primarios grandes que presentarían un riesgo de metástasis. Esta vigilancia resultaría de particular importancia para los cánceres de crecimiento rápido, tales como los melanomas.

También puede crearse una "interfaz fácil de utilizar" con una matriz de anticuerpos disponiendo los anticuerpos que corresponden a, por ejemplo, la leucemia mieloide aguda (AML) en la forma de un carácter, por ejemplo "M" para esta leucemia. La misma matriz de anticuerpos podría presentar anticuerpos para la leucemia linfocítica aguda (ALL) dispuestos formando una "L". De esta manera, una única matriz podría proporcionar un diagnóstico directo basándose en patrones conocidos de expresión de antígenos de superficie para diferentes cánceres. El pequeño tamaño de los puntos de anticuerpos y de las matrices de puntos podría permitir la realización de varios ensayos diferentes a partir de la misma muestra sin añadirse significativamente al coste del ensayo. Lo expuesto anteriormente resulta particularmente cierto para las manchas de 1 a 5 nanolitros de tamaño, en las que cada anticuerpo podría costar una pequeña fracción de un céntimo.

Una diversidad de trastornos no neoplásicos del sistema inmunológico resulta en poblaciones anormales de linfocitos circulantes. Las enfermedades autoinmunológicas, tales como la diabetes de tipo 1, la esclerosis múltiple, la miastenia grave, la anemia perniciosa, la soriasis, la artritis reumatoide, el escleroderma y el lupus eritematoso sistémico están causados por subgrupos de células T que pueden expresar CD4, y la producción de anticuerpos contra autoantígenos por parte de subgrupos de células B que pueden expresar CD19. Por ejemplo, se han observado anormalidades cuantitativas en poblaciones de linfocitos de pacientes que presentan lupus eritematoso sistémico (\downarrowCD4+, CD45 + linfocitos T, \uparrowCD8+, CD57 + linfocitos T). La matriz de anticuerpos detecta clones expandidos de células T y B dirigidas contra el autoantígeno.

Los niños que sufren infecciones recurrentes podrían presentan inmunodeficiencia congénita. El inmunofenotipado mediante citometría de flujo se utiliza para detectar deficiencias en los subgrupos de linfocitos. El síndrome de inmunodeficiencia combinada severa (SCIDS) está causado por una deficiencia del enzima adenosina desaminasa, con niveles muy bajos de linfocitos de sangre periférica, tales como las células T (CD3) y B (CD19) y asesinas naturales (CD16). Una deficiencia de la purina nucleósido fosforilasa resulta en una deficiencia de células B. Puede diagnosticarse una diversidad de trastornos de inmunodeficiencia mediante el inmunofenotipado, aunque en la actualidad se requieren ensayos enzimáticos adicionales y el cariotipado para el diagnóstico definitivo. La matriz de anticuerpos de la presente invención proporciona información definitiva sobre los subgrupos de linfocitos que son deficientes en el caso de que no resulten necesarios los demás criterios.

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) infecta principalmente los linfocitos CD4+ debido a que la proteína gp120 del VIH se une a CD4. Durante el curso del SIDA, se produce un agotamiento irreversible de los linfocitos CD4+. Sin embargo, muchos otros tipos celulares resultan infectados por VIH, incluyendo macrófagos, linfocitos B y células microgliales. En la actualidad se realiza un seguimiento de la población de linfocitos CD4 en los pacientes con VIH, aunque el inmunofenotipado debería ser más extenso, según recomienda el Centre for Disease Control (CDC, Atlanta, USA). Los ensayos de doble marcaje siguientes se realizan mediante citometría de flujo: controles negativos, CD45/CD14, CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD19, CD3/CD16, CD3/CD56 y CD4/CD8. Este procedimiento laborioso se sustituye por un procedimiento de una sola etapa utilizando una matriz que contiene anticuerpos contra dichos antígenos CD, y antígenos adicionales que definirían adicionalmente los subgrupos de linfocitos afectados. Durante la infección por VIH, se produce una rápida caída de los linfocitos CD4+ hasta un valor mínimo aproximadamente a las 6 semanas, seguido de una recuperación parcial de los niveles a las 12 semanas. A largo plazo se produce una caída progresiva de los linfocitos CD4+, conduciendo a la muerte tras aproximadamente 11 años (Shinton, 1998). El tratamiento con zidovudina (AZT) induce un incremento transitorio de los linfocitos CD4+; se realiza un seguimiento del efecto de la quimioterapia sobre diversos subgrupos de linfocitos con una matriz de anticuerpos para seguir la evolución clínica de los pacientes infectados por VIH.

El inmunofenotipado también resulta útil para el trasplante de médula ósea y de órganos, para la determinación del grado de inmunosupresión y las complicaciones, tales como el rechazo o la infección (Bene y Martini, 1997). La citometría de flujo se utiliza antes del trasplante para el tipado de tejidos utilizando anticuerpos monoclonales para detectar las especificidades de HLA o la compatibilidad cruzada. La tolerancia a los tejidos trasplantados se induce mediante la administración de ciclosporina en el paciente. El tratamiento en el momento del trasplante fuerza el nivel de los linfocitos de sangre periférica hasta prácticamente cero. Se realiza el seguimiento de la desaparición de las células T de la sangre mediante citometría de flujo para las células CD3+. Tras el trasplante, un incremento de las células CD8+ señala un posible rechazo, y los incrementos de las células CD8+ y CD16+, CD56+ y/o CD57+ podrían indicar infección vírica. Esta vigilancia del estado inmunológico del trasplantado se realiza más rápida y extensivamente utilizando una matriz de anticuerpos.

Algunos pacientes de cáncer reciben quimioterapia de dosis elevada y después requieren un trasplante de la médula ósea para sustituir su sistema inmunológico destruido. La médula trasplantada permite la reconstitución hematopoyética, aunque ocasionalmente aparecen subgrupos poco habituales de linfocitos, tales como células T CD5+. Las infecciones oportunistas y la enfermedad del injerto contra el huésped pueden producirse en dichos pacientes, dando lugar a un incremento de las células CD8+ en ambos casos y a una elevación del número de células asesinas naturales. La sustitución de la citometría de flujo por una matriz de anticuerpos para los antígenos CD simplifica el seguimiento de los pacientes y proporciona información más amplia.

Las matrices de anticuerpos para los antígenos CD también resultan útiles para el seguimiento de los cambios en los subgrupos de linfocitos durante la terapia de desensibilización al veneno de insecto o de araña, en la que se incrementa el número de CD4+ CD45RA+ y se reduce el nivel de CD4+ CD45RO+ desde niveles elevados. Los pacientes con el síndrome de fatiga crónica podrían presentar anormalidades inmunológicas consistentes con una infección vírica con linfocitos CD8+ activados. Un análisis detallado de los subgrupos de linfocitos por parte de la matriz de anticuerpos de la presente invención establece nuevos criterios diagnósticos y proporciona información fundamental sobre este trastorno.

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Ejemplo 9 Matriz de anticuerpos para diagnosticar leucemias

La leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji pueden distinguirse utilizando una matriz de anticuerpos contra CD3, 4, 8, 14, 19 y 56 unidos a un portaobjetos de microscopía. La matriz diferenciadora proporciona los resultados siguientes (en la que "+" indica nivel de unión):

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Esta matriz se somete a ensayo con linfocitos de sangre completa y de sangre periférica. Todas las manchas son ligantes de células con diferentes subpoblaciones de células en algunas de las manchas. Las subpoblaciones de células se detectan utilizando anticuerpos contra los antígenos CD siguientes:

CD2, 7, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11b, 11c, 13, 14, 15, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 33, 34, 36, 37, 38, 41, 42, 45, 56, 57, 95, 122.

Se preparan matrices grandes con dichos anticuerpos para investigar las propiedades de unión de las células de leucemia obtenidas de los pacientes. El análisis se centra particularmente en los pacientes que presentan AML, CLL y ALL, aunque la presente invención cubre cualquier cáncer. Mediante la utilización de este enfoque, la matriz de anticuerpos puede definir nuevos subgrupos de leucemias basándose en información extensa sobre la expresión de antígenos disponibles utilizando este ensayo de una sola etapa.

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Ejemplo 10 Matriz de anticuerpos basada en nitrocelulosa

Los procedimientos utilizados para preparar el ensayo se ilustran en forma de diagrama de flujo en la figura 4. Las matrices de anticuerpos se construyen utilizando un sistema Biodot Aspirate and Dispense (Cartesian Technologies) en el que se aplican puntos de 5 nl en una película de nitrocelulosa sobre portaobjetos de microscopía de vidrio (Schleicher y Schuell, nº de cat. 10484182). Se utilizan anticuerpos monoclonales purificados (Beckman Coulter, Becton Dickinson, o Biosource International) a las concentraciones recomendadas para el análisis de citometría de flujo y se aplican en los mismos tampones en los que son suministrados por los fabricantes. A continuación, la nitrocelulosa se bloquea mediante incubación con leche desnatada al 5% p/v (Dutch Jug) durante 1,5 horas a 37ºC. Estas condiciones de bloqueo se seleccionan para minimizar el nivel de unión de fondo.

Las matrices secas se almacenan durante más de 3 meses a 4ºC sin pérdida de capacidad de unión para las líneas celulares de leucemia de células T CCRF-CEM y de linfoma de células B Raji (Tablas 1 y 2). Una comparación entre matrices secas almacenadas con desecante a 4ºC, a temperatura ambiente (22ºC) y a 37ºC durante 1 mes mostró poco o ningún deterioro a 4ºC, un deterioro mínimo a temperatura ambiente y únicamente una pérdida parcial de actividad de unión a 37ºC en ensayos con PBL normales (Tabla 3). Los anticuerpos sombreados continuaron mostrando una actividad de unión fuerte incluso tras 1 mes a 37ºC. La estabilidad de las matrices se incrementa adicionalmente mediante la adición de agentes estabilizadores de proteínas a los anticuerpos (por ejemplo polietilenglicol o productos estabilizadores disponibles comercialmente de Surmodics, MN, USA).

Se prepararon leucocitos normales o células de leucemia mediante centrifugación Histopaque y se lavaron y se resuspendieron hasta una densidad de 10^{7} células/l en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La utilización de PBS resulta en células que se encuentran metabólicamente agotadas y en un nivel reducido de unión no específica de fondo a las matrices de anticuerpos bloqueados. Las suspensiones celulares se aplicaron en la matriz y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, se fijaron con una solución de glucosa/formaldehído/PBS y después se lavaron con PBS. Las células unidas a la matriz se fotografiaron y las imágenes digitales se compararon con patrones de consenso para PBL normales o leucemias. Debido a que algunas de las muestras mostraban unión de fondo a la nitrocelulosa, se realizaron etapas para minimizar el fondo. La inclusión del agente quelante EDTA 1 mM en la PBS para suspensión celular redujo significativamente el nivel de unión de fondo sin interferir con la unión especifica a anticuerpo. Se encontró que una muestra de AML se unía muy fuertemente a anticuerpos de control de isotipo, sugiriendo la unión de los receptores de Fc. Lo anterior se superó mediante la preincubación de las células con suero AB humano inactivado por calor al 10% v/v. Para reducir adicionalmente el problema de unión de fondo, se utilizaron los compuestos siguientes para reducir la capacidad de unión de los leucocitos mediante la inhibición de la síntesis de proteínas y/o mediante el bloqueo de la molécula de adhesión Mac-1 expresada en muchos leucocitos activados: heparina, quininógeno de elevado peso molecular, mocimicina, pentoxifilina, benzidamina (Tantum), lidocaína y naftifina.

Se revisaron los portaobjetos húmedos utilizando microscopía de campo oscuro a una magnificación de 400x. Se fotografiaron los puntos en grupos de 6 y se produjo una imagen compuesta utilizando el programa informático Adobe Photoshop. Se cuantificó la densidad celular en cada punto de anticuerpos a partir de las imágenes digitales utilizando un programa informático o se registró mediante escaneo densitométrico o fluorimétrico. Los leucocitos unidos a matriz se tiñeron con antiCD45 (antígeno leucocitario común) conjugado con Alexa 488 y se observaron mediante microscopía de fluorescencia (figura 6). De esta manera, se utilizó la microscopía confocal de tres colores para la identificación y caracterización adicionales de las células unidas a puntos de anticuerpos individuales. Se utilizaron tinciones histoquímicas (por ejemplo mieloperoxidasa) en las células unidas a las matrices con el fin de confirmar la identificación de algunos subtipos de leucemia (por ejemplo AML).

Inicialmente se sometieron a ensayo 3 líneas celulares en una matriz de 54 puntos de anticuerpos de 10 nl (figuras 7a-d). La leyenda para las posiciones de los anticuerpos se muestra en la figura 7a. Se detectaron patrones claros de puntos en las líneas celulares de leucemia de células T CCRF-CEM (figura 7b), de linfoma de células B Raji (figura 7c) y mieloide NB4 (figura 7d). Se resumen estos resultados en la Tabla 4.

Los patrones típicos de puntos para las PBL normales, la leucemia linfocítica crónica (CLL), la leucemia de células pilosas (HCL), la leucemia mieloide aguda (AML) y el linfoma de células B (BCL) se muestran en las figuras 8a-g, con la leyenda para las posiciones de los anticuerpos (figura 8a). Los patrones de expresión de antígenos CD para las PBL se resumen en la Tabla 5, indicando los antígenos CD sombreados un patrón común de expresión. Las PBL recién aisladas (RIC) proporcionaron resultados similares a las mismas PBL que se habían congelado en nitrógeno líquido y después descongelado (mostradas en la Tabla 8). Esta observación permite la utilización de leucocitos y leucemias congeladas para el análisis con matrices de anticuerpos. La Tabla 6 resume los patrones de expresión de antígenos CD para células de CLL procedentes de 9 pacientes de leucemia. Al congelar las muestras de CLL y someterlas a ensayo nuevamente, los patrones obtenidos fueron altamente reproducibles. Todas las CLL sometidas a ensayo expresaron fuertemente CD5, 11c, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 37, 38, 45, 52 y HLA-DR, que son marcadores de superficie celular característicos de las CLL del tipo células B.

La Tabla 7 muestra una comparación entre una PBL normal, dos CLL y muestras de pacientes de PLL (leucemia prolinfocítica), HCL, BCL y AML. La muestra de CLL llamada KB procede de un diagnóstico temprano, con un WBC de la densidad comprendido dentro del intervalo de normalidad (10x10^{9} células/l), mientras que la muestra EH2 procede de un paciente con enfermedad más avanzada y presenta un recuento WBC elevado, de 30x10^{9} células/l. El sombreado ilustra las similitudes y diferencias entre los antígenos principales expresados por estas diferentes leucemias.

Se realizó una comparación rigurosa entre el análisis de las PBL y las CLL utilizando la matriz de anticuerpos y citometría de flujo (Tabla 8). Existe una fuerte correlación entre los resultados de los dos análisis, con las excepciones de CD2, CD11b, 14, 15, 16, 56, 57, 95, 103, 154, KOR y FMC7. En la mayoría de estos casos, la citometría de flujo es positiva, mientras que la matriz de anticuerpos es negativa. Además, el porcentaje de células positivas detectadas mediante citometría de flujo es bajo o la tinción es débil. La citometría de flujo utiliza anticuerpos solubles, mientras que las matrices utilizan anticuerpos inmovilizados sobre un soporte sólido. Los anticuerpos en solución libre presentan un mejor acceso a los antígenos CD sobre las células que los anticuerpos sobre una matriz, en la que pueden producirse impedimentos estéricos. Además, se requiere una afinidad de unión más alta para retener las células unidas a una fase sólida. El almacenamiento de anticuerpos en solución a 4ºC resulta en una pérdida gradual de la actividad de unión en matrices de anticuerpos posteriormente. En la mayoría de casos, se restaura la actividad de unión utilizando anticuerpo fresco. En otros casos, resultan necesarias concentraciones más altas de anticuerpo. En un caso (CD2), se unió a las células un anticuerpo de un clon de hibridoma diferente. Estas modificaciones mejoran significativamente la correlación entre los análisis de fase sólida y la FACS.

En el caso de que la expresión de CD sea negativa según la citometría de flujo pero positiva según la matriz de anticuerpos (es decir, CD103 y KOR con PBL RIC), esta diferencia se resuelve mediante la inclusión de suero AB humano con las PBL RIC antes del ensayo en matriz de anticuerpos; tanto CD103 como KOR fueron negativos en este caso (ver la figura 8b). La inclusión de suero AB humano, que contiene inmunoglobulinas, también bloqueó la detección de inmunoglobulina (Ig) sobre la superficie de las CLL de células B. Además, el suero humano puede contener formas solubles de otros marcadores de superficie celular que podrían bloquear la expresión en las células ligantes de estos marcadores (por ejemplo CD154, CD95). Se recomienda que se sometan a ensayo inicialmente muestras en EDTA/PBS sin adición de suero AB humano. Únicamente aquellas muestras que muestren una unión fuerte de receptor de Fc en el ensayo inicial pueden someterse a nuevo ensayo con suero AB humano.

Para algunas aplicaciones, la unión de las células a los puntos de anticuerpos se cuantifica mediante comparación con un estándar interno. La figura 9 muestra la relación entre la unión celular y la densidad de células Raji incubadas con puntos de anticuerpos contra 3 marcadores de superficie diferentes. Para CD38 y HLA-DR, existe una correlación directa entre la densidad celular y el número de células unidas al punto a densidades celulares de hasta 10x10^{6} células/ml. Para HLA-DR, la correlación es lineal entre 1x10^{6} y 10x10^{6} células/ml. Para CD10, se alcanzó una meseta en aproximadamente 5x10^{6} células/ml, sugiriendo la saturación de los sitios de unión de los anticuerpos. La figura 10 muestra que la correlación entre la unión celular y la concentración de anticuerpo de CD10 era lineal a concentraciones de anticuerpo de entre 0,16 y 1,25 \mug/ml. Estos resultados demuestran que la cuantificación de la unión celular debería resulta posible con la condición de que se optimicen las condiciones para cada anticuerpo.

El ensayo de la presente invención se denomina "matriz LD" y se ha dedicado a un paciente, la Sra. Lee Dixon, quien presentaba leucemia mieloide aguda (AML, M4).

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Leyendas de las tablas

Tabla 1

Estabilidad de la matriz de anticuerpos para la unión de células CCRF-CEM

Se secaron matrices de anticuerpos a temperatura ambiente, se bloquearon, se lavaron con agua, se secaron y después se almacenaron a 4ºC, se envolvieron en película adherente en una bolsa de plástico hermética al aire. Los resultados se registraron como: - (falta de unión), +/- (unas cuantas células), + (positiva débil), ++ (positiva fuerte), +++ (las células cubren por entero el punto de anticuerpos), ++++ (cobertura gruesa del punto de anticuerpos).

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Tabla 2

Estabilidad de la matriz de anticuerpos para la unión de células Raji

El procedimiento experimental fue el mismo que para la Tabla 1 (resultados de fondo confundidos por la unión de fondo de las células a la nitrocelulosa).

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Tabla 3

Patrones de unión para las PBL sobre matrices almacenadas a 4ºC, 22ºC y 37ºC

Se reconstituyeron PBL (RIC2) almacenadas en nitrógeno líquido y se unieron a las matrices en PBS que contenía EDTA y suero AB humano mediante el procedimiento establecido. Los marcadores CD sombreados indican unión fuerte tras el almacenamiento durante 1 mes a las 3 temperaturas.

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Tabla 4

Patrones de unión para líneas celulares sobre matrices de anticuerpos

Se unieron células en cultivo resuspendidas en PBS a matrices al igual que para la Tabla 3. Los marcadores CD sombreados indican unión fuerte.

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Tabla 5

Patrones de unión para PBL sobre matrices de anticuerpos

Se unieron PBL procedentes de dos sujetos (RIC y LB) y tres capas leucocitarias del banco de sangre de la Cruz Roja (PBL1, 2, 3) a matrices al igual que para la Tabla 3. Todos los procedimientos fueron iguales a los utilizados para la Tabla 3.

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Tabla 6

Patrones de unión para muestras de leucemia linfocítica crónica procedentes de 9 pacientes

Todos los pacientes fueron iguales a los utilizados para la Tabla 3, aunque las muestras se sometieron a ensayo en PBS, excepto EH2, KB y NH, a las que se añadieron EDTA y AB humano. Los marcadores CD sombreados indican unión consistente para todos los pacientes.

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Tabla 7

Patrones de unión para muestras de PBL, CLL, PLL, HCL, BCL y AML

Todos los procedimientos fueron iguales a los utilizados para la Tabla 3. Los marcadores CD sombreados indican unión fuerte.

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Tabla 8

Comparación entre los resultados del análisis FACS y de matrices de anticuerpos para PBL frescas y congeladas y para dos muestras de CLL diferentes

Los procedimientos de matriz de anticuerpos fueron iguales a los utilizados para la Tabla 3, excepto en que no se añadió suero humano ni EDTA. El análisis FACS se llevó a cabo rutinariamente en células con suero AB humano al 10%. Las áreas sombreadas subrayan las diferencias entre los dos métodos.

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TABLA 1 Estabilidad de la matriz de anticuerpos para la unión de células CCRF-CEM

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TABLA 2 Estabilidad de la matriz de anticuerpos para la unión de células Raji

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TABLA 3 Patrones de unión para las PBL sobre matrices almacenadas a 4ºC, 22ºC y 37ºC

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TABLA 4 Patrones de unión para líneas celulares sobre matrices de anticuerpos

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TABLA 5 Patrones de unión para PBL sobre matrices de anticuerpos

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TABLA 6 Patrones de unión para muestras de leucemia linfocítica crónica procedentes de 9 pacientes

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TABLA 7 Patrones de unión para muestras de PBL, CLL, PLL, HCL, BCL y AML

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TABLA 8 Comparación entre los resultados del análisis FACS y de matrices de anticuerpos

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Bibliografía

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Claims

1. Dispositivo de ensayo que puede distinguir entre la leucemia de linfocitos T CCRF-CEM y el linfoma de linfocitos B Raji, comprendiendo dicho dispositivo:

un soporte sólido, y

una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicho ensayo de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 y CD56.

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2. Dispositivo de ensayo que puede diagnosticar leucemias, comprendiendo dicho dispositivo:

un soporte sólido; y

una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede diagnosticar leucemias, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD42, CD45, CD56, CD57, CD95 y CD122.

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3. Dispositivo de ensayo que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemias y linfomas, comprendiendo dicho dispositivo:

un soporte sólido; y

una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemias y linfomas, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD42a, CD44, CD44v3-10, CD44v6, CD45, CD45RA, CD45RO, CD52, CD56, CD57, CD60, CD61, CD71, CD79a, CD95, CD103, CD117, CD122, CD154, GPA, HLA-DR, KOR, FMC7, mIgG1, mIgG2a, mIgG2b y mIgM.

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4. Dispositivo de ensayo que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemia y de linfoma, comprendiendo dicho dispositivo:

un soporte sólido; y

una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre las células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemia y de linfoma, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD42a, CD44, CD44v3-10, CD44v6, CD45, CD45RA, CD45RO, CD52, CD56, CD57, CD60, CD61, CD64, CD71, CD79a, CD79b, CD80, CD95, CD103, CD117, CD122, CD134, CD138, CD154, Kappa, Lambda, GPA, HLA-DR, KOR, FMC7, mIgG1, IgG2a y antiIg.

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5. Dispositivo de ensayo que puede distinguir entre diferentes leucemias, comprendiendo dicho dispositivo:

un soporte sólido; y

una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede distinguir entre diferentes leucemias, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD42a, CD45, CD45RA, CD45RO, CD52, CD56, CD57, CD60, CD61, CD71, CD79a, CD95, CD103, CD117, CD122, CD154, GPA, HLA-DR, KOR, FMC7, mIgG1 y antihIg.

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6. Dispositivo de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el patrón de unión se detecta microscópicamente, bioquímicamente, histoquímicamente o inmunológicamente.

7. Dispositivo de ensayo según la reivindicación 6, en el que el patrón de unión se detecta microscópicamente.

8. Dispositivo de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las moléculas de inmunoglobulina son anticuerpos monoclonales.

9. Dispositivo de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las moléculas de inmunoglobulina son anticuerpos policlonales.

10. Método para distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji, que comprende poner en contacto una muestra biológica con el dispositivo de ensayo según la reivindicación 1, permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión sobre la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión en la matriz que puede distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji.

11. Método para diagnosticar leucemias, que comprende poner en contacto una muestra biológica con el dispositivo de ensayo según la reivindicación 2, permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión en la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión sobre la matriz que puede diagnosticar leucemias.

12. Método para diagnosticar diferentes tipos de leucemias y de linfomas, que comprende poner en contacto una muestra biológica con el dispositivo de ensayo según la reivindicación 3, permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión sobre la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión sobre la matriz que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemias y de linfomas.

13. Método para diagnosticar diferentes tipos de leucemia y de linfoma, que comprende poner en contacto una muestra biológica y el dispositivo de ensayo según la reivindicación 4, permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión sobre la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión sobre la matriz que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemia y de linfoma.

14. Método para distinguir entre diferentes leucemias, que comprende poner en contacto una muestra biológica con el dispositivo de ensayo según la reivindicación 5, permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión sobre la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión sobre la matriz que puede distinguir entre diferentes leucemias.

15. Utilización de un dispositivo de ensayo según la reivindicación 1, para distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji.

16. Utilización de un dispositivo de ensayo según la reivindicación 2, para el diagnóstico de leucemias.

17. Utilización de un dispositivo de ensayo según la reivindicación 3, para el diagnóstico de diferentes tipos de leucemia y de linfoma.

18. Utilización de un dispositivo de ensayo según la reivindicación 4, para el diagnóstico de diferentes tipos de leucemia y de linfoma.

19. Utilización de un dispositivo de ensayo según la reivindicación 5, para distinguir entre diferentes leucemias.