ES2344180T3 - Ensayo para la deteccion de una pareja de union. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo de ensayo que puede distinguir entre la leucemia de linfocitos T CCRF-CEM y el linfoma de linfocitos B Raji, comprendiendo dicho dispositivo: un soporte sólido, y una matriz de moléculas de inmunoglobulina inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran en una disposición en dicho ensayo de manera que al unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji, en el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 y CD56.
Description
Ensayo para la detección de una pareja de
unión.
La presente invención se refiere de manera
general a un ensayo para la detección de una pareja de unión. La
presencia o ausencia de una pareja de unión puede utilizarse como
indicador de un estado normal o de un estado de enfermedad o
trastorno, o de la tendencia a que se desarrolle un estado de
enfermedad o trastorno, o de la presencia de un tipo celular
particular, o agente microbiano, vírico, parasitario u otro agente
patogénico en un animal, especie de ave o planta, o de la presencia
de una entidad química particular en una muestra, tal como una
biblioteca química, espécimen biológico o muestra ambiental o
biblioteca de expresión fágica. Se da a conocer en la presente
invención una matriz de moléculas que presentan una pareja de unión
en una muestra biológica procedente o derivada de dicho animal,
especie de ave o planta, en la que el patrón de unión de las
parejas de unión a las moléculas respectivas en la matriz,
incluyendo la ausencia de unión o la densidad de interacción de la
pareja, proporciona una indicación de un estado normal o estado de
enfermedad o trastorno, o de la tendencia a que se desarrolle un
estado de enfermedad o trastorno, o de la presencia de un tipo
celular particular o agente microbiano, vírico, parasitario u otro
agente patogénico. La pareja de unión puede encontrarse en una
muestra química, ambiental o de biblioteca de expresión fágica, y el
patrón de unión, incluyendo la ausencia de unión o la densidad de
interacción de la pareja, es indicativo de la presencia, tipo y/o
concentración de una pareja de unión particular o de una familia de
parejas de unión. El ensayo resulta útil, inter alia, para
la detección de cánceres y neoplasias, así como de trastornos no
neoplásicos en animales, incluyendo seres humanos, así como en
especies de ave y en plantas. El ensayo también resulta útil para
detectar tipos celulares, agentes microbianos, víricos,
parasitarios u otros agentes patogénicos y entidades químicas en
muestras químicas, ambientales y de expresión fágica. Las moléculas
de la matriz comprenden inmunoglobulinas que pueden interactuar con
antígenos solubles unidos a células o con antígenos sintéticos
particulares. El patrón de unión en la matriz, incluyendo la
presencia, ausencia o nivel de unión a los antígenos respectivos,
proporciona una indicación de la expresión de los antígenos sobre
las células o de la expresión de los antígenos por parte de las
mismas, que, a su vez, proporciona una indicación de la existencia
de un estado normal o de un estado de enfermedad o trastorno, tal
como cáncer, en un animal, especie de ave o planta. El patrón de
unión también proporciona una indicación de la presencia y/o
concentración
de antígenos en una biblioteca química, en una muestra ambiental o en una biblioteca de expresión fágica.
de antígenos en una biblioteca química, en una muestra ambiental o en una biblioteca de expresión fágica.
Al final de la descripción se recogen los datos
bibliográficos de las publicaciones a las que hace referencia el
autor de la presente memoria.
La creciente sofisticación de las técnicas
inmunológicas está facilitando en gran medida la investigación y
desarrollo en los campos médico, veterinario, hortícola y
medioambiental. La especificidad de la interacción
anticuerpo-antígeno es de importancia fundamental. A
través de esta interacción puede determinarse la expresión de genes
codificantes de antígenos particulares.
Muchos estados de enfermedad en especies de
aves, plantas y, en particular, animales, tales como seres humanos,
presentan una base genética, y pueden caracterizarse a partir de
cambios en los patrones y/o niveles de expresión de diversos genes.
Por ejemplo, algunos cánceres están asociados a cambios de la
expresión de oncogenes y genes de supresión tumoral. Además, los
estados de enfermedad o trastornos asociados a cambios en el ciclo
celular y en el desarrollo pueden atribuirse a cambios en la
regulación transcripcional de genes particulares.
Aunque se encuentran disponibles varios ensayos
genéticos para evaluar mutaciones, la identificación de determinados
cambios genéticos no siempre puede ser directamente indicativa de un
estado de enfermedad o trastorno.
Algunos cambios genéticos se expresan mediante
alteraciones de antígenos de la superficie celular. Nuevamente, sin
embargo, los intentos anteriores para desarrollar un ensayo
diagnóstico para estados de enfermedad o trastornos complejos, tales
como el cáncer, basados en la identificación de un único antígeno no
siempre han tenido éxito.
Las leucemias y linfomas causan una mortalidad y
morbilidad significativas en el ser humano. Estos cánceres resultan
de la proliferación continua de células que de otro modo se
encontrarían bloqueadas en diversos estadios de la diferenciación
normal hacia tipos celulares especializados. Las leucemias surgen de
células formadoras de sangre presentes en la médula ósea debido a
mutaciones en cualquiera de los precursores en los diversos linajes
de diferenciación (ver la figura 1). Los linfomas se desarrollan a
partir de linfocitos o macrófagos en el tejido linfático.
Los linfocitos en la sangre periférica expresan
un gran número de diferentes antígenos sobre sus membranas
plasmáticas externas, muchos de los cuales son receptores de
factores de crecimiento, interacciones célula-célula
e inmunoglobulinas, moléculas para la adhesión celular o
estimulación del complemento, enzimas y canales iónicos. Se ha
desarrollado una nomenclatura sistemática única para clasificar los
anticuerpos monoclonales contra los antígenos de superficie celular
de los leucocitos en el ser humano, conocidos como grupo de
antígenos de diferenciación (CD) (Kishimoto et al., 1997).
Puede encontrarse información detallada sobre los antígenos CD en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/cd/index_molecules.htm. La
expresión de estos antígenos de superficie celular permite
distinguir entre diferentes tipos de células sanguíneas maduras
presentes en el sistema circulatorio periférico.
Las células en la sangre periférica son
producidas en la médula ósea mediante la proliferación y
diferenciación en linajes específicos a partir de células madre
precursoras mieloides o linfoides que expresan el antígeno de
superficie CD34 (ver la figura 2).
En la actualidad, una leucemia se diagnostica
basándose en la morfología, expresión de CD específicos, antígenos
linfoides (LY) y mieloides (MY), actividades enzimáticas y
anormalidades citogenéticas, tales como las translocaciones
cromosómicas. El diagnóstico de la leucemia mieloide aguda (AML) se
realiza, por ejemplo, utilizando dichos cuatro criterios. La
expresión de hasta tres antígenos CD en células de leucemia en la
actualidad se determina utilizando anticuerpos marcados
fluorescentemente contra antígenos CD particulares mediante análisis
de citometría de flujo. De esta manera, el cribado de células de
leucemia de pacientes para la expresión de los 166 antígenos CD no
resulta de utilización práctica mediante la utilización de esta
laboriosa técnica. Recientemente, de Matos y Vale, (1996), han
desarrollado un procedimiento de citometría de flujo para la
cuantificación simultánea en una única medición de los tipos
principales de linfocitos humanos y sus subgrupos. En este
procedimiento, se incuban poblaciones mixtas de linfocitos humanos
con anticuerpos monoclonales contra CD3, CD4, CD8, CD19 y CD56
conjugados con tres fluorocromos diferentes. La medición de las tres
emisiones fluorescentes diferentes mediante citometría de flujo
permite la cuantificación de los tipos principales de linfocitos
humanos, linfocitos T y B y células asesinas naturales (NK). Debido
a que la mayoría de citómetros de flujo únicamente pueden utilizar
tres láseres diferentes simultáneamente para el análisis celular,
este procedimiento representa la utilización actual máxima de esta
técnica.
Chang (1983) preparó series ordenadas de tipo
matriz de anticuerpos de diferentes especificidades sobre
cubreobjetos de vidrio que actuaban a modo de minúsculos
inmunoadsorbentes específicos para células que expresaban los
antígenos correspondientes sobre su superficie. Este procedimiento
se basó en observaciones anteriores de que las células son capaces
de unirse a superficies recubiertas con anticuerpos específicos para
los antígenos sobre la superficie de las células (Mage et
al., 1977; Wysocki y Sato, 1978). Chang (1983), demostró la
unión específica de células mononucleares de sangre periférica al
anticuerpo de ratón antiHLA-A2 humano adsorbido
sobre cubreobjetos de vidrio, y de timocitos de ratón a los
anticuerpos antiLyt 2.1 y antiLyt 2.2 inmovilizados.
En el trabajo que ha conducido a la presente
invención, se ha determinado que la detección de determinadas
parejas de unión puede utilizarse para diagnosticar estados de
enfermedad y trastornos, tales como cánceres y trastornos
neoplásicos, así como la presencia de un estado normal. El sistema
de detección también puede utilizarse para determinar la presencia
o ausencia de un abanico de antígenos y puede utilizarse para
cuantificar sus cantidades relativas. Esto resulta particularmente
importante en muestras químicas, bibliotecas y medioambientales y en
bibliotecas de expresión fágica.
En la presente memoria se da a conocer un
dispositivo de ensayo que comprende una matriz de moléculas en la
que cada molécula en la matriz, con la excepción de un control
negativo, puede interactuar con su pareja de unión respectiva,
putativamente presente en una muestra biológica de un animal,
especie de ave o planta, en la que el patrón de interacción entre
las moléculas y las parejas de unión es indicativo de un estado
normal o de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia
a que se desarrolle un estado de enfermedad o trastorno.
En la presente memoria se da a conocer un
dispositivo de ensayo que comprende una matriz de moléculas en la
que cada molécula en la matriz, con la excepción de un control
negativo, puede interactuar con su pareja de unión respectiva,
putativamente presente en una muestra química o de biblioteca de
expresión fágica o en una muestra medioambiental, en la que el
patrón de interacción entre las moléculas y las parejas de unión es
indicativa de la presencia, tipo y/o cantidad de una pareja de
unión particular en dicha muestra.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el diagnóstico de un estado normal o de
cáncer o de una tendencia al desarrollo de cáncer en un animal, tal
como un ser humano, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una
matriz de moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, en la que
cada molécula en la matriz, con la excepción de un control
negativo, puede interactuar con una pareja de unión respectiva, en
caso de encontrarse presente en una muestra biológica de dicho
animal, de manera que el patrón de interacción entre las moléculas
inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas es indicativo de la
presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el diagnóstico de un trastorno no
neoplásico o de una tendencia a desarrollar un trastorno no
neoplásico en un animal, tal como un ser humano, comprendiendo
dicho dispositivo de ensayo una matriz de moléculas inmovilizadas en
un soporte sólido, en el que cada molécula del ensayo, con la
excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja
de unión respectiva en caso de encontrarse presente en una muestra
biológica procedente de dicho animal, en la que el patrón de
interacción entre las moléculas inmovilizadas y sus parejas de unión
respectivas es indicativo de la presencia de un trastorno no
neoplásico o de una tendencia a desarrollar un trastorno no
neoplásico.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para la detección de un tipo celular o agente
microbiano, vírico o parasitario, o de un patógeno, comprendiendo
dicho dispositivo de ensayo una matriz de moléculas inmovilizadas
en un soporte sólido, en el que cada molécula de la matriz, con la
excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja
de unión respectiva en caso de encontrarse presente en dicho tipo
celular, agente microbiano o vírico o parasitario o patógeno, en la
que el patrón de interacción entre las moléculas inmovilizadas y
sus parejas de unión respectivas es indicativo de dicho tipo
celular, agente microbiano o vírico o parasitario o
patógeno.
patógeno.
Se da a conocer en la presente memoria una
matriz de moléculas inmovilizadas sobre un soporte sólido, estando
dicha matriz definida por la fórmula siguiente:
en la
que:
P es un elemento de un grupo de unión capaz de
interactuar con una pareja de unión,
n_{1}, n_{2}, ..., n_{i} representan
diferentes elementos del grupo de unión,
x_{1}, x_{2}, ..., x_{j} representan
diferentes grupos de unión,
b, c y d representan el número de diferentes
elementos de los grupos de unión x_{1}, x_{2}, ..., x_{j},
respectivamente, y en donde b, c y d pueden ser iguales o diferentes
y cada uno presenta un valor entre aproximadamente 0 y
aproximadamente 100, con la condición de que por lo menos uno de
entre b, c o d no sea 0,
z es el número de grupos de moléculas en la
matriz y es un número entre aproximadamente 1 y aproximadamente
2.000,
en la que el patrón de interacción entre las
moléculas inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas es
indicativo de un estado normal o de un estado de enfermedad o
trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de
enfermedad o trastorno, o de la presencia, tipo y/o cantidad de una
pareja de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho
dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados
o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizadas en regiones
discretas de un soporte sólido, de manera que diferentes regiones
discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, y en
el que los antígenos se expresan sobre la superficie de células
normales o de células cancerosas o resultan liberados por células
normales o cancerosas, en el que el patrón de unión de las
inmunoglobulinas inmovilizadas con sus antígenos respectivos es
indicativo de la presencia de cáncer o de una tendencia a
desarrollar cáncer o de la presencia de un estado normal.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para un trastorno no neoplásico, comprendiendo
dicho dispositivo una matriz de moléculas inmunoglobulinas o
derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizadas
en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes
regiones discretas presentan especificidad para diferentes
antígenos, y en el que los antígenos se expresan sobre la superficie
de células no neoplásicas o resultan liberados por células no
neoplásicos, en el que el patrón de unión de las inmunoglobulinas
inmovilizadas con sus antígenos respectivos es indicativo de un
trastorno no neoplásico o de una tendencia a desarrollar un
trastorno no neoplásico.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para un agente microbiano, vírico, parasitario
u otro agente patogénico, comprendiendo dicho dispositivo una
matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes
funcionales de las mismas inmovilizadas en regiones discretas del
soporte sólido, de manera que diferentes regiones discretas
presentan especificidad para diferentes antígenos, y en el que los
antígenos se expresan sobre la superficie de dichos agentes
microbianos, víricos, parasitarios o patógenos o resultan liberados
por los mismos, y el patrón de unión de los antígenos a las
inmunoglobulinas inmovilizadas es indicativo de la presencia o
ausencia de dicho microbio, virus, parásito o patógeno.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para una pareja de unión en una biblioteca
química, muestra medioambiental o biblioteca de expresión fágica,
comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de
inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de los mismos
inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera
que diferentes regiones discretas presentan especificidad para
diferentes antígenos, en el que el patrón de unión de los antígenos
a las inmunoglobulinas inmovilizadas es indicativo de la presencia,
tipo y/o cantidad de dicho antígeno.
Se da a conocer en la presente memoria una
matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de
las mismas, específicas para antígenos expresados sobre célula
normales o células cancerosas o liberados por células normales o
cancerosas o expresados sobre microbios, virus, parásitos, patógenos
o antígenos putativamente presentes en una biblioteca química o
muestra medioambiental, en los que cada grupo de inmunoglobulinas
específico para cada antígeno o parte del mismo ocupa una región
discreta de un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la
fórmula siguiente:
en la
que:
q es una inmunoglobulina específica de un
antígeno expresado sobre una célula normal o cancerosa, o de un
antígeno liberado por una célula normal o cancerosa, o expresado
sobre microbios, virus, parásitos, patógenos o antígenos
putativamente presentes en una biblioteca química, muestra
medioambiental o biblioteca de expresión fágica,
m_{1}, m_{2}, ..., m_{i} representan
elementos del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a
diferentes partes del mismo antígeno,
o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan
diferentes grupos de inmunoglobulinas definidos por la especificidad
para diferentes antígenos.
e, f y g representan el número de diferentes
inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2},
..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser
iguales o diferentes
y cada uno presenta un valor entre 0 y 100, con
la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0; y
es el número de grupos de inmunoglobulinas en la matriz y es un
número entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2.000,
en la que el patrón de interacción entre las
inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos resulta
indicativo de un estado normal o del desarrollo de cáncer o de una
tendencia a desarrollar cáncer o de la presencia de un microbio,
virus, parasitario o patógeno o de la presencia, tipo y/o cantidad
de una pareja de unión en dicha muestra química o medioambiental o
biblioteca de expresión fágica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se da a conocer en la presente memoria una
matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de
las mismas específicos para antígenos expresados sobre células no
neoplásicas o derivados de células no neoplásicas, en los que cada
grupo de inmunoglobulinas específico para cada antígeno o parte del
mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido, estando
definida dicha matriz por la fórmula siguiente:
en la
que:
q es una inmunoglobulina específica para el
antígeno,
m_{1}, m_{2}, ..., m_{i} representan
elementos del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a
diferentes partes del mismo antígeno,
o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan
diferentes grupos de inmunoglobulinas definidos por la especificidad
para diferentes antígenos.
e, f y g representan el número de diferentes
inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2},
..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser
iguales o diferentes y cada uno presenta un valor entre 0 y 100 con
la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,
y es el número de grupos de inmunoglobulina en
el ensayo y es un número entre aproximadamente 1 y aproximadamente
2.000,
en la que el patrón de interacción entre las
inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos es
indicativo del desarrollo de un trastorno no neoplásico o de una
tendencia a desarrollar un trastorno no neoplásico o de la presencia
de un microbio, parásito, virus o patógeno particular.
\vskip1.000000\baselineskip
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho
dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina, o de
derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizados
sobre regiones discretas del soporte sólido, de manera que
diferentes regiones discretas presentan especificidad para un grupo
diferente de antígenos de diferenciación y/o de antígenos mieloides
y/o de antígenos linfoides, expresados sobre células leucémicas, en
la que el patrón de unión de las inmunoglobulinas inmovilizadas a
sus antígenos respectivos es indicativo de la presencia de cáncer o
de una tendencia a desarrollar cáncer.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo diagnóstico que comprende una matriz de
moléculas, en la que cada molécula en el ensayo, con la excepción
de un control negativo, puede interactuar con su pareja de unión
respectiva putativamente en una muestra biológica de un animal,
especie de ave o planta, en la que las moléculas se encuentran en
una disposición en dicha matriz que permite que, al interactuar las
moléculas con las parejas de unión, un patrón diferencial de
densidad proporciona una señal identificable que es indicativa de un
estado de enfermedad o trastorno o de una tendencia a desarrollar un
estado de enfermedad o trastorno.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el diagnóstico del cáncer o de una
tendencia a desarrollar cáncer en un animal, tal como un ser
humano, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una matriz de
moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, en el que cada
molécula de la matriz, con la excepción de un control negativo,
puede interactuar con una pareja de unión respectiva en caso de
encontrarse presente en una muestra biológica de dicho animal, en
la que las moléculas se encuentran dispuestas en dicho ensayo de
manera que, al interactuar las moléculas inmovilizadas con sus
parejas de unión respectivas, un patrón diferencial de densidad
proporciona una señal identificable que es indicativa de la
presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.
Se da a conocer en la presente memoria una
matriz de moléculas inmovilizadas sobre un soporte sólido, estando
definida dicha matriz por la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
P es un elemento de un grupo de unión capaz de
interactuar con una pareja de unión,
n_{1}, n_{2}, ..., n_{i} representan
diferentes elementos del grupo de unión,
x_{1}, x_{2}, ..., x_{j} representan
diferentes grupos de unión,
b, c y d representan los números de diferentes
elementos de los grupos de unión x_{1}, x_{2}, ..., x_{j},
respectivamente, y en los que b, c y d pueden ser iguales o
diferentes y cada uno presenta un valor de entre aproximadamente 0 y
aproximadamente 100 con la condición de que por lo menos uno de
entre b, c o d no sea 0,
z es el número total de grupos de moléculas en
la matriz y es un número entre aproximadamente 1 y aproximadamente
2.000,
en la que las moléculas se encuentran en una
disposición en dicha matriz de manera que, al interactuar las
moléculas inmovilizadas con sus parejas de unión respectivas, un
patrón diferencial de densidades en un grupo de unión proporciona
una señal identificable que es indicativa de un estado de enfermedad
o trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de
enfermedad o trastorno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho
dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados
o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizadas en regiones
discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones
discretas presentan especificidad para diferentes antígenos y en
las que los antígenos se expresan sobre la superficie de células
normales o cancerosas o resultan liberadas por células normales o
cancerosas, en las que las inmunoglobulinas unidas se encuentran
dispuestas en dicha matriz de manera que el patrón de las
inmunoglobulinas inmovilizadas unidas a sus antígenos respectivas
proporciona un patrón diferencial de densidad que presenta la forma
de una señal identificable y que resulta indicativo de la presencia
de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.
Se da a conocer en la presente memoria es una
matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de
las mismas específicos de antígenos expresados sobre células
normales o cancerosas o liberados por células normales o
cancerosas, en las que cada grupo de inmunoglobulinas específicas de
cada antígeno o de parte del mismo ocupa una región discreta de un
soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula
siguiente:
en la
que:
q es una inmunoglobulina específica de un
antígeno expresado sobre una célula normal o cancerosa, o antígeno
liberado por una célula normal o cancerosa,
m_{1}, m_{2}, ..., m_{i} representan
elementos del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a
diferentes partes del mismo antígeno,
o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan
diferentes grupos de inmunoglobulinas definidos por la especificidad
para diferentes antígenos.
e, f y g representan el número de diferentes
inmunoglobulinas en cada uno de los grupos o_{1}, o_{2}, ...,
o_{k}, respectivamente, y en las que e, f y g pueden ser iguales o
diferentes, y cada uno presenta un valor entre 0 y 100, con la
condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,
y es el número total de grupos de
inmunoglobulinas en la matriz y es un número entre aproximadamente 1
y aproximadamente 2.000,
en la que las moléculas se encuentran en una
disposición en dicha matriz que permite que, al interactuar las
inmunoglobulinas inmovilizadas con sus antígenos respectivos, un
patrón diferencial de densidad proporcione una señal identificable
que es indicativa del desarrollo de cáncer o de una tendencia a
desarrollar cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención contempla un dispositivo
de ensayo tal como se da a conocer en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5.
Se da a conocer en la presente memoria un método
para determinar la presencia de un estado de enfermedad o trastorno
o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o
trastorno, tal como, aunque de manera no limitativa, cáncer en un
animal, especie de ave o planta, comprendiendo dicho método la
obtención de una muestra biológica de dicho animal, especie de ave
o planta, que comprende parejas de unión libres o parejas de unión
unidas a una superficie celular, encontrándose dichas parejas de
unión asociadas directa o indirectamente a dicho estado de
enfermedad o trastorno, y la puesta en contacto de dicha muestra
biológica con un soporte sólido que comprende una matriz de
moléculas capaces de unirse a dichas parejas de unión, en la que las
moléculas se encuentran dispuestas en dicha matriz de manera que,
al interactuar con las parejas de unión, un patrón diferencial de
densidad proporciona una señal identificable que resulta indicativa
del estado de enfermedad o trastorno o de una tendencia a
desarrollar dicho estado de enfermedad o trastorno.
Se da a conocer en la presente memoria un método
para detectar cáncer o una tendencia a desarrollar cáncer en un ser
humano o animal no humano, comprendiendo dicho método la obtención
de una muestra biológica de dicho ser humano o animal no humano y
la puesta en contacto de dicha muestra biológica con una matriz de
inmunoglobulinas, o derivados o equivalentes químicos de las
mismas, específicas para los antígenos expresados sobre las células
normales o cancerosas, o liberados por células normales o
cancerosas, en la que cada grupo de inmunoglobulinas específicas
para cada antígeno o parte del mismo ocupa una región discreta de un
soporte sólido, estando definido dicho ensayo por la fórmula
siguiente:
en la
que:
q es una inmunoglobulina específica para un
antígeno expresado sobre una célula normal o cancerosa, o para un
antígeno liberado por una célula normal o cancerosa,
m_{1}, m_{2}, ..., m_{i} representan
elementos del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a
diferentes partes del mismo antígeno,
o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan
diferentes grupos de inmunoglobulinas definidas por la especificidad
para diferentes antígenos,
e, f y g representan el número de diferentes
inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2},
..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser
iguales o diferentes, y cada uno presenta un valor entre 0 y 100,
con la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no es
0,
y es el número total de grupos de
inmunoglobulinas en la matriz y es un número entre aproximadamente 2
y aproximadamente 2.000,
en la que las moléculas se encuentran dispuestas
en dicha matriz de manera que, al interactuar las inmunoglobulinas
inmovilizadas con sus antígenos respectivos, un patrón diferencial
de densidad proporciona una señal identificable que es indicativo
del desarrollo de cáncer o de una tendencia a desarrollar
cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Se da a conocer en la presente memoria un método
para determinar la presencia de un estado de enfermedad o
trastorno, o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad
o trastorno, tal como, aunque sin limitación, cáncer en un animal,
especie de ave o planta, comprendiendo dicho método la obtención de
una muestra biológica de dicho animal, especie de ave o planta que
comprende parejas de unión libres o parejas de unión unidas a una
superficie celular, encontrándose dichas parejas de unión asociadas
directa o indirectamente a dicho estado de enfermedad o trastorno,
y la puesta en contacto de dicha muestra biológica con un soporte
sólido que comprende una matriz de moléculas capaces de unirse a
dichas parejas de unión, en el que el patrón de interacción con las
parejas de unión es indicativo del estado de enfermedad o trastorno,
o de una tendencia a desarrollar dicho estado de enfermedad o
trastorno.
Se da a conocer en la presente memoria un método
para detectar cáncer o una tendencia a desarrollar cáncer en un ser
humano o animal no humano, comprendiendo dicho método la obtención
de una muestra biológica de dicho ser humano o animal no humano, y
la puesta en contacto de dicha muestra biológica con una matriz de
inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de las mismas
específicos para los antígenos expresados sobre células normales o
cancerosas, o liberados por células normales o cancerosas, en la que
cada grupo de inmunoglobulinas específicas para cada antígeno o
parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido,
estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:
en la
que:
q es una inmunoglobulina específica para un
antígeno expresado sobre una célula normal o cancerosa, o para un
antígeno liberado por una célula normal o cancerosa,
m_{1}, m_{2}, ..., m_{j} representan
elementos del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a
diferentes partes del mismo antígeno,
o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan
diferentes grupos de inmunoglobulinas definidos por la especificada
para diferentes antígenos,
e, f y g representan el número de diferentes
inmunoglobulinas en cada uno de los grupos o_{1}, o_{2}, ...,
o_{k}, respectivamente, y los que e, f y g pueden ser iguales o
diferentes y cada uno es un número entre 0 y 100, con la condición
de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,
y es el número total de grupos de
inmunoglobulinas en la matriz y es un número entre aproximadamente 2
y aproximadamente 2.000,
en la que el patrón de interacción entre las
inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos es
indicativo del desarrollo de cáncer o de una tendencia a desarrollar
cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Se da a conocer en la presente memoria la
utilización de una matriz de moléculas capaz de interactuar con una
pareja de unión respectiva putativamente presente en una muestra
biológica, con el fin de determinar la presencia de un estado de
enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar un estado
de enfermedad o trastorno.
Se da a conocer en la presente memoria un método
para el tratamiento del cáncer en un ser humano o animal no humano,
comprendiendo dicho método la obtención de una muestra biológica de
dicho ser humano o animal humano, y la puesta en contacto de dicha
muestra con una matriz de moléculas de inmunoglobulina, o de
derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizados
en regiones discretas del soporte sólido de manera que diferentes
regiones discretas presentan especificidad para diferentes
antígenos, y en el que los antígenos se expresan sobre la
superficie de células normales o cancerosas, o resultan liberados
por células normales o cancerosas, la determinación del patrón de
unión de las inmunoglobulinas inmovilizadas a sus antígenos
respectivos, y posteriormente la realización de inmunoterapia, tal
como con, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales
humanizados correspondiente a un antígeno sustancialmente expresado
sobre células cancerosas.
La figura 1 es una representación diagramática
que muestra linajes de diferenciación de células sanguíneas con
tipos de célula precursora a partir de los que surgen diversos tipos
de leucemia. La determinación de la expresión completa de antígenos
permitiría un diagnóstico inequívoco de la leucemia (ver la figura
2). CML: leucemia mieloide crónica, AMML: leucemia mielomonocítica
aguda, ALL: leucemia linfocítica aguda, AEL: leucemia eritrocítica
aguda, AmegL: leucemia megacariocítica aguda, AMoL: leucemia
monocítica aguda, AML: leucemia mieloide aguda, CLL: leucemia
linfocítica crónica, NHL: linfoma no de Hodgkin, APL: leucemia
promielocítica aguda. Adaptado de Cooper, (1993).
La figura 2 es una representación diagramática
que muestra linajes para la diferenciación de células sanguíneas en
la médula ósea. Se indican algunos antígenos expresados sobre
células precursoras y células sanguíneas maduras. Adaptado de van
Dongen et al., (1988).
La figura 3 es una representación diagramática
de: (a) una vista superior, y (b) una vista en perspectiva, de un
dispositivo de inmunoensayo que comprende una matriz de manchas
discretas de anticuerpo.
La figura 4 es una representación diagramática
que muestra un procedimiento de matriz de anticuerpos.
La figura 5 muestra micrografías de Nomarski de
células CCRF-CEM humanas de leucemia y de linfoma de
Raji unidas a algunas de las manchas de una matriz de anticuerpos
(Coulter Beckman) adsorbida a una película de nitrocelulosa sobre un
portaobjetos de microscopía de vidrio (Molecular Probes). Los
procedimientos utilizados se describen en los Ejemplos 1 y 2, con la
excepción de que se los anticuerpos se aplicaron en un volumen de
0,4 FL. A: células CCRF-CEM, B: células Raji.
La figura 6 es una representación fotográfica de
células CCRF-CEM unidas a un punto de anticuerpos
CD4 y marcadas con anticuerpo CD45 conjugado con
Alexa-488.
La figura 7 es una representación de una matriz
de anticuerpos sometida a ensayo con líneas celulares.
(a) clave tabulada para la posición de los
puntos de anticuerpos en la matriz; (b) leucemia de células T
CCRF-CEM, (c) linfoma de células B de Raji, (d)
células mieloides NB4. Se suspendieron las células en PBS. MIgG1,
mIgG2a, b mIgM son anticuerpos de isotipo de control. Los números
indican anticuerpos contra la molécula CD relevante (por ejemplo,
"2" indica antiCD2). GPA es la antiglucoforina A, un marcador
presente sobre los glóbulos rojos en el ser humano,
HLA-DR es antiHLA-DR clase II, KOR
es un anticuerpo contra el antígeno KOR-SA3544 de
granulocitos, FMC7 es un anticuerpo contra un marcador que distingue
entre diversas leucemias de células B.
La figura 8 es una representación fotográfica de
matrices de anticuerpos sometidas a ensayo utilizando leucocitos
purificados a partir de sangre periférica, que muestra: (a) una
clave para la posición de los puntos de anticuerpos en la matriz,
(b) PBL RIC2 normales, (c) CLL, paciente KB (recuento WBC: 10 x
10^{9} células/ml), (d) CLL, paciente EH2 (recuento WBC: 30 x
10^{9} células/ml), (e) HCL, paciente RD, (f) AML, paciente GT,
(g) linfoma de células B (BCL), paciente KR. Las células se unieron
a matrices en PBS con EDTA y suero AB humano al 10% v/v. Todos los
resultados son de muestras celulares congeladas.
La figura 9 es una representación gráfica que
muestra la relación entre la densidad de células Raji y el número de
células unidas a puntos de células con anticuerpos.
La figura 10 es una representación gráfica que
muestra la relación entre la concentración de anticuerpos y el
número de células Raji unidas a membranas con anticuerpos.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo, que comprende una matriz de moléculas capaz
de interactuar con parejas de unión potencialmente presentes en una
muestra que debe someterse a ensayo. En una forma de realización,
la presencia o ausencia de interacción de las moléculas del ensayo
con parejas de unión, o la interacción relativa entre moléculas del
ensayo y parejas de unión proporciona una indicación de un estado
normal o estado de enfermedad o trastorno en el animal, especie de
ave o planta a partir del que se deriva la muestra. El dispositivo
de ensayo también resulta útil para detectar cambios en poblaciones
celulares no neoplásicas, tales como cambios en poblaciones de
linfocitos, indicativos de, por ejemplo, trastornos no neoplásicos
del sistema inmunológico. Este último aspecto comprende, por lo
tanto, la utilización de un dispositivo de ensayo para detectar
directa o indirectamente tipos celulares y patógenos, incluyendo
parásitos, virus y microorganismo. En una forma de realización
adicional, la muestra es una biblioteca química, una muestra
medioambiental o una biblioteca de expresión fágica. El patrón de
unión proporciona un indicador de la presencia, tipo y/o cantidad
de una pareja de unión particular. Esto resulta particularmente útil
en el cribado para contaminantes ambientales o el cribado de
productos naturales o bibliotecas químicas para agentes que
presentan afinidades particulares. También resulta importante para
cribar bibliotecas de expresión fágica para péptidos que presentan
afinidades o perfiles de unión particulares. La identificación de
este tipo de moléculas resulta útil para desarrollar miméticos de
péptidos.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo que comprende una matriz de moléculas, en la
que cada molécula en la matriz, con la excepción de un control
negativo, puede interactuar con su pareja de unión respectiva,
putativamente presente en una muestra biológica de un animal,
especie de ave o planta, en la que el patrón de interacción entre
las moléculas y las parejas de unión es indicativo de un estado
normal o de un estado de enfermedad o trastorno, o de una tendencia
a desarrollar un estado de enfermedad o trastorno.
El estado de enfermedad o trastorno es
preferentemente en un animal, tal como un ser humano, primate,
animal experimental de laboratorio (por ejemplo ratón, conejo,
cobaya, hámster), animal de compañía (por ejemplo perro, gato) o
animal salvaje en cautividad.
El animal preferente es el ser humano.
Sin embargo, la presente invención también se
extiende a la detección de estados de enfermedad o trastornos en
especies de aves y de plantas. Entre los ejemplos de especies de ave
se incluyen aves de corral (por ejemplo pollos, patos, pavos,
gansos), aves de caza (por ejemplo faisanes, patos salvajes, pavos
reales) y aves no voladoras (por ejemplo emúes, avestruces). Entre
los ejemplos de plantas se incluyen plantas monocotiledóneas y
dicotiledóneas, incluyendo plantas hortícolas, árboles frutales,
plantas ornamentales y árboles de plantación. En la presente
memoria la referencia a una "planta" incluye la referencia a
parte de una planta, tal como hojas, flores, tallos y raíces.
Un tipo de enfermedad o trastorno aplicable a la
detección es el cáncer en animales tales como seres humanos. El
término "cáncer" se utiliza en su sentido más amplio e incluye
leucemias benignas y malignas, sarcomas y carcinomas, así como
otras neoplasias. Las neoplasias pueden ser malignas o benignas. Los
cánceres y neoplasias comprendidos en la presente invención pueden
ser simples (monoclonales, es decir compuestos de un único tipo
celular neoplásico), mixtos (policlonales, es decir compuestos de
más de un tipo celular neoplásico) o compuestos (es decir,
compuestos de más de un tipo celular neoplásico y derivados de más
de una capa germinal). Entre los ejemplos de cánceres simples
comprendidos en la presente invención se incluyen tumores de origen
mesenquimatoso (por ejemplo tumores del tejido conectivo, tejido
endotelial, células sanguíneas, células musculares) y tumores de
origen epitelial. Entre los cánceres particulares comprendidos en la
presente invención están comprendidos de manera no limitativa
fibrosarcoma, mixosarcoma, sarcoma de Ewing, leucemia granulocítica,
carcinoma de células basales, cáncer de colon, cáncer gástrico y
una diversidad de cánceres de piel. Todavía más particularmente,
entre los cánceres contemplados por la presente invención se
incluyen, aunque sin limitación, CML, leucemia mieloide crónica;
AMML, leucemia mielomonocítica aguda; ALL, leucemia linfocítica
aguda; AEL, leucemia eritrocítica aguda; AmegL, leucemia
megacariocítica aguda; AMoL, leucemia monocítica aguda; AML,
leucemia mieloide aguda; CLL, leucemia linfocítica crónica; NHL,
leucemia no de Hodgkin; APL, leucemia promielocítica aguda, y HCL,
leucemia de células pilosas.
La referencia a una condición "normal"
incluye la presencia y/o cantidades de tipos celulares o antígenos
particulares, incluyendo, por ejemplo, receptores, canales iónicos,
moléculas de interacción célula-célula, moléculas
de señalización que, basándose en el análisis estadístico, más
probablemente puede esperarse en una población sustancialmente sana
de individuos. Este aspecto de la presente invención resulta útil,
por ejemplo, en el seguimiento de pacientes tras la terapia química
o inmunológica, o el cribado para un estado de salud en un
individuo de riesgo o grupo o población de individuos de riesgo. La
referencia a determinar una condición "normal" incluye, por lo
tanto, detectar un estado "anormal".
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo que comprende una matriz de moléculas, en la
que cada molécula en el ensayo, con la excepción de un control
negativo, puede interactuar con su pareja de unión respectiva,
putativamente presente en una muestra química, de biblioteca de
expresión fágica o medioambiental, en la que el patrón de
interacción entre las moléculas y las parejas de unión es indicativo
de la presencia, tipo y/o cantidad de una pareja de unión particular
en dicha muestra.
Una "muestra química" incluye una
biblioteca química, tal como una biblioteca de moléculas sintéticas,
moléculas biológicas o moléculas producidas por medios
combinatoriales. La biblioteca química también puede sintetizarse
utilizando tecnología de pines (por ejemplo Chiron). La referencia a
una biblioteca química incluye una biblioteca de moléculas naturales
para el cribado de productos naturales.
Una "muestra medioambiental" incluye una
muestra de un ambiente acuático, aéreo o terrestre, así como
muestras de plantas, microorganismos y coral. De acuerdo con lo
expuesto anteriormente, una muestra ambiental incluye una muestra
para cribar productos naturales para la utilización, por ejemplo,
como agentes farmacéuticos o diagnósticos. También incluye muestras
tales como muestras de suelo, agua y aire que posiblemente contengan
un contaminante.
La expresión "biblioteca de expresión
fágica" se utiliza en su sentido más amplio e incluye dos o más
partículas fágicas que presentan uno o más péptidos, polipéptidos o
proteínas heterólogos sobre la cubierta fágica. Generalmente, sin
embargo, cada fago produce un péptido, polipéptido o proteína
particular fusionado con una proteína de cubierta o parte funcional
de la misma. Las partículas fágicas se ponen en contacto con las
moléculas inmovilizadas. En el caso de que una partícula fágica
comprenda un péptido, polipéptido o proteína sobre su cubierta capaz
de unirse a una molécula inmovilizada, el fago resulta
inmovilizado. El fago inmovilizado se eluye a continuación y el
material genético codificante del péptido, polipéptido o proteína se
aísla y se clona. Éste es un método particularmente potente para
aislar miméticos de péptido, polipéptido o proteína. Por ejemplo,
pueden aislarse miméticos basándose en sus características de unión
análogas.
En un ejemplo particular, si la molécula
inmovilizada es un anticuerpo contra el ligando CD40, y un péptido,
polipéptido o proteína en una biblioteca de expresión fágica o de
otro tipo se une al anticuerpo, dicho péptido, polipéptido o
proteína se convierte en una molécula candidata a actuar como
activador de los linfocitos B o como un antagonista. De manera
similar, la molécula inmovilizada puede ser un anticuerpo contra
CD154 que presenta un nivel elevado en pacientes que sufren de
lupus. Una rueda de identidad molecular que puede unirse a un
anticuerpo CD154 o de un ligando de CD154 sería un candidato a
antagonista de CD154 que resultaría útil en el tratamiento del
lupus. Resulta aplicable un razonamiento similar para todas las
demás bibliotecas, tales como las bibliotecas químicas o de producto
naturales.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el diagnóstico de un estado normal o
cáncer o una tendencia al desarrollo de cáncer en un animal, tal
como un ser humano, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una
matriz de moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, en el que
cada molécula de la matriz, con la excepción de un control
negativo, puede interactuar con una pareja de unión respectiva en
caso de encontrarse presentes en una muestra biológica de dicho
animal, en la que el patrón de interacción entre las moléculas
inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas es indicativo de la
presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.
Otro tipo de estado o trastorno contemplado para
la detección incluye los trastornos no neoplásicos. En la presente
memoria se considera que entre los trastornos no neoplásicos se
incluye cualquier trastorno o enfermedad no caracterizado por la
proliferación celular descontrolada, e incluye los trastornos no
neoplásicos del sistema inmunológico. Entre dichos trastornos se
incluyen enfermedades autoinmunológicas, incluyendo la diabetes de
tipo 1, la esclerosis múltiple, la soriasis, la artritis reumatoide,
el escleroderma y el lupus sistémico eritematoso. Estos trastornos
están causados por subgrupos de células T que pueden expresar CD4
y/o por la producción de anticuerpos contra autoantígenos por parte
de subgrupos de células B que pueden expresar CD19. Por ejemplo,
las anormalidades de las poblaciones de linfocitos, tales como una
reducción de los linfocitos T CD4+ y CD45+, y un incremento de los
linfocitos T CD8+ y CD57+, son características de los pacientes que
presentan lupus sistémico eritematoso.
Entre otros trastornos no neoplásicos se
incluyen la inmunodeficiencia congénita en niños que resulta en
infecciones recurrentes. El inmunofenotipado mediante citometría de
flujo se utiliza para detectar deficiencias de subgrupos
linfocitarios. El síndrome de la inmunodeficiencia combinada severa
(SCIDS) está causado por una deficiencia del enzima adenosina
desaminasa, con niveles muy bajos de linfocitos de sangre
periférica, tales como células T (CD3) y B (CD19) y células
asesinas naturales (CD16). Una deficiencia de nucleósido purina
fosforilasa resulta en una deficiencia de células B. La matriz de
anticuerpos de la presente invención proporciona información
definitiva sobre los subgrupos de linfocitos que son deficientes. Lo
expuesto anteriormente facilita el diagnóstico de la afección.
La presente matriz de anticuerpos también
resulta útil para el cribado de infecciones por agentes patogénicos,
tales como virus, bacterias y parásitos, incluyendo parásitos
palúdicos. Por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) infecta principalmente a los linfocitos CD4+ debido a que la
proteína gp120 del VIH se une a CD4. Durante el curso del
desarrollo del SIDA, se produce un agotamiento de los linfocitos
CD4+. Sin embargo, muchos otros tipos celulares resultan infectados
por VIH, incluyendo macrófagos, linfocitos B y células microgliales.
En la actualidad, se realizan seguimientos de la población de
linfocitos CD4 en pacientes con VIH, aunque el inmunofenotipado
debería encontrarse más generalizado, según recomienda el Centre for
Disease Control (CDC, Atlanta, USA). Los ensayos de doble marcaje
siguientes se realizan actualmente mediante citometría de flujo:
controles negativos, CD45/CD14, CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD19,
CD3/CD16, CD3/CD56 y CD4/CD8. Este procedimiento laborioso puede
sustituirse, de acuerdo con la presente invención, por un
procedimiento de una única etapa utilizando una matriz que contenga
anticuerpos contra dichos antígenos CD y antígenos adicionales que
definen adicionalmente los subgrupos de linfocitos afectados. Al
resultar un paciente infectado por VIH, se produce una rápida
reducción de los linfocitos CD4+ hasta un valor mínimo
aproximadamente a los 6 meses, seguido de una recuperación parcial
de sus niveles alcanzadas las 12 semanas. A largo plazo, se produce
una reducción progresiva de los linfocitos CD4+, conduciendo a la
muerte tras aproximadamente 11 años (Shinton 1998). El tratamiento
con zidovudina (AZT) induce un incremento transitorio de los
linfocitos CD4+; se propone determinar los efectos de la
quimioterapia sobre diversos subgrupos de linfocitos, de acuerdo con
la presente invención, utilizando una matriz de anticuerpos para
realizar un seguimiento de la evolución clínica de los pacientes de
VIH.
El inmunofenotipado también resulta útil para el
trasplante de médula ósea y de órganos para la determinación del
grado de inmunosupresión y complicaciones tales como el rechazo o la
infección. Se utiliza la citometría de flujo antes del trasplante
para el tipado de tejidos utilizando anticuerpos monoclonales para
detectar antígenos de HLA, o para ensayos cruzados. La tolerancia a
tejidos trasplantados resulta inducida por la administración de
ciclosporina en el paciente. El tratamiento en el momento del
trasplante fuerza el nivel de linfocitos sanguíneos periféricos
hasta prácticamente cero. Se realiza un seguimiento de la
desaparición de las células T de la sangre mediante citometría de
flujo para las células CD3+. Tras el trasplante, un incremento de
las células CD8+ señala a un posible rechazo. Los incrementos de
las células CD8+ y CD16+, CD56+ y/o CD57+ podrían indicar infección
vírica. Esta vigilancia del estado inmunológico del paciente de
trasplante se propone que se realice de manera más rápida y
extensiva utilizando una matriz de anticuerpos de la presente
invención.
Algunos pacientes de cáncer reciben
quimioterapia de dosis elevada y después requieren un trasplante de
médula ósea para regenerar su sistema inmunológico destruido. La
médula trasplantada induce la reconstitución hematopoyética, aunque
aparecen conjuntos no habituales de linfocitos, tales como células T
CD5+. Pueden producirse infecciones oportunistas y enfermedad de
injerto contra huésped en dichos pacientes, resultando en un
incremento de las células CD8+ y en una elevación de las células
asesinas naturales. La sustitución de la citometría de flujo por
una matriz de anticuerpos para los antígenos CD simplifica el
seguimiento de los pacientes y proporciona información más
exhaustiva.
Las matrices de anticuerpos para antígenos CD
también resultan útiles para el seguimiento de los cambios de los
subgrupos de linfocitos durante la terapia de desensibilización al
veneno de insectos o de arañas, por ejemplo en el caso de que el
número de linfocitos CD4+ CD45RA se incremente y el número de
linfocitos CD4+ CD45RO+ se reduzca desde niveles elevados.
Los pacientes con síndrome de fatiga crónica
pueden presentar anormalidades inmunológicas que concuerdan con una
infección vírica por linfocitos CD8+ activados. Un análisis
detallado de los subgrupos de linfocitos establece criterios
diagnósticos ampliados y proporciona información exhaustiva sobre
este trastorno.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el diagnóstico de un trastorno no
neoplásico o de una tendencia al desarrollo de un trastorno no
neoplásico en un animal, tal como un ser humano, comprendiendo
dicho dispositivo de ensayo una matriz de moléculas inmovilizadas en
un soporte sólido, en el que cada molécula del ensayo, con la
excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja
de unión respectiva en el caso de encontrarse presentes en una
muestra biológica procedente de dicho animal, en la que el patrón
de interacción entre las moléculas inmovilizadas y sus parejas de
unión respectivas es indicativo de la presencia de una trastorno no
neoplásico o de una tendencia a desarrollar un trastorno no
neoplásico.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para la detección de un tipo celular o agente
microbiano o vírico o de un patógeno, comprendiendo dicho
dispositivo de ensayo una matriz de molécula inmovilizadas en un
soporte sólido, en la que cada molécula de la matriz, con la
excepción de un control negativo, puede interactuar con una pareja
de unión respectiva en caso de encontrarse presente sobre dicho tipo
celular, agente microbiano, vírico o parasitario o patógeno, en la
que el patrón de interacción entre las moléculas inmovilizadas y
sus parejas de unión respectivas es indicativo de la presencia de
dicho tipo celular, agente microbiano, vírico o parasitario o
patógeno.
En otra forma de realización, la muestra cribada
es una biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o muestra
medioambiental. El patrón de interacción proporciona la presencia,
tipo y/o cantidad de pareja de unión. Este aspecto de la presente
invención resulta particularmente útil para el cribado de
contaminantes ambientales o el cribado de una biblioteca química o
biológica de moléculas para una molécula que presente una afinidad,
perfil de unión, perfil inmunológico y/o concentración particulares.
Una biblioteca química o biológica incluye una biblioteca de
expresión fágica u otra forma de biblioteca. Una biblioteca química
puede ser sintética o natural.
La expresión "patrón de interacción" se
utiliza en su contexto más amplio para que incluya: la presencia o
ausencia de interacción respecto a la interacción de fondo, la
densidad relativa de interacción, tal como la densidad relativa de
células unidas a un punto discreto de la matriz respecto al fondo,
el patrón de morfología de las células que se encuentran unidas a
un punto discreto de la matriz, la presencia o ausencia de moléculas
internas en células lisadas en un punto discreto de la matriz, el
número relativo de células o antígenos en la matriz, la expresión
diferencial de antígenos particulares y el número de antígenos por
célula. Cualquiera o la totalidad de los criterios anteriores puede
utilizarse para evaluar la interacción entre una molécula
inmovilizada y su pareja de unión. El patrón de expresión también
puede someterse a cuantificación.
El soporte sólido típicamente es vidrio o un
polímero, tal como, aunque sin limitación, celulosa, material
cerámico, nitrocelulosa, poliacrilamida, nilón, poliestireno y sus
derivados, difluoruro de polivinilideno (PVDF), metacrilato y sus
derivados, cloruro de polivinilo o polipropileno. La nitrocelulosa
resulta particularmente útil y preferida según la presente
invención. Un soporte sólido también puede ser un híbrido, tal como
una película de nitrocelulosa soportada sobre una matriz de vidrio
o polímero. La referencia a un "híbrido" incluye la referencia
a una disposición en capas de dos o más de las superficies de vidrio
o polímero indicadas anteriormente. El soporte sólido puede
presentar la forma de una membrana o de tubos, perlas, discos o
microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para llevar a
cabo un ensayo. Los procedimientos de unión para inmovilizar las
moléculas son bien conocidos de la técnica y generalmente consisten
en unir covalentemente (por ejemplo reticular) o adsorber
físicamente las moléculas a un sustrato sólido.
La molécula inmovilizada en el soporte sólido se
denomina en la presente memoria "P". La molécula P generalmente
se selecciona de un grupo de unión denominado "x". Se puede
seleccionar un número de n de moléculas P de cada grupo de unión o
puede seleccionarse una molécula P de cada grupo de unión. Las
moléculas P pueden disponerse en cualquier forma geométrica sobre
el soporte sólido, tal como una mancha, punto, o grupo de puntos o
manchas, o en un formato extendido o en capas. Generalmente, el
formato de mancha o punto resulta preferente. Los grupos de unión
se seleccionan basándose en el estado normal o de enfermedad o
trastorno que se diagnostica o la pareja de unión que se busca
detectar o cuantificar. En el caso del cáncer, por ejemplo, puede
determinarse un cáncer particular o el desarrollo del cáncer en
general basándose en la expresión de determinados ligandos (y más
particularmente antígenos) de superficie celular, o la liberación de
ligandos solubles (por ejemplo antígenos solubles). Las moléculas P
se seleccionan a continuación como parejas de unión a la superficie
celular, o como ligandos solubles. El patrón de interacción entre
las moléculas P y sus parejas de unión respectivas es indicativo
del desarrollo, o de la tendencia a desarrollar, de cáncer o de
otros estados de enfermedad o trastornos. En el caso de la
detección de un agente microbiano, vírico o parasitario, o de un
patógeno, las moléculas P generalmente se seleccionan como parejas
de unión a las moléculas de superficie celular, tales como
azúcares, proteínas, lipoproteínas, flagelos, pili, receptores o
componentes de pared celular. En el caso de un biblioteca química,
biblioteca de expresión fágica o muestra medioambiental, las
moléculas P generalmente, aunque no necesariamente, se seleccionan
basándose en una estructura o afinidad supuesta en la muestra. En
el caso de una biblioteca de expresión fágica, por ejemplo, el
ensayo busca un péptido, polipéptido o proteína sobre el fago que
se une a una molécula inmovilizada, que de esta manera se convierte
en un mimético de afinidad. Dichas moléculas se convierten entonces
en candidatos para análogos adicionales en forma de potenciales
miméticos de proteína.
La matriz también puede comprender un control
positivo y/o negativo para ayudar a mantener el control de calidad
del procedimiento de ensayo. Un control positivo, por ejemplo, puede
ser una molécula P capaz de interactuar con una pareja de unión que
es conocido que se encuentra presente en la muestra biológica o
química.
Se da a conocer en la presente memoria una
matriz de moléculas inmovilizadas sobre un soporte sólido, estando
definida dicha matriz por la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
P es un elemento de un grupo de unión capaz de
interactuar con una pareja de unión,
n_{1}, n_{2}, ..., n_{i} representan
diferentes elementos del grupo de unión,
x_{1}, x_{2}, ..., x_{j} representan
diferentes grupos de unión,
b, c y d representan el número de diferentes
elementos de los grupos de unión x_{1}, x_{2}, ..., x_{j},
respectivamente, y en la que b, c y d pueden ser iguales o
diferentes, y cada uno presenta un valor entre aproximadamente 0 y
aproximadamente 100, con la condición de que por lo menos uno de
entre e, f y g no sea 0,
z es el número total de grupos de moléculas en
la matriz y es un número entre aproximadamente 2 y aproximadamente
2.000,
en la que el patrón de interacción entre las
moléculas inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas es
indicativo de un estado normal o de un estado de enfermedad o
trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de
enfermedad o trastorno, o de la presencia, tipo y/o cantidad de una
pareja de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, el estado de enfermedad o
trastorno es cáncer.
Preferentemente, las moléculas en la matriz se
encuentran dispuestas en manchas discretas. z es el número de
manchas discretas de diferentes tipos de molécula. Convenientemente,
las manchas se disponen por duplicado, por lo tanto el número total
de manchas en la matriz es 2z. La representación "..." se
refiere a opcionalmente elementos adicionales en el grupo entre, por
ejemplo,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La representación de la matriz mediante la
fórmula no pretende implicar ninguna limitación respecto a la forma
o secuencia de la matriz.
Las moléculas P son inmunoglobulinas y sus
parejas de unión son antígenos. Sin embargo, también se dan a
conocer en la presente memoria otras clases de moléculas P, tales
como, aunque sin limitación, receptores, ligandos de receptores,
moléculas ligantes de antígeno derivadas de células T (TABM) u otras
moléculas que presentan afinidad para determinados ligandos, tales
como lectinas, proteínas ligantes de ácidos nucleicos, entre otras.
Más preferentemente, la molécula P es una inmunoglobulina capaz de
interactuar con un antígeno presente, por ejemplo, sobre la
superficie de una célula normal o cancerosa, o un antígeno soluble
liberado por una célula normal o cancerosa, o presente en una
biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o muestra
medioambiental.
La matriz de moléculas P, y más particularmente
las moléculas de inmunoglobulina, se seleccionan basándose en los
antígenos que probablemente se expresarán durante un estado de
enfermedad o trastorno, tal como cáncer, o un antígeno generalmente
presente sobre una célula normal, o un antígeno presente en un
agente microbiano, vírico o parasitario, o patógeno. El
"antígeno" también puede ser una parte de una biblioteca
química, biblioteca de expresión fágica o puede encontrarse en una
muestra medioambiental. El término "antígeno" se utiliza en su
sentido más amplio e incluye las proteínas asociadas a la membrana
plasmática con dominios extracelulares, proteínas asociadas a
canales iónicos, así como receptores, grupos carbohidrato y
similares. El patrón de unión de las moléculas de inmunoglobulina a
antígenos diana ayuda, de esta manera, en el diagnóstico del estado
de enfermedad o en la determinación de un estado normal. La matriz
más preferentemente comprende además controles internos positivo y
negativo.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho
dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados
o equivalentes funcionales de las mismas inmovilizadas en regiones
discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones
discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, y en
el que los antígenos se expresan sobre la superficie de células
normales o cancerosas o resultan liberados por células normales o
cancerosas, en la que el patrón de unión de las inmunoglobulinas
inmovilizadas a sus antígenos respectivos es indicativo de la
presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer, o de la
presencia de un estado normal.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para un trastorno no neoplásico, comprendiendo
dicho dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o
derivados o equivalentes funcionales de las mismas inmovilizadas en
regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes
regiones discretas presentan especificidad para diferentes
antígenos y en el que los antígenos se expresan sobre la superficie
de células no neoplásicas o resultan liberados por células no
neoplásicas, en la que el patrón de unión de las inmunoglobulinas
inmovilizadas a sus antígenos respectivos es indicativo de la
presencia de un trastorno no neoplásico o de una tendencia a
desarrollar un trastorno no neoplásico.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para un agente microbiano, vírico u otro
agente patógeno, comprendiendo dicho dispositivo una matriz de
moléculas de inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales
de las mismas inmovilizadas en regiones discretas del soporte
sólido, de manera que diferentes regiones discretas presentan
especificidad para diferentes antígenos, y en la que los antígenos
se expresan sobre la superficie de dicho agente microbiano, vírico
o parasitario, o patógeno, o resultan liberados por los mismos, y
el patrón de unión de los antígenos a las inmunoglobulinas
inmovilizadas es indicativo de la presencia o ausencia de dicho
microbio, virus, parásito o patógeno.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para una pareja de unión en una biblioteca
química, biblioteca de expresión fágica o muestra medioambiental,
comprendiendo dicho dispositivo una matriz de moléculas de
inmunoglobulina o derivados o equivalentes funcionales de las mismas
inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera
que diferentes regiones discretas presentan especificidad para
diferentes antígenos, en la que el patrón de unión de los antígenos
a las inmunoglobulinas inmovilizadas es indicativo de la presencia,
tipo y/o cantidad de dicha pareja de unión.
Generalmente, se selecciona un abanico de
inmunoglobulinas basándose en los antígenos expresados sobre células
normales, células cancerosas, células cancerosas potenciales,
microbios, virus, parásitos u otros patógenos, células infectadas o
afectadas por un patógeno, o antígenos encontrados en una biblioteca
química, biblioteca de expresión fágica o muestra medioambiental.
Cada grupo de inmunoglobulinas específicas para un antígeno
diferente se define como x_{1}, x_{2}, ..., x_{j}. En una
forma de realización, una muestra contiene una población mixta de
células y las moléculas de inmunoglobulina en la matriz están
diseñadas para unirse selectivamente a antígenos sobre tipos
celulares particulares. En otra forma de realización, la muestra es
una mezcla de moléculas químicas, incluyendo compuestos sintéticos
(por ejemplo alcanos, alquenos, aromáticos, polímeros, moléculas
cíclicas), oligosacáridos, proteínas, lípidos, lipoproteínas y
carbohidratos. Las inmunoglobulinas también pueden reconocer
específicamente diferentes epítopos en el mismo antígeno. Una mancha
discreta de anticuerpos puede comprender inmunoglobulinas con una
única especificidad epitópica o las inmunoglobulinas pueden ser un
grupo heterogéneo de múltiples epítopos sobre el mismo antígeno. Una
mancha discreta de anticuerpos también puede contener múltiples
anticuerpos contra diferentes antígenos aunque se expresen todos,
por ejemplo, sobre una célula particular. Lo expuesto anteriormente
resulta útil en el caso de que se importe la captura de la célula
para el análisis posterior.
\newpage
Dentro de cada uno de los grupos x_{1},
x_{2}, ..., x_{j}, pueden encontrarse varios subgrupos de
inmunoglobulinas que son específicas para diferentes partes del
mismo antígeno definidas por los grupos x_{1}, x_{2}, ...,
x_{j}. Dichos subgrupos se definen como n_{1}, n_{2}, ...,
n_{j}.
Se da a conocer en la presente memoria una
matriz de inmunoglobulinas o derivados, o equivalentes químicos de
los mismos, específicos para antígenos expresados sobre células
normales o cancerosas o liberados por células normales o cancerosas
o expresados sobre microbios, virus, parásitos o patógenos, o
antígenos putativamente presentes en una biblioteca química,
biblioteca de expresión fágica o muestra medioambiental, en la que
cada grupo de inmunoglobulinas específicas para cada antígeno o
parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido,
estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:
en la
que:
q es una inmunoglobulina específica para un
antígeno expresado sobre una célula normal o cancerosa, o para un
antígeno liberado por una célula normal o cancerosa, o expresado
sobre microbios, virus, parásitos o patógenos, o antígenos
putativamente presentes en una biblioteca química, biblioteca de
expresión fágica o muestra medioam-
biental,
biental,
m_{1}, m_{2}, ..., m_{i} representan
elementos del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a
diferentes partes del mismo antígeno,
o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan
diferentes grupos de inmunoglobulinas definidos por la especificidad
para diferentes antígenos.
e, f y g representan los números de diferentes
inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2},
..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser
iguales o diferentes y cada uno presenta un valor entre 0 y 100,
y es el número total de grupos de
inmunoglobulinas en la matriz y presenta un valor entre
aproximadamente 2 y aproximadamente 2.000,
en la que el patrón de interacción entre las
inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos es
indicativo de un estado normal o del desarrollo de cáncer o de una
tendencia a desarrollar cáncer, o de la presencia de un microbio,
virus, parásito o patógeno, o de la presencia, tipo y/o cantidad de
una pareja de unión en dicha muestra química o medioambiental.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha indicado anteriormente, la matriz
también puede contener un control positivo y/o negativo.
Generalmente, las inmunoglobulinas se disponen en manchas discretas,
en donde y es el número total de manchas discretas de diferentes
tipos de inmunoglobulina. Preferentemente, las manchas se disponen
por duplicado. La representación "..." es tal como se ha
definido anteriormente en la presente memoria.
Las inmunoglobulinas interactúan con antígenos
de grupo de diferenciación o de denominación de grupo (CD) o
antígenos mieloides (MY) o linfoides (LY) expresados sobre las
células leucémicas. El cáncer o la tendencia a desarrollar cáncer
se detecta a partir de un incremento de la población o proporción de
células que portan antígenos particulares.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho
dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados
o equivalentes funcionales de las mismas inmovilizadas en regiones
discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones
discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de
denominación de grupo y/o antígenos mieloides y/o linfoides
expresados sobre células leucémicas, en las que el patrón de unión
de las inmunoglobulinas inmovilizadas a sus antígenos respectivos
es indicativo de la presencia de cáncer o de una tendencia a
desarrollar cáncer.
Preferentemente, las inmunoglobulinas son
anticuerpos monoclonales, aunque la presente invención se extiende
a los anticuerpos policlonales o partes ligantes de antígeno (por
ejemplo fragmentos Fab), derivados, homólogos o análogos de los
mismos, así como a los anticuerpos de fusión o híbridos, anticuerpos
sintéticos o anticuerpos recombinantes.
\newpage
Se da a conocer en la presente memoria una
matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de
los mismos, específicos para antígenos expresados sobre células no
neoplásicas, o liberados por células no neoplásicas, o expresados
sobre células microbianas o parasitarias, o patógenos, o sobre
virus, en las que cada grupo de inmunoglobulinas específicas para
cada antígeno o parte del mismo ocupa una región discreta de un
soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula
siguiente:
en la
que:
q es una inmunoglobulina específica para el
antígeno,
m_{1}, m_{2}, ..., m_{i} representan
miembros del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a
diferentes partes del mismo antígeno,
o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan
diferentes grupos de inmunoglobulinas definidas por la especificidad
para diferentes antígenos.
e, f y g representan los números de diferentes
inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2},
..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser
iguales o diferentes y cada uno presenta un valor entre 0 y 100, con
la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,
y es el número de grupos de inmunoglobulinas en
la matriz y presenta un valor entre aproximadamente 1 y
aproximadamente 2.000,
en la que el patrón de interacción entre las
inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos es
indicativo del desarrollo de un trastorno no neoplásico o de una
tendencia a desarrollar un trastorno no neoplásico o de la presencia
de un microbio, parásito, patógeno o virus particular.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección de la unión
antígeno-inmunoglobulina puede llevarse a cabo de
varias maneras. Por ejemplo, en el caso de que los antígenos sean
antígenos de superficie celular, la matriz puede diseñarse para
permitir la unión de las células a las inmunoglobulinas
inmovilizadas. Las células capturas seguidamente pueden analizarse
mediante microscopía, utilizando diversas tinciones, bioquímicamente
o inmunológicamente.
Alternativamente, las inmunoglobulinas
inmovilizadas actúan a modo de moléculas de captura para tipos
celulares particulares y la expresión de otros antígenos sobre
células normales o cancerosas se determina seguidamente utilizando
anticuerpos marcados (por ejemplo anticuerpos marcados
fluorescentemente o radioactivamente) o mediante otros medios
convenientes. Preferentemente, los anticuerpos se encuentran libres
en solución. Las moléculas de captura también puede ser para
antígenos solubles o para células desprendidas de tumores sólidos.
En relación a este último caso, convenientemente se producen
suspensiones celulares a partir de biopsias de tumor sólido y las
suspensiones celulares se ponen en contacto con la matriz de
inmunoglobulinas.
En el caso de que la matriz de inmunoglobulinas
inmovilizadas se haya diseñado para unirse a antígeno libre (es
decir, antígeno soluble), el antígeno captura puede detectarse
inmunológicamente o por otros medios.
El dispositivo de ensayo de la presente
invención preferentemente es un soporte sólido que presenta una
superficie plana lisa. Entre los ejemplos de soporte sólidos
adecuados se incluyen membranas, cubreobjetos de plástico,
portaobjetos de vidrio o los pocillos de placas de microtitulación.
Resulta particularmente preferida la nitrocelulosa. El soporte
sólido comprende una matriz de regiones recubiertas de
inmunoglobulina, preferentemente en forma de manchas u otro patrón
geométrico. Las manchas son discretas y se encuentran circundadas
por regiones que no contienen ninguna molécula de inmunoglobulina.
Las inmunoglobulinas dentro de una región dada o mancha
generalmente se inmovilizan mediante enlaces covalentes o no
covalentes. Las inmunoglobulinas preferentes son los anticuerpos
monoclonales.
Preferentemente, las manchas de la matriz se
disponen en una secuencia, tal como una matriz rectangular,
triangular o esférica, en la que la posición de una región de
inmunoglobulina está definida por coordenadas de, por ejemplo, fila
y columna. La matriz de inmunoglobulinas puede cubrir cualquier
región conveniente, tal como entre aproximadamente 0,1 mm^{2} y
aproximadamente 100 mm^{2}, preferentemente entre aproximadamente
0,5 mm^{2} y aproximadamente 15 mm^{2}. Generalmente, cada
región o mancha está formada de inmunoglobulinas que presentan una
única especificidad diferenciada. La especificidad en el presente
contexto se refiere a diferentes antígenos o a diferentes regiones
de un solo antígeno. El número preferido de manchas de
inmunoglobulina es de entre aproximadamente 7 y aproximadamente
1.000, y más preferentemente de entre aproximadamente 10 y
aproximadamente 1.000. Más preferentemente, las inmunoglobulinas se
disponen en múltiples, tal como por duplicado, por triplicado o
superior.
La matriz inmovilizada de inmunoglobulinas se
pone a continuación en contacto con una muestra biológica que
comprende células, residuos celulares, extractos celulares, líquido
tisular, suero, sangre, líquido cerebroespinal, orina, líquido
linfático, aspirado, aspirado de médula ósea, moco u otro tejido o
líquido corporal. Alternativamente, la muestra es una muestra
química o una muestra medioambiental, tal como una biblioteca
química, muestra acuática o muestra terrestre. Preferentemente, la
muestra contiene una población mixta de células. El contacto se
lleva a cabo durante un periodo de tiempo y bajo condiciones
suficientes para que las células que portan antígenos particulares
resulten capturadas por las inmunoglobulinas inmovilizadas o para
que los antígenos libres resulten capturados por las
inmunoglobulinas inmovilizadas. Las células y antígenos capturados
seguidamente pueden detectarse mediante cualquier medio
conveniente, tal como bioquímicamente, histoquímicamente,
inmunológicamente o microscópicamente. La detección inmunológica
resulta particularmente conveniente. Por ejemplo, puede añadirse
una segunda inmunoglobulina específica para un antígeno o célula
capturada, marcada con una molécula informadora. La identificación
de la molécula informadora indica que el antígeno ha sido capturado.
Alternativamente, tras la adición de la segunda inmunoglobulina,
ésta forma un complejo con el antígeno capturado, se añade una
inmunoglobulina antiinmunoglobulina marcada con una molécula
informadora y se determina la presencia de una señal procedente de
la molécula informadora.
La expresión "molécula informadora", tal
como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula
que, debido a su naturaleza química, proporciona una señal
analíticamente identificable que permite la detección de antígeno
unido a inmunoglobulina. La detección puede ser cualitativa o
cuantitativa. Las moléculas informadas utilizadas más comúnmente en
este tipo de ensayo son enzimas, fluoróforos o moléculas que
contienen radionucleidos (es decir, isótopos radioactivos). En el
caso de un inmunoensayo enzimático, se conjuga un enzima con la
segunda o tercera inmunoglobulina, generalmente por medio de
glutaraldehído o peryodato. Sin embargo, tal como se reconocerá
fácilmente, existe una amplia diversidad de diferentes técnicas de
conjugación que se encuentran fácilmente disponibles para el
experto en la materia. Entre los enzimas utilizados comúnmente se
utilizan peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa,
\beta-galactosidasa y alcalina fosfatasa, entre
otros. Los sustratos que se utilizarán con enzimas específicos
generalmente se seleccionan para la producción, tras la hidrólisis
por el enzima correspondiente, de un cambio de color detectable.
También resulta posible utilizar sustratos fluorogénicos que
proporcionan un producto
fluorescente.
fluorescente.
Alternativamente, pueden acoplarse químicamente
compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, a
inmunoglobulinas sin alterar su capacidad de unión. Al resultar
activadas por la iluminación con luz de una longitud de onda
particular, la inmunoglobulina marcada con fluorocromo absorbe la
energía lumínica, induciendo un estado de excitabilidad de la
molécula, seguido de la emisión de luz de un color característico
visualmente detectable microscópicamente o utilizando otros
dispositivos de obtención de imágenes, tales como un microscopio
confocal o un escáner láser bidimensional (por ejemplo FluorImager o
Typhoon, Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale,
USA).
USA).
La presencia de cáncer o de una tendencia a
desarrollar cáncer, o la presencia de un estado de enfermedad no
cáncer puede indicarse por un cambio de un número o proporción
particular de células que portan antígenos particulares. Por
ejemplo, un incremento de determinados tipos celulares será
indicativo de condiciones particulares.
Se da a conocer en la presente memoria un método
para determinar la presencia de un estado de enfermedad o
trastorno, o de una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad
o trastorno, tal como, aunque sin limitación, cáncer en un animal,
especie de ave o planta, comprendiendo dicho método obtener una
muestra biológica de dicho animal, especie de ave o planta, que
comprende parejas de unión libres o parejas de unión unidas a una
superficie celular, estando dichas parejas de unión asociadas
directa o indirectamente a dicho estado de enfermedad o trastorno,
y la puesta en contacto de dicha muestra biológica con un soporte
sólido que comprende una matriz de moléculas capaces de unirse a
dichas parejas de unión, en la que el patrón de interacción con las
parejas de unión resulta indicativo del estado de enfermedad o
trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de
enfermedad o
trastorno.
trastorno.
Preferentemente, las parejas de unión comprenden
dos o más antígenos diferentes asociados al estado de enfermedad o
trastorno, y la matriz de moléculas es una matriz de
inmunoglobulinas que presentan especificidad para los diferentes
grupos de antígenos.
El patrón de interacción puede determinarse
mediante cualquier medio convencional, tal como mediante
inmunoensayo, examen microscopio o técnicas histológicas o
bioquímicas. El patrón de interacción también puede determinarse
mediante impulso eléctrico, emisiones electrónicas y/o emisiones
radioactivas.
Se da a conocer en la presente memoria un método
para detectar cáncer o una tendencia a desarrollar cáncer en un ser
humano o animal no humano, comprendiendo dicho método la obtención
de una muestra biológica de dicho ser humano o animal no humano y
poner en contacto dicha muestra biológica con una matriz de
inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de los mismos
específicos para antígenos expresados sobre células normales o
cancerosas o liberados por células normales o cancerosas, en la que
cada grupo de inmunoglobulinas específicas para cada antígeno o
parte del mismo ocupa una región discreta de un soporte sólido,
estando definida dicha matriz por la fórmula siguiente:
en la
que:
q es una inmunoglobulina específica para un
antígeno expresado sobre una célula normal o cancerosa, o para un
antígeno liberado por una célula normal o cancerosa,
m_{1}, m_{2}, ..., m_{i} representan
miembros del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a
diferentes partes del mismo antígeno,
o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan
diferentes grupos de inmunoglobulinas definidas por la especificidad
para diferentes antígenos.
e, f y g representan los números de diferentes
inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2},
..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g puede ser
iguales o diferentes y cada uno presenta un valor entre 0 y 100, con
la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea 0,
y es el número total de grupos de
inmunoglobulinas en la matriz y presenta un valor de entre
aproximadamente 2 y aproximadamente 2.000,
en la que el patrón de interacción entre las
inmunoglobulinas inmovilizadas y sus antígenos respectivos es
indicativo del desarrollo de cáncer o de una tendencia a desarrollar
cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Se da a conocer en la presente memoria una
matriz de moléculas capaces de interactuar con una pareja de unión
respectiva putativamente en una muestra biológica, para determinar
la presencia de un estado de enfermedad o trastorno, o de una
tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o trastorno.
Preferentemente las moléculas son
inmunoglobulinas.
Preferentemente, las inmunoglobulinas son
específicas para todos los antígenos unidos o solubles, tales como
antígenos sobre células cancerosas o liberados por las mismas.
En una forma de realización particularmente
preferida, el patrón de interacción se mide cualitativa o
cuantitativamente como patrón de densidad de las células unidas a
las moléculas en la matriz o de antígenos libres de las células,
que se han unido a las moléculas de la matriz. El patrón de densidad
puede determinarse, por ejemplo, macroscópica o microscópicamente,
o puede obtenerse con la ayuda de inteligencia artificial, tal como
mediante la utilización de un densitómetro guiado por ordenador.
Además, la presente invención comprende la cuantificación del patrón
de unión. Entre los aspectos computacionales de las matrices de
anticuerpos se incluyen, por ejemplo, el número de células, los
patrones de unión de antígenos o de células, las densidades de
células unidas por mancha, o el numero de antígenos por célula.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo que comprende una matriz de moléculas en la
que cada molécula en la matriz, con la excepción de un control
negativo, puede interactuar con su pareja de unión respectiva,
putativamente presente en una muestra biológica de un animal,
especie de ave o planta, en la que las moléculas se encuentran
dispuestas en dicha matriz de manera que, al interactuar las
moléculas y las parejas de unión, un patrón diferencial de densidad
proporciona una señal identificable que es indicativo de un estado
de enfermedad o trastorno, o de una tendencia a desarrollar un
estado de enfermedad o trastorno.
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el diagnóstico del cáncer o de una
tendencia a desarrollar cáncer, en un animal, tal como un ser
humano, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo una matriz de
moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, en la que cada
molécula en la matriz, con la excepción de un control negativo,
puede interactuar con una pareja de unión respectiva en el caso de
encontrarse presente en una muestra biológica de dicho animal, en
la que las moléculas se encuentran dispuestas en dicha matriz de
manera que, al interactuar las moléculas inmovilizadas con sus
parejas de unión respectivas, un patrón diferencial de densidad
proporciona una señal identificable que es indicativo de la
presencia de cáncer o de una tendencia a desarrollar
cáncer.
cáncer.
Preferentemente, las moléculas inmovilizadas son
inmunoglobulinas y las parejas de unión son antígenos unidos a
células, antígenos celulares internos o antígenos solubles (es
decir, libres).
En una forma de realización particularmente
preferida, las inmunoglobulinas se disponen en una matriz de manera
que, en el caso de que se encuentre presente un cáncer para el que
se cribe, el patrón de interacción proporciona una densidad
diferencial que proporciona una forma identificable, tal como una
letra, número o diseño geométrico que puede detectarse
fácilmente.
Por ejemplo, los antígenos que probablemente se
expresan durante la leucemia mieloide aguda (AML) pueden disponerse
de manera que la letra "A" se muestra preferentemente en forma
de puntos más densos respecto al fondo. La letra "A" se utiliza
meramente con fines de ejemplificación, debido a que puede
utilizarse cualquier forma o disposición geométricas.
Se da a conocer en la presente memoria una
matriz de moléculas inmovilizadas en un soporte sólido, estando
definida dicha matriz por la fórmula siguiente:
en la
que:
P es un miembro de un grupo de unión capaz de
interactuar con una pareja de unión,
n_{1}, n_{2}, ..., n_{i} representan
diferentes miembros del grupo de unión,
x_{1}, x_{2}, ..., x_{j} representan
diferentes grupos de unión,
b, c y d representan el número de diferentes
elementos de los grupos de unión x_{1}, x_{2}, ..., x_{j},
respectivamente, y en los que b, c y d pueden ser iguales o
diferentes y cada uno presenta un valor entre aproximadamente 0 y
aproximadamente 100, con la condición de que por lo menos uno de
entre b, c o d no sea 0,
z es el número total de grupos moléculas en la
matriz y es un número entre aproximadamente 1 y aproximadamente
2.000,
en la que las moléculas se encuentran dispuestas
en dicha matriz de manera que al interactuar las moléculas
inmovilizadas y sus parejas de unión respectivas, un patrón
diferencial de densidades dentro de un grupo de unión proporciona
una señal identificable que es indicativa de un estado de enfermedad
o trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de
enfermedad o trastorno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho
dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados
o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizadas en regiones
discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones
discretas presentan especificidad para diferentes antígenos, y en
la que los antígenos se expresan sobre la superficie de células
normales o cancerosas o resultan liberados por células normales o
cancerosas, en las que las inmunoglobulinas ligantes se encuentran
en una disposición en dicha matriz en la que el patrón de
inmunoglobulinas inmovilizadas con sus antígenos respectivos
proporciona un patrón diferencial de densidad que presenta la forma
de una señal identificable que es indicativa de la presencia de
cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.
Se da a conocer en la presente memoria una
matriz de inmunoglobulinas o derivados o equivalentes químicos de
los mismos, específicos para antígenos expresados sobre células
normales o cancerosas, o liberados por células normales o
cancerosas, en las que cada grupo de inmunoglobulinas específicas
para cada antígeno o parte del mismo ocupa una región discreta de
un soporte sólido, estando definida dicha matriz por la fórmula
siguiente:
en la
que:
q es una inmunoglobulina específica para un
antígeno expresado sobre una célula normal o cancerosa, o para un
antígeno liberado por una célula normal o cancerosa,
m_{1}, m_{2}, ..., m_{j} representan
elementos del mismo grupo de inmunoglobulinas que se unen a
diferentes partes del mismo antígeno,
o_{1}, o_{2}, ..., o_{k} representan
diferentes grupos de inmunoglobulinas definidas por la especificidad
para diferentes antígenos.
e, f y g representan los números de diferentes
inmunoglobulinas dentro de cada uno de los grupos o_{1}, o_{2},
..., o_{k}, respectivamente, y en los que e, f y g pueden ser
iguales o diferentes, y cada uno presenta un valor de entre 0 y 100,
con la condición de que por lo menos uno de entre e, f y g no sea
0,
y es el número total de grupos de
inmunoglobulinas en la matriz y es un número entre aproximadamente 1
y aproximadamente 2.000,
en la que las moléculas se encuentran dispuestas
en dicha matriz de manera que, al interactuar las inmunoglobulinas
inmovilizadas y sus antígenos respectivos, un patrón diferencial de
densidad proporciona una señal identificable que es indicativa del
desarrollo de cáncer o de una tendencia a desarrollar cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Se da a conocer en la presente memoria un
dispositivo de ensayo para el cáncer, comprendiendo dicho
dispositivo una matriz de moléculas de inmunoglobulina o derivados
o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizados en regiones
discretas del soporte sólido, de manera que diferentes regiones
discretas presentan especificidad para diferentes antígenos de
grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos linfoides (LY) y/o
mieloides (MY) expresados sobre células leucémicas, en las que las
moléculas se encuentran dispuestas en dicha matriz de manera que,
al unirse las inmunoglobulinas inmovilizadas a sus antígenos
respectivos, un patrón diferencial de densidad proporciona una
señal identificable que es indicativa de la presencia de cáncer o de
una tendencia a desarrollar cáncer.
Se da a conocer en la presente memoria un método
para determinar la presencia de un estado de enfermedad o
trastorno, o una tendencia a desarrollar un estado de enfermedad o
trastorno, tal como, aunque sin limitación, cáncer en un animal,
especie de ave o planta, comprendiendo dicho método la obtención de
una muestra biológica de dicho animal, especie de ave o planta, que
comprende parejas de unión libres o parejas de unión unidas a una
superficie celular, encontrándose dichas parejas de unión asociadas
directa o indirectamente a dicho estado de enfermedad o trastorno,
y la puesta en contacto de dicha muestra biológica con un soporte
sólido que comprende una matriz de moléculas capaces de unirse a
dichas parejas de unión, en la que las moléculas se encuentran
dispuestas en dicha matriz de manera que, al interactuar las parejas
de unión, un patrón diferencial de densidad proporciona una señal
identificable que es indicativa del estado de enfermedad o
trastorno, o de una tendencia a desarrollar dicho estado de
enfermedad o trastorno.
Se da a conocer en la presente memoria un método
para tratar el cáncer en un ser humano o animal no humano,
comprendiendo dicho método la obtención de una muestra biológica de
dicho ser humano o animal no humano y la puesta en contacto de
dicha muestra con una matriz de moléculas de inmunoglobulina o
derivados o equivalentes funcionales de las mismas, inmovilizadas
en regiones discretas del soporte sólido, de manera que diferentes
regiones discretas presentan especificidad para diferentes
antígenos, y en las que los antígenos se expresan sobre la
superficie de células normales o cancerosas o resultan liberados por
células normales o cancerosas, y la determinación del patrón de
unión de las inmunoglobulinas inmovilizadas a sus antígenos
respectivos, y después llevar a cabo la inmunoterapia utilizando
los anticuerpos contra los antígenos expresados. Estos anticuerpos
preferentemente son anticuerpos monoclonales humanizados. También
puede utilizarse un método similar para tratar las condiciones no
neoplásicas.
El dispositivo de ensayo y los métodos para
llevar a cabo los ensayos de la presente invención se adaptan con
facilidad para la automatización. Por ejemplo, pueden utilizarse
sistemas robóticos para administrar cantidades apropiadas,
incluyendo volúmenes de nanolitros de inmunoglobulinas, a un soporte
sólido, tal como una película de nitrocelulosa o una placa de
microtitulación. Tras el tratamiento apropiado, las inmunoglobulinas
inmovilizadas seguidamente pueden utilizarse en cualquier ensayo.
Nuevamente, éste puede automatizarse o llevarse acabo utilizando
sistemas robóticos.
Se da a conocer en la presente memoria la
utilización de una matriz de anticuerpos tal como se describe en la
presente memoria en la fabricación de un dispositivo de ensayo para
la detección de un estado de enfermedad o de una tendencia a
desarrollar un estado de enfermedad, o para la detección de un
microbio, virus, parásito o patógeno o para el cribado de una
biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o muestra
medioambiental.
La matriz de la presente invención también puede
adaptarse para la utilización en un microchip. La tecnología de
microchips permite la generación de miles de patrones de anticuerpos
para un rango de condiciones y permite además la automatización y/o
el análisis por ordenador. Un "microchip" incluye un soporte de
matriz que comprende una serie organizada de moléculas adaptadoras,
ligandos o parejas de unión potenciales.
Se da a conocer en la presente memoria un método
de tratamiento que comprende identificar un antígeno utilizando una
matriz de anticuerpos que es específica de una célula enfermedad o
que es específica de un estado de enfermedad, o que actúa como
mimético de una proteína, preparar un anticuerpo contra dicho
antígeno o un agente citotóxico específico para dicho antígeno, y
después administrar dicho anticuerpo o agente citotóxico durante un
tiempo y bajo condiciones suficientes para llevar a cabo dicho
tratamiento.
En una forma de realización, el anticuerpo es
una forma humanizada de un anticuerpo no derivado del ser humano.
En otra forma de realización, el antígeno humano o humanizado se
conjuga con una molécula citotóxica. Se describen en la presente
memoria composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo,
agente citotóxico o mimético de proteína. Dicha composición también
puede contener uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente
aceptables.
A título de ejemplo únicamente, a continuación
se describe la presente invención haciendo referencia a una forma de
realización particular, es decir la utilización de una matriz para
detectar antígenos CD. La descripción siguiente de ningún modo
pretende limitar la presente invención a una forma de realización
particular.
La matriz de anticuerpos del presente aspecto de
la presente invención permite la detección rápida y simultánea de
la expresión de antígenos CD sobre la superficie de leucocitos
aislados a partir de la sangre. Los anticuerpos contra 51 antígenos
CD, 4 anticuerpos de control de isotipo murino (IgG1, IgG2a, IgG2b,
IgM) y anticuerpos contra 7 otros marcadores de superficie que
resultan importantes en el diagnóstico de leucemias (glicoforina A,
HLA-DR, KOR-SA3544, FMC7,
inmunoglobulinas kappa y lambda) se unen en forma de puntos de 5 nl
a una película de nitrocelulosa sobre portaobjetos de microscopía.
Únicamente los leucocitos que expresan antígenos CD particulares se
unen al punto de anticuerpos correspondiente. Se identifican
categorías particulares de leucocitos que expresan subgrupos
específicos de antígenos CD a partir del patrón de puntos obtenidos
de la unión de las células a la matriz de anticuerpos de CD. Se
identifican diversos tipos de leucocitos y leucemias con un elevado
grado de certidumbre a partir del patrón de expresión de los
antígenos CD, en el que diferentes subgrupos de leucocitos expresan
diferentes combinaciones de aproximadamente 12 a 20 de los antígenos
representados en la matriz (figuras 1 y 2). Esta forma de análisis
multifactorial se basa en el reconocimiento de patrones para
diferentes leucocitos y leucemias. La presente invención permite
utilizar un gran número de anticuerpos, provocando que esta
identificación resulte bastante robusta, ya que tolera variaciones
de la expresión entre diferentes muestras o individuos.
Los leucocitos maduros se diferencian a partir
de células madre en la médula ósea siguiendo linajes particulares
hasta células mieloides y linfocitos T y B. La expresión de los
antígenos CD cambia a medida que se diferencian las células
precursoras a partir de las células madre siguiendo los diversos
linajes hasta formar subpoblaciones de leucocitos maduros que
expresan un subconjunto particular de antígenos CD. De esta manera,
el subconjunto de antígenos CD expresados en una leucemia puede ser
similar al de una célula precursora en un linaje particular.
Alternativamente, el bloqueo de un linaje particular mediante
mutación puede resultar en la diferenciación de precursores para
formar células que expresan una combinación no habitual de antígenos
CD.
La aplicación de la matriz de anticuerpos de la
invención se ilustra mediante la determinación de la expresión de
los antígenos CD sobre leucocitos de sangre periférica (PBL)
normales y sobre células de leucemia linfocítica crónica (CLL). Las
células CLL se unen a los puntos de anticuerpos con una intensidad
uniforme. Además, las células CCL se unen a menos puntos de
anticuerpos que las PBL normales. Se sometieron a ensayo muestras de
sangre procedentes de pacientes de CLL con enfermedad avanzada con
recuentos de glóbulos blancos (WBC) de entre 30x10^{9} y
86x10^{9} células/l, y también de pacientes con recuentos WBC
comparables a la densidad de PBL normales (10x10^{9} células/l).
El patrón de la matriz de anticuerpos para esta CLL de bajo nivel
todavía podía distinguirse del de las PBL normales (ver los
resultados para el paciente de CLL denominado KB, representado en la
figura 8c).
En resumen, se utilizó una matriz prototipo de
62 anticuerpos (se muestran matrices de 54 y 60 puntos en las
figuras 7 y 8, respectivamente) para permitir la identificación
rápida y reproducible de subgrupos de antígenos CD sobre células
PBL y CLL normales. Esta matriz permite el diagnóstico de diferentes
tipos de leucemias y linfomas basándose en la expresión de los
antígenos CD. La identificación de antígenos CD no habituales en la
leucemia o en un linfoma proporciona una diana para el tratamiento
del paciente con un anticuerpo monoclonal humanizado contra ese
antígeno. Por ejemplo, el rituximab es antiCD20 utilizado para
tratar los linfomas de células B, tales como el linfoma no de
Hodgkins (NHL). Campath-1H es antiCD52 utilizado
para tratar las leucemias crónicas de células T y B, tales como
T-PLL y B-CLL. Las matrices de
anticuerpos de CD de este tipo también resultan útiles para el
diagnóstico y tratamiento de trastornos no neoplásicos que implican
leucocitos, tales como las enfermedades autoinmunológicas e
inmunodeficientes, VIH y mononucleosis. Además, el método podría
utilizarse para el análisis de leucocitos en sangre del cordón y
aspirados de médula ósea.
La descripción siguiente proporciona el método
más preferido para la preparación de las matrices de anticuerpos.
El panel de anticuerpos se utiliza generalmente para construir
matrices de anticuerpos con el sistema Aspirate and Dispense
PixSys^{TM} 3200 de Cartesian Technologies. Se seleccionan los
anticuerpos para la utilización en un diagnóstico o protocolo de
detección particular. Cada anticuerpo se aplica generalmente en un
volumen de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 nanolitros
en un formato de puntos a intervalos aproximados de entre 0,5 y 1,5
mm para crear una matriz apropiada sobre una película de
nitrocelulosa generalmente sobre un soporte sólido, tal como,
aunque sin limitación, un portaobjetos de microscopía. Tras la
creación de los puntos, se evalúan los soportes en una caja de luz
y se marcan ligeramente las esquinas de las matrices utilizando,
por ejemplo, un lápiz de plomo. A continuación, se sumergen las
matrices de anticuerpos en un agente de bloqueo, tal como, aunque
sin limitación, leche desnatada, extracto de musgo irlandés u otra
fuente de carragenano o gelatina. Resulta particularmente útil la
leche desnatada en polvo aproximadamente entre el 2% y
aproximadamente el 15% p/v en PBS a 4ºC durante la noche, o a 37ºC
durante entre aproximadamente 60 y 120 minutos. Tras la aplicación
del agente de bloqueo, los soportes sólidos se lavan suavemente con
agua purificada y se dejan secar a temperatura ambiente durante 60
a 120 minutos. A continuación, se almacenan los soportes sólidos en
una bolsa hermética al aire a 4ºC en la oscuridad.
Las células que deben someterse a ensayo en las
matrices de anticuerpos se recolectan frescas o se reconstituyen a
partir de muestras almacenadas en nitrógeno líquido. Las células se
lavan en PBS y se resuspenden a una densidad de entre
aproximadamente 1x10^{5} y 1x10^{9} células/ml. A continuación,
se preparan soporte sólidos mediante calentamiento de los mismos a
temperatura ambiente y se humectan con PBS. Seguidamente se secan
los bordes de la nitrocelulosa siguiendo el límite de la matriz
marcada y se introduce en un ambiente húmedo, tal como una placa de
Petri revestida de celulosa húmeda. Se pipetean entre
aproximadamente 100 \mul y aproximadamente 500 \mul de
suspensión celular sobre el portaobjetos dentro de los bordes secos
de la matriz. A continuación, se incuba la matriz con las células
en la placa de Petri cerrada humidificada durante aproximadamente
30 minutos a temperatura ambiente. El tiempo y temperatura de la
incubación en este punto pueden modificarse para adaptarse a las
condiciones particulares a conveniencia de la persona que realiza el
ensayo.
Tras la incubación con las células, los soporte
sólidos se sumergen cuidadosamente en PBS, después se introducen en
una placa de Petri de PBS y se agitan suavemente para lavar las
células no unidas específicamente a la matriz. En el caso de que se
haya producido unión de fondo significativa según se observa
mediante examen microscópico, se repite la etapa de lavado.
A continuación se observa al microscopio la
matriz utilizando, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia
Olympus BX60 (Olympus Optical Company, Japón) con un objetivo UPLan
4x con el condensador fijado en la posición de la fase 1 y un
filtro verde tapando la fuente lumínica. Se capturan imágenes y se
analizan utilizando una cámara CCD enfriada digital SenSys (1.317 x
1.035 píxeles, Photometrics), capturador de imágenes PCI y programas
informáticos de procesamiento y análisis de imágenes de Windows
(Digital Optics). Se procesan las imágenes para la presentación
utilizando el programa informático Adobe Photoshop versión 3.0. Las
intensidades para la unión específica de células para cada punto de
anticuerpo también se registran utilizando una escala relativa de
+/-, +, ++, +++.
Tras registrar lo resultados en forma de
archivos de ordenador, las células unidas a la matriz de anticuerpos
se fijan mediante el baño del portaobjetos en fijador FACS
(formaldehído al 0,94% v/v, D-glucosa al 2%,
NaN_{3} al 0,03% v/v, PBS (pH 7,3)) durante 30 minutos. Tras el
enjuague en PBS, las células unidas se tiñen durante 5 minutos con
contratinción de hematoxilina (Immunotech, Marseille, Francia), que
tiñe los núcleos de las células de color azul. A continuación, los
soportes sólidos se enjuagan en PBS, se secan y se almacenan a
temperatura ambiente. Seguidamente los soportes sólidos pueden
humectarse posteriormente con PBS y examinarse nuevamente al
microscopio.
Aunque la presente invención se ejemplifica
particularmente con respecto a la utilización del ensayo para
detectar el cáncer, tal como se ha indicado anteriormente, el ensayo
también puede utilizarse para detectar o cuantificar una molécula
particular o clase o familia de moléculas en una muestra química,
tal como una biblioteca química, biblioteca de expresión fágica o
en una muestra medioambiental. También puede utilizarse para
detectar o cuantificar microbios, virus, parásitos u otros patógenos
particulares.
Se da a conocer en la presente memoria la
utilización de medios genéticos para llevar a cabo los ensayos. En
este caso, las moléculas P serían oligonucleótidos. La pareja de
unión sería una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo ARNm) capaz de
hibridarse a una molécula P. En una forma de realización
particularmente preferida, la pareja de unión es ADN producido por
una transcriptasa inversa, tal como mediante la utilización de
RT-PCR.
En un ejemplo particular, la matriz puede
utilizarse para detectar la expresión de antígenos CD sobre
leucocitos, leucemias y linfomas. La matriz comprende una
micromatriz de oligonucleótidos correspondientes a la totalidad de
los antígenos CD (2.166 o un subconjunto particular). Esta matriz
microscópica consiste de minúsculos puntos (pl) de oligonucleótidos
complementarios (\sim20 nucleótidos [nt]) unidos covalentemente a
un soporte sólido. El ARNm se extrae de 5.000 a 10.000 leucocitos y
se amplifica mediante RT-PCR con marcaje de los
extremos de los transcritos de ADN resultantes con biotina o
^{32}P. Los ADN marcados se hibridan a continuación con la matriz
de oligonucleótidos y se desprende el ADN no unido mediante lavado.
La presencia de transcritos de ADN de los ARNm se detecta
utilizando un escáner de fluorescencia o de radioactividad de alta
resolución, proporcionando un patrón de puntos para la expresión de
los ARNm de CD. Este patrón de puntos correspondería al obtenido con
la matriz de anticuerpos con leucocitos unidos.
Este procedimiento alternativo para la detección
de la expresión de antígenos CD es más sensible que la utilización
de células intactas, aunque requiere instrumentación más
sofisticada. Este procedimiento resulta particularmente útil para la
detección de enfermedad residual mínima en pacientes en
remisión.
La presente invención se describe adicionalmente
mediante los Ejemplos no limitativos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos pueden unirse covalentemente a
una membrana adecuada, tal como una membrana
Immobilon-P (PVDF, Millipore Corporation). Resulta
preferido el bloqueo posterior con un exceso de una solución de
proteínas, tal como una preparación de leche desnatada. El agente
de bloqueo se diseña para eliminar las uniones no específicas a la
superficie ligante. Otros agentes de bloqueo adecuados son el
extracto de musgo irlandés u otra fuente de carragenano o gelatina.
Los anticuerpos también se adsorben a una película de nitrocelulosa
sobre un portaobjetos de microscopía de vidrio (Schleicher y
Schuell, NH, USA) y seguidamente la nitrocelulosa no unida se
bloquea con leche desnatada. También se adsorben anticuerpos a
membranas de nilón. Para incrementar la accesibilidad de los
anticuerpos antiCD unidos a los antígenos presentes sobre las
células, el soporte sólido utilizado para la matriz se recubre
inicialmente con una forma truncada recombinante de proteína G de
Streptococcus que conserva su afinidad para la parte Fc de
IgG, pero que no presenta albúmina, sitios de unión de Fab ni
regiones de unión a membrana (Goward et al., 1990). Se
aplican anticuerpos a esta capa de proteína G y se unen mediante
sus dominios Fc, dejando los dominios Fab libres para que
interactúen con células. Los dominios Fab también se encuentran más
alejados del soporte sólido, proporcionando a los anticuerpos mayor
accesibilidad a los antígenos CD situados sobre las membranas
celulares.
celulares.
La matriz de anticuerpos también se construye
sobre una membrana o un cubreobjetos. En este caso, los anticuerpos
se unen covalentemente a la membrana en forma de manchas por
duplicado en una matriz bidimensional. Las manchas se disponen en
una matriz tal como, aunque sin limitación, una matriz 15x15. Los
anticuerpos son monoclonales y son específicos para los antígenos
de grupo de diferenciación (grupo de denominación) (antígenos CD) y
antígenos mieloides (MY) expresados sobre células de leucemia.
También pueden incluirse anticuerpos específicos para los antígenos
LY. Se encuentran disponibles datos de los antígenos CD en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/cd/index molecule.htm. Las manchas
son de tamaño microscópico y se producen mediante la aplicación de
una gota (\sim10 nanolitros) de solución de anticuerpos (por
ejemplo 10 proteínas Fg/ml) sobre partes determinadas de una
membrana o superficie de vidrio, tal como un cubreobjetos, en
primer lugar se lavan con un absorbente no específico de proteínas,
tal como leche desnatada al 30% p/v (Dutch Jug, Bonlac Foods Ltd.,
Melbourne, Australia) y después se enjuagan. También pueden
utilizarse otras soluciones de proteínas y otras marcas de leche
desnatada. Los anticuerpos pueden acoplarse covalentemente al
soporte sólido, tal como mediante grupos amino de los residuos de
lisina, los grupos carboxilato de los residuos de aspartato o de
ácido glutámico, o los grupos sulfhidrilo de los residuos de
cisteína. La matriz de anticuerpos se une selectivamente a células
de líquidos corporales que expresan los antígenos respectivos o
pueden unirse a antígenos libres. Se incluye un control positivo
y/o negativo, tal como un anticuerpo para moléculas superficiales o
moléculas solubles que es conocido que se encuentran presentes en
la muestra. Un ejemplo de una forma del dispositivo de ensayo se
muestra en la figura 3. El soporte sólido convenientemente es de
tamaño y forma similares a un portaobjetos de microscopía y puede
construirse de vidrio o de otro material polimérico. En la figura
representada, se observan 40 manchas discretas por duplicado, un
total de 80 manchas. Puede añadirse separadamente o moldearse con el
portaobjetos una pared circundante al portaobjetos de microscopía,
facilitando la retención del material líquido.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizan muestras de sangre como fuente de
antígenos o de antígenos expresados sobre la superficie celular
tras el tratamiento para evitar la formación de coágulos. Los
linfocitos de sangre periférica pueden fraccionarse mediante
centrifugación para producir una "capa leucocitaria", o más
específicamente, mediante medio de densidad
Ficoll-Hypaque. Puede llevarse a cabo el
fraccionamiento adicional de los linfocitos u otras subpoblaciones
celulares utilizando perlas Dynabeads, que son perlas magnéticas
unidas covalentemente a un anticuerpo específico. Generalmente, las
células se resuspenden en solución de Hank a una densidad de
2x10^{6} células/ml y se aplican a una matriz de anticuerpos en
forma de una suspensión uniforme de 200 \mul. La solución de Hank
es isotónica y contiene glucosa, que mantiene la viabilidad e
integridad de las células durante esta etapa de unión. Tras la
incubación de la suspensión celular con la matriz de anticuerpos
durante 30 a 60 minutos (por ejemplo 30 minutos) a 37ºC en una
atmósfera húmeda, las células no unidas se lavan de la matriz con
solución salina tamponada con fosfato (PBS, dos alícuotas de 20
\mul) que después se decanta. Alternativamente, las células no
unidas se suspenden mediante balanceo suave y la matriz se lava con
solución de Hank previamente calentada (3x1 ml).
\vskip1.000000\baselineskip
Se utiliza un panel de anticuerpos (tal como 51
manchas de anticuerpos) para construir matrices de anticuerpos con
el sistema Aspirate and Dispense PixSys^{TM} 3200 de Cartesian
Technologies. Se seleccionan los anticuerpos monoclonales para el
diagnóstico de los tipos comunes de leucemia. Los moldes para las
matrices de anticuerpos sobre los portaobjetos se presentan en las
figuras 7A y 8A. Se aplican puntos (5 nl) de cada anticuerpo a
intervalos de 0,8 mm, creando una matriz de 0,65 cm x 0,45 cm sobre
la película de nitrocelulosa sobre el portaobjetos de microscopía.
Tras la creación de los puntos, se evalúan los portaobjetos en una
caja de luz y se marcan levemente las esquinas de las matrices con
un lápiz de plomo.
A continuación, se sumergen las matrices de
anticuerpos en agente de bloqueo al 5% p/v, tal como leche
desnatada, albúmina de suero bovino (BSA), suero bovino, extracto
de musgo irlandés u otra fuente de carragenano o gelatina en PBS a
4ºC durante la noche, equivalente a un bloqueo de 90 minutos a 37ºC.
Tras el bloqueo, se lavaron suavemente los portaobjetos con agua
purificada y se dejaron hasta secarse totalmente a temperatura
ambiente durante 90 minutos. Los portaobjetos se envolvieron a
continuación en GladWrap (marca comercial), se sellaron en una bolsa
hermética al aire y se almacenaron a 4ºC en la oscuridad.
Las células que debían someterse a ensayo sobre
las matrices de anticuerpos se recolectaron frescas o se
reconstituyeron a partir de muestras almacenadas en nitrógeno
líquido. Las células se lavaron en PBS y se resuspendieron a una
densidad de 1x10^{7} células/ml. Se desenvolvieron los
portaobjetos que debían someterse a ensayo, se calentaron hasta la
temperatura ambiente y se humectaron con PBS. A continuación, se
secó la nitrocelulosa en torno a los bordes de la matriz marcada y
se introdujo en una placa de Petri revestida de celulosa húmeda. Se
pipeteó cuidadosamente la suspensión celular (300 \mul) sobre el
portaobjetos dentro de los bordes secos de la matriz. Se incubó la
matriz con las células en la placa de Petri cerrada humidificada
durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Tras la incubación con las células, el
portaobjetos se introdujo cuidadosamente en un tubo de 50 ml de PBS,
después se introdujo en una placa de Petri de PBS y se balanceó
suavemente para lavar la placa de las células no unidas
específicamente. En el caso de que todavía se observase unión de
fondo significativa en el examen microscópico del portaobjetos, se
repetiría dicha etapa hasta que el patrón de unión resultase
evidente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aplicaron muestras de células o de antígenos
a la matriz de anticuerpos-membranas, se incubaron
para permitir la unión máxima y se lavó el material no unido
utilizando una solución de lavado adecuada. Generalmente, las
células unidas se fijaron a los anticuerpos mediante
entrecruzamiento químico. Las células unidas a anticuerpos en la
matriz se visualizaron microscópicamente para determinar las
morfologías. En caso necesario, se fijaron las células a la matriz
y se tiñeron, se trataron enzimáticamente y/o se sometieron a ensayo
para la actividad enzimática y/o expresión de receptores.
Las células fijadas también pueden hacerse
interactuar con un segundo anticuerpo marcado con una molécula
informadora (por ejemplo un fluorocromo). Alternativamente, se
utilizó una serie de "segundos" anticuerpos, cada uno con un
fluorocromo diferente. A continuación, se determinó la expresión de
múltiples antígenos sobre las células mediante microscopía confocal
de fluorescencia.
Las células fijadas también se tiñeron o se
marcaron fluorescentemente para permitir la cuantificación de las
densidades celulares en la muestra original de líquido corporal.
Esta cuantificación puede automatizarse con un escáner programable
que registra las densidades celulares en cada punto de anticuerpos
en la matriz. Por ejemplo, un densitómetro láser (Molecular
Dynamics Inc., Sunnyvale, CA, USA) que escanea en dos dimensiones
(resolución: 50 Fm) resulta particularmente útil. El grado de
tinción de las manchas de anticuerpos es proporcional al número de
células unido a cada anticuerpo. Para la detección de la
fluorescencia, puede utilizarse un FluorImager o un Typhoon
(Molecular Dynamics, Inc.) (resolución: 50 im).
La matriz de anticuerpos, tal como una contra
antígenos CD y MY, proporciona un patrón de expresión de los
antígenos y ésta se compara a continuación con patrones prefijados
de expresión de antígenos para diferentes leucemias (por ejemplo la
leucemia mieloide aguda [AML]). Para la AML (M4), por ejemplo, se
expresan los antígenos siguientes: MY4 (CD14), MY7, MY9 y M01
(CD11b).
\vskip1.000000\baselineskip
Se aplicaron muestras (0,4 \mul) de soluciones
de anticuerpo (10 \mug/ml) para CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 y CD56
(Coulter Beckman) a una película de nitrocelulosa sobre un
portaobjetos de microscopía de vidrio (Molecular Probes) y se
mantuvieron en una atmósfera húmeda en una placa de Petri. Se
aplicaron suspensiones (500 FL) de células CCRF-CEM
de leucemia humana y de linfoma B de Raji (10^{7} células/ml) a
las matrices, se incubaron y se lavaron con PBS tal como se ha
indicado en el Ejemplo 2. Las células CCRF-CEM de
leucemia se unieron fuertemente a los anticuerpos antiCD4 y
antiCD8, con cierta unión a antiCD3 y ninguna unión a antiCD19. Las
células de Raji únicamente se unieron a antiCD19. Estos resultados
indican que las células CCRF-CEM, pro ejemplo,
expresan niveles elevados de CD4, niveles intermedios de CD8,
niveles más bajos de CD3 y niveles despreciables de CD19, CD14 y
CD56. A la inversa, las células Raji expresan CD19, pero no CD3,
CD4, CD8, CD14 ni CD56. Estos resultados, obtenidos utilizando la
matriz de anticuerpos de antígenos CD, se confirmaron mediante
citometría de flujo (Becton Dickinson Facscalibur) utilizando
anticuerpos marcados con el fluoróforo, FITC. Estos niveles de
expresión de los antígenos CD son consistentes con la expresión de
antígenos informada para las células T y B (Bene y Martini, 1997).
Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 5A y
5B.
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó la matriz con un microscopio de
fluorescencia Olympus BX60 (Olympus Optical Company, Japón)
utilizando un objetivo UPLan 4x con el condensador fijado en la
posición de fase 1 y un filtro verde tapando la fuente lumínica. Se
capturaron imágenes y se analizaron utilizando una cámara CCD
enfriada digital SenSys (1.317 x 1.035 píxeles, Photometrics), un
capturador de imágenes PCI y programas informáticos de procesamiento
y análisis de imágenes de Windows (Digital Optics). Se procesaron
las imágenes (6 puntos de anticuerpos por imagen) para la
presentación utilizando el programa informático Adobe Photoshop
versión 3.0. También se registraron las intensidades para la unión
específica de las células a cada punto de anticuerpos utilizando una
escala relativa de +/-, +, ++, +++.
Tras registrar los resultados en forma de
archivos de ordenador, las matrices de anticuerpos con células
unidas se fijaron mediante el baño del portaobjetos en fijador FACS
(formaldehído al 0,94% v/v, D-glucosa al 2%,
NaN_{3} al 0,03% v/v, PBS (pH 7,3)) durante 30 minutos. Tras
enjuagar en PBS, las células unidas se tiñeron durante 5 minutos
con contratinción de hematoxilina (Immunotech, Marseille, Francia),
que tiñe los núcleos de las células de color azul. Se enjuagaron
los portaobjetos en PBS, se secaron y se almacenaron a temperatura
ambiente. Los portaobjetos secos posteriormente pueden humectarse
con PBS y examinarse nuevamente al microscopio.
\vskip1.000000\baselineskip
Existen varias opciones para detectar la unión a
una matriz de anticuerpos de células completas o de antígenos en una
muestra de sangre.
- (i)
- Las células o antígenos se hacen reaccionar con un reactivo que une covalentemente grupos fluorescentes a grupos amino o sulfhidrilo en todas las proteínas en la muestra. Son fluoróforos adecuados (Molecular Probes, http://www.probes.com) disponibles en forma de kits de marcaje de proteínas: Alexa 488 y 3-(4-carboxibenzoil)-quinolín-2-carboxaldehído (CBQCA), que puede excitarse a 488 nm utilizando un láser de argón. Alternativamente, las células unidas a una matriz se marcan con diacetato de 5-clorometilfluoresceína (CMFDA), una sonda que atraviesa la membrana que resulta desacetilada por las esterasas intracelulares, formando 5-clorometilfluoresceína fluorescente. Este producto experimenta una reacción mediada por glutatión S-transferasas B, produciendo el compuesto pigmento fluorescente glutatión B que no atraviesa la membrana que seguidamente reaccionar con tioles en proteínas y péptidos, formando conjugados. Las células marcadas fluorescentemente unidas a una matriz de anticuerpos se cuantifican utilizando un fluorímetro de barrido (por ejemplo FluorImager o Typhoon, Molecular Dynamics, Inc.) o un microscopio confocal. Preferentemente se utilizan condiciones de reacción suaves, de manera que la mayoría de sitios de unión de antígeno no resulte afectada. Se marcan diferentes células en grados diferentes con un número diferente de fluoróforos. Las células se lavan antes de la reacción con el fluoróforo.
- (ii)
- Las células no marcadas unidas a una matriz se hacen reaccionar con anticuerpos solubles marcados fluorescentemente que se unen a un antígeno CD diferentes sobre las células, permitiendo la cuantificación de las células unidas.
- (iii)
- Para algunas muestras, el nivel celular de antígeno CD puede exceder el número disponible de anticuerpos en una mancha particular. Los antígenos CD que se ha encontrado que se expresan, de un cribado inicial, podría cuantificarse posteriormente utilizando una serie de diluciones de un anticuerpo particular. En el caso de que el número de anticuerpos en una mancha de esta matriz exceda el número de antígenos CD sobre las células aplicadas en la muestra, no se produce ningún incremento adicional de la fluorescencia. Un gráfico de fluorescencia frente a cantidad de anticuerpo proporciona la densidad de células que expresan ese antígeno CD en la muestra de plasma. A partir de estos datos, se calcula el número de un antígeno CD particular por célula. Los niveles de células unidas en esta matriz cuantitativa se determinan utilizando los procedimientos (i) o (ii) anteriores.
\newpage
Las células unidas en la matriz de
anticuerpos-membranas se visualizan
microscópicamente para determinar sus morfologías. Las células se
fijan a la matriz y se tiñen, se hibridan con una sonda
oligonucleótida marcada radioactiva o fluorescentemente, se tratan
enzimáticamente o se someten a ensayo para actividades enzimáticas,
para la determinación de sus morfologías. Las células fijadas
también pueden hacerse reaccionar con un segundo anticuerpo soluble
marcado (por ejemplo con un fluorocromo unido) o en efecto con
varios anticuerpos secundarios solubles diferentes, cada uno con un
fluorocromo diferente. La expresión de múltiples antígenos por parte
de las células cancerosas unidas mediante la membrana (por ejemplo
de leucemia) a la matriz seguidamente pueden determinarse mediante
microscopía de fluorescencia, tal como la microscopía confocal.
En un método alternativo, las células fijadas se
lisan o se tratan de otra manera para exponer los antígenos
intracelulares y después se hacen reaccionar con un segundo
anticuerpo soluble marcado (por ejemplo con un fluorocromo unido)
específico para un antígeno intracelular, o en efecto con varios
anticuerpos secundarios solubles diferentes, cada uno con un
fluorocromo diferente. La expresión de múltiples antígenos
intracelulares por las células de cáncer (por ejemplo de leucemia)
unidas mediante la membrana a las matrices seguidamente se determina
mediante microscopía confocal de fluorescencia.
Las células fijadas se tiñen o se marcan
fluorescentemente para permitir la cuantificación de las densidades
celulares en la muestra original de líquido corporal. Esta
cuantificación puede automatizarse con un escáner programable que
registra las densidades celulares en cada mancha de anticuerpos en
la matriz, para diferentes anticuerpos (por ejemplo CD, MY y/o LY).
Para las mezclas celulares que contienen proporciones desconocidas
de subtipos celulares, se cuantifican las densidades de las células
que expresan un antígeno de superficie particular mediante la unión
de las células a una serie de puntos de tamaño uniforme de
anticuerpos, que difieren en las densidades del mismo anticuerpo en
factores de 10. La densidad de un subtipo celular particular se
determina mediante escaneo densitométrico o fluorimétrico de células
fijadas o teñidas que se encuentran unidas a estos puntos de
anticuerpos diluidos en serie, con el fin de determinar en qué nivel
la densidad de anticuerpos de un punto particular excede la
densidad de células en la muestra de suspensión celular. Una segunda
forma de análisis es correr una suspensión celular que baja una
tira de un anticuerpo particular unido a membrana, fijar y teñir
las células unidas y después medir la longitud de la tira de células
unidas respecto a la longitud de la tira total de anticuerpos. La
densidad de células que expresa un antígeno particular seguidamente
se calcula a partir de la capacidad de unión conocida de los
anticuerpos en la tira. Para los puntos de anticuerpos diluidos en
serie o para una tira de anticuerpos, se corre un estándar interno
para un antígeno expresado sobre leucocitos normales no relacionados
con las células cancerosas.
Mediante la utilización de una matriz de
anticuerpos monoclonales (por ejemplo contra los antígenos, CD, MY
o LY), se compara el patrón de expresión de antígenos particulares
identificados mediante esta matriz a patrones prefijados de
expresión de antígenos para diferentes leucemias (por ejemplo M4 AML
(leucemia mieloide aguda): MY4(CD14), MY7, MY9, MO1
(CD11b)). La morfología celular proporciona un segundo criterio
diagnóstico. El diagnóstico puede automatizarse con el escaneo
fluorimétrico o espectrofotométrico de las matrices para determinar
qué manchas de anticuerpos se unen a células, con reconocimiento
computerizado de los patrones de expresión de antígenos para
cánceres particulares. Este método permite el diagnóstico
automatizado de una amplia diversidad de leucemias, linfomas y
otros cánceres metastásicos. Mediante la utilización de una matriz
completa de anticuerpos contra los antígenos CD, MY o LY, podrían
descubrirse nuevos tipos de leucemias y linfomas.
La identificación de antígenos particulares
sobre células cancerosas proporciona información esencial para la
inmunoterapia posterior del paciente con anticuerpos monoclonales
humanizados, o inmunotoxinas en las que una toxina o fármaco se
encuentra covalentemente unido al anticuerpo. Se realiza un
seguimiento de la remisión progresiva inducida por la quimioterapia
y/o la radioterapia y la recaída posterior debido al crecimiento de
células resistentes a fármaco utilizando muestras celulares
periódicas.
Podrían construirse otras matrices de
anticuerpos específicos para antígenos expresados por colon
metastásico, cáncer mamario, melanoma u otros cánceres, para
detectar niveles muy bajos de células metastásicas en líquidos
corporales (por ejemplo sangre o líquido cerebroespinal) en
pacientes con tumores primarios grandes que presentarían un riesgo
de metástasis. Esta vigilancia resultaría de particular importancia
para los cánceres de crecimiento rápido, tales como los
melanomas.
También puede crearse una "interfaz fácil de
utilizar" con una matriz de anticuerpos disponiendo los
anticuerpos que corresponden a, por ejemplo, la leucemia mieloide
aguda (AML) en la forma de un carácter, por ejemplo "M" para
esta leucemia. La misma matriz de anticuerpos podría presentar
anticuerpos para la leucemia linfocítica aguda (ALL) dispuestos
formando una "L". De esta manera, una única matriz podría
proporcionar un diagnóstico directo basándose en patrones conocidos
de expresión de antígenos de superficie para diferentes cánceres.
El pequeño tamaño de los puntos de anticuerpos y de las matrices de
puntos podría permitir la realización de varios ensayos diferentes
a partir de la misma muestra sin añadirse significativamente al
coste del ensayo. Lo expuesto anteriormente resulta particularmente
cierto para las manchas de 1 a 5 nanolitros de tamaño, en las que
cada anticuerpo podría costar una pequeña fracción de un
céntimo.
Una diversidad de trastornos no neoplásicos del
sistema inmunológico resulta en poblaciones anormales de linfocitos
circulantes. Las enfermedades autoinmunológicas, tales como la
diabetes de tipo 1, la esclerosis múltiple, la miastenia grave, la
anemia perniciosa, la soriasis, la artritis reumatoide, el
escleroderma y el lupus eritematoso sistémico están causados por
subgrupos de células T que pueden expresar CD4, y la producción de
anticuerpos contra autoantígenos por parte de subgrupos de células B
que pueden expresar CD19. Por ejemplo, se han observado
anormalidades cuantitativas en poblaciones de linfocitos de
pacientes que presentan lupus eritematoso sistémico
(\downarrowCD4+, CD45 + linfocitos T, \uparrowCD8+, CD57 +
linfocitos T). La matriz de anticuerpos detecta clones expandidos de
células T y B dirigidas contra el autoantígeno.
Los niños que sufren infecciones recurrentes
podrían presentan inmunodeficiencia congénita. El inmunofenotipado
mediante citometría de flujo se utiliza para detectar deficiencias
en los subgrupos de linfocitos. El síndrome de inmunodeficiencia
combinada severa (SCIDS) está causado por una deficiencia del enzima
adenosina desaminasa, con niveles muy bajos de linfocitos de sangre
periférica, tales como las células T (CD3) y B (CD19) y asesinas
naturales (CD16). Una deficiencia de la purina nucleósido
fosforilasa resulta en una deficiencia de células B. Puede
diagnosticarse una diversidad de trastornos de inmunodeficiencia
mediante el inmunofenotipado, aunque en la actualidad se requieren
ensayos enzimáticos adicionales y el cariotipado para el diagnóstico
definitivo. La matriz de anticuerpos de la presente invención
proporciona información definitiva sobre los subgrupos de
linfocitos que son deficientes en el caso de que no resulten
necesarios los demás criterios.
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
infecta principalmente los linfocitos CD4+ debido a que la proteína
gp120 del VIH se une a CD4. Durante el curso del SIDA, se produce un
agotamiento irreversible de los linfocitos CD4+. Sin embargo,
muchos otros tipos celulares resultan infectados por VIH, incluyendo
macrófagos, linfocitos B y células microgliales. En la actualidad
se realiza un seguimiento de la población de linfocitos CD4 en los
pacientes con VIH, aunque el inmunofenotipado debería ser más
extenso, según recomienda el Centre for Disease Control (CDC,
Atlanta, USA). Los ensayos de doble marcaje siguientes se realizan
mediante citometría de flujo: controles negativos, CD45/CD14,
CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD19, CD3/CD16, CD3/CD56 y CD4/CD8. Este
procedimiento laborioso se sustituye por un procedimiento de una
sola etapa utilizando una matriz que contiene anticuerpos contra
dichos antígenos CD, y antígenos adicionales que definirían
adicionalmente los subgrupos de linfocitos afectados. Durante la
infección por VIH, se produce una rápida caída de los linfocitos
CD4+ hasta un valor mínimo aproximadamente a las 6 semanas, seguido
de una recuperación parcial de los niveles a las 12 semanas. A
largo plazo se produce una caída progresiva de los linfocitos CD4+,
conduciendo a la muerte tras aproximadamente 11 años (Shinton,
1998). El tratamiento con zidovudina (AZT) induce un incremento
transitorio de los linfocitos CD4+; se realiza un seguimiento del
efecto de la quimioterapia sobre diversos subgrupos de linfocitos
con una matriz de anticuerpos para seguir la evolución clínica de
los pacientes infectados por VIH.
El inmunofenotipado también resulta útil para el
trasplante de médula ósea y de órganos, para la determinación del
grado de inmunosupresión y las complicaciones, tales como el rechazo
o la infección (Bene y Martini, 1997). La citometría de flujo se
utiliza antes del trasplante para el tipado de tejidos utilizando
anticuerpos monoclonales para detectar las especificidades de HLA o
la compatibilidad cruzada. La tolerancia a los tejidos trasplantados
se induce mediante la administración de ciclosporina en el
paciente. El tratamiento en el momento del trasplante fuerza el
nivel de los linfocitos de sangre periférica hasta prácticamente
cero. Se realiza el seguimiento de la desaparición de las células T
de la sangre mediante citometría de flujo para las células CD3+.
Tras el trasplante, un incremento de las células CD8+ señala un
posible rechazo, y los incrementos de las células CD8+ y CD16+,
CD56+ y/o CD57+ podrían indicar infección vírica. Esta vigilancia
del estado inmunológico del trasplantado se realiza más rápida y
extensivamente utilizando una matriz de anticuerpos.
Algunos pacientes de cáncer reciben
quimioterapia de dosis elevada y después requieren un trasplante de
la médula ósea para sustituir su sistema inmunológico destruido. La
médula trasplantada permite la reconstitución hematopoyética,
aunque ocasionalmente aparecen subgrupos poco habituales de
linfocitos, tales como células T CD5+. Las infecciones oportunistas
y la enfermedad del injerto contra el huésped pueden producirse en
dichos pacientes, dando lugar a un incremento de las células CD8+
en ambos casos y a una elevación del número de células asesinas
naturales. La sustitución de la citometría de flujo por una matriz
de anticuerpos para los antígenos CD simplifica el seguimiento de
los pacientes y proporciona información más amplia.
Las matrices de anticuerpos para los antígenos
CD también resultan útiles para el seguimiento de los cambios en
los subgrupos de linfocitos durante la terapia de desensibilización
al veneno de insecto o de araña, en la que se incrementa el número
de CD4+ CD45RA+ y se reduce el nivel de CD4+ CD45RO+ desde niveles
elevados. Los pacientes con el síndrome de fatiga crónica podrían
presentar anormalidades inmunológicas consistentes con una
infección vírica con linfocitos CD8+ activados. Un análisis
detallado de los subgrupos de linfocitos por parte de la matriz de
anticuerpos de la presente invención establece nuevos criterios
diagnósticos y proporciona información fundamental sobre este
trastorno.
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La leucemia de células T
CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji pueden
distinguirse utilizando una matriz de anticuerpos contra CD3, 4, 8,
14, 19 y 56 unidos a un portaobjetos de microscopía. La matriz
diferenciadora proporciona los resultados siguientes (en la que
"+" indica nivel de unión):
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\vskip1.000000\baselineskip
Esta matriz se somete a ensayo con linfocitos de
sangre completa y de sangre periférica. Todas las manchas son
ligantes de células con diferentes subpoblaciones de células en
algunas de las manchas. Las subpoblaciones de células se detectan
utilizando anticuerpos contra los antígenos CD siguientes:
CD2, 7, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11b, 11c, 13, 14, 15,
16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 33, 34, 36, 37, 38, 41, 42, 45, 56,
57, 95, 122.
Se preparan matrices grandes con dichos
anticuerpos para investigar las propiedades de unión de las células
de leucemia obtenidas de los pacientes. El análisis se centra
particularmente en los pacientes que presentan AML, CLL y ALL,
aunque la presente invención cubre cualquier cáncer. Mediante la
utilización de este enfoque, la matriz de anticuerpos puede definir
nuevos subgrupos de leucemias basándose en información extensa sobre
la expresión de antígenos disponibles utilizando este ensayo de una
sola etapa.
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Los procedimientos utilizados para preparar el
ensayo se ilustran en forma de diagrama de flujo en la figura 4.
Las matrices de anticuerpos se construyen utilizando un sistema
Biodot Aspirate and Dispense (Cartesian Technologies) en el que se
aplican puntos de 5 nl en una película de nitrocelulosa sobre
portaobjetos de microscopía de vidrio (Schleicher y Schuell, nº de
cat. 10484182). Se utilizan anticuerpos monoclonales purificados
(Beckman Coulter, Becton Dickinson, o Biosource International) a
las concentraciones recomendadas para el análisis de citometría de
flujo y se aplican en los mismos tampones en los que son
suministrados por los fabricantes. A continuación, la nitrocelulosa
se bloquea mediante incubación con leche desnatada al 5% p/v (Dutch
Jug) durante 1,5 horas a 37ºC. Estas condiciones de bloqueo se
seleccionan para minimizar el nivel de unión de fondo.
Las matrices secas se almacenan durante más de 3
meses a 4ºC sin pérdida de capacidad de unión para las líneas
celulares de leucemia de células T CCRF-CEM y de
linfoma de células B Raji (Tablas 1 y 2). Una comparación entre
matrices secas almacenadas con desecante a 4ºC, a temperatura
ambiente (22ºC) y a 37ºC durante 1 mes mostró poco o ningún
deterioro a 4ºC, un deterioro mínimo a temperatura ambiente y
únicamente una pérdida parcial de actividad de unión a 37ºC en
ensayos con PBL normales (Tabla 3). Los anticuerpos sombreados
continuaron mostrando una actividad de unión fuerte incluso tras 1
mes a 37ºC. La estabilidad de las matrices se incrementa
adicionalmente mediante la adición de agentes estabilizadores de
proteínas a los anticuerpos (por ejemplo polietilenglicol o
productos estabilizadores disponibles comercialmente de Surmodics,
MN, USA).
Se prepararon leucocitos normales o células de
leucemia mediante centrifugación Histopaque y se lavaron y se
resuspendieron hasta una densidad de 10^{7} células/l en solución
salina tamponada con fosfato (PBS). La utilización de PBS resulta
en células que se encuentran metabólicamente agotadas y en un nivel
reducido de unión no específica de fondo a las matrices de
anticuerpos bloqueados. Las suspensiones celulares se aplicaron en
la matriz y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos,
se fijaron con una solución de glucosa/formaldehído/PBS y después
se lavaron con PBS. Las células unidas a la matriz se fotografiaron
y las imágenes digitales se compararon con patrones de consenso
para PBL normales o leucemias. Debido a que algunas de las muestras
mostraban unión de fondo a la nitrocelulosa, se realizaron etapas
para minimizar el fondo. La inclusión del agente quelante EDTA 1 mM
en la PBS para suspensión celular redujo significativamente el nivel
de unión de fondo sin interferir con la unión especifica a
anticuerpo. Se encontró que una muestra de AML se unía muy
fuertemente a anticuerpos de control de isotipo, sugiriendo la
unión de los receptores de Fc. Lo anterior se superó mediante la
preincubación de las células con suero AB humano inactivado por
calor al 10% v/v. Para reducir adicionalmente el problema de unión
de fondo, se utilizaron los compuestos siguientes para reducir la
capacidad de unión de los leucocitos mediante la inhibición de la
síntesis de proteínas y/o mediante el bloqueo de la molécula de
adhesión Mac-1 expresada en muchos leucocitos
activados: heparina, quininógeno de elevado peso molecular,
mocimicina, pentoxifilina, benzidamina (Tantum), lidocaína y
naftifina.
Se revisaron los portaobjetos húmedos utilizando
microscopía de campo oscuro a una magnificación de 400x. Se
fotografiaron los puntos en grupos de 6 y se produjo una imagen
compuesta utilizando el programa informático Adobe Photoshop. Se
cuantificó la densidad celular en cada punto de anticuerpos a partir
de las imágenes digitales utilizando un programa informático o se
registró mediante escaneo densitométrico o fluorimétrico. Los
leucocitos unidos a matriz se tiñeron con antiCD45 (antígeno
leucocitario común) conjugado con Alexa 488 y se observaron
mediante microscopía de fluorescencia (figura 6). De esta manera, se
utilizó la microscopía confocal de tres colores para la
identificación y caracterización adicionales de las células unidas a
puntos de anticuerpos individuales. Se utilizaron tinciones
histoquímicas (por ejemplo mieloperoxidasa) en las células unidas a
las matrices con el fin de confirmar la identificación de algunos
subtipos de leucemia (por ejemplo AML).
Inicialmente se sometieron a ensayo 3 líneas
celulares en una matriz de 54 puntos de anticuerpos de 10 nl
(figuras 7a-d). La leyenda para las posiciones de
los anticuerpos se muestra en la figura 7a. Se detectaron patrones
claros de puntos en las líneas celulares de leucemia de células T
CCRF-CEM (figura 7b), de linfoma de células B Raji
(figura 7c) y mieloide NB4 (figura 7d). Se resumen estos resultados
en la Tabla 4.
Los patrones típicos de puntos para las PBL
normales, la leucemia linfocítica crónica (CLL), la leucemia de
células pilosas (HCL), la leucemia mieloide aguda (AML) y el linfoma
de células B (BCL) se muestran en las figuras 8a-g,
con la leyenda para las posiciones de los anticuerpos (figura 8a).
Los patrones de expresión de antígenos CD para las PBL se resumen
en la Tabla 5, indicando los antígenos CD sombreados un patrón común
de expresión. Las PBL recién aisladas (RIC) proporcionaron
resultados similares a las mismas PBL que se habían congelado en
nitrógeno líquido y después descongelado (mostradas en la Tabla 8).
Esta observación permite la utilización de leucocitos y leucemias
congeladas para el análisis con matrices de anticuerpos. La Tabla 6
resume los patrones de expresión de antígenos CD para células de CLL
procedentes de 9 pacientes de leucemia. Al congelar las muestras de
CLL y someterlas a ensayo nuevamente, los patrones obtenidos fueron
altamente reproducibles. Todas las CLL sometidas a ensayo
expresaron fuertemente CD5, 11c, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 37, 38, 45,
52 y HLA-DR, que son marcadores de superficie
celular característicos de las CLL del tipo células B.
La Tabla 7 muestra una comparación entre una PBL
normal, dos CLL y muestras de pacientes de PLL (leucemia
prolinfocítica), HCL, BCL y AML. La muestra de CLL llamada KB
procede de un diagnóstico temprano, con un WBC de la densidad
comprendido dentro del intervalo de normalidad (10x10^{9}
células/l), mientras que la muestra EH2 procede de un paciente con
enfermedad más avanzada y presenta un recuento WBC elevado, de
30x10^{9} células/l. El sombreado ilustra las similitudes y
diferencias entre los antígenos principales expresados por estas
diferentes leucemias.
Se realizó una comparación rigurosa entre el
análisis de las PBL y las CLL utilizando la matriz de anticuerpos y
citometría de flujo (Tabla 8). Existe una fuerte correlación entre
los resultados de los dos análisis, con las excepciones de CD2,
CD11b, 14, 15, 16, 56, 57, 95, 103, 154, KOR y FMC7. En la mayoría
de estos casos, la citometría de flujo es positiva, mientras que la
matriz de anticuerpos es negativa. Además, el porcentaje de células
positivas detectadas mediante citometría de flujo es bajo o la
tinción es débil. La citometría de flujo utiliza anticuerpos
solubles, mientras que las matrices utilizan anticuerpos
inmovilizados sobre un soporte sólido. Los anticuerpos en solución
libre presentan un mejor acceso a los antígenos CD sobre las
células que los anticuerpos sobre una matriz, en la que pueden
producirse impedimentos estéricos. Además, se requiere una afinidad
de unión más alta para retener las células unidas a una fase sólida.
El almacenamiento de anticuerpos en solución a 4ºC resulta en una
pérdida gradual de la actividad de unión en matrices de anticuerpos
posteriormente. En la mayoría de casos, se restaura la actividad de
unión utilizando anticuerpo fresco. En otros casos, resultan
necesarias concentraciones más altas de anticuerpo. En un caso
(CD2), se unió a las células un anticuerpo de un clon de hibridoma
diferente. Estas modificaciones mejoran significativamente la
correlación entre los análisis de fase sólida y la FACS.
En el caso de que la expresión de CD sea
negativa según la citometría de flujo pero positiva según la matriz
de anticuerpos (es decir, CD103 y KOR con PBL RIC), esta diferencia
se resuelve mediante la inclusión de suero AB humano con las PBL
RIC antes del ensayo en matriz de anticuerpos; tanto CD103 como KOR
fueron negativos en este caso (ver la figura 8b). La inclusión de
suero AB humano, que contiene inmunoglobulinas, también bloqueó la
detección de inmunoglobulina (Ig) sobre la superficie de las CLL de
células B. Además, el suero humano puede contener formas solubles
de otros marcadores de superficie celular que podrían bloquear la
expresión en las células ligantes de estos marcadores (por ejemplo
CD154, CD95). Se recomienda que se sometan a ensayo inicialmente
muestras en EDTA/PBS sin adición de suero AB humano. Únicamente
aquellas muestras que muestren una unión fuerte de receptor de Fc en
el ensayo inicial pueden someterse a nuevo ensayo con suero AB
humano.
Para algunas aplicaciones, la unión de las
células a los puntos de anticuerpos se cuantifica mediante
comparación con un estándar interno. La figura 9 muestra la
relación entre la unión celular y la densidad de células Raji
incubadas con puntos de anticuerpos contra 3 marcadores de
superficie diferentes. Para CD38 y HLA-DR, existe
una correlación directa entre la densidad celular y el número de
células unidas al punto a densidades celulares de hasta 10x10^{6}
células/ml. Para HLA-DR, la correlación es lineal
entre 1x10^{6} y 10x10^{6} células/ml. Para CD10, se alcanzó
una meseta en aproximadamente 5x10^{6} células/ml, sugiriendo la
saturación de los sitios de unión de los anticuerpos. La figura 10
muestra que la correlación entre la unión celular y la concentración
de anticuerpo de CD10 era lineal a concentraciones de anticuerpo de
entre 0,16 y 1,25 \mug/ml. Estos resultados demuestran que la
cuantificación de la unión celular debería resulta posible con la
condición de que se optimicen las condiciones para cada
anticuerpo.
El ensayo de la presente invención se denomina
"matriz LD" y se ha dedicado a un paciente, la Sra. Lee Dixon,
quien presentaba leucemia mieloide aguda (AML, M4).
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Tabla
1
Se secaron matrices de anticuerpos a temperatura
ambiente, se bloquearon, se lavaron con agua, se secaron y después
se almacenaron a 4ºC, se envolvieron en película adherente en una
bolsa de plástico hermética al aire. Los resultados se registraron
como: - (falta de unión), +/- (unas cuantas células), + (positiva
débil), ++ (positiva fuerte), +++ (las células cubren por entero el
punto de anticuerpos), ++++ (cobertura gruesa del punto de
anticuerpos).
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Tabla
2
El procedimiento experimental fue el mismo que
para la Tabla 1 (resultados de fondo confundidos por la unión de
fondo de las células a la nitrocelulosa).
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Tabla
3
Se reconstituyeron PBL (RIC2) almacenadas en
nitrógeno líquido y se unieron a las matrices en PBS que contenía
EDTA y suero AB humano mediante el procedimiento establecido. Los
marcadores CD sombreados indican unión fuerte tras el almacenamiento
durante 1 mes a las 3 temperaturas.
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Tabla
4
Se unieron células en cultivo resuspendidas en
PBS a matrices al igual que para la Tabla 3. Los marcadores CD
sombreados indican unión fuerte.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
5
Se unieron PBL procedentes de dos sujetos (RIC y
LB) y tres capas leucocitarias del banco de sangre de la Cruz Roja
(PBL1, 2, 3) a matrices al igual que para la Tabla 3. Todos los
procedimientos fueron iguales a los utilizados para la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
6
Todos los pacientes fueron iguales a los
utilizados para la Tabla 3, aunque las muestras se sometieron a
ensayo en PBS, excepto EH2, KB y NH, a las que se añadieron EDTA y
AB humano. Los marcadores CD sombreados indican unión consistente
para todos los pacientes.
\newpage
Tabla
7
Todos los procedimientos fueron iguales a los
utilizados para la Tabla 3. Los marcadores CD sombreados indican
unión fuerte.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
8
Los procedimientos de matriz de anticuerpos
fueron iguales a los utilizados para la Tabla 3, excepto en que no
se añadió suero humano ni EDTA. El análisis FACS se llevó a cabo
rutinariamente en células con suero AB humano al 10%. Las áreas
sombreadas subrayan las diferencias entre los dos métodos.
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\newpage
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Claims (19)
1. Dispositivo de ensayo que puede distinguir
entre la leucemia de linfocitos T CCRF-CEM y el
linfoma de linfocitos B Raji, comprendiendo dicho dispositivo:
un soporte sólido, y
una matriz de moléculas de inmunoglobulina
inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de
manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad
para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o
antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células
de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se
encuentran en una disposición en dicho ensayo de manera que al
unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos,
un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable
que puede distinguir entre la leucemia de células T
CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji, en el que
el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas
para CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 y CD56.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Dispositivo de ensayo que puede diagnosticar
leucemias, comprendiendo dicho dispositivo:
un soporte sólido; y
una matriz de moléculas de inmunoglobulina
inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de
manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad
para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o
antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células
de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se
encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que al
unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos,
un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable
que puede diagnosticar leucemias, en el que el soporte sólido
contiene moléculas de inmunoglobulina específicas para CD2, CD3,
CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16,
CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD33, CD34, CD36, CD37,
CD38, CD41, CD42, CD45, CD56, CD57, CD95 y CD122.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Dispositivo de ensayo que puede diagnosticar
diferentes tipos de leucemias y linfomas, comprendiendo dicho
dispositivo:
un soporte sólido; y
una matriz de moléculas de inmunoglobulina
inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de
manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad
para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o
antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células
de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se
encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que al
unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos,
un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable
que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemias y linfomas, en
el que el soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina
específicas para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b,
CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24,
CD25, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD42a, CD44,
CD44v3-10, CD44v6, CD45, CD45RA, CD45RO, CD52, CD56,
CD57, CD60, CD61, CD71, CD79a, CD95, CD103, CD117, CD122, CD154,
GPA, HLA-DR, KOR, FMC7, mIgG1, mIgG2a, mIgG2b y
mIgM.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Dispositivo de ensayo que puede diagnosticar
diferentes tipos de leucemia y de linfoma, comprendiendo dicho
dispositivo:
un soporte sólido; y
una matriz de moléculas de inmunoglobulina
inmovilizadas en regiones discretas del soporte sólido, de manera
que diferentes regiones discretas presentan especificidad para
diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o antígenos
mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre las células de
leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se encuentran
en una disposición en dicha matriz de manera que al unirse las
moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos, un patrón
diferencial de unión proporciona una señal identificable que puede
diagnosticar diferentes tipos de leucemia y de linfoma, en el que el
soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas
para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b, CD11c, CD13,
CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD33,
CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD42a, CD44,
CD44v3-10, CD44v6, CD45, CD45RA, CD45RO, CD52, CD56,
CD57, CD60, CD61, CD64, CD71, CD79a, CD79b, CD80, CD95, CD103,
CD117, CD122, CD134, CD138, CD154, Kappa, Lambda, GPA,
HLA-DR, KOR, FMC7, mIgG1, IgG2a y antiIg.
\newpage
5. Dispositivo de ensayo que puede distinguir
entre diferentes leucemias, comprendiendo dicho dispositivo:
un soporte sólido; y
una matriz de moléculas de inmunoglobulina
inmovilizadas en regiones discretas sobre el soporte sólido, de
manera que diferentes regiones discretas presentan especificidad
para diferentes antígenos de grupo de diferenciación (CD) y/o
antígenos mieloides (MY) y/o linfoides (LY) expresados sobre células
de leucemia, en el que las moléculas de inmunoglobulina se
encuentran en una disposición en dicha matriz de manera que al
unirse las moléculas de inmunoglobulina a sus antígenos respectivos,
un patrón diferencial de unión proporciona una señal identificable
que puede distinguir entre diferentes leucemias, en el que el
soporte sólido contiene moléculas de inmunoglobulina específicas
para CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11b, CD11c, CD13,
CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD33,
CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD42a, CD45, CD45RA, CD45RO, CD52,
CD56, CD57, CD60, CD61, CD71, CD79a, CD95, CD103, CD117, CD122,
CD154, GPA, HLA-DR, KOR, FMC7, mIgG1 y antihIg.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Dispositivo de ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el patrón de unión se detecta
microscópicamente, bioquímicamente, histoquímicamente o
inmunológicamente.
7. Dispositivo de ensayo según la reivindicación
6, en el que el patrón de unión se detecta microscópicamente.
8. Dispositivo de ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que las moléculas de inmunoglobulina
son anticuerpos monoclonales.
9. Dispositivo de ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que las moléculas de inmunoglobulina
son anticuerpos policlonales.
10. Método para distinguir entre la leucemia de
células T CCRF-CEM y el linfoma de células B Raji,
que comprende poner en contacto una muestra biológica con el
dispositivo de ensayo según la reivindicación 1, permitiendo que los
leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de
inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los
leucocitos para formar un patrón de unión sobre la matriz, y
determinar un patrón diferencial de unión en la matriz que puede
distinguir entre la leucemia de células T CCRF-CEM y
el linfoma de células B Raji.
11. Método para diagnosticar leucemias, que
comprende poner en contacto una muestra biológica con el dispositivo
de ensayo según la reivindicación 2, permitiendo que los leucocitos
en la muestra biológica se unan a las moléculas de inmunoglobulina
sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los leucocitos para
formar un patrón de unión en la matriz, y determinar un patrón
diferencial de unión sobre la matriz que puede diagnosticar
leucemias.
12. Método para diagnosticar diferentes tipos de
leucemias y de linfomas, que comprende poner en contacto una muestra
biológica con el dispositivo de ensayo según la reivindicación 3,
permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las
moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante
antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión sobre
la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión sobre la
matriz que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemias y de
linfomas.
13. Método para diagnosticar diferentes tipos de
leucemia y de linfoma, que comprende poner en contacto una muestra
biológica y el dispositivo de ensayo según la reivindicación 4,
permitiendo que los leucocitos en la muestra biológica se unan a las
moléculas de inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante
antígenos sobre los leucocitos para formar un patrón de unión sobre
la matriz, y determinar un patrón diferencial de unión sobre la
matriz que puede diagnosticar diferentes tipos de leucemia y de
linfoma.
14. Método para distinguir entre diferentes
leucemias, que comprende poner en contacto una muestra biológica con
el dispositivo de ensayo según la reivindicación 5, permitiendo que
los leucocitos en la muestra biológica se unan a las moléculas de
inmunoglobulina sobre el soporte sólido mediante antígenos sobre los
leucocitos para formar un patrón de unión sobre la matriz, y
determinar un patrón diferencial de unión sobre la matriz que puede
distinguir entre diferentes leucemias.
15. Utilización de un dispositivo de ensayo
según la reivindicación 1, para distinguir entre la leucemia de
células T CCRF-CEM y el linfoma de células B
Raji.
16. Utilización de un dispositivo de ensayo
según la reivindicación 2, para el diagnóstico de leucemias.
17. Utilización de un dispositivo de ensayo
según la reivindicación 3, para el diagnóstico de diferentes tipos
de leucemia y de linfoma.
18. Utilización de un dispositivo de ensayo
según la reivindicación 4, para el diagnóstico de diferentes tipos
de leucemia y de linfoma.
19. Utilización de un dispositivo de ensayo
según la reivindicación 5, para distinguir entre diferentes
leucemias.
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