RU197681U1 - Биочип для мультиплексного анализа - Google Patents
Биочип для мультиплексного анализа Download PDFInfo
- Publication number
- RU197681U1 RU197681U1 RU2019115153U RU2019115153U RU197681U1 RU 197681 U1 RU197681 U1 RU 197681U1 RU 2019115153 U RU2019115153 U RU 2019115153U RU 2019115153 U RU2019115153 U RU 2019115153U RU 197681 U1 RU197681 U1 RU 197681U1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biochip
- cells
- cell
- antibodies
- test
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Предлагаемая полезная модель относится к области медицины, а именно к диагностике, и может быть использована для диагностики онкологических заболеваний. Биочип для мультиплексного анализа содержит прозрачную подложку из стекла, разделенную на функциональную и рабочую части, функциональная часть служит для фиксации биочипа в руках, рабочая часть имеет покрытие и разделена на тестовые ячейки посредством решетки из пластика, каждая тестовая ячейка снабжена иммобилизованными флуоресцентными антителами, специфичными к антигенам клеток, биочип содержит пленку, закрепленную поверх решетки, на подложку рабочей части нанесено покрытие, создающее положительный заряд на поверхности стекла, в тестовые ячейки внесены антитела, конъюгированные с флуоресцентной меткой Су-3, и реагент, препятствующий высыханию внесенных антител, рабочая поверхность биочипа покрыта воздухонепроницаемой стерильной пленкой, функциональная часть биочипа снабжена информацией о локализации внесенных антител. Технический результат от использования предлагаемого биочипа заключается в обеспечении возможности анализа клеток геморрагической жидкости, клеток мочи, клеток из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток, полученных из соскобов резецированной солидной опухоли, повышении надежности работы биочипа и увеличении срок его годности. 4 пр.
Description
Предлагаемая полезная модель относится к области медицины, а именно к диагностике, и может быть использована для диагностики онкологических заболеваний. Кроме того, предлагаемая полезная модель может быть использована в ветеринарии, а также в области биологии, иммунологии и цитологии.
Биочип - один из новейших инструментов биологии и медицины 21 века, используя минимум материала и минимум времени для исследования он позволяет определять множество различной и достоверной информации, например, о различных генетических дефектах, онкогенах, аллергенах. Биочипы позволяют обнаружить в организме человека маркеры, соответствующие конкретным заболеваниям, определенным вирусам и раковым клеткам практически в любом анализируемом материале - кровь, слюна, пот.
Широкие диагностические возможности биочипов обуславливают актуальность разработки их новых видов.
Выпускаемые в настоящее время биочипы отличаются друг от друга по методике изготовления, виду подложки и зонда, методу регистрации результата взаимодействия реагента с исследуемым образцом. Для считывания результатов реакции используются флуоресцентные метки, лазеры и оптические сканеры.
В настоящее время известны следующие виды биочипов:
- ДНК-биочипы, используемые для идентификации генов и их мутаций, связанных с различными заболеваниями, диагностики инфекционных болезней, скрининга микроорганизмов;
- белковые чипы, которые используют для обнаружения белковых маркеров, характерных для различных заболеваний на разных стадиях их развития;
- клеточные чипы, позволяющие избежать проблемы нестабильности белков в белковых чипах и проводить более точный анализ взаимодействия белков внутри клетки, визуализация самой клетки и ее органелл;
- тканевые чипы, позволяющие проводить анализ тысяч образцов тканей на одном предметном стекле и использующиеся для определения содержания белков в здоровых и патологически измененных тканях и оценки потенциальных мишеней для лекарственных препаратов;
- микрочипы на основе малых молекул, которые позволяют проводить одновременный скрининг тысяч потенциальных лекарственных средств;
- микрофлюидальные чипы - многофункциональное устройство для обмена, между компонентами которого используются электроды и микрожидкости.
Известна группа биочипов, содержащих твердый носитель, на рабочей зоне которого в форме кластеров иммобилизованы олигонуклеотидные зоны и идентификатор: патент РФ на полезную модель №69866 (МПК C12Q 1/68, дата публикации 10.01.2008), патент РФ на изобретение №2270254 (МПК C12Q 1/68, дата публикации 20.02.2006), патент РФ на изобретение №2436843 (МПК C12Q 1/00, дата публикации 27.12.2008).
Другая группа биочипов представляет собой твердую подложку, выполненную из стекла (патент РФ на полезную модель №141359, МПК G01N 33/552, дата публикации 28.11.2013) с нанесенным на его поверхность покрытием, например из халькогенидного стекла (там же) или из полилизина (патент РФ на полезную модель №142470, МПК G01N 33/53, дата публикации 27.06.2014) или полимерным рабочим слоем (патент РФ на изобретение №2298797, МПК G01N 33/531, дата публикации 10.05.2007). На покрытии размещены тестовые участки подложки с иммобилизованными антителами, специфичными к поверхностным антигенам клеток.
В качестве ближайшего аналога предлагаемого биочипа выбран известный биочип для мультиплексного анализа, содержащий прозрачную подложку из стекла, разделенную на функциональную и рабочую части, функциональная часть служит для фиксации биочипа в руках, рабочая часть имеет покрытие и разделена на тестовые ячейки посредством решетки из пластика, каждая тестовая ячейка снабжена
иммобилизованными флуоресцентными антителами, специфичными к антигенам клеток, биочип содержит пленку, закрепленную поверх решетки (патент РФ на полезную модель №142470, МПК G01N 33/53, дата публикации 27.06.2014).
Известный биочип содержит прозрачную подложку, выполненную из стекла с нанесенным на его рабочую поверхность полилизином, биочип разделен на 9 равных ячеек посредством решетки из пластика. В каждой ячейке содержатся флуоресцентные антитела (0,01 мкл). Для исследований используют тестовые участки с антителами к рецепторам эстрогена, рецепторам прогестерона, рецепторам СА-125, рецепторам РЭА, рецепторам СК 7, рецепторам СК 20, рецепторам Ber-ЕР4, рецепторам TTF1 и рецепторам WT1. Для сохранения антител во влажной среде в каждую ячейку добавлен реагент PBS в количестве 0,1 мкл. Биочип покрыт сверху гидрофобной пленкой, фиксированной к верхнему краю пластиковой решетки, создающей герметичные ячейки, ограниченные снизу подложкой с покрытием, сверху - пленкой, с остальных сторон - пластиковыми стенками решетки, которая также препятствует транзиту антител из одной ячейки в другую. Биочип хранится в темном месте для исключения выцветания метки.
Известный биочип работает следующим образом.
Биочип достают из непрозрачного контейнера. Готовят биоматериал для исследования. С рабочей поверхности биочипа снимают защитную гидрофобную пленку, после чего незамедлительно производят инсталляцию исследуемой биожидкости в тестовые ячейки. Затем биочип ставят на нагревательный столик при температуре 37°С и закрывают непрозрачной крышкой, для исключения попадания света, на 30 минут. Далее биочип помещают на предметное стекло флуоресцентного микроскопа и проводят анализ флуоресценции в каждой из ячеек. После проведения исследования производят фиксацию клеток. Далее производят окраску для последующего морфологического исследования клеток.
Известный биочип позволяет исследовать серозную жидкость, жидкость с менее богатым, чем кровь клеточным составом, и определить характер асцита (реактивный или онкологический).
Однако, известный биочип имеет следующие недостатки:
- известное устройство обеспечивает возможность исследования клеток, содержащихся в серозных жидкостях. Однако, на сегодняшний день известно, что не только серозные выпоты являются часто встречающимся симптомом заболеваний как воспалительного характера (острый панкреатит, цирроз печени, гепатиты и других), так и онкологических (рак яичника, рак печени, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки и другие) заболеваний. Уникальной диагностической информацией обладают клетки геморрагической жидкости, клетки мочи, клетки, полученные методом тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии, а также соскобы с резецированной солидной опухоли до ее фиксации в формалине. Однако, известный биочип не обеспечивает возможности исследования вышеуказанных клеток;
- полилизиновое покрытие подложки способствует сорбции как антител, так и клеток, что препятствует полноценному связыванию антител с клетками, также невозможно провести анализ реакции в пятне куда были нанесены антитела, так как свечение вокруг клеток носит фоновый, а не специфический характер;
- флуоресцентная метка FITC, используемая в известном устройстве, является не достаточно стабильной, что влияет на длительность хранения биочипа;
- пластиковая решетка, прикрепленная к биочипу, не позволяет проводить анализ на микроскопе при увеличении более 200 вследствие невозможности приближения объектива максимально близко к дну ячейки. Кроме того, пластиковая решетка прикреплена к подложке с помощью полиакрилатного клея, что может способствовать преждевременной денатурации антител за счет токсических эффектов клея;
- антитела находятся в ячейках в растворе PBS, что не дает возможности длительного хранения по двум причинам: преждевременный рост микроорганизмов и естественная сорбция антител к дну и стенкам ячейки;
- защитная пленка не является стерильной, что представляет дополнительный фактор риска роста микроорганизмов и порчи белковой составляющей (антител);
- известный биочип обеспечивает возможность исследования ограниченного количества маркеров (9-ти), что не всегда достаточно для нужд медицинских исследований.
Известен способ исследования клеток при диагностике онкологических заболеваний с помощью известного биочипа, включающий предварительную подготовку клеток, полученных из серозной жидкости, помещение исследуемого материала в ячейки биочипа, проведение флуоресцентного анализа и последующее исследование наличия и детекции флуоресценции в каждой тестовой ячейке, при э гом на этапе предварительной подготовки серозную жидкость центрифугируют в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин, выбранный в качестве ближайшего аналога (патент РФ на полезную модель №142470, МПК G01N 33/53, дата публикации 27.06.2014).
Известный способ с помощью известного биочипа осуществляют следующим образом.
Забирают серозную жидкость несколькими рутинными способами (интраоперационно в стерильный шприц в количестве не менее 2 мл, при пункции трансвагинально, трансабдоминально в стерильный шприц). Затем материал помещают в пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при скорости 2000 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость удаляют, осадок микропипеткой вносят в ячейки биочипа в количестве 0,2 мл. Исследуют количество окрашенных клеток и яркость флуоресценции. После чего производят фиксацию клеток и их последующую окраску гематоксилином Майера и проводят морфометрическое исследование.
Однако известный способ имеет следующие недостатки.
Известный способ не обеспечивает возможности исследовать другие биологические клеточные материалы, такие как клетки геморрагической жидкости, клетки в моче, клетки из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клетки из соскобов резецированных солидных опухолей до фиксации опухоли в формалине, что сужает диагностические возможности способа.
Задачей предлагаемой полезной модели является создание биочипа для мультиплексного анализа, который лишен недостатков прототипа.
Технический результат от использования предлагаемого биочипа заключается в обеспечении возможности анализа клеток геморрагической жидкости, клеток мочи, клеток из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток, полученных из соскобов резецированной солидной опухоли, повышении надежности работы биочипа и увеличении срока его годности.
Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом биочипе для мультиплексного анализа, содержащем прозрачную подложку из стекла, разделенную на функциональную и рабочую части, функциональная часть служит для фиксации биочипа в руках, рабочая часть имеет покрытие и разделена на тестовые ячейки посредством решетки из пластика, каждая тестовая ячейка снабжена иммобилизованными флуоресцентными антителами, специфичными к антигенам клеток, биочип содержит пленку, закрепленную поверх решетки, на подложку рабочей части нанесено покрытие, создающее положительный заряд на поверхности стекла, в тестовые ячейки внесены антитела, конъюгированные с флуоресцентной меткой Су-3 и реагент, препятствующий высыханию внесенных антител, рабочая поверхность биочипа покрыта воздухонепроницаемой стерильной пленкой, функциональная часть биочипа снабжена информацией о локализации внесенных антитела.
Предлагаемая полезная модель отвечает критерию «новизна», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников информации, которые бы порочили новизну предлагаемого устройства
Предлагаемый биочип представляет собой подложку размерами 25,4×76,2 мм, толщиной 1 мм. До начала работы биочип хранят в непрозрачном контейнере. Время нахождения на свету не должно превышать 20 минут до начала постановки реакции. Следует избегать попадания прямых солнечных лучей на изделие вне контейнера. Перед началом работы с поверхности биочипа снимают воздухонепроницаемую стерильную пленку.
Предлагаемый биочип обеспечивает возможность анализа клеток геморрагической жидкости, клеток мочи, клеток, полученных из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток, поученных из соскобов с солидных опухолей. Выполнение подложки с покрытием, создающим положительный заряд на поверхности стекла, позволяет проводить селективную сорбцию клеток за счет отрицательного заряда мембраны последних, при- этом препятствует сорбции антител за счет положительного заряда последних. В предлагаемые ячейки можно сорбировать антитела к любым антигенам опухоли. Возможность селективного связывания антитела с клеткой, а клетки с подложкой, исключающей неспецифическое осаждение антител на подложку, позволяет сократить время на исполнение анализа и повысить специфичность и надежность работы биочипа.
Внесение в тестовые ячейки антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой, например Су3, позволяет сохранить свечение ячеек до 2 месяцев.
Добавление реагента в каждую тестовую ячейку, содержащего, например, PBS, БСА и 0,06% азида натрия позволяет продлить работоспособность биочипа (более 1 года), так как препятствует высыханию капель антител за счет формирования защитной оболочки на молекулярном уровне, а также препятствует размножению микроорганизмов. Покрытие биочипа воздухонепроницаемой стерильной пленкой также препятствует размножению микроорганизмов.
В результате работы создано простое в использовании устройство, позволяющее одномоментно проводить анализ сразу 30 маркеров клеток, с возможностью оценки связи морфологии клетки и свечения, взаимосвязи антигена и клетки, его локализации, качественной характеристики. Использование вышеуказанных реагентов для анализа обеспечивает возможность длительного ретроспективного исследования
Предлагаемая полезная модель работает следующим образом.
Подготавливают биоматериала в виде взвеси клеток для исследования. Серозную жидкость забирают несколькими рутинными способами (интраоперационно в стерильный шприц в количестве не менее 2 мл, при пункции трансвагинально, трансабдоминально в стерильный шприц). Затем серозную жидкость помещают в пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин. Удаляют надосадочную жидкость, взвесь клеток в объеме не более 0,7-1 мл микропипеткой вносят в ячейки биочипа.
Мутную с осадком серозную жидкость, берут не более 20 мл (две центрифужные пробирки) и, после центрифугирования, надосадочную жидкость аккуратно удаляют пипеткой, доводя до объема 0,7-1 мл и ресуспендируют, получая концентрированную взвесь клеток. Полученную клеточную взвесь центрифугируют и осадок пипеткой вносят в ячейки биочипа.
Геморрагическую жидкость забирают с помощью пункции, центрифугируют в большом количестве (по 6-8) центрифужных пробирок емкостью 10 мл, далее надсадочные жидкости сливают, осадок ресуспензируют и объединяют в одну пробирку. Если собранная взвесь клеток превышает объем более 1 мл, еще раз центрифугируют и пипеткой аккуратно удаляют лишнюю жидкость, доводя объем до 0,7-1 мл, ресуспензируют, получая концентрированную взвесь клеток в жидкости и вносят мерными микропипетками материал в ячейки биочипа.
Взвесь клеток из материала тонкоигольной аспирационной биопсии помещают в пробирку Эппендорфа с питательной средой объемом 0,8 мл. Накрывают пробирку крышкой и тщательно перемешивают на шейкере, центрифугируют 5 минут при скорости 1500 об/мин, затем вносят мерными микропипетками материал в ячейки биочипа.
Для исследования солидных опухолей выполняют следующее. После получения резецированной опухоли, до ее фиксации формальдегидом, опухолевое образование рассекают и производят соскоб с его поверхности шпателем или краем стекла. Полученный соскоб помещают в пробирку Эппендорфа объемом 0,8 мл, содержащую питательную среду. Затем, закрыв пробирку крышечкой, взвесь тщательно перемешивают на шейкере и центрифугируют 5 минут при скорости 1500 об/мин, после чего вносят мерными микропипетками материал в ячейки чипа.
Внесенный биоматериал, аккуратно ресуспензируют слегка касаясь пипеткой дна для лучшего растворения антител и взаимодействия их с клетками опухоли. Затем биочип накрывают воздухонепроницаемой стерильной пленкой и помещают на шейкер на 2-3 минуты для лучшего растворения антител и взаимодействия их с клетками опухоли. После чего помещают в термостат или в гибридайзер на 25 минут при температуре 37°С. По истечении "указанного времени, соблюдая режим темноты, легким движением чип ополаскивают в стаканчике с Трис-буфером и дают высохнуть. Проводят исследование под флуоресцентным микроскопом. Проводят анализ флуоресценции в каждой из ячеек по следующим параметрам: количество флуоресцентно окрашенных клеток и яркость флуоресценции. После проведения флуоресцентного исследования выполняют фиксацию клеток и окраску по Лейшману. Проводят морфологическое исследование клеток. Результаты флуоресцентного анализа и морфометрического сопоставляют. Если свечения не отмечено, биочип окрашивают по Лейшману и проводят цитологическое исследование, оценивают клеточность и морфологию клеток. После проведенного анализа, чип заворачивают в фольгу и помещают в холодильник при -2-8°С.
Примеры конкретного осуществления даны в виде протоколов исследования.
Протокол №1
Пациентка А. 57 лет, поступила в стационар с подозрение на рак яичников, асцит. Пациентке в условиях поликлиники стерильным шприцом была выполнена пункция заднего свода влагалища. Было получено 20 мл светлой жидкости, соломенного цвета. Исследуемую жидкость поместили в пробирку объемом 20 мл и центрифугировали в течение 5 мин при 2000 об/мин. Затем серозную жидкость без осадка и каких-либо включений центрифугировали в большом количестве (по 4-5) центрифужных пробирок емкостью 4 мл, далее надосадочную жидкость сливали, осадки ресуспензировали и объединяли в одну пробирку. Полученную клеточную взвесь тщательно перемешали на шейкере.
Для исследования был применен биочип для исследования серозных жидкостей. В исследовании бы|ш использованы следующие виды антител: ячейка 1 маркер СА-125, ячейка 2 - РЭА, ячейка 3 - СК7, ячейка 4 - СК20, ячейка 5 - РЭ, ячейки 6 - TTF, ячейка 7 -WT1, ячейка 8 - Ерсат4, ячейка 9 - виментин, ячейка 10 - Cdx2.
С поверхности сняли воздухонепроницаемую стерильную пленку и внесли биоматериал взвеси клеток в каждую ячейку мерной пипеткой. Затем биочип вновь накрыли пленкой и поставили на шейкер, инкубировали в термостате в полной темноте 30 минут при температуре 37°С. Далее проводили отмывку биочипа в буферном растворе. Лишнюю влагу удалили фильтровальной бумагой. Затем решетку снимали и проводили исследование под флуоресцентным микроскопом. Выявлено свечение в комплексах клеток расположенных в ячейках: 1 - ярко выраженное свечение, 8 - ярко выраженное свечение, 3 - умеренно выраженное свечение. В остальных ячейках свечение не выявлено. Результат исследования: на биочипе - иммунофенотип соответствует раку яичников. Заключение исследователя: асцитическая жидкость содержит комплексы аденокарциномы яичника.
После оценки флуоресценции биочип окрасили по Лейшману, проведена морфологическая оценка клеток в каждой ячейке.
Протокол окраски по Лейшману: Мазок высушен на воздухе. Зафиксирован в фиксаторе-красителе Лейшмана в течение 3 минут, промыт водой. Произведена окраска 40 мл 0,1% красителя азур II, 30 мл 0,1% воднорастворимого эозина, 70 мл дистиллированной воды. Смесь красителей готовят перед работой (extempore).
Морфологическое заключение: во всех ячейках комплексы клеток аденокарциномы.
Пациентка, госпитализирована, выполнена операция экстирпации матки с придатками. Оментэктомия. Биопсия брюшины. Результат нистологического исследования: серозная аденокарцинома яичника. Диагноз - рак яичника IIIс стадии
Протокол №2
Пациентка И. 38 лет. Выявлено новообразование молочной железы. Выполнена пункция. Цитологическое исследование: аденогенный рак. Выполнено оперативное вмешательство в объеме секторальной резекции с подмышечной лимфоаденэктомией. Материал был отобран для исследования на биочипе ЕРН (рак молочной железы). В номерах ячеек 1, 6, 11 внесены антитела к рецепторам эстрогена, в номерах ячеек 2,7,12 антителя к рецепторам прогестерона, в номерах ячеек 3, 8, 13 внесены антитела Her2-neu, в номера ячеек 4, 9, 14 внесены антитела Ki67, в номера ячеек 5, 10, 15 внесены антитела EGFR. Для сохранения антител во влажной среде добавлен реагент PBS, азид натрия 0,06%, БСА.
После получения резецированной опухоли до ее фиксации формальдегидом, опухолевый узел был рассечен и произведен соскоб шпателем с поверхности образования. Полученный соскоб помещен в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл с питательной средой. Затем, закрыв пробирку крышечкой, взвесь центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин. С поверхности биочипа удалили защитную пленку и внесли материал взвеси клеток в каждую ячейку мерной пипеткой.
Так же выборочно взяты и рассечены 2 лимфоузла, произведены соскобы с поверхности каждого лимфоузла. Каждый соскоб был помещен в свою пробирку объемом 1,5 мл с питательной средой. Затем, закрыв пробирку крышечкой, взвесь центрифугировали со скоростью 1500 об/мин в течение 5 минут. С поверхности биочипа удалили защитную пленку и внесли материал взвеси клеток в каждую ячейку мерной пипеткой.
Материал опухоли в ячейки: 1, 2, 3,4, 5.
Материал лимфоузла №1 - 6, 7, 8, 9, 10
Материал лимфоузла №2 - 11, 12, 13, 14,15
Затем биочип накрыт снятой пленкой и помещен на шейкер на 5 минут. Затем помещен в термостат на 30 минут при температуре 37°С. Проведена отмывка в буфере. Лишнюю влагу удалили фильтровальной бумагой. Затем была снята решетка и проведено исследование под флуоресцентным микроскопом.
Заключение на биочипе:
Опухоль имеет следующий фенотип:
Рецепторы эстрогена: отрицательные.
Рецепторы прогестерона: отрицательные.
Рецепторы Her2-neu: 3+ (выраженное)
Ki67 - более 30% (2 балла)
Рецепторы EGFR: 1+ (слабо выраженное)
Лимфоузел №1 имеет следующий фенотип:
Рецепторы эстрогена: отрицательные.
Рецепторы прогестерона: отрицательные.
Рецепторы Her2-neu: 3+ (выраженное)
Ki67 -более 30% (2 балла)
Рецепторы EGFR: 1+ (слабо выраженное)
Лимфоузел №2 имеет следующий фенотип:
Рецепторы эстрогена: отрицательные.
Рецепторы прогестерона: отрицательные.
Рецепторы Her2-neu: 3+
(выраженное)
Ki67 - более 30% (2 балла)
Рецепторы EGFR: 0 (отрицательное)
Заключение исследователя: рак молочной железы Her2-neu: 3+, рецепторы эстрогена 0 баллов, рецепторы прогестерона 0 баллов, Ki67-более 30% клеток, рецепторы EGFR-1 балл.
Протокол окраски по Лейшману.
Морфологическое заключение: во всех ячейках комплексы клеток аденокарциномы молочной железы
Результат планового гистологического исследования: инвазивная карцинома молочной железы скирозного строения. В лимфоузлах метастазы аденокарциномы.
Результат иммуногистохимии: рак молочной железы Her2-neu: 3+, рецепторы эстрогена 0 баллов, рецепторы прогестерона 0 баллов, К167 - более 30% клеток, рецепторы EGFR-1 балл.
Пациентке выставлен диагноз рак молочной железы III стадии.
Протокол №3
Пациент Д. 69 лет. Взята моча на цитологический анализ. При цитологии выявлены комплексы атипических клеток. Больной сдал анализ мочи повторно. В лабораторию доставлена моча, соломенно-желтого цвета объемом 50 мл. Исследуемую жидкость поместили в пробирки объемом 20 мл и центрифугировали в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин. Затем мочу центрифугировали в большом количестве (по 4-5) центрифужных пробирок емкостью в 4 мл, после чего надосадочные жидкости слили, осадок ресуспензировали и объединили в одну пробирку.
Для исследования использован биочип NPV (урогенитальный тракт). В тестовых ячейках биочипа размещены антитела конъюгированные с Су3 к рецепторам р16 - ячейка 1, к рецепторам Ki67 - ячейка 2, к рецепторам р 63 - ячейка 3, к рецепторам цитокератины 5/6 - ячейка 4, цитокератин 7 - ячейка 5, цитокератин 20 - ячейка 6, СА 125 - ячейка 7, WT1 - ячейка 8, уроплакин - ячейка 9, CD 95 ячейка 10, Cdx2 - ячейка 11. Для сохранения антител во влажной среде добавлен реагент PBS, азид натрия 0,06%, БСА.
С поверхности биочипа удалена воздухонепроницаемая стерильная пленка, в каждую ячейку мерной пипеткой внесен исследуемый материал - взвеси клеток мочи. Затем биочип накрыли снятой пленкой. Обработали в течение 5 минут на шейкере. Инкубировали в термостате в полной темноте 30 минут при температуре 37°С. Далее проведена отмывка в буфере. Лишнюю влагу удалили фильтровальной бумагой. Затем сняли решетку и провели исследование под флуоресцентным микроскопом. При оценки под флуоресцентным микроскопом выявлено свечение в комплексах клеток расположенных в ячейках: 1 - ярко выраженная, 8 - умеренное выраженная, 9 - ярко выраженная. Ячейки 10 и 4 - слабовыраженная. Остальные ячейки отрицательные.
Заключение, полученное на биочипе: иммунофенотип соответствует раку мочевого пузыря высокой степени злокачественности.
Заключение исследователя: в моче присутствую клетки плоскоклеточного рака мочевого пузыря высокой степени злокачественности
После оценки флуоресценции биочип окрашен по Лейшману и проведена морфологическая оценку клеток в каждой ячейке.
Морфологическое заключение: во всех ячейках комплексы атипичных клеток.
Пациентка госпитализирована в стационар. Выполнена цистоскопия с биопсией. Результат гистологического исследования: плоскоклеточный рак. Диагноз рак мочевого пузыря I стадии.
Протокол №4
Пациентка С. 45 лет. Узловое новообразовоание щитовидной железы Пациентке в условиях поликлиники стерильным шприцом была выполнена пункция новообразования. Было получено 5 мл геморрагической жидкости. Жидкость направлена на исследование. Исследование проведено на биочипе TYR (щитовидная железа). Тестовые ячейки биочипа содержали следующие антитела с меткой Су3: тиреоглобулин - ячейка 1, кальцитонин - ячейка 2, TTFI - ячейка 3, галектин - ячейка 4, мезотелиальный антиген HBMEI - ячейка 5, цитокератин 19 - ячейка 6, CD44v6 - ячейка 7, р53 - ячейка 8. Для сохранения антител во влажной среде добавлен реагент PBS, азид натрия 0,06%, БСА.
Исследуемая жидкость перелита в пробирку объемом 10 мл, содержащую питательную среду. Проведено центрифугирование в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин. в пробирке объемом 10 мл. Затем геморрагическую жидкость без осадка и каких-либо включений центрифугировали в большом количестве (по 4-5) центрифужных пробирок емкостью в 4 мл, после центрифугирования надосадочные жидкости слили, осадки ресуспензировали и объединили в одну пробирку. Полученную клеточную взвесь тщательно перемешали на шейкере. Затем с поверхности биочипа сняли воздухонепроницаемую стерильную пленку и внесли материал взвеси клеток в каждую ячейку мерной пипеткой. Затем биочип накрыли снятой пленкой. Инкубировали в термостате в полной темноте 30 минут при температуре 37°С. Далее поместили на шейкер. Далее проводили отмывку в буфере. Лишнюю влагу удаляли фильтровальной бумагой. Затем сняли решетку и провели исследование под флуоресцентном микроскопе.
Выявлено свечение в комплексах клеток расположенных в ячейках: 1 - ярко выраженная, 2 - ярко выраженная, 7 - умеренно выраженная, 8 - ярко выраженная. Остальные ячейки отрицательные.
Заключение по результатам анализа на биочипе: иммунофенотип соответствует раку щитовидной железы.
Заключение исследователя: пунктат содержит клетки рака щитовидной железы.
После оценки флуоресценции биочип окрасили по Лейшману и провели морфологическую оценку клеток в каждой ячейке.
Морфологическое заключение: во всех ячейках комплексы клеток карциномы.
Пациентка госпитализирована в стационар. Выполнена операция гемиструмэктомия. Результат гистологического исследования: фолликулярная карцинома щитовидной железы. Пациентке выставлен диагноз рак щитовидной железы.
Claims (1)
- Биочип для мультиплексного анализа, содержащий прозрачную подложку из стекла, разделенную на функциональную и рабочую части, функциональная часть служит для фиксации биочипа в руках, рабочая часть имеет покрытие и разделена на тестовые ячейки посредством решетки из пластика, каждая тестовая ячейка снабжена иммобилизованными флуоресцентными антителами, специфичными к антигенам клеток, биочип содержит пленку, закрепленную поверх решетки, отличающийся тем, что на подложку рабочей части нанесено покрытие, создающее положительный заряд на поверхности стекла, в тестовые ячейки внесены антитела, конъюгированные с флуоресцентными метками Су-3, и реагент, препятствующий высыханию внесенных антител, рабочая часть биочипа покрыта воздухонепроницаемой стерильной пленкой, функциональная часть биочипа снабжена информацией о локализации внесенных антител.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019115153U RU197681U1 (ru) | 2018-04-27 | 2018-04-27 | Биочип для мультиплексного анализа |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019115153U RU197681U1 (ru) | 2018-04-27 | 2018-04-27 | Биочип для мультиплексного анализа |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU197681U1 true RU197681U1 (ru) | 2020-05-21 |
Family
ID=70803150
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019115153U RU197681U1 (ru) | 2018-04-27 | 2018-04-27 | Биочип для мультиплексного анализа |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU197681U1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2776889C1 (ru) * | 2021-10-19 | 2022-07-28 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет "ЛЭТИ" им. В.И. Ульянова (Ленина)" (СПбГЭТУ "ЛЭТИ") | Способ количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа и устройство для его осуществления |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2303634C2 (ru) * | 2005-10-11 | 2007-07-27 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук | Способ анализа генетического полиморфизма, определяющего предрасположенность к онкологическим заболеваниям и индивидуальную чувствительность к фармацевтическим препаратам с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) |
WO2009112594A2 (en) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | Clondiag Gmbh | Assays |
RU137188U1 (ru) * | 2013-01-31 | 2014-02-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО НижГМА МЗ России) | Биочип для диагностики в области медицины |
RU142470U1 (ru) * | 2014-02-07 | 2014-06-27 | Святослав Владимирович Зиновьев | Биочип для мультиплексного анализа |
-
2018
- 2018-04-27 RU RU2019115153U patent/RU197681U1/ru active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2303634C2 (ru) * | 2005-10-11 | 2007-07-27 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук | Способ анализа генетического полиморфизма, определяющего предрасположенность к онкологическим заболеваниям и индивидуальную чувствительность к фармацевтическим препаратам с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) |
WO2009112594A2 (en) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | Clondiag Gmbh | Assays |
RU137188U1 (ru) * | 2013-01-31 | 2014-02-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО НижГМА МЗ России) | Биочип для диагностики в области медицины |
RU142470U1 (ru) * | 2014-02-07 | 2014-06-27 | Святослав Владимирович Зиновьев | Биочип для мультиплексного анализа |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2776889C1 (ru) * | 2021-10-19 | 2022-07-28 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет "ЛЭТИ" им. В.И. Ульянова (Ленина)" (СПбГЭТУ "ЛЭТИ") | Способ количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа и устройство для его осуществления |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10060905B2 (en) | Liquid medium and sample vial for use in a method for detecting cancerous cells in a cell sample | |
CN109073631B (zh) | 物质标记贴片及使用其进行诊断组织的方法和装置 | |
JP2008209419A (ja) | 少なくとも2種の異なる分子マーカーを同時に測定することによって腫瘍およびそれらの前駆体段階を検出する場合に臨床的特異性を増強する方法 | |
JP4986449B2 (ja) | 浮遊細胞の検査方法 | |
Voith von Voithenberg et al. | Spatially multiplexed RNA in situ hybridization to reveal tumor heterogeneity | |
CN106980018B (zh) | 一种应用cd45免疫荧光联合cep17探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 | |
CN106970225B (zh) | 一种应用cd45免疫荧光联合cep 8探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 | |
WO2012088195A2 (en) | Device and methods for the detection of cervical disease | |
CN109439732B (zh) | 一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒 | |
KR101969847B1 (ko) | 동일 검체에서 여러 항원을 검출하기 위한 순차적 다중 면역염색법 | |
WO2017204674A1 (ru) | Биочип для мультиплексного анализа и способ исследования клеток при диагностике онкологических заболеваний | |
Chin et al. | Hydrogel Stamping for Rapid, Multiplexed, Point-of-Care Immunostaining of Cells and Tissues | |
RU197681U1 (ru) | Биочип для мультиплексного анализа | |
CN103900864A (zh) | 脱落细胞芯片 | |
JP6670503B2 (ja) | 生体由来細胞を用いたがん細胞の検出方法 | |
JP6457119B2 (ja) | 生化学検査と免疫反応検査を行うマルチユニット、及びこれを用いた検査方法 | |
RU137188U1 (ru) | Биочип для диагностики в области медицины | |
US20210252518A1 (en) | Biological sample holder and handler | |
Nagai-Okatani et al. | Tissue glycome mapping: lectin microarray-based differential glycomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections | |
CN101469351B (zh) | 一种前列腺癌症早期诊断、转移、复发的综合检测试剂盒及应用 | |
RU197467U1 (ru) | Биочип для мультиплексного анализа | |
Bravaccini | Fluorescence in situ hybridization in urine samples (UroVysion Kit) | |
CN210071844U (zh) | 基于pd-l1受体的癌症检测装置 | |
Sigdel et al. | Discovery of immune reactive human proteins by high-density protein arrays and customized validation of potential biomarkers by ELISA | |
JP2008541019A (ja) | 組織学のための異種移植組織の対照 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC91 | Official registration of the transfer of exclusive right (utility model) |
Effective date: 20210201 |