CN117946244A - 一种cd73蛋白的检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CD73蛋白的检测方法、试剂盒及其应用，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为包含特异性结合片段的CD73抗体，所述特异性结合片段为如SEQ NO:1所示的氨基酸序列，所述第二抗体为Polymer酶标二抗，所述方法为基于前述试剂盒对待测样品进行免疫组化染色。本发明提供的试剂盒和检测方法，特异性好、便捷性高、易于操作且成本可控，在进行CD73高表达相关癌症的CD73蛋白表达情况的体外检测方面具有良好前景，也可进一步用于预测和评估免疫治疗药物的效果。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种CD73蛋白的检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术
CD73又称为胞外5'-核苷酸酶，是由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜表面的一种多功能跨膜糖蛋白，其分子量为70kDa，由NT5E基因编码。最早，CD73被定义为淋巴细胞表面分化抗原，在T淋巴细胞中具有刺激信号分子的功能。随着研究的不断深入，人们发现CD73分子不仅存在于淋巴细胞中，而是在大多数组织中广泛存在，并且发挥多种不同的生理功能，如：上皮离子交换、液体转运、血小板功能、组织乏氧以及血管渗漏等。CD73具有水解酶和非水解酶功能。在肿瘤的发生发展过程中，CD73的水解酶与非水解酶功能并非独立存在，而是同时发挥作用并互相促进，共同参与维持肿瘤的演进。
CD73在多种恶性肿瘤组织中高表达，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及恶性黑色素瘤等。CD73在肿瘤微环境中，能够促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭和转移。此外，它能够抑制保护性免疫细胞，如效应性T细胞、NK细胞和B细胞。增强抑制性免疫细胞，如肿瘤相关的巨噬细胞、髓系抑制性细胞和调节性T细胞。由此可见，CD73在肿瘤的进展过程中扮演着重要的角色，是肿瘤治疗的潜在靶标。
在肿瘤治疗过程中，采用免疫组织化学法检测患者肿瘤组织内靶蛋白的表达有利于治疗的决策，现有技术中，对于CD73蛋白的检测通常采用ELISA试剂盒检测，存在时间较长、成本较高的缺陷。
因此，本领域亟需开发一种能够特异性好、便捷性高、易于操作且成本可控的CD73蛋白检测试剂盒及其方法，可用于进行CD73高表达相关癌症的CD73蛋白表达情况的体外检测，也可进一步用于预测和评估免疫治疗药物的效果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种多肽，所述多肽特异性结合抗CD73抗体，所述多肽的氨基酸序列如SEQ NO:1所示。
本发明的第二方面，提供一种检测CD73蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为包含特异性结合片段的CD73抗体，所述特异性结合片段为如SEQNO:1所示的氨基酸序列，所述第二抗体为Polymer酶标二抗。
具体地，所述试剂盒还包括PBS缓冲液、抗原修复液、封闭液、显色液和复染液。
具体地，所述第一抗体的工作液的稀释比例为1：500～1：700。
具体地，所述封闭液为过氧化物酶封闭液。
具体地，所述显色液为DAB显色液。
具体地，所述复染液为苏木素染液。
本发明的第三方面，提供一种前述的检测CD73蛋白的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)样本准备：
取待测组织的石蜡块，制成3～5μm的石蜡切片，于60℃恒温箱中烤片60min；
2)上机检测：
使用Leica全自动免疫组化染色机，对样品进行免疫组化染色；
3)脱水透明：
将样品依次置于70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇和无水乙醇中浸泡，每次浸泡时间为3min，其中，无水乙醇中浸泡两次；
之后，再浸泡两次二甲苯，每次浸泡时间为10min；
4)封片：
采用中性树胶对浸泡后的样品进行封片。
具体地，所述Leica全自动免疫组化染色机的运行程序为：
1)脱蜡；
2)使用抗原修复液进行抗原修复10-12min；
3)使用过氧化物酶封闭液进行封闭5-10min；
4)加入第一抗体孵育30-60min；
5)加入第二抗体孵育8-10min；
6)使用DAB显色液进行显色5-10min；
7)使用苏木素染液复染2-5min。
本发明的第四方面，提供了一种前述的检测CD73蛋白的试剂盒在筛选或制备防治疾病的药物中的应用，所述疾病为恶性肿瘤，所述恶性肿瘤包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和恶性黑色素瘤。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明提供的多肽，针对抗CD73抗体具有优良的检测特异性，从而帮助筛选出构建高特异性高灵敏度的CD73检测试剂盒的CD73抗体，进一步提升了CD73蛋白表达免疫组化染色检测的准确度。
2.本发明的检测CD73蛋白的试剂盒及其检测方法，操作简便、成本较低且适用性广，可以广泛适用于多种肿瘤疾病中CD73蛋白表达的体外检测诊断，且有利于筛选和预测多种CD73靶点的免疫治疗药物的效果。
附图说明
图1是本发明实施例一中，anti-CD73抗体1(Clone：EPR6114)和CD73抗体2的免疫组化检测结果；
图2是本发明实施例二中，多肽竞争性结合实验的免疫组化检测结果；
图3是本发明实施例三中，使用本发明提供的试剂盒和检测方法对扁桃体组织进行免疫组化检测的结果图；
图4是本发明实施例三中，使用本发明提供的试剂盒的检测方法对非小细胞肺癌组织进行免疫组化检测的结果图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中所使用的材料、仪器和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所使用的技术手段，如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一特异性CD73抗体试剂的筛选
获取扁桃体和2个非小细胞肺癌组织石蜡块，将蜡块制成3～5μm的石蜡切片，采用来自Abcam公司的anti-CD73抗体1(Clone：EPR6114)和另一候选的市售的CD73抗体2在Leica全自动免疫组化染色机进行免疫组织化学染色检测，配套试剂详细信息如下：1)BONDDewax Solution(货号：AR9222-CN，备案号：国械备2015293，生产商：Leica Biosystems)2)BOND Epitope Retrival Solution 2(货号：AR9640-CN，备案号：国械备20150327，生产商：Leica Biosystems)3)BOND Wash Solution 10XConcentrate(货号：AR9590-CN，备案号：国械备20150492，生产商：Leica Biosystems)
4)BOND Polymer Refine Detection Kit(货号：DS9800，备案号：国械备20150558，生产商：Leica Biosystems)
检测步骤如下：
1)样本准备：将3～5μm的石蜡切片于60℃恒温箱中烤片60分钟。
2)上机检测：在Leica全自动免疫组化染色机上进行检测，运行程序如下：
(*包含在Leica BOND Polymer Refine Detection Kit试剂套装中的试剂)
3)将样品依次置于70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇和无水乙醇中浸泡，每次浸泡时间为3min，其中，无水乙醇中浸泡两次；之后，再浸泡两次二甲苯，每次浸泡时间为10min；
4)封片：采用中性树胶对浸泡后的样品进行封片。
结果如图1所示，图中，A为扁桃体组织，B为非小细胞肺癌CD73阳性组织，C为非小细胞肺癌CD73阴性组织，A-1、B-1、C-1为anti-CD73抗体1(Clone：EPR6114)的免疫组化染色结果，A-2、B-2、C-2为抗体2的免疫组化染色结果。
根据图1，对扁桃体组织的检测中，采用anti-CD73抗体1(Clone：EPR6114)检测时(A-1)，扁桃体的内皮细胞、套区及部分滤泡间区淋巴细胞呈现中等至强的细胞膜/质染色，生发中心、纤维被膜细胞呈现弱至中等的细胞膜/质染色，其余细胞未染色；采用anti-CD73抗体2检测时(A-2)，扁桃体生发中心具有较强的非特异性染色。
对非小细胞肺癌CD73阳性组织的检测中，采用anti-CD73抗体1(Clone：EPR6114)检测时(B-1)，非小细胞肺癌CD73阳性样本中，肿瘤细胞阳性染色定位准确，肿瘤间质部位没有非特异性染色；采用抗体2检测时(B-2)，非小细胞肺癌CD73阳性样本中肿瘤细胞染色定位准确，但肿瘤间质部位具有较强的非特异性染色。
对非小细胞肺癌CD73阴性组织的检测中，采用anti-CD73抗体1(Clone：EPR6114)检测时(C-1)仅免疫细胞和内皮细胞有散在染色，无背景染色，而采用抗体2检测时(C-2)，除免疫细胞和内皮细胞有散在染色外，在肿瘤间质部位存在背景染色。
综上可以看出，anti-CD73抗体1(Clone：EPR6114)可以特异性结合扁桃体组织和非小细胞肺癌组织上的CD73阳性细胞，且相较于抗体2没有非特异性染色，因此，anti-CD73抗体1(Clone：EPR6114)为检测CD73的优势克隆。
实施例2CD73免疫组化多肽竞争性结合实验
选用本申请提供的序列为SEQ ID NO:1所示的多肽进行CD73免疫组化多肽竞争性结合实验。选取1例扁桃体和2例非小细胞肺癌石蜡组织块，将蜡块制成3～5μm的石蜡切片。将多肽配制成以下浓度梯度：0ng/mL、3.6ng/mL、36ng/mL、360ng/mL，并提前与实施例1验证得到的CD73优势克隆的anti-CD73抗体1(Clone：EPR6114)进行孵育后作为一抗，采用与实施例1相同的方法进行免疫组化染色检测。
结果如图2所示，为多肽浓度为360ng/mL时多肽竞争结合的结果。图2中，A为扁桃体组织，B为非小细胞肺癌CD73阳性组织，C为非小细胞肺癌CD73阴性组织；A-CD73、B-CD73、C-CD73为CD73抗体试剂的免疫组化染色结果，A-多肽、B-多肽、C-多肽为多肽封闭的免疫组化染色结果。
图2中，对于扁桃体组织，A-CD73表示在扁桃体组织A中单独孵育第一抗体(多肽0ng/mL)进行检测的结果，可看出扁桃体的内皮细胞、套区及部分滤泡间区淋巴细胞呈现中等至强的细胞膜/质染色，生发中心、纤维被膜细胞呈现弱至中等的细胞膜/质染色，其余细胞未染色；A-多肽表示在扁桃体组织A中多肽浓度为360ng/mL时与第一抗体共同孵育后进行检测的结果，无阳性染色。
对于非小细胞肺癌CD73阳性组织，B-CD73表示单独孵育第一抗体(多肽0ng/mL)进行检测的结果，阳性染色定位准确，在肿瘤细胞中呈现中等至强的细胞膜和/或细胞质染色；B-多肽表示多肽浓度为360ng/mL时与第一抗体共同孵育后进行检测的结果，无阳性染色。
对于非小细胞肺癌CD73阴性组织，B-CD73表示单独孵育CD73抗体(多肽0ng/mL)进行检测的结果，B-多肽表示多肽浓度为360ng/mL时与第一抗体共同孵育后进行检测的结果，可以看出，两者均无明显阳性染色。
综上所述，SEQ ID NO:1所示的多肽序列能够特异的阻断CD73抗体试剂与组织中CD73蛋白的结合，即为抗体特异性结合片段，因此本发明提供的检测CD73蛋白的试剂盒具有优良的检测特异性。
实施例3采用本发明提供的检测CD73蛋白的方法检测CD73蛋白的表达水平
获取扁桃体和多个非小细胞肺癌组织石蜡块，将蜡块制成3～5μm的石蜡切片，采用本发明提供的检测CD73蛋白的方法，以anti-CD73抗体1(Clone：EPR6114)为第一抗体，利用实施例1相同的方法进行免疫组化染色检测。
本发明提供的检测CD73蛋白的试剂方法对扁桃体组织进行免疫组织化学的染色结果如图3所示，可以看出扁桃体的内皮细胞、套区及部分滤泡间区淋巴细胞呈现中等至强的细胞膜/质染色，生发中心、纤维被膜细胞呈现弱至中等的细胞膜/质染色，其余细胞未染色。
本发明提供的检测CD73蛋白的试剂方法对于非小细胞肺癌组织上进行免疫组织化学的染色结果如图4所示，其中，a为非小细胞肺癌组织中肿瘤细胞染色，b为非小细胞肺癌组织中免疫细胞染色。
根据图4，a组织中肿瘤细胞呈现明显的阳性染色，且无背景染色，b组织中肿瘤相关的免疫细胞和肿瘤细胞均呈现明显的阳性染色，且免疫细胞的阳性比例大于肿瘤细胞。
综上可以看出，本发明提供的多肽序列能够特异性结合抗CD73抗体，用于筛选特异性好的CD73抗体并应用于检测CD73蛋白，从而提供的检测CD73蛋白的试剂盒和检测方法可同时检测CD73阳性的肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞。因此，本发明提供的检测CD73蛋白的试剂盒及其检测方法有望进一步发展成为评估CD73蛋白在组织中表达的有效方法。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽特异性结合抗CD73抗体，所述多肽的氨基酸序列如SEQ NO:1所示。
2.一种检测CD73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为包含特异性结合片段的CD73抗体，所述特异性结合片段的氨基酸序列如SEQNO:1所示，所述第二抗体为Polymer酶标二抗。
3.根据权利要求2所述的检测CD73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PBS缓冲液、抗原修复液、封闭液、显色液和复染液。
4.根据权利要求2所述的检测CD73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体的工作液的稀释比例为1：500～1：700。
5.根据权利要求3所述的检测CD73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为过氧化物酶封闭液。
6.根据权利要求3所述的检测CD73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述显色液为DAB显色液。
7.根据权利要求3所述的检测CD73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述复染液为苏木素染液。
8.一种权利要求2-7中任一项所述的检测CD73蛋白的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)样本准备：
取待测组织的石蜡块，制成3～5μm的石蜡切片，于60℃恒温箱中烤片60min；
2)上机检测：
使用Leica全自动免疫组化染色机，对样品进行免疫组化染色；
3)脱水透明：
将样品依次置于70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇和无水乙醇中浸泡，每次浸泡时间为3min，其中，无水乙醇中浸泡两次；
之后，再浸泡两次二甲苯，每次浸泡时间为10min；
4)封片：
采用中性树胶对浸泡后的样品进行封片。
9.根据权利要求8所述的检测CD73蛋白的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述Leica全自动免疫组化染色机的运行程序为：
1)脱蜡；
2)使用抗原修复液进行抗原修复10-12min；
3)使用过氧化物酶封闭液进行封闭5-10min；
4)加入第一抗体孵育30-60min；
5)加入第二抗体孵育8-10min；
6)使用DAB显色液进行显色5-10min；
7)使用苏木素染液复染2-5min。
10.一种权利要求2-7中任一项所述的检测CD73蛋白的试剂盒在筛选或制备防治疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为恶性肿瘤，所述恶性肿瘤包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和恶性黑色素瘤。
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