DE3889455T2 - Verfahren zur Anfangsdiagnose bei kranken Tieren und diagnostisches Reagens für dieses Verfahren. - Google Patents
Verfahren zur Anfangsdiagnose bei kranken Tieren und diagnostisches Reagens für dieses Verfahren.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anfangsdiagnose zur Diagnostizierung, ob ein brütendes Tier, ein Haustier oder Versuchstier krank ist oder nicht. Sie betrifft ebenfalls ein Reagens zur Verwendung in einem solchen Verfahren.
- Üblicherweise ist es Praxis, daß Rinder, Schweine, Pferde, Ziegen, Schafe, Haushühner usw. in der Viehzucht gehalten werden, und Hunde, Katzen usw. als Haustiere gehalten werden. Kaninchen, Meerschweinchen, Mäuse, Hunde, Katzen, Ratten usw. werden als Versuchstiere verwendet.
- Im Falle der Viehzucht ist es notwendig, daß kranke Tiere aus der Produktion ausgeschlossen werden, um die Qualität des Fleisches, der Milch, der Eier usw. auf einem bestimmten Niveau zu halten. Bisher gab es jedoch keine wirksamen Maßnahmen, um die kranken Tiere zu identifizieren, und Züchter versuchen normalerweise, solche Tiere gemäß ihrer eigenen Erfahrung festzustellen und dann Veterinärmediziner für die Diagnose zu befragen.
- Eine auf einer solchen Erfahrung basierende Beurteilung ist jedoch in vielen Fällen schwierig, es sei denn, die Krankheitserscheinungen sind bereits fortgeschritten, was oft in einer Verzögerung der Behandlung resultiert.
- Wenn junge Schweine oder Kälber neu dazukommen, sterben sie häufig rasch weil sie sich der neuen Umgebung aufgrund einiger Erkrankungen nicht anpassen können.
- In jüngster Zeit werden Hunde und Katzen in zunehmendem Maße als Haustiere gehalten, aber nicht viele Leute haben eine vollständige Kenntnis oder ein Verständnis über ihren Gesundheitszustand, und die Behandlung von Erkrankungen dieser Tiere wird in vielen Fällen verzögert.
- Versuchstiere werden auf ihren Gesundheitszustand durch Veränderungen des Körpergewichts beurteilt, und nur die die als normal angesehen werden, werden für Versuchszwecke genommen.
- Viele dieser Tiere sterben jedoch aus unbekannten Gründen nach dem Beginn des Versuchs. Das Ansprechen dieser Tiere auf pharmazeutische Substanzen ist in einigen Fällen abnorm hoch oder abnorm gering, und es ist sehr wahrscheinlich, daß sie bestimmte Erkrankungen besitzen.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Anfangsdiagnose des Gesundheitszustandes von brütenden Tieren, Haustieren und Versuchstieren bereitzustellen und solche Tiere zu identifizieren und auszuschließen, die krank sind.
- Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 erreicht, und durch ein Reagens gemäß Anspruch 6. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen definiert.
- Verfahren zur Bestimmung von α1-Säureglycoprotein sind im Stand der Technik bekannt und werden z.B. beschrieben in
- Chemical Abstracts, 92 (1980):72114n;
- Chemical Abstracts, 99 (1983):19228w;
- Chemical Abstracts, 99 (1983):4005x;
- Chemical Abstracts, 98 (1983):139908u;
- EP-A-199 196; und
- US-A-4 492 753.
- Die vorliegende Erfindung wird aus der folgenden Beschreibung einiger ihrer Ausführungsformen in Verbindung mit den anhängenden Zeichnungen besser verständlich.
- Die Figur 1 ist ein Schaubild, das den Bereich der al-Säureglycoproteinwerte in Rinderserum zeigt, bestimmt durch das erfindungsgemäße diagnostische Reagens; und Figur 2 gibt die Schwankungen des α1-Säureglycoproteins im Serum von BCG-infizierten Mäusen an, gemessen mit dem erfindungsgemäßen diagnostischen Reagens.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Anfangsdiagnose kranker Tiere bereit, nach dem α1- Säureglycoprotein in Körperflüssigkeiten von brütenden Tieren, Haustieren und Versuchstieren gemessen wird, und ein Reagens zur Anfangsdiagnose von kranken Tieren, bei dem in einer Diffusionsplatte, die spezifische Antikörper verschiedener Tierarten gegenüber α1-Säureglycoprotein von brütenden Tieren, Haustieren oder Versuchstieren enthält, Vertiefungen zur Applikation von Proben vorgesehen sind. Bei der Herstellung dieses Reagens wird das Serum von brütenden Tieren, Haustieren und Versuchstieren durch Ammoniumsulfatfällung behandelt, durch eine Ionenaustauschsäulenchromatographie gereinigt, und weiter durch Gelfiltration gereinigt. Das so erhaltene α1- Säureglycoprotein wird den verschiedenen Tierarten verabreicht, um sie zu immunisieren, und das erhaltene spezifische Antiserum wird in eine Diffusionsplatte gegossen.
- Die brütenden Tiere umfassen hier Rinder, Schweine, Pferde, Ziegen, Schafe, Haushühner usw., und die Haustiere umfassen Hunde, Katzen usw. Die Versuchstiere sind Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten, Mäuse, Hunde, Katzenn usw.
- Die als Bestimmungsproben verwendeten Körperflüssigkeiten sind:
- Blut, Plasma, Serum, Urin, Milch, cerebrospinale Flüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, Ascites, Brustflüssigkeit, Tränen, Galle, Samenflüssigkeit, Nasenflüssigkeit, SPeichelflüssigkeit usw.
- α1-Säureglycoprotein der vorstehend genannten Tiere ist wie folgt erhältlich:
- Ammoniumsulfat wird dein Tierserum zugegeben, bis 60 % Sättigung erreicht ist. Nach Stehenlassen bei Raumtemperatur während 3 Stunden wird der Niederschlag entfernt. Dem Überstand wird weiteres Ammoniumsulfat bis zu einer 90 %-igen Sättigung zugegeben. Nach Stehenlassen bei 4 ºC während 16 Stunden wird α1-Säureglycoprotein als Niederschlag erhalten.
- Die durch Ammoniumsulfatfraktionierung erhaltene Fraktion von α1-Säureglycoprotein wird mit 0.02 M Acetatpufferlösung (pH = 4.3) diaiysiert und durch eine mit der gleichen Pufferlösung eguilibrierte DEAE-Cellulosesäule hindurchgeleitet. Wenn die Elution stufenweise durch Veränderung der Konzentration der Pufferlösung, z.B. durch Elution mit 0.1 M, 0.5 M oder 2.0 M Pufferlösung, durchgeführt wird, wird al-Säureglycoprotein als mit 0.5 M Pufferlösung eluierte Fraktion erhalten.
- Die über DEAE-Cellulosesäule gereinigte Fraktion von α1- Säureglycoprotein wird mit 0.02 M Acetatpufferlösung (pH = 4.3) dialysiert und durch eine CM-Cellulosesäule, die mit der gleichen Pufferlösung eguilibriert ist, hindurchgeleitet. α1- Säuleglucoprotein wird als eluierte Fraktion, ohne adsorbiert zu werden, erhalten. Nach Dialyse mit gereinigtem Wasser wird sie gefriergetrocknet.
- Die mit der CM-Cellulosesäule gereinigte Fraktion des α1- Säureglycoproteins wird gemäß dem Molekulargewicht durch eine Säule mit Sephacryl -Gel aufgetrennt. Die Fraktion des α1- Säureglycoproteins wird beim Molekulargewicht von ca. 50 000 eluiert. Nach Dialyse mit gereinigtem Wasser wird sie gefriergetrocknet, um ein weißes Pulver von α1- Säureglycoprotein zu erhalten.
- Die physikochemischen Eigenschaften von α1-Säureglycoprotein im Serum verschiedener Tierarten, das durch die vorstehend genannten Reinigungsverfahren erhalten wurde, wird unter Verwendung von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, Aminosäureanalysator, Gaschromatographie, Plattenelektrofokussierung usw. analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Physikochemische Eigenschaften von α1-Säureglycoprotein im Serum verschiedener Tiere Tier Molekulargewicht Kohlenhydratgehalt Isoelektrischer Punkt Rind Schwein Pferd Haushuhn Hund Katze Maus
- Freundsches komplettes Adjuvans wird so wie vorstehend beschriebenem gereinigten α1-Säureglycoprotein zur Emulgierung zugegeben und diese wird an Ziegen, Kaninchen, Schafe, Pferde, Rinder usw. (Tiere die von den zu untersuchenden Tieren verschieden sind) zugegeben. Die Injektion wird alle 2 Wochen wiederholt, und nach Bestätigung eines erhöhten Antikörperwerts Blut gesammelt. Das so gesammelte Blut wird zentrifugiert und der Überstand verwendet, um ein spezifisches Antiserum zu erhalten.
- Mit diesem spezifischen Antiserum kann α1-Säureglycoprotein durch verschiedene immunologische Antigen-Antikörper- Reaktionen festgestellt und quantitativ bestimmt werden. Die Antigen-Antikörper-Reaktion mit α1-Säureglycoprotein in der Probe wird z.B. durch eine einzige Radialimmunodiffusion, eine doppelte Immunodiffusion, Immunoelektrophorese, Antigen- Antikörper-Kreuzelektrophorese, Gegenimmunoelektrophorese, Rocket-Elektrophorese, sensibilisierte Hemagglutinationsreaktion, passive Hemagglutination- Inhibierungsreaktion, sensibilisierte Latexagglutinationsreaktion, einen turbidimetrischen Immunoassay, Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay usw. induziert. Das α1-Säureglycoprotein in Blut oder in Körperflüssigkeit wird gemessen.
- (i) einzige Radialimmunodiffusion (SRID-Verfahren) 5 u l Probe des Serums (Antigen) und dergleichen wird in kleine Löcher einer Agarplatte, die Anti-α1-Säurglucoprotein enthält, injiziert. Wenn die Reaktion bei Raumtemperatur oder bei 37 ºC während 24 bis 48 Stunden durchgeführt wird, diffundiert α1-Säureglycoprotein in der Probe radial, reagiert mit Antikörper und bildet Sedimentationsringe. Da die Antigenkonzentration und die Fläche der Niederschlagsringe miteinander in linearer Beziehung stehen, kann die Menge an α1-Säureglycoproteinen der Probe mittels einer Eichkurve einer α1-Säureglycoprotein-Standardlösung bestimmt werden. Dieses Verfahren ist leicht durchzuführen, erfordert keine teuren Vorrichtungen und Instrumente und hat eine hohe Reproduzierbarkeit. Es erfordert jedoch eine relativ lange Zeit vor der endgültigen Auswertung. Die minimale Sensitivität beträgt 5 u g/ml, und das Verfahren ist zur quantitativen Bestimmung von α1-Säureglycoprotein im Serum geeignet.
- Je 25 u l Pufferlösung wird in Vertiefungen von Mikroplatten (V-Typ) gegeben, und eine zweite Verdünnungsserie wird aus der Probe durch Verdünnung (25 u l) hergestellt. 25 u l von Anti- α1-Säureglycoproteinserum mit einem konstanten Titer wird zugegeben und vermischt. Nach Belassen bei Raumtemperatur während 30 Minuten wird neutralisiert. 50 u l sensibilisierte Erythrocyten (Schaferythrocyten, beschichtet mit α1- Säureglycoprotein) werden zugegeben. Nach Mischen und Stehenlassen während mehr als 2 Stunden wird eine Auswertung durch Hemagglutination vorgenommen. Die Konzentration an α1- Säureglycoprotein wird vom Agglutinationswert des Standard-α1- Säureglycoproteins und der Mehrfachverdünnung der Probe berechnet. Dies wird zur quantitativen Bestimmung von Spurenmengen an α1-Säureglycoprotein (10 ng/ml oder weniger) verwendet und ist zur Messung von α1-Säureglycoprotein in Urin zweckmäßig. Es ist aber nicht geeignet zur quantitativen Analyse von Serum-α1-Säureglycoprotein, weil dort ein beträchtlicher Fehler in der zweiten Verdünnung vorhanden ist. Die Sensitivität beträgt 10 ng/ml.
- Dieses Verfahren wird in die Plattenmethode und die Perlenmethode unterteilt. Die Probe und ein mit alkalischer Phosphatase markiertes al-Säureglycoprotein werden dem Material zugegeben, auf dem der Antikörper aufbeschichtet ist, und die Reaktion wird durch die kompetitive Methode bei 37 ºC während 2 Stunden durchgeführt. Nach dem Waschen wird p- Nitrophenylphosphat zugegeben; die Reaktion wird nach 30 Minuten gestoppt und die Absorption bei 450 nm gemessen. Die Menge an α1-Säureglycoprotein wird aus der auf ähnliche Weise erhaltenen Standardkurve von α1-Säureglycoprotein bestimmt. Die Empfindlichkeit beträgt 10 ng/ml.
- Wenn 50 u l Probe zu 2.0 ml Anti-α1-Säureglycoproteinserum, das auf einen bestimmten Titer verdünnt ist, zugefügt wird, tritt eine Agglutinationsreaktion auf und ergibt eine Trübung. Diese Trübung wird mit Erhöhung der Antigenmenge verstärkt. Die Reaktion wird bei 37 ºC 30 Minuten lang durchgeführt und die Trübung wird mit einem Spektrophotometer (Absorption bei 340 nm) gemessen. Mit einem Probenblindwert kompensiert wird die Menge an α1-Säureglycoprotein aus der Eichkurve von α1- Säureglycoprotein bestimmt. Wenn ein automatischer Analysator verwendet wird, kann die Messung durch Umsetzung bei 37 ºC während 10 Minuten mit 500 u l Antikörper und 20 u l Probe durchgeführt werden. Das Verfahren kann rasch durchgeführt werden und besitzt eine hohe Reproduzierbarkeit. Die Empfindlichkeit beträgt 5 u g/ml.
- α1-Säureglycoprotein kommt im Blut und anderen Körperflüssigkeiten normaler Tiere, wie von brütenden Tieren, Haustieren und Versuchstieren vor, und erreicht einen hohen Wert, wenn das Tier an verschiedenen Krankheiten leidet, insbesondere an Entzündungen, Infektionen, malignen Tumoren usw. Die Bestimmung von α1-Säureglycoprotein in Körperflüssigkeiten durch immunologische Verfahren bedeutet nicht notwendigerweise die Identifizierung der Krankheit, kann aber zur frühen Bestimmung der Erkrankung nützlich sein. Wenn sie von einer detaillierten sekundären Untersuchung begleitet ist, so ist sie hilfreich, die Diagnose mit hoher Genauigkeit zu stellen.
- Da α1-Säureglycoprotein aus verschiedenen Arten von Tieren gereinigt werden kann, kann Anti-α1-Säureglycoproteinserum mit hoher Spezifität und einem hohen Titer erhalten werden und das diagnostische Reagens mit hoher Zuverlässigkeit kann leicht hergestellt werden.
- Ammoniumsulfat wurde zur Rinderserum bis zu einer 60 %-igen Sättigung zugegeben. Nach Stehenlassen bei Raumtemperatur während 3 Stunden wurde der Niederschlag entfernt und zum Überstand weiteres Ammoniumsulfat zugegeben bis eine 90 %-ige Sättigung erreicht wurde. Nach Stehenlassen der Lösung bei 4 ºC während 16 Stunden wurde α1-Säureglycoprotein als Niederschlag erhalten.
- Durch Ammoniumsulfatfraktionierung erhaltenes α1- Säureglycoprotein wurde mit 0.02 M Acetatpufferlösung (PH = 4.3) dialysiert und durch eine mit der gleichen Pufferlösung equilibrierte DEAE-Cellulosesäule hindurchgeführt. Nach Waschen mit 0.1 M Pufferlösung wurde α1-Säureglycoprotein als mit 0.5 M Pufferlösung eluierte Fraktion erhalten.
- Die durch DEAE-Cellulosesäule gereinigte α1- Säureglycoproteinfraktion wurde mit 0.02 M Acetatpufferlösung (pH = 4.3) dialysiert. Sie wurde dann durch eine mit der gleichen Pufferlösung equilibrierte CM-Cellulosesäule hindurchgeführt. α1-Säureglycoprotein wurde als nichtadsorbierte eluierte Fraktion erhalten. Nach Dialyse mit gereinigtem Wasser wurde sie gefriergetrocknet.
- Die mit CM-Cellulosesäule gereinigte α1- Säuleglucoproteinfraktion wurde nach dem Molekulargewicht durch eine Säule mit Sephacryl -Gel fraktioniert. Die bei einem Molekulargewicht von ca. 50000 eluierte α1- Säureglycoproteinfraktion wurde mit gereinigtem Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Es wurde so ein hoch gereinigtes weißes Pulver von α1-Säureglycoprotein erhalten.
- Physiologische Kochsalzlösung wurde zu α1-Säureglycoprotein zugegeben, um eine Konzentration von 4 bis 20 mg/ml zu erhalten. 0.5 bis 10 ml dieser Lösung wurden mit einer äquivalenten Menge von Freundschem kompletten Adjuvans gemischt und emulgiert, und diese Flüssigkeit wurde subkutan in den Rücken von Kaninchen oder Ziegen injiziiert. Nach 2 Wochen wurden 1 bis 20 ml von auf ähnliche Weise hergestelltem α1-Säureglycoprotein weiter immunisiert. Nach weiteren 2 Wochen wurden 1 bis 20 ml emulgierter Lösung von α1- Säureglycoprotein immunisiert. Am Tag 10 nach der letzten Immunisierung wurde Blut gesammelt und Serum abgetrennt. Nach Erhitzen bei 56 ºC während 30 Minuten und Inaktivierung wurde zum Zwecke der Konservierung Natriumazid bis zu einer Konzentration von 0.05 % zugegeben. Die Spezifität dieses Antiserums gegenüber α1-Säureglycoprotein wurde nach der Methode von ouchterlony unter Verwendung von Rinderserum als Antigen und durch Immunoelektrophorese gemessen, und es wurde festgestellt, daß kein anderer als der Antiköper gegen α1- Säureglycoprotein vorhanden war.
- Gereinigter Agar wurde zu 1/15 M Phosphatpuffer-Salzlösung (pH = 7.4) auf eine Konzentration von 1.2 % zugegeben. Nach Erhitzen und Lösen wurde die Lösung in einen horizontalen Behälter bis zu einer Dicke von ca. 1.5 mm eingespritzt und verfestigt. Löcher mit einem Durchmesser von 3 mm und einem Abstand von ca. 3mm wurden vorgesehen und Antiserum, das zu testende Serum und das gemäß der Erfindung erhaltene α1- Säureglycoprotein wurden in jedes dieser Löcher appliziert um sie auszufüllen, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden lang durchgeführt. Die Niederschlagslinie zwischen dem zu testenden Serum und dem Antiserum wurde festgestellt. Wenn diese Niederschlagslinie beobachtet wurde, wurde dies mit α1-Säureglycoprotein-positiv beurteilt.
- Gereinigter Agar wurde zu 1/15 M Phosphatpuffer-Salzlösung (pH = 7.4) bis zu einer Konzentration von 1.2 % zugegeben. Nach Erhitzen und Auflösen wurde diese Lösung bei einer Temperatur von 55 ºC gehalten. Dann wurde das vorstehend unter B beschriebene Antiserum zugegeben, um eine Endkonzentration von 2 bis 15 % zu erhalten, und es wurde gemischt. Diese Lösung wurde in einen horizontalen Behälter bis zu einer Dicke von ca. 1.5 mm eingespritzt und verfestigt. Es wurden Löcher mit einem Durchmesser von 3 mm und mit einem Abstand von 15 mm vorgesehen, und je 5 ml von ursprünglicher Lösung von Rinder- α1-Säureglycoprotein-Standardlösung, vierfach und sechzehnfach verdünnter Lösungen und der zu testenden Flüssigkeit wurden genau abgemessen und dann appliziert. Wenn die Reaktion bei Raumptemperatur 24 Stunden lang durchgeführt wurde, wurde festgestellt, daß der Durchmesser des Niederschlagsrings in einer bestimmten funktionellen Beziehung stand.
- α1-Säureglycoprotein in normalem Serum gesunder Kühe, wie z.B. Holstein, Japanese Black Cattle, Japanese Shorthorn, Hereford, Jersey, usw. wurde quantitativ durch eine einzige Radialimmunodiffusion unter Verwendung des wie vorstehend hergestellten Reagens quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 α1-Säureglycoprotein in normalem Serum gesunder Rinder verschiedener Arten Rinderarten Fälle α1-Säureglycoprotein (ug/ml) Mittelwert±Standardabweichung Holstein Japanese Black Cattle Japanese Shorthorn Hereford Jersey
- In den Werten des α1-Säureglycoproteins im Serum gesunder Rinder war kein Unterschied zwischen den Rinderarten festzustellen.
- Der Maximalwert (450 ug/ml) in allen 143 Fällen wurde als obere Grenze des Normalwertes betrachtet.
- Für gesunde Rinder wie für solche, bei denen Leukämie, mesenteriale Nekrose, Schwanken, Mastitis, Verrenkungen, Pneumonie, Depressionen (Downer Cows) oder Polyarthritis diagnostiziert wurde, wurde α1-Säureglycoprotein im Serum quantitativ unter Verwendung des wie vorstehend unter D beschrieben hergestellten Reagens bestimmt. Die obere Grenze der normalen Werte betrug 450 ug/ml. Die Ergebnisse sind in Figur 1 gezeigt.
- Das Abnormalitäts-Verhältnis für normale Rinder betrug 0 %, während das für kranke Rinder betrug: 85.0 % für Rinder mit Leukämie, 83.3 % für solche mit Schwanken, 84.6 % für Mastitis, 75.0 % für Luxation, 72.2 % für Pneumonie, 79.3 % für Depressionen, und 76.9 % für Polyarthritis. Kranke Rinder wurden durch Anfangsdiagnose bei höherem Verhältnis als abnormal diagnostiziert.
- Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren stellt deshalb eine nützliche Information für die Gesundsheitsvorsorge der Rinder, für eine geeignete Beobachtung pathologischer Zustände und für die Beurteilung der Prognose dar.
- Der in B des obigen Beispiels 1 erhaltene spezifische Antikörper wurde auf einem unlöslichen Träger aufgeschichtet. Als Probe wurde Kuhmilch dazu gegeben, und ein Marker (gereinigtes, nach A des Beispiels 1 erhaltenes, mit alkalischer Phosphatase markiertes α1-Säureglycoprotein) wurde zugegeben, und die kompetitive Reaktion bei 37 ºC 2 Stunden lang durchgeführt. Nach Waschen wurde p-Nitrophenyl-phosphat zugegeben und die Reaktion nach 30 Minuten beendet, und die Absorption bei 450 nm gemessen. Aus der Standardkurve für auf ähnliche Weise erhaltenes al-Säureglycoprotein wurde die Menge an α1-Säureglycoprotein in Kuhmilch bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 α1-Säureglycoprotein in Kuhmilch Erkrankung Fälle α1-Säureglycoprotein (ug/ml) Mastitis Apostematosa Gangrenöse Mastitis Gesunde Kuhmilch
- Nach dem gleichen Verfahren wie im Beispiel A von Beispiel 1 wurde α1-Säureglycoprotein von Schwein gereinigt, und Ziegen durch das gleiche Verfahren wie in B beschrieben immunisiert. Es wurde ein spezifisches Antiserum erhalten.
- Nach dem gleichen Verfahren wie vorstehend unter D beschrieben wurde ein Reagens durch quantitative Bestimmung von α1- Säureglycoprotein hergestellt, und die Menge an α1- Säureglycoprotein wurde im Serum gesunder Landrace-Schweine und White York-Schweine, sowie von Schweinen, die als krank diagnostiziert wurden, wie in Tabelle 4 angegeben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 α1-Säureglycoprotein im Serum von Schweinen Erkrankung Fälle α1-Säureglucoprotein Abnormalität Schweineruhr Exudative Dermatitis Mutterschweine mit Fehlgeburten Multipler Abszess Pneumonie Meningitis Collibacillemie Gesunde Landrace-Schweine Gesunde White York-Schweine
- Der Wert von α1-Säureglycoprotein von mehr als 506 ug/ml wurde als abnormal bewertet.
- Wenn die Grenze des normalen Wertes mit 505 ug/ml festgesetzt wird, was den Maximalwert für α1-Säureglycoprotein für gesunde Landrace- und White York-Schweine darstellt, wurden die Schweine mit Schweineruhr, exudativer Dermatitis, Multiplem Abszess, Pneumonie und Meningitis als 100 % abnormal bewertet, auch wenn die Zahl der getesteten Fälle nicht so groß war, und die Schweine mit Colibacillemie wurden als 80 % abnormal bewertet.
- Das erfindungsgemäße Verfahren erwies sich deshalb zur frühen Bestimmung kranker Schweine, insbesondere von solchen mit entzündlichen und Infektionskrankheiten, als hilfreich.
- Durch primäres Screening des für dieses Beispiel beschriebenen Verfahrens können die kranken Schweine identifiziert werden, und eine Gesamtbeurteilung durch detaillierte sekundäre Untersuchungen, wie z.B. klinische Untersuchungen, bacteriologische und biologische Untersuchungen, histopathologische Untersuchungen, eine Bilddiagnose usw. ist erreichbar.
- Wenn Schweine als krank diagnostiziert werden, können den Symptomen entsprechende notwendige Schritte unternommen werden, wie z.B. eine Aussonderung, Sterilisierung, vorbeugende Injektion, Verabreichung von Drogen, Verbesserung der Blutkontrolle usw.
- Wie vorstehend beschrieben kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Anfangsdiagnose eine ausreichende Beobachtung und Vorhersage des Auftretens von Erkrankungen durch eine regelmäßige Überprüfung bereitstellen, und es ist zur Identifizierung von mit Krankheiten verbundenen Zuständen und für die Gesundheitsvorsorge von Zuchtschweinen nützlich.
- Nach dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 3 beschrieben wurde die Menge an α1-Säureglycoprotein im Serum von 20 neu hinzugekommenen Schweinen durch das Verfahren der einzigen Radialimmunodiffusion bestimmt. Durch primäres Screening wurde gefunden, daß 4 dieser Schweine abnormal hohe Werte besaßen.
- Die Ergebnisse der detaillierten Untersuchung ergaben, daß diese Schweine mit den abnormal hohen Werten an α1- Säureglycoprotein Multiplen Abszess, Meningitis, Pneumonie oder Infektionskrankheiten hatten. An jedem individuellen Schwein wurde eine angemessene Behandlung durchgeführt, und bei allen wurde wieder ihr Gesundheitszustand hergestellt.
- Wenn junge Schweine oder Schlachtschweine neu hinzukommen, leiden die Schweine in vielen Fällen bereits selbst an bestimmten Erkrankungen, und eine Anzahl von Schweinen tendiert dazu, rasch zu sterben, weil sie sich nicht an die neuen Umgebungsbedingungen anpassen können.
- Da die Preise dieser neu hinzukommenden Schweine zunehmend höher werden, ist der Tod dieser Schweine in Bezug auf die Kosten und den Gewinn der Viehzuchtindustrie ein grobes Problem. Durch eine erfindungsgemäße Anfangsdiagnose kann der Gesundheitszustand der Schweine überprüft und ihr plötzlicher Tod verhindert werden, bevor er tatsächlich auftritt.
- Auf die gleiche Weise wie in A von Beispiel 1 wurde α1- Säureglycoprotein von Pferden gereinigt und wurde zur Immunisierung von Kaninchen nach dem gleichen Verfahren wie in B beschrieben verwendet. Auf diese Weise wurde ein spezifisches Antiserum erhalten.
- Nach dem gleichen Verfahren wie in D wurde ein Reagens für die quantitative Bestimmung von α1-Säureglycoprotein hergestellt, und die Menge an α1-Säureglycoprotein im Serum von Pferden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5 α1-Säureglycoprotein im Serum von Pferden Erkrankungen Fälle α1-Säureglycoprotein Abnormalität Pneumonie Cardiopathie Trauma Gesunde Pferde
- Der Wert von α1-Säureglycoprotein von mehr als 451 ug/ml wurde als abnormal bewertet.
- Nach dem gleichen Verfahren wie in A von Beispiel 1 wurde α1- Säureglycoprotein von Haushühnern gereinigt und nach dem gleichen Verfahren wie in B beschrieben an Kaninchen zur Immunisierung verabreicht. Auf diese Weise wurde ein spezifisches Antiserum erhalten.
- Nach dem gleichen Verfahren wie nach D wurde ein Reagens zur quantitativen Bestimmung von α1-Säureglycoprotein von Haushühnern hergestellt und die Menge an α1-Säureglycoprotein im Serum von Haushühnern gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6 α1-Säureglycoprotein im Serum von Haushühnen Erkrankungen Fälle α1-Säureglycoprotein Abnormalität Bronchieninfektion Staphylococcemie Marek's Erkrankung Gesunde Haushühner
- Der Wert von α1-Säureglycoprotein von mehr als 461 ug/ml wurde als abnormal bewertet.
- Nach dem gleichen Verfahren wie in A von Beispiel 1 wurde α1- Säureglycoprotein von Hunden gereinigt und nach dem gleichen Verfahren wie in B beschrieben an Kaninchen zur Immunisierung verabreicht. Auf diese Weise wurde ein spezifisches Antiserum erhalten.
- Nach dem gleichen Verfahren wie nach D wurde ein Reagens zur quantitativen Bestimmung von α1-Säureglycoprotein von Hunden hergestellt und die Menge an α1-Säureglycoprotein im Serum von Hunden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 α1-Säureglycoprotein im Serum von Hunden Erkrankungen Fälle α1-Säureglycoprotein Abnormalität Nephritis Infektiöse Hepatitis Fraktur Pyometra Staupe Gesunde Hunde
- Der Wert von α1-Säureglycoprotein von mehr als 501 ug/ml wurde als abnormal bewertet.
- Nach dem gleichen Verfahren wie in A von Beispiel 1 wurde α1- Säureglycoprotein von Katzen gereinigt und nach dem gleichen Verfahren wie in B beschrieben an Kaninchen zur Immunisierung verabreicht. Auf diese Weise wurde ein spezifisches Antiserum erhalten.
- Nach dem gleichen Verfahren wie nach D wurde ein Reagens zur quantitativen Bestimmung von α1-Säureglycoprotein von Katzen hergestellt und die Menge an α1-Säureglycoprotein im Serum von Katzen gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8 α1-Säureglycoprotein im Serum von Katzen Erkrankungen Fälle α1-Säureglycoprotein Abnormalität Leukämie eitrige Erkrankung Trauma eitrige Pleuritis Panleukopenia Gesunde Katzen
- Der Wert von α1-Säureglycoprotein von mehr als 581 ug/ml wurde als abnormal bewertet.
- Nach dem gleichen Verfahren wie in A von Beispiel 1 wurde α1- Säureglycoprotein von Mäusen gereinigt und nach dem gleichen Verfahren wie in B beschrieben an Kaninchen zur Immunisierung verabreicht. Auf diese Weise wurde ein spezifisches Antiserum erhalten.
- Nach dem gleichen Verfahren wie nach D wurde ein Reagens zur quantitativen Bestimmung von α1-Säureglycoprotein von Mäusen hergestellt.
- Nachdem 0.1 ml von je 10&sup5; Tuberkelbazillen (BCG) intravenös an 5 Mäuse (BALB/c; 8-Wochen alt, männlich) verabreicht wurden, wurde das Blut zu verschiedenen Zeiten gesammelt und α1- Säureglycoprotein im Serum durch das Verfahren der einzigen Radialimmunodiffusion unter Verwendung des obigen Reagens bestimmt.
- Die Ergebnisse sind in der Figur 2 dargestellt. Nach Verabreichung von BCG begann sich α1-Säureglycoprotein im Blut vom ersten Tag an zu erhöhen, und der Maximalwert (1300 ug/ml) wurde am dritten Tag erreicht. Dann fiel der Wert ab und kehrte am neunten Tag zum normalen Wert (240 ± 80 ug/ml) zurück.
- Wie vorstehend beschrieben wurde die durch Infektion mit BCG verursachte Schwankung von α1-Säureglycoprotein beobachtet. Das weist darauf hin, daß dies ein nützlicher Index ist, um die biologischen Wirkungen von chemischen Substanzen und Extrakten, die für verschiedene Typen von Arzneimittelwirksamkeitstests verwendet werden, zu bestätigen.
- Wie vorstehend erläutert macht es das erfindungsgemäße Verfahren zur Anfangsdiagnose kranker Tiere möglich, durch Messung von α1-Säureglycoproteinen in Körperflüssigkeiten von brütenden Tieren, Haustieren und Versuchstieren Erkrankungen, insbesondere entzündliche Erkrankungen, anfänglich zu diagnostizieren und zu screenen. Es ist deshalb zur Frühbestimmung von entzündlichen Erkrankungen, infektiösen Erkrankungen, malignen Tumoren usw. brauchbar.
- Mit diesem Verfahren ist es nun möglich, das Auftreten von Erkrankungen durch eine regelmäßige Inspektion vorherzusagen.
- Es ist auch brauchbar zur Identifizierung von mit Erkrankungen einhergehenden Zuständen, zur Gesundheitsvorsorge von Zchtrindern, Zchtschweinen usw., und zur Gesundheitskontrolle von neu eingebrachten Tieren.
- Außerdem trägt es zu einer geeigneten Auswertung von Wirkungen nach therapeutischen Maßnahmen, z.B. einer Chemotherapie, einem chirurgischen Eingriff usw. bei, und ist hilfreich als Anzeige zur Beurteilung einer Prognose.
- Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Wirkungen ist das erfindungsgemäße diagnostische Reagens auch brauchbar für eine einfache und leichte Bestimmung einer großen Zahl von Proben. Es ist nur eine geringe Menge einer Körperflüssigkeit, wie z.B. von Serum, zur Messung erforderlich, und das Verfahren weist auch eine hohe Reproduzierbarkeit auf.
- Für die Herstellung des erfindungsgemäßen diagnostischen Reagens ist es möglich, einen hoch spezifischen Anti-Tier-α1- Säureglycoprotein-Antikörper zu erhalten und die Produkte mit einer hohen Zuverlässigkeit mit geringen Kosten und in großen Mengen herzustellen.
Claims (6)
1. Verfahren zur Anfangsdiagnose zur
Diagnostizierung, ob ein brütendes Tier, ein Haustier oder
Versuchstier krank ist oder nicht, umfassend die Stufen:
(a) Fraktionieren des Serums eines Tiers der gleichen Art wie
das zu diagnostizierende Tier unter Verwendung von
Ammoniumsulfat als Fällungsmittel,
(b) Reinigen und Extrahieren der erhaltenden Serumfraktionen
durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie und Gelfiltration
in hoch gereinigtes α1-Säureglycoprotein
(c) Beimpfen eines Tiers einer von dem zu diagnostizierenden
Tier verschiedenen Art mit dem α1-Säureglycoprotein, wodurch
das Tier immunisiert wird, und Gewinnen von spezifischem
Antiserum für Tiere der Art des zu diagnostizierenden Tiers,
(d) Entnahme von aus jedem einer Vielzahl gesunder Tiere der
Art des zu diagnostizierenden Tiers erhaltenen
Körperflüssigkeit,
(e) Verwendung des spezifischen Antiserums zur quantitativen
Bestimmung von α1-Säureglycoprotein in jeder der
Körperflüssigkeiten durch immunologische Antigen-Antikörper-
Reaktion und Definieren eines Maximalwerts als obere Grenze
des Normalwerts,
(f) Entnahme einer aus dem zu diagnostizierenden Tier
gewonnenen Körperflüssigkeit der gleichen Art, wie sie von den
gesunden Tieren gewonnen wurde, und
(g) quantitatieve Bestimmung von α1-Säureglycoprotein in der
Körperflüssigkeit auf die gleiche Weise wie vorstehend
beschrieben, wobei das Tier als krank diagnostiziert wird,
wenn der bestimmte Wert oberhalb der oberen Grenze liegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die brütenden Tiere Rinder, Schweine,
Pferde, Ziegen, Schafe oder Haushühner sind, die Haustiere
Hunde oder Katzen sind, und die Versuchstiere Kaninchen,
Meerschweinchen, Ratten oder Mäuse sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeit Blut, Plasma, Serum,
Urin, Milch, cerebrospinale Flüssigkeit, Gelenkflüssigkeit,
Ascites, Brustflüssigkeit, Tränen, Galle, Samenflüssigkeit,
Nasenflüssigkeit oder Speichelflüssigkeit ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung durch
immunologische Antigen-Antikörper-Reaktion erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die immunologische Antigen-Antikörper-
Reaktion eine einzige Radialimmunodiffusion, eine doppelte
Immunodiffusion, Immunoelektrophorese, Antigen-Antikörper-
Kreuzelektrophorese, Gegenimmnunoelektrophorese, Rocket-
Elektrophorese, sensibilisierte Hemagglutinationsreaktion,
passive Hemagglutination-Inhibierungsreaktion, sensibilisierte
Latexagglutinatiosreaktion, ein turbidimetrischer Immunoassay,
Radioimmunoassay oder Enzyinimmunoassay ist.
6. Reagens zur Verwendung in einem Verfahren nach
einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß an einer Diffusionsplatte, die spezifische Antikörper
verschiedener Tierarten gegenüber α1-Säureglycoprotein von
brütenden Tieren, Haustieren oder Versuchstieren enthält,
Vertiefungen zur Applikation von Proben vorgesehen sind.
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