AT500529B1

AT500529B1 - Verfahren zum ausschluss des rinderwahnsinns (bse)

Info

Publication number: AT500529B1
Application number: AT92004A
Authority: AT
Original assignee: Hausen Arnulf Dr; Ledjeff Elena Sophia
Priority date: 2003-07-14
Filing date: 2004-01-05
Publication date: 2008-08-15
Also published as: AT500529A1

Description

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Obwohl sie schon lange existiert, erregte die neurodegenerative Krankheit BSE, der Rinderwahnsinn, erst ab 1985 starkes Aufsehen, als BSE in England massiv auftrat. Konsens besteht darin, dass BSE keine Infektionskrankheit im üblichen Sinne ist, da es nicht gelingt bei den kranken Kühen Mikroorganismen zu finden, die in einen Wirt eindringen können und sich dort vermehren. Auch die WHO klassifiziert deshalb BSE nicht als Infektionskrankheit.

Die derzeit am meisten verbreitete Hypothese der Krankheitsentstehung von BSE besteht darin, dass BSE auf Rinder durch Tiermehl, das sog. Prionprotein enthält, übertragen wird. Die Beweise für diese Annahme sind jedoch sehr dürftig. BSE ist also eine Krankheit unbekannter Ursache.

Epidemiologische Daten liefern schwerwiegende Argumente dafür, dass BSE durch eine Manganvergiftung verursacht wird. Insbesondere stimmen sie nicht mit der BSE-Verbreitung überein. Fast alle BSE-Fälle wurden in der Nähe der Industrie- und Hüttenregionen Manchester, Birmingham und im Ruhrgebiet beobachtet. Damit passt jene Erklärung viel besser, die diese Erkrankung des Gehirn- und Nervensystems als Manganvergiftung deutet (M. Purday, Med. Hypotheses, 2001, 57(1), 29-45). Gleichzeitig mit der Tiermehlverfütterung wurden massiv manganhaltige Pflanzenschutzmittel (Manep, Mancep) verwendet. Die betroffenen Kühe in England erhielten stets auch Getreideschrot, das einen sehr hohen Mangangehalt aufweist!

Insgesamt existieren mehrere vermutete Ursachen für BSE- und ähnliche Tierseuchen, jedoch keine, bei der Fütterung oder Ernährung nicht die entscheidende Rolle spielt. Ernährung andererseits bestimmt die Darmbesiedelung durch Mikroben. Darmmikroben erzeugen enzymatisch viele Stoffwechselprodukte (Metabolite), die sie auch zum Teil ausscheiden. Diese wirken sowohl auf die anderen Darmmikroben, als auch auf den Wirtsorganismus positiv oder negativ. Eine Infektion dagegen ist nach verbreiteter Ansicht nicht für BSE verantwortlich.

Wir finden in wässriger Lösung von Kot bei HPLC Metabolite mit für Neopterin charakteristischen Anregungs- und Emissionswellenlängen der Fluoreszenz (nur ganz wenige Substanzen fluoreszieren!). Das Verhalten der im Kot der untersuchten Kontrolliere und der BSE-Tiere gefundenen Stoffwechselprodukte und Neopterin bei HPLC und Dünnschichtromatographie ist sehr stark unterschiedlich. Ein beispielhaftes Chromatogramm von 0,01 ml wässriger Lösung von Kot einer „BSE-infizierten“ Kuh (Fig. 1) zeigt einwandfrei, dass darin keinerlei Neopterin zu finden ist, dagegen große Mengen von Metaboliten mit charakteristischer Fluoreszenz für Neopterin, jedoch höherer Polarität, erkennbar an der Position im Chromatogramm! Im verfütterten Heu oder Getreideschrot können wir diese Metabolite nicht finden.

Die Stoffwechselprodukte in wässriger Lösung von Kot unterscheiden sich von Neopterin, neben dem bildenden Organismus, eindeutig durch ihre chromatographische Laufstrecke, also durch ihre Polarität. Gleich ist dagegen die Fluoreszenz und die Reaktion mit dem Neopterinantikörper. Wir fanden die mit dem Neopterin-RIA messbaren Metabolite auch in Kulturüber-ständen von Bakterien- (auch von E. coli), in Schimmelkulturüberständen und in Siloextrakten, also können sie von Mikroorganismen des Darmes sezerniert werden, die alle kein Neopterin bilden können. Wir fanden auch in Kulturüberständen von E. coli (Bebrüten über 3 Tage bei 37 °C), von 3 unterschiedlichen E. Coli-Arten Neopterinwerte von 29 - 35 nmol/l und in 5 unterschiedlichen Siloextrakten Neopterinwerte von 21-31 nmolll. Diese Metabolite in Rinderkot werden also von Mikroorganismen des Verdauungstraktes erzeugt.

Stuhl, Kot und wässriger Lösung von Kot wurde bisher bei BSE-Rindern nicht mit Messverfahren für Neopterin untersucht. Die erhaltenen Messwerte liegen dabei signifikant höher als bei gleich (konventionell) ernährten Konfrontieren. Die Messung der von speziellen Mikroorganismen im Stuhl von Wiederkäuern gebildeten Metaboliten mit identischen oder abgeänderten Neopterinmessverfahren zeigt so eine qualitativ oder quantitativ unterschiedliche Population der Darmflora an, nicht eine Infektion. Unsere Messungen können so eine mögliche Wirkung von Mangan auf die qualitative oder quantitative Zusammensetzung dieser Mikroorganismen anzei- 4 AT 500 529 B1 gen. Auch Pflanzenschutzmittel, saurer Regen, starke UV-Strahlung, Ozonloch, ändern diese Mikroorganismen! Ebenso wirkt sich auch hoher Mangangehalt des Getreideschrot aus (M. Purdey: Med Hypotheses 2001; 57(1), 29-45). Da diese Metabolite von Darmmikroorganismen produziert werden, wird schon eine Prädisposition (subklinische Erkrankung) Jahre vor dem klinischen BSE-Ausbruch beobachtet.

Obwohl die Fluoreszenz und das Verhalten gegenüber dem Antikörper gleich sind, kann es sich bei den im Kot der Tiere nachweisbaren Metaloliten nicht um Neopterin handeln. Neopterin kann in Körperflüssigkeiten von Rindern (Serum, Milch, Harn, Liquor) nicht gefunden werden (unveröffentlichte eigene Messungen). Nur beim Menschen und bei Primaten kommt Neopterin vor (D.Fuchs et al., DMW 120, 567-570; 1995. und B. Wirleitner et al„ J. Leukoc. Biol. 72: 1148-53; 2002). Neopterin kann auch nicht in Heu oder Getreideschrot gefunden werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Verfahrens zum Ausschluss der bovinen spongiformen Enzephalopathie (BSE) bei Rindern durch Messen in wässriger Lösung von Kot mit bekannten Verfahren für Neopterin. Dabei können sowohl identische immunologische (RIA oder ELISA) Methoden der Neopterinmessung, als auch teilweise abgeänderte spektroskopische und chromatographische Methoden zur Anwendung kommen.

Gleich wie bei bisherigen Verfahren ist also die Messmethode, unterschiedlich ist die Anwendung: BSE ist auch gemäß der noch bestehenden Deutung als Krankheit mit veränderten Prionen, auch nach der WHO keine Infektion, sondern eine wahrscheinlich durch Ernährung verursachte Krankheit derzeit noch unbekannter Ursache. Neu ist auch, dass man mit unserem Verfahren wässrige Lösung von Kot untersuchen kann (am lebenden Rind) und nicht nur Hirngewebe getöteter Tiere! Unterschiedlich zu den bisherigen Neopterinmessungen ist auch, dass nicht vom eigenen Immunsystem erzeugtes Neopterin gemessen wird, sondern Stoffwechselprodukte, die ausschließlich von Mikroorganismen des Verdauungstraktes gebildet und im Darm ausgeschieden, und mit bekannten Messverfahren für Neopterin bestimmt werden.

Gemessen wird also nicht in diagnostisch für Infektionen besonders geeigneten Körperflüssigkeiten, wie Blut, Serum, Plasma, Liquor oder Harn, sondern in Kot bzw. daraus gewonnener wässriger Lösung, die praktisch frei von körpereigenen Substanzen ist.

Figur 2 zeigt die Ergebnisse einer Versuchsreihe zum Ausschluss von BSE bei Rindern mit Hilfe des Verfahrens. Getestet wurden je vier Kühe, die im März 2003 jeweils 100 g Hirn von BSE-Rindern schlucken mussten, und vier komplett gleich, d.h. konventionell ernährte Kühe zu zwei verschiedenen Terminen (September 2003 und November 2003).

Alle Tiere wurden also „konventionell“, mit viel Getreideschrot (manganhältig), und ganz gleich, daher mit wenig Gras und Heu, jedoch mit Silage und Getreideschrot gefüttert. Der Kot der „infizierten“ Tiere wurde zur der Gewinnung der Lösung von Kot in einem hitzestabilen Behälter bei über 136 °C 4 Stunden in einem Dampfbad gekocht um gegebenen Falls Prionen unschädlich zu machen. Jeweils 0,7 g der Kotprobe dieser Tiere und ebenso der Kontrolltiere wurde mit je 0,7 ml Wasser verdünnt, eine Stunde bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann zentrifugiert und von der wässrigen Lösung 0,05 ml zur weiteren Untersuchung eingesetzt. Anschließend wurde ein Verfahren zum Nachweis von Neopterin mit einem kommerziellen Radioimmu-noassay oder ELISA durchgeführt.

Wie in Figur 2 erkennbar ist, werden bei den „infizierten“ Tieren weit höhere Werte erhalten, als bei den konventionell gefütterten Kontrolltieren. So beträgt der Mittelwert bei fünf Konfrontieren etwa 16,20 nmol/l mit einer Standardabweichung von 4,06 nmol/l. Der Mittelwert bei den 4 „infizierten“ Tieren lag im September 2003 bei 59,43 nmol/l (Standardabweichung 7,50 nmol/l) und im November 2003 bei 61,88 nmol/l (Standardabweichung 19,39 nmol/l). Das Vorliegen von BSE kann also bei Werten unter 40 nmol/l ausgeschlossen werden. 5 AT 500 529 B1

Zum Erklären sei angeführt, dass prinzipiell drei Bereiche beobachtet wurden: 1. ) Bereiche unter 25 nmolll: Biokühe, getreideschrotfrei gefüttert (hier nicht gezeigt) 2. ) Bereiche zwischen 25 und 40 nmolll: mit Getreideschrot konventionell gefütterte Tiere 3. ) Bereiche über 40 nmolll: BSE-Tiere

Der bisher durchgeführten Prionennachweis kann nur an Hirngewebe, also an geschlachteten Tieren, und selbst bei „Infektion“ in Utero frühestens erst nach 30 Monaten, aber oft erst nach 5-6 Jahren, positive Ergebnisse liefern. Mit dem beschriebenen Verfahren der Kotuntersuchung kann an lebenden Tieren und bereits nach 5 Monaten ein vollkommen unschädlicher Test zum Ausschluss von BSE durchgeführt werden. Ferner sind die bisherigen Prionentestverfahren nur zu 95 % zuverlässig. Ein völlig anderes Verfahren würde die Sicherheit weiter erhöhen.

Ein weiterer Vorteil ist zum Beispiel: wird, auch mit dem derzeit verwendeten Priontest, bei einer geschlachteten Kuh eines Hofes mit 80 Kühen eine einzige BSE-Erkrankung festgestellt, so wurden bisher alle anderen 79 Kühe geschlachtet und verbrannt. Mit dem Verfahren des BSE-Ausschlusses am lebenden Rind können diese 79 Tiere auch getestet werden und gegebenenfalls am Leben bleiben. Für das Funktionieren des beschriebenen Verfahrens ist es dabei ohne Belang, dass mit dem angeführten geeigneten Nachweisverfahren nicht die Konzentration des Neopterin gemessen wird, sondern (bei Messungen unter Verwenden von Antikörpern) die Konzentration anderer, nicht identifizierter Metaboliten, welche beispielsweise eine Kreuzreaktivität mit dem Anti-Neopterinantikörper aufweisen und daher durch für Neopterin geeignete Nachweisverfahren unter Verwenden von Antikörpern ebenfalls messbar sind. Chromatographische Verfahren müssen geändert werden. Es werden also Produkte von Mikroorganismen im Darm der Rinder, vorzugsweise in Kot, oder daraus gewonnene wässrige Lösungen von Kot, bekannten Verfahren der Messung von Neopterin, wie RIA, ELISA, HPLC oder anderen geeigneten Nachweisverfahren unterzogen.

Dafür werden beispielsweise vorzugsweise 0,5 ml wässrige Lösung von Kot durch Zentrifugieren bei 3 000 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten des 1:1 mit Wasser verdünnten Kots der Rinder nach 1 Stunde Stehen bei Raumtemperatur gewonnen. Die Lösung von Kot kann durch Dialyse, vorzugsweise durch eine Zellulosemembran, vorzugsweise in 3 ml Wasser, von Verunreinigungen abgetrennt werden. Die so gewonnene Lösung wird eingedampft und mit vorzugsweise 0,1 ml einer Mischung aus 0,1 mol/l NaOH und 0,1 mol/l Jod in Kaliumjodid gelöst. Die so gewonnene Lösung wird vorzugsweise eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach kann sie durch Zentrifugieren von unlöslichem Material getrennt werden. Zu vorzugsweise 0,1 ml des klaren Überstandes werden vorzugsweise 0,05 ml 0,1 mol/l Ascorbinsäure und vorzugsweise 1 ml Phosphatpuffer gegeben und mit dem klaren Überstand durchmischt. Von der so gewonnenen Flüssigkeit werden vorzugsweise 0,01 ml in die HPLC-Apparatur injiziert. Danach wird beispielsweise mit einem Fluoreszenzdetektor ein Chromatogramm bei einer Anregungswellenlänge von vorzugsweise 353 nm und einer Detektionswellenlänge etwa 438 nm erstellt.

Alternativ oder zusätzlich kann als Nachweisverfahren ein Radioimmuno- (RIA) oder ein durch radioaktive Enzyme markierter Assay (ELISA) eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein Neopterin RIA oder ELISA eingesetzt werden. Bei einem derartigen RIA oder ELISA werden die wässrigen Lösungen von Kot, sowie Neopterinstandarde in steigender Konzentration jeweils mit einem radioaktiv oder durch Enzyme markierten Antikörper durchmischt.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Bestimmung wird der Kot der Tiere zur Gewinnung einer wässrigen Lösung von Kot mit der gleichen Menge Wasser versetzt, gut durchmischt und vorzugsweise für 10 Minuten zentrifugiert. Falls das Nachweisverfahren nicht unmittelbar nach dem Zentrifugieren fortgesetzt wird, wird die wässrige Lösung von Kot bis zum Fortsetzen des

Claims

6 AT 500 529 B1 Nachweisverfahrens tiefgekühlt. Beispielsweise können etwa 0,05 ml wässriger Lösung von Kot in ein 5 ml Spitzröhrchen gegeben werden. Daneben werden sechs Standards, vorzugsweise Neopterin-Standards in steigender Konzentration in sechs solcher Röhrchen gegeben. In alle Röhrchen werden etwa 0,1 ml markierte Anti-Neopterin-Antikörper, beispielsweise eine Lösung von Jod-125-Neopterin und 0,1 ml Anti-Neopterin-Antikörper, pipettiert, gut durchmischt und eine Stunde im Dunklen stehen gelassen. Danach wird in alle Röhrchen je 1 ml Waschlösung gegeben, welche gut mit dem Inhalt der Röhrchen durchmischt wird. Danach erfolgt Zentrifugieren des Inhalts der Röhrchen für 10 Minuten und das Abgießen des dadurch gebildeten Überstandes. Die Radioaktivität jeder einzelnen Mischung kann beispielsweise für eine Minute, vorzugsweise durch einen Gammacounter, gemessen werden. Die Auswertung erfolgt in bekannter Weise direkt mit einer Standardkurve oder einem dafür geeigneten Computerprogramm. In Abhängigkeit der gemessenen Impulsrate wird dadurch die Konzentration von mikrobiellen Metaboliten, bestimmt. Eine kommerzielle Version zur Durchführung des Radioimmunoassays bzw. des ELISAs für Neopterin ist beispielsweise bei der Firma Brahms Diagnostik GmbH in D-16761 Henningdorf bei Berlin erhältlich. Patentansprüche: 1. Verfahren zum Ausschluss der bovinen spongiformen Enzephalopathie (BSE), dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise Kot von Rindern, oder vorzugsweise wässrige Lösung von Kot, Messverfahren für Neopterin unterzogen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Nachweisverfahren die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC - High Performance Liquid Chroma-tography) eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass, vorzugsweise wässrige Lösung vom Kot durch 0,5 g Kot der Rinder und 0,5 g Wasser, Durchmischen und Zentrifugieren gewonnen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die so gewonnene wässrige Lösung von Kot, vorzugsweise 1 Stunde, bei Raumtemperatur stehen gelassen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung von Kot durch Dialyse, vorzugsweise durch eine Zellulosemembran, vorzugsweise in 3 ml Wasser, von Verunreinigungen abgetrennt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die so gewonnene Flüssigkeit eingedampft und mit, vorzugsweise 0,1 ml, einer Mischung aus 0,1 mol/l NaOH und 0,1 mol/l Jod in KJ (Kaliumjodid) gelöst wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung durch Zentrifugieren von unlöslichem Material getrennt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zu, vorzugsweise 0,1 ml des klaren Überstandes, vorzugsweise 0,05 ml, 0,1 mol/l Ascorbinsäure und, vorzugsweise 1 ml Phosphatpuffer gegeben und durchmischt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass von der so gewonnenen Flüssigkeit, vorzugsweise 0,01 ml, in die HPLC-Apparatur injiziert werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mit einem Fluoreszenzdetektor 7 AT 500 529 B1 ein Chromatogramm bei einer Detektionswellenlänge von etwa 438 nm und einer Anregungswellenlänge von etwa 353 nm erstellt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Nachweisverfahren ein Radioimmunoassay (RIA) oder ein durch radioaktive Enzyme markierter Assay (ELISA) eingesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung von Kot bis zum Fortsetzen des Nachweisverfahrens tiefgekühlt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise wässrige Lösung von Kot, sowie Neopterinstandarde in steigender Konzentration jeweils mit einem markierten Anti-Neopterin-Antikörper und Anti-Neopterin-Antikörpern durchmischt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass 0,05 ml wässrige Lösung von Kot verwendet werden.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass 6 Neopterinstandards verwendet werden.
16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass 0,1 ml markierte Anti-Neopterin-Antikörper verwendet werden.
17. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Markersubstanz eine Lösung von Jod-125-Neopterin ist.
18. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass 0,1 ml Anti-Neopterin-Antikörpern verwendet werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die so hergestellten Mischungen für eine Stunde im Dunkeln stehen gelassen werden.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischungen mit, vorzugsweise je 1 ml, Waschlösung durchmischt werden.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die so hergestellten Mischungen, vorzugsweise für 10 Minuten, zentrifugiert werden und der Überstand abgegossen wird.
22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Radioaktivität jeder einzelnen Mischung, vorzugsweise für 1 Minute, vorzugsweise durch einen Gammacounter, gemessen wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass als Nachweisverfahren die Massenspektroskopie eingesetzt wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass als Nachweisverfahren die Lichtabsorption im ultravioletten, sichtbaren, infrarotem oder Röntgenbereich eingesetzt wird. Hiezu 2 Blatt Zeichnungen