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Die Erfindung bezieht sich auf die
Erkennung der Spongiformen Enzephalopathie und anderen demyelinisierenden
Bedingungen in Säugern
und ist insbesondere, aber nicht ausschließlich, befasst mit der Diagnose
der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie (BSE).
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BSE ist eine neuere neurologische
Störung
von Rindern, von der nach 1982 zuerst in Großbritannien als Folge einer Änderung
in der Zubereitung von „Knochen-
und Fleisch-" Futtermitteln
berichtet wurde. Aus Furcht, dass es als Folge des Fleischverzehrs
auf Menschen übertragen
werden könne,
hat BSE einige öffentliche
Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Es wurde vermutet, dass BSE durch „Prionen", einem Typus eines infektiösen Proteins,
verursacht werden könne.
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Die vorliegende Erfindung beruht
auf einem alternativen Modell der Genese verschiedener Formen der
Spongiformen Enzephalopathie und anderen demyelinisierenden Bedingungen
in Säugern.
Gemäß dem vorgeschlagenen
Modell werden BSE und damit in Beziehung stehende Krankheiten als
Autoimmunkrankheiten empfangen, die als ein Ergebnis einer molekularen
Mimikry zwischen bestimmten infektiösen Agenzien und dem Myelin
des infizierten Säugers
auftreten. Dieses neue Modell von BSE basiert insbesondere auf den folgenden
experimentellen Beobachtungen.
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Eine charakteristische histopathologische
Ausprägung
von BSE ist eine „schwammförmige" (spongiforme) Erscheinung,
die ebenfalls in der chronischen, aber nicht der akuten „experimentellen
allergischen Enzephalomyelitis" (EAE)
auftritt, zumindest bei Hasen und Meerschweinchen. Von einer kurzen
Sequenz des Rindermyelins (FSWGAEGQK), welches der Denaturierung
wiedersteht, die auf Erhitzen bis 100°C für eine Stunde ertolgt, war
vor über
25 Jahren berichtet worden, dass es als Folge der Impfung von Meerschweinchen Hinterteillähmung, Tremore
und Tod hervorruft, die zu einem gewissen Ausmaß der Ausprägung ähneln, die in Rindern beobachtet
wurden, die unter BSE leiden. In Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung ist diese Sequenz in einem Computertest zum Einsatz gekommen,
um nach Proteinen zu suchen, die molekulare Mimikry zeigen. Diese
Sequenz kann in denaturierter Form als enzephalitogen bezeichnet
werden.
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Analyse von Proteinen in Datenbanken
(Genbank und SwissProt) hat aufgedeckt, dass drei Mikroben molekulare
Mimikry der Myelinsequenz von Rindern gezeigt haben, wobei es am
Besten in 4-Carboxy-Muconolakton-Decarboxylase des Acinetobacter
calcoaceticus, einer gewöhnlichen
Mikrobe, die im Boden und Wasservorräten vorkommt, gefunden wurde.
Diese Sequenzübereinstimmungen
werden in der nachfolgenden Tabelle gezeigt.
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Vergleich von Aminosäuren des
Rindermyelins mit Mikroorganismen aus Genbank und SwissProt, die ähnliche
Sequenzen in andere Proteinen haben.
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Alphabetische Buchstaben beziehen
sich auf die biochemischen Symbole für Aminosäuren.
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In Übereinstimmung mit dem neuen
Modell wurde nun herausgefunden, dass Seren von Rindern, die mit
BSE befallen sind, bemerkenswert hohe Spiegel von Antikörpern auf
Acinetobacter Spezies enthalten.
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Die vorliegende Erfindung bietet
daher einen diagnostischen Test auf Spongiforme Enzephalopathie und
andere demyelinisierende Bedingungen in Säugern, besonders auf Bovine
Spongiforme Enzephalopathie (BSE), Multiple Sklerose (MS) oder Creutzfeld-Jakob-Krankheit
(CJD), was die Untersuchung von Antikörpern umfasst, die in dem Säuger vorliegen
und welche Antikörper
auf eine Spezies des Acinetobacters sind, der molekulare Mimikry
auf ein Myelinpeptid von Säugern
zeigt und die Peptidsequenz ISRFAWGEV enthält.
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Der Begriff „molekulare Mimikry" bezieht sich auf
einen Grad der Übereinstimmung
(Sequenzhomologie) wie zwischen dem Antigenpeptid und einem Myelinpeptid,
welches aus der Bildung von Antikörpern resultiert, die eine
Kreuzreaktion mit Myelin eingegangen sind und Nervengewebe demyelinisieren
. Die Gegenwart solcher Antikörper
bei angehobenem Spiegel verglichen zu denen, die in nichtbefallenen
Tieren gefunden wurden, ist daher ein Zeichen für BSE, welches verwendet kann,
um BSE in einem frühen
Stadium festzustellen, in dem heilende oder andere entsprechende
Handlungen vorgenommen werden können.
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Die Untersuchung kann mittels der
Verwendung einer diagnostischen Testausrüstung durchgeführt werden,
die das ganze Acinetobacter als Testantigen enthält. Ein beliebiger Strang von
Acinetobacter, der das oben identifizierte Antigenpeptid aufweist,
kann verwendet werden. Alternativ kann ein Peptid verwendet werden,
welches als Testantigen aus dem Bakterium derivatisiert worden ist,
wie z. B. das isolierte Peptid ISRFAWGEV oder eine synthetische
Form dieses Peptids. Jeder geeignete Typus von Untersuchungsvorgang kann
verwendet werden, die ELISA-Methode ist jedoch besonders bequem.
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BSE indizierende Antikörperspiegel
sind die, welche bedeutend höher
sind als die Kontrollspiegel. Für gewöhnlich können Spiegel,
die über
zwei Standardabweichungen über
die Kontrollspiegel angehoben sind, als positive Anzeige gewertet
werden, mögliche
oder wünschenswerte
Werte können
aus Vorsichtsgründen aber
im Bereich dieser Größe liegen.
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Vorgehensweisen zur Durchführung einer
Untersuchung in Übereinstimmung
mit dieser Erfindung sind im nachfolgenden erläuternden Beispiel beschrieben,
basierend auf dem Vergleich von Seren von Tieren, von denen bekannt
ist, dass sie BSE hatten, mit Seren von gesunden Tieren.
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Material und Methoden
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Rinderseren
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Seren von 29 Tieren, über die
post mortem befunden wurde, dass sie den Kriterien von BSE genügen, und
von 18 Tieren, bei denen dies nicht der Fall war, wurden durch das
Zentrale Veterinärlabor
(ZVL) (New Haw, Addlestone, Suney) zur Verfügung gestellt, einer Exekutivagentur
des Ministeriums für
Landwirtschaft, Fischerei und Nahrungsmittel (MAFF) von Großbritannien.
Die 18 Tiere, die kein BSE hatten, wurden auf Grund von Verhaltensauffälligkeiten
dem ZVL angezeigt, aber post mortale Untersuchungen, die durch MAFF ausgeführt wurden,
hatten BSE ausgeschlossen.
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Des Weiteren wurden 30 Seren von
Tieren, die weniger als 30 Monate alt waren (A < 30M) (8 Friesen, 21 Hereford-Friesen
und eine Charolais-Friesische Kreuzung), und 28 Seren von Tieren,
die älter
als 30 Monate waren (A > 30M)
(alle Milchwirtschaftsfriesen), wurden als weitere Kontrollen verwendet.
Diese wurden von einer Farm bezogen, die unter den Bedingungen des „organischen
Wirtschaftens" geführt wurde
und wo kein Fall von BSE bekannt wurde. Serumproben wurden während routinemäßiger Herdentests
gezogen.
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Vorbereitung der Bakterien
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Acinetobacter calcoaceticus wurde
von der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd. NCIMB
10694 (Aberdeen) bezogen. Kulturen wurden in 2-Liter-Kolben auf einem
Orbitalschüttler über zwei Tage
bei 30°C
in 200 ml Nährlösung (Oxoid;
25 g/l) gezüchtet.
Die Kolben wurden mit 10 ml der entsprechenden Starterkultur geimpft
und bei 37°C
für sechs
Stunden schütteln
gelassen. Chargenkulturzellen wurden durch Zentrifugieren bei 6000
Umdrehungen pro Minute für
20 Minuten bei 4°C
gewonnen (MSE 18,6 × 250 ml
Rotor). Die Pellets aus Zellen wurden dann drei mal mit 0,15 M phosphatgepufferter
Salzlösung
(PBS; pH 7,4) gewaschen, ehe sie schließlich in 20 ml PBS rückgelöst wurden.
Aus der Suspension wurde eine Stammlösung hergestellt, indem mit
0,05 molaren Karbonatpuffer (pH 9,6) verdünnt wurde, bis eine optische
Dichte (OD) von 0,25 auf dem Spektrophotometer (Corning Model 258)
abgelesen wurde.
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Enzymverbundener Immunsorptions-Versuch
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ELISA-Versuche wurden auf konventionelle
Weise durchgeführt.
Kurz, ELISA-Platten
wurden über Nacht
bei 4°C
mit Bakterien überzogen
und die nichtspezifischen Stellen mit PBS blockiert, was 0,1% Tween, 0,2%
Ovalbumin (Sigma, Grade III) enthielt, die Platten wurden gewaschen
und eine 1/200 Verdünnung
von Test- oder Kontrollserum
hinzugefügt.
Die Platten wurden bei 37 °C
für eine
Stunde inkubiert, gewaschen und Hase/Anti-Kuh-Immunoglobulin (IgG
+ IgA + IgM) (1 : 4000) (Dako Ltd.) hinzugefügt. Die Platten wurden für zwei Stunden
reinkubiert, gewaschen und Substrat hinzugefügt. Die Reaktion wurde mit
einer Lösung
von 2 mg/ml Natriumfluorid (Sigma) beendet. Die Platten wurden bei
630 nm auf einem Mikrotiter Plattenleser (Dynatech MR 600) gelesen
und die Ergebnisse als OD +/– S.
E. ausgedrückt.
Alle Studien wurden kodiert durchgeführt, so dass der Testen nicht
wusste, welches Test- oder Kontrollseren waren. Die mittleren OD-Einheiten der
gesamten Immunoglobulinantikörper
in unterschiedlichen Gruppen wurden unter Verwendung des T-Tests mit
Student'scher Verteilung
verglichen.
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ELISA-Arbeitsanweisung
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- 1. Verdünne
Antigen in Schutzpuffer, gebe 200 μl in jede Mulde. Inkubiere über Nacht,
eingepackt in Folie bei 4°C.
- `2. Wasche das Antigen aus unter Verwendung von Wasch-/Inkubationspuffer;
die Mulden des Tabletts sollten während der Waschstufen vollständig gefüllt sein,
da das Tween-20 verhindert, dass jegliches weiteres Protein auf
dem Plastik absorbiert wird. Wasche drei mal, belasse jeweils für etwa Vierminutenintervalle
bei Raumtemperatur.
- 3. Inkubiere die Platte bei 37°C über eine Stunde mit 0,2 % Ovalbumin
im Wasch/Inkubationspufter.
- 4. Füge
200 μl Testserum
hinzu. Verdünnungen
werden in Wasch/Inkubationspuffer gemacht. Inkubiere für zwei Stunden
bei 37°C,
eingepackt in Folie.
- 5. Wiederhole Waschvorgang wie in 2.
- 6. Füge
200 μl Meerrettichperoxid
HRP-konjugierte zweite Antikörperlösung hinzu,
ebenfalls verdünnt
in Wasch-/Inkubationspuffer.
- 7. Wiederhole Waschvorgang wie in 2.
- B. Gebe 200 μl
Substrat (ABTS) in die Mulden hinzu; belasse für ungefähr 20 Minuten in der Dunkelheit
bei Raumtemperatur, um Färbung
zu entwickeln. Beende Reaktion mit 100 μl Stoplösung und lies Platte bei 630
nm.
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Ergebnisse
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Antikörper auf A. calcoaceticus des
Gesamtimmunoglobulins (IgG + IgA + IgM) wurden signifikant erhöht in den
BSE Seren (Mittel +/– SE:
0,99 +/– 0,05),
wenn verglichen mit CVL Kontrollwerten (0,65 +/– 0,06) (t = 4,48, p < 0,001), Kontrollen
aus organischer Bewirtschaftung, älter als 30 Monate, (0,57 +/– 0,03)
(t = 7,19, p < 0,001)
und Kontrollen aus organischer Bewirtschaftung, jünger als
30 Monate (0,53 +/– 0,02)
(t = 8,64, p < 0,001).
Diese Ergebnisse werden in der beigefügten Abbildung gezeigt.
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Legende zur Abbildung:
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Antikörpertiter (Balken = Mittelwert)
für 30
Kontrollen, weniger als 30 Monate alt (A < 30 m), 28 Kontrollen, älter als
30 Monate (A > 30
m), 18 Kontrollen aus dem Zentralen Veterinärlabor (ZVL), verglichen mit 29
BSE Seren, wenn getestet gegen Acinetobacter calcoaceticus (1 a) und E.coli (1 b) (gestrichelte Linie
repräsentiert
95% Vertrauensgrenze für
den Mittelwert der Kontrollen: A < 30
m + A > 30 m – ein auseinandergezogener
Test) (OD = optische Dichte).
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Es gab keine bedeutende Abweichung
zwischen den CVL Kontrollen und den Kontrollen aus organischer Bewirtschaftung,
die älter
als 30 Monate waren, aber es gab eine kleine, statistisch bedeutende
Abweichung bei den Seren von Tieren, die weniger als 30 Monate alt
waren (t = 2,41, p < 0,05).
Eine Rücküberprüfung des
CSL Kontrollserums mit dem höchsten
Anti-Acinetobacterspiegel von 1,16 OD zeigte, dass es von einem
klinisch normalen Kontrolltier herrührte, welches als negativ auf
BSE bezüglich
der festgeschriebenen Diagnosekriterien diagnostiziert wurde und
das ebenfalls bezüglich
der Untersuchung auf mit Scrapie verbundene Fibrillen negativ war.
Es gab in diesem Fall jedoch Vakuolenbildung im weißen Bereich, der
Substantia Nigra und der inneren Verkapselung, dies fand jedoch
zuvor statt und wurde nicht als bedeutsam betrachtet.
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Ein deutliches Ergebnis dieser Untersuchungen
ist, dass in zumindest einer „übertragbaren
Spongiformen Enzephalopathie" (TSE),
nämlich
BSE, eine spezifische Immunantwort gegen eine Mikrobe gezeigt werden
kann, die leicht in der Umgebung von Rindern gefunden wird, und
bei welcher es ebenfalls vorkommt, dass sie eine Molekularsequenz ähnlich der
des Rindermyelins besitzt.
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Andere Formen der Spongiformen Enzephalopathie,
einschließlich
Creutzfeld-Jakob-Krankheit
(CJD) und Multiple Sklerose (MS) bleiben zur Erklärung durch
das selbe Modell, wie es für
BSE angegeben wurde, offen. CJD-Seren und MS-Seren durchlaufen derzeit
Tests um das Vorliegen von Kreuzreaktionen von Antikörpern zu
bestätigen.
