DE69720433T3

DE69720433T3 - Verfahren zum nachweis von prionkrankheit

Info

Publication number: DE69720433T3
Application number: DE69720433T
Authority: DE
Inventors: Edward Bram SCHREUDER; Johannes Lucius VAN KEULEN; Elisabeth Maria VROMANS; Pieter Johannes LANGEVELD; Adrianus Marinus SMITS
Original assignee: STICHTING INST VOOR DIERHOUDER; STICHTING INSTITUUT VOOR DIERHOUDERIJ EN DIERGEZONDHEID (ID-DLO)
Current assignee: Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek DLO
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1997-04-02
Publication date: 2009-07-30
Anticipated expiration: 2017-04-03
Also published as: BR9708421A; JP3333213B2; WO1997037227A1; EP0891552A1; NO984602D0; DK0891552T3; US20050048582A1; AR006494A1; US6972177B1; AU2180897A; US7211401B2; NZ332132A; DK0891552T4; NO321571B1; CA2250800C; EP0891552B2; JP2000505559A; EP0891552B1; ATE236407T1; DE69720433D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Prionkrankheit, auch als spongiforme Encephalopathien, (SEs) genannt, beispielsweise die Scrapie des Schafs, die bovine spongiforme Encephalopathie (BSE „Verrückte Kuh-Krankheit") des Rindes, die Creutzfeld-Jacob-Krankheit (CJD) und Kuru des Menschen. Prionenkrankheiten sind unter anderem durch Nahrungsaufnahme oder durch Impfung mit Prionproteinen übertragbar, was wegen einer medizinischen Behandlung vorkommen kann, jedoch auch gelegentlich oder auf erbbiologischer Basis ohne Beweis der Übertragung vorkommen kann.
Einführung
Prionkrankheit sind ein Brennpunkt öffentlichen Interesses, was kürzlich durch die Entdeckung von unerwarteten Fällen von CJD bei Jugendlichen und Farmern in Großbritannien angeheizt worden ist, wo die Übertragung von Prionproteinen von Vieh auf Menschen über Fleischkonsum geschlussfolgert worden ist, was die Übertragung von BSE auf Menschen anzeigt und dabei JCD verursacht.
Mehrere Faktoren verstärken die öffentlichen Befürchtungen:

a) Die Natur des verursachenden Agens, das sogenannte Prionenprotein von SEs ist unbekannt oder wird mindestens kontrovers diskutiert;
b) was immer seine Natur ist, das Agens ist hochresistent gegenüber Verfahren, welche andere Infektionsagentien beseitigt (z. B. Erhitzung);
c) therapeutische Eingriffe sind offensichtlich nicht möglich, sobald Symptome auftreten;
d) SEs haben eine extrem lange Inkubationsperiode;
e) praktische, empfindliche und spezifische diagnostische Verfahren, die während der präklinischen Phase angewendet werden, sind nicht verfügbar. Dies alles fügt sich zu dem generellen Gefühl des „Lebens mit einer Zeitbombe". Nicht nur die mögliche Anwesenheit von Prionproteinen in Fleisch und Fleischprodukten stellt eine Gesundheitsbedrohung dar, auch die mögliche Anwesenheit von Prionproteinen in Blut und Blutprodukten, wie sie bei Transfusionen verwendet werden, die Anwesenheit in pharmazeutischen Produkten tierischer Herkunft, in Kosmetika tierischen Ursprungs, in für Zellkulturen verwendeten Seren, kurz in einer extensiven Reihe von Produkten tierischen Ursprungs sind mögliche Gefahren für die menschliche und tierische Gesundheit enthalten.

Bis heute hängt die bejahende Diagnose von Scrapie und auch anderen übertragbaren spongiformen Encephalopathien von der histologischen Untersuchung des Gehirns ab, das bei der nach dem Tod erfolgenden Untersuchung von Tieren oder Menschen mit klinischen Anzeichen der Krankheit entnommen wurde. Ablagerungen von abweichendem oder verändertem Protein (PrP^Sc, Prionprotein, auch als Ausnahmeprotein bezeichnet) kann im Gehirn von verendeten Tieren entdeckt werden. Dieses Protein ist gegenüber Verfahren, wie Proteinase K Digestion, sehr unempfindlich, die sonst normale Proteine denaturiert, auflöst oder entfernt. Das abweichende Protein wird als zentral in der Pathogenese der Prionenerkrankung betrachtet. Obzwar nicht infektiös in klassischer mikrobiologischer Art wegen der Abwesenheit einer spezifischen Nukleinsäure, wird das abweichende Protein selbst als das ursächliche Agens angesehen, und wenn ein anfälliges Tier solch ein abweichendes Protein in seinem Körper (d. h. durch Verdauung, Impfung oder über Mutation der Gene der normalen Version des PrP-Proteins, PrP^C) erhält, kann eine Kettenreaktion starten, die schließlich zur klinischen Manifestation der Prionkrankheit führt. Die Kettenreaktion zieht die Bildung von mehr abweichenden Proteinen nach sich, die aus dem normalen Protein gebildet wird, das in dem Körper des Tiers vorhanden ist. Normale und abweichende Formen wirken in solcher Weise miteinander, dass mehr abweichende Formen produziert werden. Da die abweichende Form sehr resistent gegenüber Proteolyse (Eiweißspaltung) ist, werden Ablagerungen des umgewandelten Prionproteins gebildet, insbesondere im Gehirn und anderen Teilen des zentralen Nervensystems (CNS), was zur spongiformen Encephalophatie führt und daher zur klinischen Manifestation der Gehirnerkrankung.
Da SE-infizierten oder betroffenen Tieren und Menschen eine krankheitsspezifische Immunreaktion mangelt, war es bisher unmöglich, Individuen zu identifizieren, bevor sie klinische Anzeichen entwickeln (was Jahre dauern kann). Keine biochemischen, haematologischen oder schwere pathologischen Abnormitäten sind zuverlässig mit SEs assoziiert. Die Diagnose von SEs hängt deshalb von der Erkenntnis klinischer Anzeichen, von bildgebenden Verfahren der Elektroencephalographie oder Magnetresonanz (die beide nur bei menschlichen Patienten angewendet werden) oder der stärker invasiven Methode der vorgenommenen Hirnbiopsien ab. Die endgültige Diagnose wird während der Autopsie durch histologische Untersuchung des Gehirns gemacht. Die neuropathologischen Verletzungen oder Veränderungen, die aus der Vacuolation (die spongiforme Änderung) der grauen Substanz, assoziiert mit Gliosis und neuronalem Verlust, bestehen, sind generell genügend charakteristisch. Eine weitere Bestätigung ist dadurch möglich, dass mit Scrapie assoziierte Fibrilen (SAFs) in Gehirnextrakten nachgewiesen werden, oder indem die Anwesenheit des konstituierenden Proteins, PrP^Sc, bewiesen wird. PrP^Sc ist mit der Krankheit assoziiert und stellt eine abweichende Form des zumeist codierten Prionenproteins (PrP) dar, wobei die abweichende Form durch eine anwandelnde Änderung induziert wird. PrP^Sc kann durch immunologische Verfahren festgestellt werden, beispielsweise durch das sogenannte Western-Blotting oder durch Immunohistochemie. Die letztere Technik wird allmählich mehr als zuverlässiges diagnostisches Werkzeug für klinische Fälle sowohl auf den SE-Gebieten des Menschen und der Veterinärmedizin angenommen.
Die Suche nach einem praktischen vorklinischen diagnostischen Test war und bleibt ein Hauptthema der Forschung. Dieses fokussiert sich generell auf den Nachweis der Infektivität unter Anwendung einer Bioanalyse oder dem Nachweis des mit der Krankheit assoziierten PrP^Sc. Obwohl die Bioanalyse die empfindlichste Nachweismethode darstellt, ist sie weitaus zu umständlich und zeitaufwendig, um jemals ein praktisches Diagnoseverfahren zu werden: Testergebnisse könnten verfügbar werden, lange nachdem der Patient verstorben ist.
Die meisten Forscher haben sich deshalb auf Verfahren zur Feststellung von PrP^Sc konzentriert. Obwohl nicht alle Forscher mit der Feststellung übereinstimmen, dass PrP^Sc das verursachende Agens ist, stimmen die meisten, wenn nicht alle darin überein, dass die Zuordnung der Anwesenheit von PrP^Sc mit der Krankheit fest etabliert ist. Der Nachweis von PrP^Sc in Geweben außerhalb des zentralen Nervensystems (CNS) würde die Probeentnahme durch weniger invasive Verfahren als die Gehirnbiopsie ermöglichen, wobei die Aussichten für ein praktisches präklinisches diagnostisches Verfahren substantiell verbreitert würden. Zahlreiche Gewebe sind im Versuch, ein frühes Nachweisverfahren zu entwickeln, angewendet worden: Blut, Urin, Gewebefibroblaste und, speziell auf tierischen Gebiet, lymphartiges Gewebe. Eine kurze Zusammenfassung der vielversprechendsten und aufregendsten Ergebnisse wird nachfolgend gebracht (wegen einer extensiven Darstellung siehe Schreuder, 1994a, 1994b).
Blut: Bei menschlichen SEs wurde häufig die experimentelle Übertragung der Creutzfeld-Jacob-Krankheit (CJD) von Proben aus Leukozyten im zentrifugierten Blut von menschlichen CJD-Patienten auf Nagetiere diskutiert (Muaramoto et al., 1993), es gibt jedoch nur geringe oder keine Anzeichen dafür, dass Blut und speziell Leukozytenfilm im zentrifugierten Blut irgendeine Infektivität bei Tieren enthält, die natürlicherweise von Scrapie betroffen sind, weder in klinischen noch in präklinischen Stufen (Fraser und Dickinson, 1978; Hadlow et al., 1982). Interessante Ergebnisse sind neulich von Meiner et al. (1992) berichtet worden, der PrP^Sc in peripheren Geweben entdeckte, sowohl in kultivierten Fibroblasten als auch in Monocyten, und zwar in einer Gruppe von acht CJD-Patienten, die eine Mutation des Codons 200 tragen und an klinischer Krankheit leiden. Diese Autoren verwendeten sowohl Western-Blotting als auch die immunocytochemischen Techniken. Es scheint, dass ihre Publikation keine Nachfolger hatte, und selbst wenn diese Ergebnisse bestätigt werden könnten, erscheinen die Chancen für einen verlässlichen Bluttest gering zu sein, mindestens im Falle von tierischen SEs und in Anbetracht der Anzahl der negativen Berichte aus der Literatur (berichtet in Brown, 1995).
Urin: Nur einmal ist ein Anspruch erhoben worden, dass die Infektivität bei Urin im Falle von Creutzfeld-Jacob-Krankheit demonstriert wurde, indem CJD auf Mäuse übertragen wurde. Der gleiche Autor war jedoch nicht in der Lage, dieses Experiment zu wiederholen (Braun, 1995). Von einem gänzlich unterschiedlichen Lösungsansatz wurde unlängst berichtet (Brugere et al., 1991). Urin von mit Scrapie betroffenen Tieren und von Kontrolltieren wurde in einem voltametrischen Verfahren durch wiederholte Mikroelektrolyse in Kapillaren untersucht, was die Unterscheidung dieser beiden Gruppen ermöglichte. Die Vorgehensweise erschien vielversprechend, jedoch konnte ihr Wert bei der Feststellung von vorklinischen Stufen von insbesondere BSE nicht bestätigt werden.
Lymphartiges Gewebe: Lymphgewebe ist offensichtlich nicht auf dem Gebiet der Diagnose von menschlichen SEs verwendet worden, jedoch im veterinärmedizinischen Gebiet. Das bereits klassische Werk von Hadlow hat gezeigt, dass im lymphartigerm Gewebe von natürlich infizierten Scrapie-Schafen die Infektivität durch eine Bioanalyse bereits bei 10 bis 14 Monate alten Schafen feststellbar war. Diese Feststellung wurde getroffen, bevor jegliche Infektivität beim zentralen Nervensystem (CNS) gefunden wurde (Hadlow et al., 1980). Das Verfahren Western-Blotting offenbarte, dass die Anwesenheit von PrP^Sc in der Milz von mit Scrapie infizierten Mäusen (Diringer et al., 1983; Doi et al., 1988) in einigen Fällen bereits nach 4 Wochen nach der experimentellen Infektion nachgewiesen wurde. Entnommene Lymphknoten dieser Mäuse enthielten auch PrP^Sc. In ähnlicher Weise wurden unter Anwendung des Western Blotting PrP^Sc in einer Gruppe von natürlich infizierten Schafen mit klinischen Anzeichen von Scrapie in Proben des zentralen Nervensystems (CNS), der Milz und von Lymphknoten ziemlich konsistent nachgewiesen (Ikegami et al., 1991). Der Wert dieser Technik des Western Blotting wurde mindestens für klinische Fälle durch andere Gruppen bestätigt. Jedoch waren die Ergebnisse aus einer Gruppe von experimentell infizierten Schafen, die 16, 18 und 21 Monaten nach Impfung, jedoch bevor sich klinische Zeichen entwickelten, getötet wurden, inkonsistent und schwierig zu beurteilen: PrP^Sc wurde in Milzproben von nur 3 aus 12 als positiv eingeschätzten Tieren nachgewiesen, und zwar mit Lymphknotenproben mit nur schwachen oder zweifelhaften Ergebnissen, es wurden jedoch keine positiven Ergebnisse gefunden, was die Unempfindlichkeit dieses Verfahrens illustriert. Deshalb ergeben die Techniken des Western Blotting in vorklinischer Diagnose von TSE wechselhafte und nicht zuverlässige Ergebnisse.
Der Grund für diese wechselhaften Ergebnisse kann in dem Verfahren der Zubereitung des PrP^Sc-Proteins (das in den betroffenen Geweben anwesend ist) und dem Umstand erklärt werden, dass das PrP^Sc-Protein dissoziiert oder von dem normalen zellulären isoformen PrP-Protein getrennt wird, welches ebenfalls mit den gleichen Antiseren immunoreaktiv ist, die für Western Blotting angewendet werden. Ikegami et al. (1991) und Muramatsu et al. (1993) finden es notwendig, die Proben für die Western Blotting-Analyse durch zahlreiche Schritte vorzubereiten. Sie reichern zunächst die Proben an, indem sie Gewebeextrakte zubereiten, die relativ angereicherte Anteile sowohl von PrP^Sc als auch PrP enthalten, wonach notwendigerweise das PrP-Protein mit einer Proteinase K-Behandlung entfernt wurde. Dieses Verfahren enthält mindestens 10 getrennte Schritte der Inkubation und Trennung, bei welchen der absolute Betrag des nachzuweisenden Proteins in der Probe bei jedem Schritt verringert wird. Obzwar dieses Protokoll für die Diagnose der klinischen Phase von SEs sehr gut arbeitet, wobei überreichlich PrP^Sc im Verhältnis zu dem normalen zellulären isoformen PrP vorhanden ist, ist in der vorklinischen Phase von TSE der absolute Betrag an PrP^Sc so klein, dass es gewöhnlich während der Präparation verloren geht.
Bei BSE unterscheidet sich die Situation von der bei Scrapie: Einerseits können Ergebnisse aus Experimenten mit Mäuse- Übertragung, bei denen verschiedene Gewebe von mit BSE betroffenem Vieh verwendet wurde, andeuten, dass die Verteilung des BSE-Agens in Geweben außerhalb des zentralen Nervensystems (CNS) nicht so extensiv ist wie im Falle von Scrapie bei Schafen, andererseits mag es zutreffend sein, dass die bei den Bioanalysen verwendeten Mäuse weitaus weniger für BSE als für Scrapie empfindlich sind. Experimentelle Übertragung von BSE auf Mäuse war nur dann erfolgreich, wenn Hirnmaterial verwendet wurde (Fraser et al., 1988; Fraser et al., 1990); mit anderen Materialien einschließlich Milz, Samen, Leukozytenfilm, Muskel, Knochenmark und Placenta geimpfte Mäuse blieben gesund.
Alle obigen Verfahren außer der Bioanalyse haben jedoch gemeinsam, dass die Diagnose von SEs nur in der klinischen Phase der Krankheit durchgeführt werden kann, häufig nur nach Autopsie. In Anbetracht der Tatsache, dass Bioanalysen sehr langsam sind, und zwar wegen des sehr langsamen Fortschritts der Krankheit in dem experimentellen Tier, das für die Bioanalyse als solches verwendet wird, sind zur Zeit keine Verfahren verfügbar, welche die unmittelbare Diagnose von SEs in einer vorklinischen Phase der Krankheit darbieten. Obzwar der durchschnittliche Experte bei der Entwicklung von diagnostischen Tests zur Zeit einen Reichtum von diagnostischen Techniken zur Verfügung hat, um alle Arten von Proteinen in biologischen Proben nachzuweisen, indem er monoklonale oder polyklonale Antisera in mit Enzymen oder Markierern verbundenen Immunoanalysen anwendet, indem er Techniken mit oder ohne Anreicherungsverfahren für das der Studie zugrunde liegende Protein anwendet, ist daher kein Gold-Standard verfügbar, um der Entwicklung von solchen diagnostischen Verfahren eine Führung zu geben, die im Falle der präklinischen Diagnose von Prionkrankheit anwendbar wäre. Mit anderen Worten: Verfahren zur Ausführung ausgefeilter diagnostischer Tests sind zur Zeit dem allgemeinen Experten auf dem Gebiet gut bekannt; dem Experten fehlen jedoch Verfahren zur Errichtung der Sensitivität und Spezifität von solchen ausgefeilten diagnostischen Tests wegen des Fehlens eines Gold-Standards.
Wir haben nunmehr ein zuverlässiges und rasches diagnostisches Verfahren für die präklinische Diagnose von Prionkrankheit oder SEs gefunden. Die Erfindung bietet ein Verfahren für präklinische Diagnose bei Schaf-Scrapie, aber auch bei anderen SEs, wie BSE und CJD, dar. Wir benutzten Scrapie beim Schaf als Modell beim Studium von SEs. Kenntnisse der Gruppe von SEs, welche die menschlichen Formen, wie CJD und Kuru, einschließen, sind größtenteils während Studien mit Scrapie erhalten worden. Scrapie ist eine fortschreitende und fatale neurologische Krankheit bei Schafen und Ziegen und wird als der „Archetyp" der Gruppe von SEs betrachtet und ist wahrscheinlich die Ursache für die BSE-Epidemie in Großbritannien. Die Kontrolle und die sanitären Maßnahmen, die während des Ausbruchs von BSE in Großbritannien durchgeführt wurden, basierten größtenteils auf dem, was von Scrapie bekannt war. Indem die zuvor erwähnten Daten von Hadlow über die Anwesenheit von Infektivität in zahlreichen peripheren Geweben in Betracht gezogen wurde, schlossen wir, dass unter anderem lymphartigem Gewebe ein Kandidat für die Entwicklung eines präklinischen Tests sein könnte, der auf dem Nachweis von PrP^Sc basiert, jedoch wurden auch andere Gewebe, beispielsweise, aber nicht ausschließlich Retina, alveolare Makrophagen oder Monocyten, bei denen PrP Infektivität angetroffen wurde, in Betracht gezogen.
Die Immunhistochemie (IHC), welche das Immuno-Peroxidase-Einfärbeverfahren verwendet, erwies sich in unserer Hand als ein hoch zuverlässiges und praktisches Verfahren des Nachweises von PrP^Sc (Van Keulen et al., 1995) und weniger beschwerlich als Western Blotting, wenn IHC auf histologische Schnitte der Gehirne zur Diagnose der klinischen Scrapie und BSE angewendet wurde. Unter Anwendung der gleichen IHC-Technik und der gleichen Antiseren wurde eine Anzahl von lymphartigen Geweben in einer Gruppe von natürlich betroffenen, klinisch positiven Scrapie-Schafen (n = 55) untersucht (Van Keulen et al., in der Presse, siehe auch den experimentellen Teil). Wir demonstrierten die Anwesenheit von PrP^Sc in der Milz, dem retropharyngealen Lymphknoten, dem mesenterischen Lymphknoten und den Gaumenmandeln, und zwar in allen außer einem Tier (98%). Von allen untersuchten Lymphknoten hatten die Mandeln die höchste Rate an niedergeschlagenem PrP^Sc, die pro Anzahl der Follikel festgestellt werden konnte: In allen positiven Fällen zeigten sich mehr als 60% der gefärbten Mandelfollikel positiv, und in 95% der Fälle war dies selbst mehr als 80%. Um die Anwendbarkeit dieses Verfahrens in der präklinischen Phase der Scrapie abzuschätzen, unternahmen wir eine Studie unter Einbezug einer nachfolgenden Biopsie und nahmen die Mandeln von Schafen, und zwar wurden Mandeln gewählt, weil die experimentelle Verfügbarkeit der nachfolgenden Studien garantiert ist, jedoch können auch andere Gewebe für die präklinische Diagnose in Betracht gezogen werden. Wir haben das der Scrapie assoziierte PrP^Sc in Mandeln von 10 Monate alten Schafen nachgewiesen, was weniger als die Hälfte der Inkubationsperiode ist, da die der Studie unterliegenden Schafe die Scrapie voraussichtlich im Alter von ungefähr 25 Monaten entwickeln. Bei Schafen, von denen angenommen wurde, dass sie Scrapie bei einem viel späteren Zustand entwickeln oder während ihrer gesamten Lebenszeit gesund bleiben, stellten wir dieses PrP^Sc-Protein nicht fest.
Mit Bezug auf Scrapie könnten weitere Kontrollprogramme von diesen Ergebnissen profitieren. Kontrollprogramme bei verschiedenen Züchtungen könnten aus einer Kombination von Züchtungsprogrammen, welche Gebrauch von der festgestellten Verbindung zwischen PrP-Genotyp und größere Scrapie-Empfänglichkeit oder -Widerstandskraft, und dem oben beschriebenen Verfahren bestehen, welches die Krankheit erzeugende Anwesenheit von PrP^Sc in Mandeln von anfälligen Tieren in der präklinischen Stufe der Krankheit nachweist.
Mit Bezug auf BSE und SEs im allgemeinen können Änderungen und Einstellungen des angewendeten Verfahrens nunmehr durchgeführt werden, um sich den spezifischen Umständen und Bedingungen von BSE- und SE-Diagnose anzupassen. Diese Änderungen können durch spezifische Kenntnis über Homologien und Heterologien bei den Aminosäuresequenzen von Prionproteinen von unterschiedlichen Spezies (für eine Auswahl von bekannten Sequenzen siehe 1) geleitet werden. Auch kann eine Führung bei der Auswahl spezifischer Antiseren angetroffen werden, indem ausgewählte kontinuierliche oder diskontinuierliche Peptidsequenzen dieser Prionproteine im Hinblick auf Reaktivität ausgewählt werden. Vor allem kann die IHC-Technik für die Anwendung bei BSE und bei peripheren Lymphknoten im Speziellen weiter verfeinert werden. Dies könnte Adaptionen des Protokolls bei der Anwendung für die Immuno-Färbung von Gehirnabschnitten erforderlich machen. PrP^Sc-Nachweis bei lymphartigen Geweben ist nur unter Anwendung der Immuno-Blotting-Verfahren und in klinischen Fällen (Mohri et al., 1992) versucht worden. Diese Ergebnisse waren negativ, was ein Nachweisproblem mit Bezug auf Sensitivität andeutet. Keine ernsthaften Anstrengungen wurden unternommen, um PrP^Sc in präklinischen Zuständen von BSE nachzuweisen. Das Verfahren, tonsillare Biopsien bei lebenden Rindern vorzunehmen, ist durchführbar und selbst leichter als bei Schafen, da man beim Rind mit einer leichten Sedation auskommt (Xylazine (Rompun)). Die Möglichkeit einer frühen Diagnose im Falle von BSE könnte die Notwendigkeit für gewisse drakonische Maßnahmen erleichtern, die heutzutage mit Bezug auf die Rinderpopulation in Großbritannien vorgeschlagen werden.
Weitreichende Auswirkungen unserer Erfindung liegen auf dem Gebiet der humanen SEs. Auch hier kann die Anwendbarkeit der IHC-Technik in der präklinischen Phase nunmehr festgestellt werden. In der Literatur fanden wir keinen Hinweis auf die Untersuchung von lymphartigen Geweben in diesem Zusammenhang. Da Mandeln leichter zugänglich sind und da ein pathologischanatomisches Labor fast immer zur Verfügung steht, könnte die oben beschriebene Technik, bei menschlichen SEs angewendet, zu einer frühen Diagnose von zweifelhaften Fällen von SEs beitragen. Dies ermöglicht die Fähigkeit der Feststellung von Individuen, welche die Krankheit in einem frühen Stadium der Inkubationsperiode beherbergen, und zwar mindestens beträchtlich lange bevor klinische Anzeichen erscheinen, was wiederum die Anwendung gewisser therapeutischer Maßnahmen für spezifische Risikogruppen ermöglichen würde (mindestens Eingriffe, welche den Fortschritt der Krankheit verzögern, beispielsweise die Anwendung von Amphotericin-B).
Die vorliegende Erfindung bietet somit Verfahren für den Nachweis von Prionkrankheiten dar, wobei abweichende Proteine in zahlreichen Geweben nachgewiesen werden, beispielsweise im lymphartigen oder tonsillaren Gewebe, wenn auch nicht beschränkt darauf, welches von lebenden Tieren genommen werden kann, speziell von Farmtieren oder Menschen oder anderen Säugetieren. Die immunologische Feststellung umfasst jede dem Fachmann bekannte Methode bei der diagnostischen Testentwicklung, und zwar alle Verfahren, die den immunologischen Nachweis mit Enzym- oder Markiererverbundenen oder nicht verbundenen Antikörpern verwenden, selbst Western Blotting-Techniken können nun in empfindliche und spezifische Techniken dank der Tatsache entwickelt werden, dass ein Gold-Standard für präklinische Diagnosen von Prionerkrankungen nunmehr verfügbar geworden ist. Die Erfindung umfasst ferner die Anwendung eines der obigen Verfahren bei der Diagnose von Prionkrankheiten, bei Krankheitskontrollprogrammen, bei der Auswahl von für den Verbrauch geeignetem Fleisch und bei der Auswahl von Blut und Blutprodukten.
Experimenteller Teil
Der immunohistochemische Nachweis von Prionprotein in lymphartigem Gewebe von Schafen mit klinischen Fällen von natürlicher Scrapie.
Materialien und Methoden
Schaf.
67 Schafe mit nervösen Störungen, welche die der Scrapie-Infektion ähneln, wurden gekauft. 55 Schafe wurden als mit Scrapie durch histopathologische und immunohistochemische Prüfung des Gehirns diagnostiziert (Van Keulen et al., 1995). Ein Tier litt sowohl an einer Scrapie-Infektion als auch an einer gleichzeitigen Meningoencephalitis, die vermutlich durch Lysteria-Monocytogene verursacht wurde. Scrapie-positive Schafe stammten von 30 verschiedenen Herden. Die Gruppe bestand aus 54 weiblichen und 1 männlichen Tier im Alter von 2 bis 5 Jahren und umfasste 8 unterschiedliche Rassen und Kreuzungen. 12 Schafe zeigten keine histopathologischen Anzeichen einer Scrapie-Infektion und zeigten keine PrP^Sc-Immunofärbung im Gehirn. 5 dieser Schafe wurden mit Meningoencephalitis diagnostiziert, eines hatte intramyelitische Ödeme unbekannter Ursache, und 6 Schafe zeigten keine histopathologischen Abnormitäten. Scrapienegative Schafe waren alle weiblich aus 10 unterschiedlichen Herden und zwei unterschiedlichen Rassen und Kreuzungen im Alter von 1 bis 5 Jahren.
Nekroskopie.
Eine Obduktion wurde innerhalb von 36 Stunden nach dem natürlichen Tod oder unmittelbar nach dem Töten des Tieres durchgeführt, letzteres durch intravenöse Injektion von Natriumpentobarbital und Ausbluten. Das Gehirn jedes Schafes wurde zur Scrapie-Diagnose wie zuvor beschrieben (Van Keulen et al., 1995) entfernt. Proben wurden von verschiedenen lymphartigen Geweben einschließlich Milz, Gaumenmandel, oberflächliche Halslymphknoten (prescapulare Lymphknoten), Subiliac Lymphknoten (präfemoraler Lymphknoten), medial retropharyngealer Lymphknoten, tracheobronchialer Lymphknoten, mesenterischer Lymphknoten und Ileum genommen.
Histologische und immunohistochemische Prozeduren.
Gewebeproben wurden unmittelbar für 24 Stunden in ein Bad mit Periodat-Lysin-Paraformaldehyd-Fixativ (PLP) mit einem Gehalt an 2%igem Paraformaldehyd (Merck, Darmstadt, Deutschland) eingetaucht. Proben wurden dann auf eine maximale Dicke von 2 mm zugeschnitten und für weitere 24 Stunden in frisch zubereitetem PLP fixiert. Nach der Fixierung wurden die Proben in Wasser gewaschen, routinemäßig dehydriert und in Paraffin eingebettet. Drei Schnitte von 5 μm wurden geschnitten, auf mit 3-Aminoalkyltriethooxysilan-beschichtete Glasprobenträger (Sigma, St. Louis, MO, USA) montiert, für weitere 48 Stunden bei 60°C getrocknet und entparaffinisiert. Der erste Schnitt wurde mit Hematoxylin-Eosin (HE) gefärbt. Die zweiten und dritten Schnitte wurden mit Antipeptid-Serum, welches gegen das Ovine-Prion-Protein gerichtet ist, bzw. mit Prä-Immun-Serum immunogefärbt, und zwar gemäß dem folgenden Verfahren; nach 30 Minuten Eintauchen in 98% Ameisensäure (Merck) wurden die Schnitte gewaschen und Autoklav-mäßig in Wasser für weitere 30 Minuten bei 121°C in einen Druckkocher eingetaucht. Endogene Peroxidase wurde mit 0,3% Hydrogenperoxid in Methanol (Merck) blockiert. Der Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit Anti-Peptid-Antiserum oder Präimmunserum, das in Phosphat-gepufferter Saline (pH 7,2) zu 1:1500 verdünnt war und 1% Bovinserum-Albumin (Sigma) enthält, folgte die Inkubation zunächst mit Biotinkonjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG und dann mit Streptvidin-Peroxidase für 10 bzw. 5 Minuten (Dakopatts, Glostrup, Dänemark). Als Substrat wurde Aminoethylcarbazol (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA, USA) verwendet, weil dessen rote Farbe leicht von dem gelbbraunen Ceroid/Lipofuscin und dem Hemosiderin-Pigment unterschieden werden konnte, welches oft in lymphartigen Geweben anwesend war. Zwischen den verschiedenen Schritten wurden die Schnitte gründlich in Phosphat-gepufferter Saline mit einem Gehalt von 0,05% Tween-20 (Merck) gespült. Schnitte wurden mit Mayers Hematoxylin während 30 Sekunden gegengefärbt und in Glycergel (Dakopatts) montiert. Mit jedem immunohistochemischen Färben wurde ein Schnitt der Medulla oblongata eines sicheren, mit Scrapie betroffenen Schafes gleichzeitig wegen PrP gefärbt, um die korrekten Immunofärbeverfahren zu überwachen.
Peptid-Synthese und Antipeptid-Antisera.
Fünf Peptide mit Sequenzen, die von dem Ovin-Prion-Protein (PrP 94–105, 100–111, 126–143, 145–177, 223–234) abgeleitet sind, wurden synthetisiert und dazu verwendet, Antipeptid-Antiseren in Kaninchen gemäß den zuvor veröffentlichten Verfahren (Van Keulen et al., 1995) zu erheben. Es wurde sichergestellt, dass die Antisera spezifisch für PrP sind (sowohl unverdaut als auch nach Proteinase K-Behandlung), und zwar auf Western Blots von speziell gereinigtem Prionprotein von mit Scrapie betroffenem Schafhirn gemäß anerkannten Verfahren (Hilmert und Diringer, 1984). Präimmunsera wurden vor Immunisierung gesammelt und dienten als negative Kontrollsera.
Die verwendeten Sera haben Vorteile, die auf einer Mischung von empirischen, theoretischen und analytischen Werten beruhen, deren Kombination sie in der diagnostischen Anwendung unschätzbar macht. Die Zubereitung der Sera ist in einer Publikation von Van Keulen et al., 1995, beschrieben worden. Die immunochemischen Eigenschaften dieser Sera sind teilweise publiziert. Die spezifischen in diesem Beispiel benutzten Sera sind für die Scrapie-Diagnose ausgelegt, jedoch kann eine Führung in den unten gegebenen Hinweisen für die Entwicklung von Sera gefunden werden, die bei der Diagnose von anderen SEs anwendbar sind, vorausgesetzt, man wählt die Sequenzen aus, wie sie der der Spezies entsprechenden spezifischen Sequenz des Prionproteins entspricht. Falls notwendig, kann man andere Tiere als Kaninchen wählen, um die spezifischen Sera zu erzeugen.

1: Die Sera sind mit synthetischen Peptiden mit Sequenzen, basierend auf der Sequenz von PrP-Protein herbeigeführt worden.
2: Die Sera sind mit Kaninchen herbeigeführt worden.
3: Die Peptidsequenzen weisen solche Unterschiede mit den Kaninchen-PrP-Sequenzen auf, dass sie nicht nur Antikörper induzieren, welche diese Peptide erkennen, sondern auch das authentische PrP-Protein.
4: Die für die Immunisierung verwendeten Peptide werden kurz gehalten (12mere); es wird angenommen, dass diese Kürze eine kritische Rolle in der hohen Spezifität für die Scrapie-Formen von PrP spielt und daher bei der Bindung in den Gewebeschnitten selbst nach harscher Denaturierung und degradativer Behandlungen wichtig ist.
5: Die für die Immunisierung verwendeten Sequenzen und zur Erzielung der spezifischen Scrapie-PrP-Einfärbung wurden von dem Protease K-resistenten Bereich der PrP^Sc ausgewählt.
6: Die in der Diagnose IHC verwendeten Sera sind auch gut reaktiv in anderen immunochemischen Tests, wie Western Blotting von sowohl PrP^C als auch PrP^Sc, ELISA mit PrP-Protein, PEPSCAN mit 12mer-Peptiden mit überlappenden Sequenzen von Schaf-PrP.
7: Die ausgewählten Peptide haben Eigenschaften (Wasseranziehung, Flexibilität, Oberflächenvorkommen), die, wenn für die Immunisierung benutzt, für die Hervorlockung von Antikörpern mit Bindungen zum Antigen vorteilhaft sind, auf denen die Sequenzen basieren.
8: Die hervorgelockten Antisera zeigen die richtige Spezifität, wenn sie in PEPSCAN mit 12mer-Peptiden analysiert werden. Die Hinzufügung eines fremden dimeren Glycins am entweder dem N-Ende oder dem C-Ende dieser Peptide lässt nicht die Spezifität der Peptide sinken, sondern macht wahrscheinlich die Immunisierung noch effektiver, vermutlich weil es die Peptide dazu bringt, weiter weg von dem Trägerprotein hervorzustehen, und macht sie flexibler auf dem Trägerprotein, Eigenschaften, welche bedeutende Determinanten bei der Antigenizität sind.
9: Die für die Peptidsynthese und Immunisierung ausgewählten Sequenzen stellen Bereiche oder Domänen dar, die eine niedrige Tendenz zur Bildung einer sekundären Struktur (a-Helix oder β-Fläche) aufweisen und kein Teil der vier Bereiche sind, die in der Literatur als zur Bildung der β-Ebene als synthetische Peptide beschrieben sind.

Ergebnisse
Immunohistochemisches Testen von Antipeptid-Antisera.
Ein identisches und besonderes Immunomarkierungsmuster wurde bei allen Antipeptid-Antisera in den lymphartigen Geweben von mit Scrapie betroffenem Schaf festgestellt. Weil die fünf Antisera gegen unterschiedliche Epitope des PrP-Proteins gerichtet waren, kann die Kreuzreaktivität der Antipeptid-Antisera mit anderem Protein ausgeschlossen werden. Wir klassifizierten das immunomarkierte Protein als PrP. Wir definierten ferner dieses PrP als Scrapie-assoziiertes PrP (PrP^Sc), weil keine PrP-Immunoreaktivität in einem der lymphartigen Gewebe von Scrapie-negativem Schaf festgestellt wurde. Der Ersatz der Antipeptid-Antisera durch Prä-Immunsera führte nicht zu einer Immunomarkierung.
Lokalisierung des PrP^Sc in den lymphartigen Geweben.
PrP^Sc wurde innerhalb der primären und sekundären lymphartigen Follikel von Milz, Gaumenmandel, Lymphknoten und solitären Follikeln oder Peyers Flecken auf dem Ileum (1A bis C) festgestellt. Das PrP^Sc-Immunomarkierungs-muster bestand aus einem retikularen Netzwerk in der Mitte des lymphartigen Follikels, der in Färbungsintensität variierte. Abgesehen von diesem Netzwerk wurden feine bis grobe Körner von PrP^Sc in dem Zytoplasma von nicht lymphartigen Zellen innerhalb des Follikels angetroffen. Einige dieser Zellen wurden als Makrophagen identifiziert, wegen der gleichzeitige Anwesenheit von Ceroid/Lipofuscin-Pigment in ihrem Zytoplasma (1D) wurde keine Immunomarkierung der B-Lymphozyten in dem lymphartigen Follikel festgestellt.
Gelegentlich wurde zusätzliche Immunomarkierung in spezifischen Zellen und Regionen des lymphartigen Gewebes angetroffen. In der Milz enthielten individuelle Zellen in der periarterialen lymphtischen Hülle (PALS) und der Randzone, welche die Milzkorpuskeln umgibt, Körner von PrP^Sc, manchmal kombiniert mit Ceroid/Lipofuscin-Pigment innerhalb des Zytoplasmas. Kein PrP^Sc wurde in der roten Pulpe der Milz festgestellt. In der Gaumenmandel und dem Ileum, Zweige oder Körner von PrP^Sc wurden eingesprengt zwischen den Lymphozyten des Dombereichs zwischen den Follikeln und dem Crypt-Epithelium angetroffen. In den Lymphknoten wurden Körner von PrP^Sc zwischen den Lymphozyten des Paracortex festgestellt.
Verteilung der PrP^Sc in lymphartigen Geweben.
PrP^Sc wurde in 54 (98%) der 55 mit Scrapie betroffenen Schafe in der Milz, der Mandel, dem retropharyngalen Lymphknoten und dem mesenterischen Lymphknoten festgestellt. In den tracheobronchialen, präfemoralen und präscapularen Lymphknoten wurde PrP^Sc in leicht niedriger Prozentzahl der Schafe (Tabelle 1) festgestellt. PrP^Sc wurde in solitären lymphartigen Follikeln oder Peyers Flecken des Ileums in 24 (89%) von 27 Schafen angetroffen, in welchen lymphartiges Gewebe in den Schnitten des Ileums anwesend war. In nur einem von 55 mit Scrapie betroffenen Schafen konnte PrP^Sc nicht in einem der lymphartigen Gewebe nachgewiesen werden.
Der Anteil der lymphartigen Follikel, die PrP^Sc enthielten, wurde für die Schnitte der Milz, der Mandel und der Lymphknoten geschätzt. In der Gaumenmandel von 98% der mit Scrapie betroffenen Schafe enthielten über 60% der lymphartigen Follikel PrP^Sc. Die Mandeln von 93% der Schafe mit Scrapie überstieg der Anteil der PrP^Sc positiven lymphartigen Follikel selbst 80%. In der Milz oder den Lymphknoten war die PrP^Sc-Akkumulation in mehr als 60% der lymphartigen Follikel nur in weniger als 30% der Schafe anwesend.
Immunohistochemische Feststellung von Prionprotein in lymphartigen Geweben von Schafen mit präklinischen Fällen von natürlicher Scrapie.
Material und Methoden
Schaf.
Wir wählten eine Gruppe von 10 vorsätzlich gezüchteten Lämmern, 6 davon gleicherbig (homozygous) für das PrP-Allel mit Valin (V) an Poosition 136 und Glutamin (Q) an Position 171. In verschiedenen Züchtungen oder Rassen ist dieses PrP^VQ-Allel signifikant assoziiert mit einer vergrößerten Empfänglichkeit für Scrapie (Belt et al., 1995). Die verbleibenden 4 Lämmer waren heteroerbig (heterozygous) und besaßen ein PrP^VQ-Allel und ein PrP^AR-Allel (Alanin an Position 136 und Arginin an Position 171). Das PrP^AR-Allel ist signifikant assoziiert mit vergrößertem Widerstand des Schafes gegenüber Scrapie. In einer Herde mit natürlichem Scrapie beobachteten wir, dass Schafe mit dem Genotyp PrP^VQ/VQ an Scrapie in einem Alter von ungefähr 25 Monaten starben und dass die Mehrzahl der Schafe mit dem Genotyp PrP^VQ/AR noch in einem Alter von 70 Monaten gesund waren. Da wir erwarteten, _dass _die PrP^VQ/VQ-Schafe höchst wahrscheinlich klinische Anzeichen der Scrapie innerhalb von ungefähr 25 Monaten nach der Geburt entwickeln würden und dass die PrP^VQ/AR-Schafe gesund bleiben würden, betrachteten wir diese beiden Gruppen von Schafen als ein geeignetes Modell zum Studium von Änderungen bei bekannten Stadien der Inkubationsperiode. Alle 10 Schafe wurden auf der gleichen Farm in einer Umgebung, in der Scrapie seit mehreren Jahren vorgekommen ist, geboren und aufgezogen. Sie wurden hier gehalten, bis sie 6 Monate alt waren, als sie zu unserem Institut in eine Koppel überführt wurden, wo verschiedene Scrapie-positive Tiere ihre letzten Tage verbracht hatten.
Probenahme und Testen von Mandeln vom lebenden Tier.
Tonsilbiopsien wurden unter genereller Anästhesie gesammelt, was durch eine intravenöse Anwendung einer Kombination von Ketalar (Ketamin-HCl) 4 mg/kg, Xylazine (Rompun) 0,05 mg/kg und Atropin 0,1 mg/kg erzielt wurde. Wir verwendeten einen Mundknebel, ein Lyryngoskop, eine Biopsiezange mit einem Kopf von ungefähr 4 mm im Durchmesser. Mandeln bei Schafen sind nicht so leicht zugänglich wie bei anderen Spezies, beispielsweise dem Menschen, wo sie oft in den Pharyngealraum hineinreichen. Beim Schaf sind sie verborgen und umgeben einen kleinen Hohlraum. Es zeigte sich jedoch, dass es genügt, eine Biopsie der Kante des Eingangs zu diesem Hohlraum zu nehmen, die Fossa tonsillaris, wobei genügend Material (Follikel!) gesammelt wird, um die Prüfung zu ermöglichen. Einige Erfahrung in der Technik wurde dadurch erhalten, dass, bevor die Tiere euthanasiert wurden, tonsillare Biopsien von 11 Schafen gesammelt wurden, darunter klinisch betroffene Scrapie-Schafe. Histologische Verfahren umfassten Immunofärbung mit spezifischen (Anti-PrP^Sc) Anti-Peptid-Sera, wie zuvor und in Van Keulen et al., 1995, beschrieben. Von den 11 Schafen erwiesen sich 8 als Scrapiepositiv, während 3 sich als negativ herausstellten, was histologisch und durch IHC des Hirngewebes nach der post mortem-Untersuchung bestätigt wurde. Die tonsillare Biopsie aller 8 positiven Tiere zeigte eine positive Immunofärbung bei IHC, während keine Immunofärbung in den drei negativen Fällen festgestellt werden konnte.
In dem aktuellen Experiment planten wir, tonsillare Biopsien aufeinander folgend bei regelmäßigen Intervallen und beginnend in einem Alter von 6 Monaten vorzunehmen. Aus logistischen Gründen wurde dies verzögert. Wir sammelten Biopsien von beiden Gruppen zum ersten Mal bei ungefähr 10 Monaten nach der Geburt, während keines der Schafe klinische Anzeichen der Scrapie zeigte. Die jüngsten Schafe waren 9% Monate alt, das älteste Schaf war 10 Monate und 1 Woche alt.
Ergebnisse.
Nach der IHC-Färbung fanden wir klare, bereits extensive PrP^SC-Färbung in den tonsillaren Biopsien aller 6 empfänglichen PrP^VQ/VQ-Schafe, während keine Immunofärbung in den tonsillaren Biopsien eines der widerstandsfähigen PrP^VQ/AR-Schafe festgestellt wurden. Wir haben so die Scrapie-assoziierte PrP^SC in Mandeln von 10 Monate alten Schafen nachgewiesen, was weniger als die Hälfte der Inkubationsperiode ist, in der die Entwicklung von Scrapie zu erwarten war, wenn Schafe ungefähr 25 Monate alt sind. Bei Schafen, bei denen die Entwicklung von Scrapie in einem viel späteren Stadium zu erwarten war oder die während ihrer gesamten Lebensdauer gesund bleiben, haben wir dieses PrP^SC-Protein nicht nachgewiesen. Wir schließen daraus, dass IHC-Färbung und ähnliche Verfahren die Möglichkeit für präklinische Diagnose bei Schaf-Scrapie sowie für andere SEs, wie BSE und CHD bieten.
Literaturverzeichnis

Belt, P. B. G. M., I. H. Muileman, B. E. C. Schreuder, J. Bos-de Ruijter, A. L. J. Gielkens und M. A. Smits. 1995. Identification of five allelic variants of the sheep PrP gene and their association with natural scrapie. J. Gen. Virol. 76: 509–517.
Fraser, H. und A. G. Dickinson. 1978. Studies of the lymphoreticular system in the pathogenesis of scrapie: the role of spleen and thymus. J. Corp. Pathol. 88: 563–573.
Hadlow, W. J., R. C. Kennedy und R. E. Race. 1982. Natural infection of Suffolk sheep with scrapie virus. J. Infect. Dis. 146: 657–664.
Hilmert, H. und H. Diringer. 1984. A rapid and efficient method to enrich SAF protein from scrapie brains of hamsters. Biosci. Rep. 4: 165–170.
Ikegami, Y., M. Ito, H. Isomura, E. Momotani, K. Sasaki, Y. Muramatsu, N. Ishiguro und M. Shinagawa. 1991. Pre-clinical and clinical diagnosis of scrapie by detecticn of PrP protein in tissues of sheep. Vet. Pec. 128: 271–275.
Mohri, S., C. F. Farquhar, R. A. Somerville, M. Jeffrey, J. Foster und J. Hope. 1992. Immunodetection of a disease specific PrP fraction in scrapie-affected sheep ard BSE-affected cattle. Vet. Rec. 131: 537–539.
Muramoto, T., T. Kitamoto, J. Tateishi, und I. Goto. 1993. Accumulation of abnormal prion protein in mice infected with Creutzfeldt-Jakob disease via intraperitoneal route: a sequential study. Am. J. Pathol. 143: 1470–1479.
van Keulen, L. J. M., B. E. C. Schreuder, R. H. Meloen, G. Mooij-Harkes, M. Poelen-van den Berg, M. E. W. Vromans, und J. Langeveld. 1995. Immunohistochemical detection and localization of prion protein in brain tissue of sheep with natural scrapie. Vet. Pathol. 32: 299–308.
Brown, P. Current opinion in Hematology 2, 472–477 (1995)
Brugère H., Banissi C., Brugère-Picoux J., Chatelain J. und Buvet R. Recherche d'un témoin biochimique urinaire de l'infection du mouton par la tremblante. Bull. acad. vet. de France 1991; 64: 139–45.
Diringer H., Gelderblom H., Hilmert H., Özel M., Edelblut C., und Kimberlin RH. Scrapie infectivity, fibrils and low molecular weight protein. Nature 1983; 306: 476–8.
Doi S., Ito M., Shinagawa M., Sato G., Isomura H. und Goto H. Western blot detection of scrapie-associated fibril protein in tissues outside the central nervous system from preclinical scrapie-infected mice. J. gen. Virol. 1988; 69: 955–60.
Fraser F. Bruce ME und McConnell T. Murine scravie strains, BSE models and genetics. In: Sub-Acute spongiform Encephalopathies. Procs of a Seminar in CEC Agricultural Research Programme, Brussels, 12–14 November 1990 (Bradley R., Savey M. und Marchant BA, eds.). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands 1991; 131–6.
Hadlow WJ, Kennedy RC und Race RE. Natural infection of Suffolk sheep with scrapie virus. J. Inf. Dis. 1982; 146: 657–64.
Hadlow WJ, Kennedy RC, Race RE und Eklund CM. Virologic and histologic findings in dairy goats affected with natural scrapie. Vet. Pathol. 1980; 17: 187–99.
Fraser H., McConnell I., Wells GAH und Dawson M. Transmission of bovine spongiform encephalopathy to mice. Vet. Rec. 1988; 123: 472.
Meiner Z., Halimi M., Polakiewicz RD, Prusiner SB and Gabizon R. Presence of prion protein in peropheral tissues of Libyan Jews with Creutzfeld-Jacob disease. Neurology 1992; 42, 1355–1360
Schreuder B. Animal spongiform encephalopathies – an update. Part 1. Scrapie and lesser known animal spongiform encephalopathies. Vet. Quart. 1994; 16, 174–181
Schreuder B. Animal spongiform encephalopathies – an update. Part 2. Bovine spongiform encephalopathy. Vet. Quart. 1994; 16, 182–192
Muramatsu Y., Onodera A., Horiuchi M., Ishigano N. and Shinagawa M. Detection of PrP^Sc in sheep at the preclinical stage of scrapie and its significance for diagnosis of insidious infection. Arch. Virol. 134; 427–432 (1993)

Claims

Verfahren zum immunologischen Nachweis von Prionenerkrankungen in einer präklinischen Phase, wobei Ausnahmeproteine in Geweben festgestellt werden, und das Verfahren bezüglich einer von einem lebenden Säuger erhaltenen Probe ausgeführt wird, und zwar unter Verwendung mindestens eines Antikörpers, der gegen eine Peptidsequenz von dem Protease K-resistenten Bereich des Ausnahmeproteins induziert wurde, wobei die Sequenz einen von fünf Bereichen des Ausnahmeproteins darstellt, und welches von einer artspezifischen Sequenz des Ausnahmeproteins ausgewählt ist, welches in dem Schafprotein der Aminosäureposition 94–105, 100–111, 126–143, 145–177 oder 223–234 entspricht, wie in 1 gezeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Prionenerkrankung die Scrapie des Schafes, BSE des Rindes oder Creutzfeld-Jacob-Erkrankung oder Kuru des Menschen betrifft.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Gewebe lymphartig ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das Gewebe von der Mandel stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, welches zwischen Ausnahmeprotein und normalem Protein unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem das normale Protein entfernt wird.
Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in der Diagnose der Prionenerkrankung oder in Programmen der Krankheitskontrolle oder in dem Nachweis von Ausnahmeproteinen in einem Produkt tierischen Ursprungs.