PT85116B - Processo de preparacao de lectina bacteriana, de composicoes para inoculacao e de conjunto para diagnostico e hospedeiro biologico - Google Patents

Description

Âmbito Técnico da Invenção

A presente invenção refere-se a uma lectina adequaaa para uso num inoculo ou numa vacina contra ITeisseria gonorrhoeae, a uma vacina contendo a lectina e a um processe para o diagnós tico da gonorreia. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a uma lectina de ITeisseria gonorrhoeae obtenível de gonococos, a um processo para isolar a lectina, a um inoculo e/ou a uma vacina preparada a partir dela, e a meios para produzir essa lectina.

Arte Anterior

A incidência anual de infecções por ITeisseria gonorrhoeae (N.g.) diagnosticadas, é estimada em cerca de aois milhões de casos. Uma infecção por gonococos no homem resulta geralmente numa infecção urogenital com relativamente poucas compli cações. A infecção disseminada por gonococos é referida como ocorrendo em 1 a 3% dos casos da gonorreia, mas a morbidade desta doença com a terapia corrente é muito baixa.

Por outro lado, em mulheres infectadas cora gonorreia, ocorre a salpingite em 10 a 20;.' aos casos e, mesmo quando adequadamente tratada, pode ter como resultado salpingite, recorrente gravidez ectópica e infertilidade. ITos Estados Unidos estima-se que todos os anos a salpingite conduz a 1,8 milhões de consultas a médicos privados e a 220 000 hospitalizações.

controlo da gonorreia por medidas de saúde pública tem sido até à data dificil. 'Tão foi eficaz uma vacina compos ta de gonococos globais mortos, Greenburg et al. Preliminary Studies on the Development of a Gonococcal Vaccine, Buli. Wld. Hlth. Org. 4^:531 (1971)·

Apareceram também estirpes de gonococos resistentes à penicilina e à tetracilina.

A infecção por gonococos envolve a colonização das membranas das mucosas pela bactéria, um processo mediado pela adesão da célula colonizante à membrana ue superfície. C> termo adesão descreve a ligação relativamente estável das bac66 374

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terias às superfícies. Qualquer estrutura responsável por essas actividades adesivas é designada por adesina.

pilus dos gonococos é uma adesina possuindo uma estru tura filamentosa de subunidades idênticas repetidas (pipilina) Na estirpe MS11 de N.g., cada pilina tem um peso molecular de aproximadamente 18 000 daltons. A ligação dos gonococos à superfície epitelial pode ser bloqueada por um anticorpo anti-pilus. Em adição à ligação de bloqueamento celular, os anticorpos criados contra a proteína do pilus são também opsónicos isto é, eles mediam a mostalidade das bactérias invasoras pelos fagócitos do sangue. Contuao, a utilização de imunogenes do pilus como vacinas têm sido tornada impraticável pela falta de reactividade sorológica cruzada dos pilus obtidos de diferentes estirpes de IT.g.

Verificou-se que os glicosfingolipidos da superfície de células eucarióticas, por exemplo lactcsilceramida, gangliotriosilceramida, e gangliotetraosilceramida, estão envolvidos no reconhecimento e adesão de N.g., e também que o reconheci mento dirigido por glicolípidos é mediado por uma lectina bac teriana até ao momento não referida, uma proteína bacteriana que possui a capacidade de reconhecer e de se ligar a sequências de sacáridos específicos (estruturas de carbo-hidratos). Esta lectina bacteriana, quando usada como constituinte de um inoculo de uma vacina, ou num ensaio de diagnóstico, nãc sofre das desvantagens mencionadas anteriormente para o imunoge ne do pilus.

Sumário da invenção

A presente invenção contempla uma lectina bacteriana isolada, designada por GCL-1. Esta lectina pode ser obtida de gonococos, liga-se a carbo-hidratos eucarióticos e tem um peso molecular relativo de cerca de 22 400 daltons. 0 valor do pH isoeléctrico para esta lectina está na gama de cerca de 6,1 xxEMXKXxàKxs^i a cerca de o,4. A lectina tem a capacidade de se ligar especificamente a gangliotetraosilceramida e é útil como constituinte de um inoculo ou de uma vacina contra

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a gonorreia. Esta lectina é também útil como meie de diagnóstico de gonorreia. Esta lectina pode ser utilizada na sua for ma isolada ou como um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Adicionalmente, a presente invenção contempla um inoculo e uma vacina constituídos pela lectina isolada mencionada acima ou por um seu sal farmaceuticamente aceitável e por um veículo farmaceuticamente aceitável. Contempla também um processo de imunização contra infecções por gonococos que consiste em administrar a um paciente a quantidade eficaz da lectina isolada ou do seu sal mencionado acima, num veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção contempla ainda um fragmento de ADI' isolaao coaificando a lectina GCL-1, o mesmo fragmento de ADN presente num hospedeiro biológico e uma cultura em que o hospedeiro biológico mencionado acima está presente juntamente com um meio de cultura adequado para a expressão do gene codificando GCL-1 presente num vector ue expressão e quando contida num meio de expressão adequado.

Breve Descrição dos Desenhos

Nos desenhos que formam parte do conteúdo desta invenção·.

a figura 1, é uma fotografia de um gel SDS-PAGE a 12% revelado com prata, com a posição das proteínas marcadoras de peso molecular e os seus pesos moleculares relativos em unidades de milhares de daltons representados à direita.

A faixa A contém proteína de pilina purificada possuindo um peso molecular relativo de cerca de 13 000 daltons.

A faixa B contém uma amostra das proteínas que permanecem após a lectina desta invenção (GCL-1) ter sido absorvida por afinidade a partir do extracto bruto de GCL-1 produzido no exemplo 1. Não se detecta GCL-1 a um nível dentro do limite do processo de deteção. Contudo, pode observar-se a proteína de pilina na posição de peso molecular de 18 000 daltons

A faixa C contém GCL-1 isolada por afinidade presente na posição de 22 400 daltons. Não está presente quantidade

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102.1 substancial de pilina ou de proteína associada com a pilina.

A faixa D contém c eluído de uma solução de extracto bru to de GCL-1 submetida a isolamento por afinidade com globósido como descrito no exemplo 1. Utilizou-se esta solução como controlo para detectar ligação não especifica à matriz de afinidade de glicolípidos. A ausência de uma quantidade significativa de GCL-1 nesta faixa indica que a ligação de GCL-1 à matriz de afinidade de gangliotetraosilceramida era uma interac ção específica de lectina -ligante.

A faixa Ξ contém as seguintes proteínas marcadoras de peso molecular: lactalbumina, 14; inibidor da tripsina de soja, 20; tripsinogénio, 24; anidrase carbónica, 29; gliceraldeí do-3-fosfato-desidrogenase, 3b; albumina do ovo, 4^5 ® albumina de bovino, 66, todas em unidades de milhares de daltons.

A figura 2 é uma fotografia de uma análise por './estern blot^H, de soluç-ões contendo GCL-1 utilizando anticorpos de coelho anti GCL-1 obtidos para terem afinidaae com GCL-1 isolado. À esquerda das manchas indicam-se posições previstas em milhares de daltons, das proteínas que possuem os pesos moleculares relativos indicados.

A faixa A contém uma amostra do extracto bruto de GCL-1 produzido no exemplo 1. GCL-1 é a banda principal de proteína que possui um peso molecular relativo de 22 400 daltons. Aparecem duas bandas mais pequenas de proteínas que se crê serem lectínas associadas a pilina na posição de 29 000 daltons e acima da posição de 36 000 daltons.

A faixa B contem uma amostra uo agregado contendo proteína de pilina obtido no exemplo 1. Quando está presente GCL-1 numa quantidade substancial, estão também presentes em quantidades substanciais outras pilinas e proteínas associadas à pilina.

A faixa C contém GCL-1 isolada por afinidade essencialmente livre de outras proteínas associadas à pilina.

A figura 3 é uma fotografia de um ensaio de Western blot que mostra que os anticorpos de coelho anti-GCL-l reagem cruzadamente com uma proteína produzida por íiorexella bovis possuindo o mesmo peso molecular relativo, que GCL-1 produzido

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por IT.g. (seta). A faixa A contém uni extracto bruto de GCL-1 preparado de acordo com o exemplo 1 a partir da estirpe MS11 de N.g. variante B2 não piliada. A faixa B contém um extracto preparado de modo semelhante a partir de iforexella bovis.

A figura 4 é um gráfico que ilustra a purificação do extracto bruto de GCL-1 do exemplo 1 por eluição de uma coluna de cromatofocalização mono P com a aplicação de um gradiente de pH. 0 eluente foi controlado em relação à proteína medindo a densidade óptica para uma adsorvância a 28o nanómetros (O.D. 28o) em fracções eluídas num gradiente de pH linearmente decrescente. As fracções do pico contendo GCL-1 eluíam-se da coluna de cromatofocalização numa gama de pH que varia ligeiramente acima de 6,1 a 6,4 e que está indicada pela seta.

A figura 5 é uma fotografia de uma análise de Western blot de soluções contendo GCL-1 utilizando anticorpos de coelho anti-GCL contra isolado de GCL-1 por cromatofocalização. À esquerda das manchas estão indicadas as posições previstas em milhares de daltons, das proteínas que têm os pesos moleculares relativos indicados.

A faixa A contém una amostra de uma cultura de Escherichla coli contendo o plasmideo pHSSõ descrito no exemplo 5 mas com falta de algumas inserções de ADN gonocócio. A amostra foi lisada no tampão amostra de SDS-PAGE, resolvido por electroforese e por Western blot corno se descreve no exemplo 5·

A faixa B contém uma amosura uo extracto bruto de GCL-1 produzido no exemplo 1 e analisado como descrito para a faixa A. GCL-1 corresponde à banda principal de proteína que possui um peso molecular relativo de cerca de 22 400 daltons.

A faixa C contém as seguintes proteínas marcadoras de peso molecular pré-revelado (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD); miosina, 200; fosforilase b, 97,4; albumina de soro de bovino, 68; albumina de ovo, 43; quimotripsinogénio, 25,7; ^-lactoglobulina, 18,4; e lisozima, 14,3, todas em unidades de milhares de daltons.

As faixas de D a 0 contêm amostras de culturas individuais ae E. coli contendo o plasmidio PHSS6 com ADIT gonocóci66 374

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co inserido, como descrito no exemplo >, que foram analisadas como descrito para a faixa A.

Descrição Detalhada da Invenção

Definições :

termo anticorpo nas suas várias formas gramaticais aqui utilizadas refere-se a uma imunoglobulina ou a qualquer seu fragmento contendo um centro de combinação de anticorpo biologicamente activo que se liga especificamente a um antígeno.

termo complexo como aqui utilizado refere-se ao produto obtido quando uma lectina se liga especificamente a um ligando.

termo imunorreagente aqui utilizado refere-se ao produto de uma reacção iraunoL-ógica, isto é, à entidade produzida quando se liga imunologicamente um antigeno por um anticorpo.

termo isolado utilizaao aqui relativamente a uma lectina refere-se à lectina que está essencialmente livre de outras proteínas gonocócitas. Quando se utiliza este termo em relação a preparações de anticorpos deste invento, este termo refere-se a anticorpos anti-GCL-1 que são essencialmente isentos de outros anticorpos de proteínas anti-gonocócicas.

termo ligante refere-se a uma molécula possuindo uma estrutura de carbo-hidrato que é especificamente ligada por lectina.

termo sal farmaceuticamente aceitável como utilizado aqui, refere-se a um sal não tóxico de metal alcalino, metal alcalino-terroso ou de amónio da lectina isolada. Esses sais são vulgarmente utilizados na indústria farmacêutica e incluem sais de sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio e amónio e produtos semelhantes, que são preparados por processos bem conhecidos da técnica, o termo também inclui sais não tóxicos de adição ae ácido que são geralmente preparados fazendo reagir a lectina desta invenção com um ácido orgânico

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ou inorgânico adequado. Os sais representativos incluem o cloridrato, brometo, sulfato, bissulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succ inato, tartarato e análogos.

A proteína gonolócica isolada ligante de carbo-hidrato ou lectina, contemplada pela presente invenção tem um peso molecular relativo de cerca de 22 400 daltons determinado por electroforese de uodecilsulfato de sódio gel de poliacrilamida (SD3-PAGE) usandoíX-lactalbumina, inibidor de tripsina de soja tripsinogénio, anidrase carbónica, gliceraldeido - 3 - fosfato -desidrogenase, albumina de ovo, e albumina de bovino como padrões de comparação dos pesos moleculares. Isto é, a mobilidade electroforética da presente lectina (GGL-1) está entre a do inibidor da tripsina de soja e a ao tripsinogénio. A técni ca e a fiabilidade da determinação ao peso molecular por 3D3-PAG3 são bem conhecidos da técnica. 7/eber et al., J.Biol. Chem. 244 : 4406-4412(1909), Zwaan» I., Anal. Biochem. 21 í 199-168 (1967).

Pode também caracterizar-se GCL-1 como tendo um valor de pH isoeléctrico de cerca de 6,1 a cerca de 6,4. 0 valor do pH isoeléctrico ou ponto isoeléctrico (pi) de uma proteína é 0 valor do pH do qual a proteína não tem carga eléctrica. Assim, no ponto isoeléctrico, a proteína não se move num campo eléctrico. Os métodos para determinar o valor do pH isoelétrico de uma proteína usando géis de poliacrilamida são bem conhecidos da técnica. Allen, R.G. e ilaurer, H.h., Electrophoresis and Isoelectric Foçusingin Polyacrilamiae Gel, ’.7alter de Gruyter, TTew York (1984); Arbuthnot, J.P. e Beeley, J. A., Isoelectric Foçusing, Buttervzorths, London (1979)«

A GGL-1 também se liga especifieamente a glicoesfingolípidos lactosilceramida, isoglobotriosilceramida, gangliotrio silceramida e gangliotetraosilceramida.

Os processos para determinar a capacidade de uma lectina para se ligar especifieamente a um ligando carbo-hidrato são bem conhecidos da técnica. Asses processos incluem estu66 374

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dos de inibição da ligação na aglutinação de glóbulos vennelfcs do sangue ou precipitação de polissacárido pela lectina envolvida. Pode também usar-se para este fim a cromatografia por afinidade utilizando lectina ou o ligando carbo-hidrato como absorvente de afinidade.

Tipicamente, mistura-se uma quantidade conhecida de GCL-1 com uma quantidade predeterminada de glicoesfingolípido. Mantém-se a mistura em conuições de ensaio biológico durante uru período de tempo, de minutos a horas, predeterminado como por exemplo cerca de 10 minutos a cerca de 1Ó-20 horas, isto é, durante um período de tempo suficiente para a GCL-1 formar um complexo com o ligando glicoesfingolípido.

As condições de ensaio biológico são aquelas que mantêm a actividade biológica da lectina isolada da invenção e dos seus ligandos alvo. Essas condições de ensaio incluem uma gama de temperaturas de cerca de 4°C a cerca de 45°C, uma gama de valores de pH de cerca de 5 a cerca de 9, θ uma força iónica variando desde a da água destilada até a de uma solução molar de cloreto de sódio. São bem conhecidos da técnica os pro cessos para optimizar essas condições.

A presença do complexo contendo GCL-1 que se forma é em seguida determinada, quer directamente quer indirectamente, por técnicas de ensaios bem conhecidas da técnica.

Os processos para a produção de glicoesfingolípidos a que se liga especificamente a GCL-1 são bem conhecidos da técnica. Ver, por exemplo, Hansson et al., FBB3 170:15-18 (1974); Breimer et al., J.Biochem, 90:589-609 (19'31); Karlsson e Larson, J. Biol.Ghem. 257:557-568 (1932); Breimer et al., Biomed.Mass. Spectrom. 6:231-241 (1979); Hanson et al., Biochem. Biophys. Acta 750:214 (19θ3)·

Outro aspecto da invenção refere-se a um processo de isolamento da GCL-1. Este processo compreende o fraccionamento de uma solução contendo esta lectina utilizando as suas propriedades acima descritas.

Especificamente, obtêm-se em primeiro lugar soluções contendo GCL-1 por extracção da proteína de superfície de K.g.

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com este fim, separa-se a proteína de superfície da E.g. tipicamente submetendo a um vcrtex a IT.g. numa solução tampão isoténica, não desnaturante. 3eparam-se da solução obtida por centrifugação as células residuais e detritos, 0 licor sobrenadante proauzido contém a proteína GCL-1, que é em seguida recuperada.

Podem em seguida utilizar-se os vários processos de filtração por gel, cromatografia ae gel, cromatofocalização, ultrafiltração, mobilidade electroforética, permuta iónica, e outros semelhantes, como por exemplo os conhecidos para o frac cicnamento de proteínas, para separar uma proteína com as caracteristicas acima descritas das outras proteínas presentes.

Por exemplo, é bem conhecido na técnica que os métouos de electroforese, em gel de poliacrilamida a duas dimensões (23PAGS), envolvendo duas técnicas diferentes de separação electroforética podem ser utilizadas para separar, com reprodutibilidade, proteínas de fontes biológicas complexas. Separam-se proteínas numa solução de acordo com os seus pontos isoeléctricos respectivos por focalização isoeléctrica (IEF) na primeira dimensão, e em seguida de acordo com o peso molecular por 3DS-PAGE na segunda dimensão. Dado que a resolução de proteínas se baseia em caracteristicas não relacionadas em cada dimensão, obtém-se uma distribuição essencialmente uniforme de manchas de proteínas discretas através de um gel a duas dimensões. A mancha discreta correspondente a uma proteína com o ponto isoeléctrico e peso molecular acima referidos e é isolada como lectina GCL-1 que, por sua vez, é recuperada em seguida do gel por técnicas convencionais.

Alternativamente pode separar-se a GCL-1 de outras proteínas presentes no licor sobrenadante acima mencionado por cromatofocalização em cromatografia líquida. Este processo separa proteínas de acordo com as diferenças nos seus pontos isoeléctricos. Em virtude do gradiente de pH que flui através da coluna, as proteínas são focalizadas e eluídas em ordem aos seus pontos isoeléctricos. As fracções correspondentes à gama de pontos isoeléctricos acima referidos são recolhidas e a GCL-1 é recuperada das fracções recolhidas por técnicas

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convencionais.

Pode também isolar-se a GCL-1 submetendo um liquido contendo esta proteína a um ou mais processos conhecidos para isolar uma proteína que possua a capacidade de se ligar especificamente a um ligando, como por exemplo a croriatografia por afinidade, adsorção por afinidade, e semelhantes. Quando se utiliza este processo alternativo de isolamento, mistura-se tipicamente um líquido contendo GCL-1 com um ligando fixado a uma matriz sólida como por exemplo ganglictetraosilceramida. Mantém-se a mistura obtida em condições de ensaio biológico durante um período ue tempo suficiente para a GCL-1 se ligar especificamente ao ligando na matriz sólida para formar um complexo de fase sólida. Separa-se em seguida a proteína não especificamente ligada do complexo de fase sólida por lavagem ou tratamento com um tampão. Em seguida, dissocia-se a GCL-1 do ligando fixado na fase sólida e elui-se para a forma isolada.

Em adição, podem utilizar-se processos imunoquimicos para isolar a GCL-1 de ur.i líquido contendo a lectina utilizando os anticorpos a seguir descritos. Esses processos, por exemplo imunoafinidade, imunoadsorção, e outros semelhantes, são efectuados de modo semelhante ao acima descrito para a purificação por afinidade com base em ligando glicolipídico.

Pode também produzir-se a GCL-1 na forma isolada utilizando técnicas de recombinação de ADI\ bem conhecidas. Resumidamente, isola-se ADM de IT.g. e fragmenta-se por corte ou por digestão por endonuclease de restrição. Inserem-se os fragmentos em vectores plasmídio como por exemplo pHSSó ou o vector fago lambda. Introduzem-se os vectores contendo inserções num hospedeiro compatível e faz-se nele a sua propagação. Os hospedeiros que contém um vector são em seguida clcnados e os clones são ensaiados para a determinação da presença de plasmidics contendo o gene da. GCL-1.

vector clonado contendo o gene da GC1-1 pode ser em seguida utilizado como vector qe expressão para expressar o produto do gene da GCL-1 directamente. Em alguns casos, é

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-12desejável manipular mais o gene da GCL-1 para acomodar a expressão num vector diferente cu num hospedeiro biológico diferente.

Isola-se em seguida o gene da GCL-1 dum plasmideo conten do o gene e recombina-se com as sequência de nucleõtiâos adequadas para formar um vector de expressão ue transcrição-tradução. Introduz-se em seguida o vector de expressão da GCL-1 num meio de expressão procariótica de transcrição-tradução/adequado como por exemplo um hospeoeiro bacteriano, meio de expressão eucariótico como/por exemplo um hospedeiro mamífero cu uma levedura por exemplo, células do ovário do hamster chinês (CHC)_7, ou um meio in vitro como o uescrito como pox’ exemplo por DeVries e Zubay, Proc. ITatl. Acad. Sei. USA 57 ^: 267 (1967)

Hum aspecto aaicional da presente invenção, utiliza-se a lectina da presente invenção cu um seu sal num diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável para formar um inoculo ou uma vacina que, quando administrada a um paciente numa quantidade eficaz, é susceptivel de induzir anticorpos que imunorreagem com GCL-1 à superfície de II.g., evitando assim, a adesão a uma membrana de superfície.

termo inoculo nas suas várias fornas gramaticais é aqui utilizado para descrever uma composição contendo uma lectina da presente invenção como ingrediente activo utilizado para a indução de anticorpos contra a GCL-1.

Pode usar-se o inoculo para se obterem anticorpos em mamíferos como por exemplo ratos, coelhos, cabras, cavalos e animais semelhantes, para uso em ensaies de diagnóstico que detectam células de II.g. expressando GCL-1. Pouem também usar-se os inóculos como vacinas contendo quantidades eficazes da lectina da presente invenção para proteger os indivíduos vacinados da infecção com gonococos e evitar assim uma infecção de gonorreia. Pode também ser dada uma injecção ou injecções de reforço se necessário.

termo vacina nas suas várias formas gramaticais é aqui utilizado em relação à protecção ue nm ser humano. C termo inoculo nas suas várias formas gramaticais aqui usa66 374

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das descreve também uma composição contendo a proteína da presente invenção como ingrediente activo utilizado para a criação de anticorpos que se ligam imunologicamente à GCL-1 gonococica. Uma vacina e um inoculo pouem assim conter ingredientes idênticos. Os usos finais contemplaaos são contudo, diferentes.

A quantidade eficaz de GCL-1 isolada por dose unitária depende, entre outras coisas, da espécie õo animal inoculado peso corporal do animal, e do regime ue inoculação escolhido como se sabe bem na técnica. Os inoculos contêm tipicamente concentrações de GCL-1 de cerca ue 1G microgramas a cerca de JOG miligramas por inoculação (dose), preferivelmente cerca de 100 microgramas a c-rca de 100 miligramas por inoculação.

g termo dose unitária refere-se ainda a unidades fisicamente discretas adequadas como aosagens unitárias para animais, contendo cada unidade uma quantidade pré-determinada de material activo calculada para produzir o efeito terapêutico pretendido em associação com o uiluente necessário, isto é o veículo ou transportador. As especificações para a nova do se unitária desta invenção são ditadas por e são dependentes directamente de (a) caracteristicas únicas do material activo e o efeito imunológico particular que se pretende conseguir, e (b) limitações inerentes na técnica da preparação de compostos desse material activo para uso imunológico em seres humanos, como se descreve com detalhe na especificação constituindo isto caracteristicas da presente invenção.

Os inóculos são tipicamente preparados a partir de lectina bacteriana isolada da presente invenção suspendendo a lectina num diluente fisiclcgicamente aceitável como por exem pio água, solução salina ou solução salina tamponada com fosfato (PB3). Podem também estar presentes os aditivos habitualmente usados em vacinas, ou inoculos se uesejado. Exemples desses aditivos são estabilizantes como por exemplo lactose ou sorhitol, e adjuvantes, como por exemplo hidróxido, sulfato ou fosfato de alumínio, um alúmen, ou um alginato. C fosfato de alumínio precipitado (AlPG^) é um adjuvante par66 374

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-14· ticularmente adequado para uma vacina, enquanto c adjuvante completo de Freund (CFA) e o adjuvante incompleto de Freund (IFA) são preferidos para uso em inoculos.

As vacinas e inoculos da presente invenção podem ser administrados por injecção, habitualmente intramuscular ou subcutânea, oralmente por meio de uma cápsula ou comprimido entérico, como supositório, como pulverização nasal, e por outras vias adequadas de administração.

Os anticorpos induzidos por (criados para) a lectina bacteriana da presente invenção numa forma isolada constituem ainda outra concretização da presente invenção. As preparações de anticorpos isolados da presente invenção exibem apenas essencialmente actividade anti-gonocócico contra GCL-1.

Criam-se em mamíferos corno por exemplo coelhos, cabras, cavalos e animais semelhantes por imunização, anticorpos contra GCL-1 na forma isolada, utilizando os inoculos atrás descritos. Podem também produzir-se preparações de anticorpos isolados por purificação por imunoafinidade utilizando a lectina bacteriana isolada da presente invenção por processos bem conhecidos da técnica.

Podem também obter-se preparações de anticorpos anti-GCL -1 isolados utilizando a tecnologia de hibridomas descrita por Niman et al., Proc. ITatl. Acad. Sei. USA 82; 7924-7928 (19θ5), aqui incorporada por referência na extensão conveniente.

Para se obter o hibridoma a partir do qual se produz 0 anticorpo monoclonal, funde-se o mieloma ou outra linha celular que se auto-perpetuam com linfócitos obtidos do baço de um mamífero hiperimunizado com GCL-1.

Prefere-se que a linha celular de mieloma seja da mesma especie dos linfócitos. Um rato da estirpe 129 G1X⁺ é o mamífero preferido. Cs mielomas do rate adequados para uso na presente invenção incluem as linhas celulares sensíveis à hipoxantina-aminopterina-timidina (ΠΑΤ) P3Zo3-Ag8.653 (ATCC CRL 15080), e Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1531).

Tipicamente fundem-se os esplenócitos com células de mieloma usando polietilenoglicol (PEG) 1500. Escolhem-se os hí66 374

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-15bridos fundidos pela sua sensibilioade a HAT. Identificaram-se os hibridomas que produzem os anticorpos da presente invenção usando o ensaio de imunoabservente ligado a enzima (ELISA) anti-GCL-1 aqui descrito.

Pooem obter-se anticorpos monoclonais não apenas de sobrenadantes de culturas de hibridoma, mas podem também obter-se de uma forma geralmente mais concentrada a partir de fluido ascítico de mamíferos em que se introduziu o hibridoma pretendido. A produção de anticorpos monoclonais utilizando o fluido ascítrico é bem conhecida da técnica e não necessita de ser tratada com maior detalhe.

A lectina bacteriana isolada da presente invenção é particularmente útil para determinar a presença e a quantidade de anticorpos anti-GCL-1 numa amostra corporal, como por exem pio sangue, soro ou plasma.

Numa concretização, a presente invenção contempla um processo para determinar a presença de anticorpos anti-GCL-1 numa amostra corporal compreendendo os seguintes passos:

(a) Parte-se de uma amostra corporal a ensaiar. Tipicamente essa amostra é obtida na forma de uma quantidade conhecida de sangue e mais preferivelmente de soro ou plasma. Os processos para se obter a amostra ue sangue, soro e plasma são bem conhecidos da técnica.

(b) A seguir, arranja-se uma quantidade pré-determinada da lectina bacteriana isolada da presente invenção.

(c) Em seguida mistura-se a amostra corporal com a lectina bacteriana isolada para se obter uma mistura de imunr reação.

(d) Mantém-se a mistura obtida em condições de ensaio biológico durante um período de tempo pré-determinado entre minutos e horas. E geralmente suficiente um período de tempo de cerca de 10 minutos a cerca de 16-20 horas para quaisquer anticorpos anti-GCL-1 presentes na amostra se ligarem imunologicamente à lectina para formarem um imunorreagente.

As condições de ensaio biológico para imunorreacções

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são semelhantes às descritas para os ensaios de ligação de lectina-ligando.

(e) Ensaia-se em seguida a mistura mantida nas condições de ensaio biológico para determinar a presença de qualquer imunorreagente que se tenha formado durante o período de manutenção acima mencionado. A presença de um imunorreagente é uma indicação de que estão presentes anticorpos antí-GCL-1 na amostra.

ensaio para a determinação da presença de imunorreagente contendo anticorpos anti-GCL-1, quer directamente quer indirectamente, pode ser conseguida por técnicas de ensaio bem conhecidas da técnica. Por exemplo, pode utilizar-se um sistema de ensaio homogéneo como os descritos nas patentes U.S. N^s 4 536 479; N^s 4 233 401: IT2 4 233 402 e NS 3 99b 34?.

Nas concretizações preferidas, determina-se a presença de anticorpos anti-GCL-1 ligando a lectina através dos seguintes passos:

(i) Combina-se uma amostra corporal com anticorpos marcados biologicamente activos que se ligam a qualquer imunoglobulina humana que possa estar presente na amostra corporal para formar um imunorreagente. Gs anticorpos marcados são susceptiveis de sinalisar a presença de anticorpos no imunorreagente.

(ii) Mantem-se a mistura de amostra do fluido do corpo/ /anticorpo marcado assim obtida em condições de ensaio biológico durante um período de tempo pré-determinado suficiente para que os anticorpos formem um imunorreagente com quaisquer anticorpos anti-GCL-1 presentes como primeiro imunorreagente. A imunorreacção pode ser conseguida de modo semelhante ao des crito no passo (d), acima.

Nos ensaios particularmente preferidos, a lectina da presente invenção e os anticorpos marcados estão assim imunologicamente ligauos a quaisquer -anticorpos anti-GCL-1 presentes na amostra de fluido corporal formando assim um imunorreagente de tipo sanduíche que contém uma ligação de marcação como fazendo parte dele. Isto é, forma-se um imunorreagente όό 374

EPG: 11-SCRF

102.1

-17de tipo sanduíche que contém um marcador quando uma molécula de anticorpo anti-GCL-1 imunorreage 1) como anticorpo com a lectina da presente invenção e 2) como antigénio com um anticorpo marcado. ITas concretizações preferidas, quaisquer anticorpos marcados que não façam parte do imunorreagente (isto é os que não se ligam imunologicamente a anticorpos anti-GGL-1) são separados do imunorreagente, preferivelmente por lavagem, antes de ensaiar para a determinação da presença do anticorpo marcado.

(iii) Faz-se em seguida ura ensaio para a presença do anticorpo marcado, ligado como parte do imunorreagente que con tém um anticorpo anti-GCL-1. Isto origina um ensaio para determinar a presença de anticorpos anti-GCL-1 na amostra corporal. Determina-se a quantidade cie anticorpo marcado, ligado como parte do imunorreagente e utiliza-se esta determinação para quantificar a quantidade de anticorpos anti-GGL-1 na amostra. Essa quantidade pode ser zero, obviamente, indicando assim que não estão presentes quaisquer anticorpos anti-GCL-1 na amostra, dentro dos limites de detecção. Gs processos para determinar a presença e quantidade de um segundo anticorpo marcado dependem do marcador usado, sendo esses marcadores um método de ensaio bem conhecido da técnica.

A marcação de anticorpos proteicos é também uma técnica bem conhecida. Por exemplo, podem marcar-se anticorpos produzidos por hibridomas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo isótopos como componente no meio de cultura de tecidos. Ver, por exemplo, Galfre, G. e Eilstein, G., Líeth. Enzlmol.73 '· 3-4ó (1931). São particularmente aplicáveis as técnicas de conjugação ou de acoplamento de proteínas através de grupos funcionais activados. Ver, por exemplo, Aurameas, et al., Scand. J. Immuol. 8 Suppl. 7 : 7-23 (1973) e Patente U. S. N² 4 493 795, sendo aqui ambas indicadas como referência Em adição, pode efectuar-se uma reacção de acoplamento, dirigida a centros de modo a que a marcação não interfira substan cialmente com a imunorreacção do segundo anticorpo com o seu antigénio alvo. Ver, por exemplo, Rodwell et al.,

Biotech.

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EPG: 11-3GRF

162.1

3:889-894 (1935).

meio de marcação pode ser um agente de marcação fluorescente que se liga quimicamente a anticorpos ou antigénios sem os desnaturar para formar um fluorocromo (corante) que é um traçador imunofluorescente útil. 03 agentes de marcação fluorescentes adequados são fluorocromos como por exemplo isocianato de fluorosceína (FIG), isotiocianato de fluorosceína (FITC), cloreto de 5”dimetilamina-l-naftalenossulfonilo (DAITS3) isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), lisamina, rodamina 3206 cloreto de sulfonilo (RB 2063C) e produtos semelhantes Encontra-se uma descrição das técnicas de análise por imunofluorescência em DeLuca, imunofluorescence Analysis, The Antibody as a Tool, líarchalonis et al., Eds., V.^Tiley -R Sons Ltd., New York. H.Y. (19θ2), (pp. 189-231) que aqui se incorpora como referência.

Nas concretizações preferidas o grupo indicador é uma enzima, como por exemplo peroxiuase de rábano (HRP), glicose oxidase, ou proautos semelhantes, guando o grupo indicador principal é uma enzima como por exemplo a peroxidase de rábano (HRP) ou glicose oxidase, são necessários reagentes adicionais para visualizar o facto de se ter formado um complexo de anti-corpo— ligando (imunorreagente). Esses reagentes adicio nais para HRP incluem peróxido de hidrogénio e um precursor de um corante de oxidação como por exemplo, diaminobenzidina. Um reagente adicional útil com a glicose oxidase é o ácido 2, 2‘-azino-d i-(3-et il-benzotiazolino-G-sulf6nico(ABT3).

Gomo agentes de marcação são também úteis elementos radioactivos.

Um agente radiomarcador típico é um elemento radioactivo que produz emissões de raios gama. Os elementos que emi4. . . . 124_T 125_T 128_T 131_ 132_T 51_r tem raios gama tais como I, ^yI, I, I, I e ' Cr representam uma classe de elementos radioactivos emissores de raios gama que indicam grupos. E particularmente preferido o

Um outro grupo dos grupos indicadores úteis é constituído pelos elementos como ^C, ^0 e que emitem eles próprios positrões. Os positrões assim emitidos produzem rata

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EPG: 11-SCRF

102.1

gama após choque com electrões presentes no corpo do animal.

111

Ê também útil um emissor beta como por exemplo índio.

Os processos e sistemas de ensaio da presente invenção podem utilizar anticorpos de lectina ue anti-lectina da presente invenção fixados numa matriz sólida para formar um supor te sólido.

Os anticorpos de lectina ou anti-lectina são tipicamente fixados na matriz sólida por adsorção de um meio aquoso embora se possam também utilizar pelos especialistas outros modos de adsorção bem como outros modos de fixação. São exemplos desses modos a reacçao de anticorpos de lectina ou anti-lectina com a funcionalidade carboxilo reactiva produzida pela reacçao do brometo de cianogénio com matrizes contendo glicose como por exemplo dextrose ou celulose recticulada. Discute-se a seguir o glutaraldeido como uma ligação em conjunção com partículas de látex e semelhantes.

Conhecem-se bem da técnica matrizes sólidas úteis. Esses materiais incluem o dextrano reticulado disponível sob a marca registade de SEPHADEX de Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, MJ; agarose; pérolas de poliestireno com cerca de 1 micron acerca de 5 ™ de diâmetro disponível de Abbott Laboratories de North Chicago; II; policloreto de vinilo, poliastireno, poliacrilamida recticulada, nitrocelulose, tecidos com base em nylon como por exemplo folhas, tiras ou almofadas: tu bos, placas ou cavidades de uma placa de microtitulação como por exemplo os produzidos de poliestireno ou poli(cloreto de vinilo) e semelhantes.

As partículas da látex úteis em ensaios do tipo aglutinação são também matrizes sólidas úteis. Esses materiais são comercialmente disponíveis de Japan Synthetic Rubber Company of Tokyo, Japão e são descritas como partículas com grupos funcionais carboxi dispersos num sabão aniónico. Lotes típicos dessas partículas têm um diâmetro médio de 0,308 microns e têm distribuição de grupos funcionais carboxi, média de cer ca de 15 a cerca de 30 Angstroms quadrados por grupo carboxi.

Antes do uso, fazem-se reagir as partículas com uma diamina como por exemplo l,3^_diamino-2-propanol para se obterem

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várias ligações amida com os grupos carboxi das partículas man tendo entretanto grupos amina livres. As aminas livres são em seguida feitas reagir com um dialdeido como por exemplo glutaraldeido e o anticorpo ou antigénio para formar produtos de reacção de base de Schiff. Os produtos de reacção de base de Schiff são em seguida reduzidos com um redutor solúvel em água como por exemplo boro-hidreto de sódio para produzirem um suporte sólido útil.

Os especialistas compreenderão que existem vários processos de imunoensaios de fase sólida que podem ser aqui utilizados. São exemplos de ensaios de fase sólida úteis técnicas de imunoensaio com enzimas multiplicadas (ElíIT) e ensaio de imuno fluorescência (FIA), em adição à ELISA especificamente discutida. Contudo, é adequado qualquer processo que resul te num sinal formado pela reacção de anticorpo anti-GCL-1 com a lectina da presente invenção. Cada um desses processos de ensaio pode utilizar técnicas de anticorpo simples ou duplos em que se utiliza um meio indicador para sinalisar a imunorreacção, e assim a ligação de um anticorpo que se pretende ensaiar com a lectina da presente invenção. Exemplos de técnicas podem encontrar-se detalhados em Ilaggio, Enzyme Immunoassay CRC Press Cleveland, OH (1931), e em Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, NY (1980).

Uma concretização de um processo especifico para ensaiar uma amostra de fluido corporal para a determinação de anticorpos anti-GCL-1 é um ELISA não competitivo em que se efectuam sequencialmente imunorreacções. Nesse ensaio, fixa-se uma alíquota da presente invenção, por exemplo, geralmente cerca de 1 a cerca de pg, nas paredes interiores de uma cavidade de microtitulação para se obter um suporte sólido.

Qualquer anticorpo anti-GCL-1 presente na amostra corporal ensaiada é em seguida feito imunorreagir com a lectina de fase sólida. Esta reacção é conseguida misturando uma alíquota, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 200 ml de amostra(que pode ser prediluída) como por exemplo soro de plasma na cavidade de microtitulação com a lectina fixada em fase sólida para formar uma mistura de fases sólida/líquida. LIantém-se a

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102.1

mistura durante um período tempo pre-determinado, suficiente para que qualquer anticorpo anti-GCL-1 presente na amostra se ligue imunologicamente às moléculas de lectina e forme um imunorreagente de fase sólida. Separam-se em seguida as fases sólida e liquida, e lava-se tipicamente a fase sólida para ajudar a assegurar a remoção de materiais não especificamente ligados.

Os anticorpos anti-GCL-1 presentes como imunorreagente de fase sólida (isto é, anti-GCL-1 ligados a lectina fixada em fase sólida) são em seguida feitos imunorreagir com segundos anticorpos marcados com enzima. Consegue-se isto misturando uma alíquota, por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 10 ug de segundos anticorpos marcados com enzima numa solução tampão aquosa, preferivelmente anticorpos de Ig anti-humano de cabra marcados com HRP, para se obter uma segunda mistura sólida/líquida. A segunda mistura é mantida como acima descrito forman do assim uma sanduíche imunoreagente de fase sólida consistindo de lectina, anticorpo anti-GCL-1 e anticorpos marcados com enzima.

Após seperação da fase líquida da fase sólida como acima descrito, mistura-se uma alíquota de substrato cromogenico tal como O-fenilenodiamina (OPD) na presença de peróxido de hidrogénio para HRP, na cavidade de microtitulação contendo imunorreagente de fase sólida para se obter uma terceira mistura sólida/líquida. Mantém-se essa mistura durante um período de tempo pré-determinado suficiente para que qualquer enzima presente como imunorreagente converta uma quantidade proporcional de substracto em produto. A densidade óptica da solução colorida resultante é em seguida medida e comparada com os resultados obtidos utilizando soluções contendo quantidades conhecidas de reagente.

Um sistema de diagnóstico, preferivelmente na forma de conjunto montável, útil para realizar os processos de anticorpo anti-GCL-1 da presente invenção inclui, em combinação mas em embalagens separadas (a) a lectina isolada da presente invenção e (b) um anticorpo marcado para sinalizar a imunorreacção de anticorpos anti-GCL-1 com a lectina. De preferência o

tá 374

EPG. 11-SCRF

102,1

-22anticorpo marcado é um anticorpo completo ligado a uma enzima.

lias concretizações preferidas o sistema inclui ainda uma matriz sólida a que se pode fixar a lectina para se obter um suporte sólido. As matrizes sólidas úteis já foram descrite.s De preferência, contudo, a matriz sólida é a cavidade de uma placa de microtitulação.

ITuma concretização ainda preferida o sistema também inclui anticorpos criados para a lectina da presente invenção como controlo positivo.

Fornecem-se quantidades conhecidas da lectina e de anticorpos marcado s · Ξ ssas quantidades são pelo menos suficientes para efectuar um ensaio, Os anticorpos marcados e a lectina são tipicamente fornecidos numa forma e quantidade que foi concenbida para ser diluída para o volume predeterminado com água, solução salina ou um tampão como por exemplo os conhecidos da técnica.

Podem também incluir-se no sistema embalagens adicionais Essas embalagens podem conter (1) saís tampão em forma seca ou líquida, (ii) substratos de enzima como por exemplo o-fenilenodiamina e produtos semelhantes.

Também se contempla aqui um processo de ensaio para a determinação da presença de GCL-1 numa amostra corporal. Em geral, parte-se duma amostra corporal como por exemplo um esI fregaço cervical ou urogenital a ensaiar, e mistura com anticorpos que contêm um centro de combinação com anticorpos induzido pela lectina da presente invenção. Mantém-se a mistura em condições de ensaio biológico durante um período de tem po predeterminado suficiente para que as moléculas de anticor po imunorrsajam com GCL-1 presente na amostra corporal. Iiede-se em seguida a quantidade dessa imunorreacção para determinar se estavam presentes ou ausentes moléculas de GCL-1 nas amostras corporais ensaiadas.

Um exemplo dessa concretização é um ensaio imunofluores cente em que um esfregaço cervical ou urogenital é fixado em acetona numa placa de microscópio simples. Incuba-se nas placas, utilizando técnicas bem conhecidas, uma alíquota de anticorpos criados de acordo com a presente invenção, por

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EPG: 11-SCRF

102.1

exemplo, criados em coelhos, geralmente com cerca de 10 microgramas a cerca de ^GOG microgramas.

Após remoção por lavagem de quaisquer anticorpos não-imunorreagidos e com centros de ligação não-específicos de bloqueamento na placa com uma proteína como por exemplo B3A, pode-se incubar depois um segundo anticorpo, como por exemplo o anticorpo de coelho anti-cabra na placa de ensaio, se desejado. Marca-se o segundo anticorpo ligando a um corante de fluorocromo por exemplo isotiocianato de fluoresceína (FITC).

Após esta segunda incubação, lava-se qualquer excesso do segundo anticorpo deixando quaisquer anticorpos de coelho anti-cabra marcados com FITC que se ligam aos primeiros anticorpos na placa de ensaio. A presença de anticorpos marcados com FITC pode ser detectada utilizando microscopia de fluorescência e sinalisar assim a presença de uma infecçao por N.gonorrhoeae.

G meio indicador é embalado separadamente dos anticorpos quando não está directamente ligado a anticorpos da presente invenção. Quando misturados com uma amostra corporal como por exemplo esfregaço cervical ou urogenital fixado em acetona, os anticorpos imunorreagem com a GCL-1 para formarem um imunorrea gente, e o meio indicador presente sinaliza em seguida a formação do produto da imunorreacção.

A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos.

EXEMPLO 1 : Produção e Isolamento da GCL-l

Fez-se o crescimento de variantes transparentes pilíadas e não-piliadas da estirpe MS11 da IT.g. bem como da estirpe C9 da N.g. em placas GCB (29 g de meio base GC, Difco, Ig de Bacto-agar, Difco, 8 ml de suplemento A (400 g de glicose, 10 g de L-glutamina, 20 mg de cocarboxilase/1) e 0,8 ml de suplemento B (1,25' g de Fe(N0g)g/2^0 ml por 800 ml de volume total). Distinguiram-se os fenótipos de piliação e transportes pelo sistema descrito por James et al., Infect. Immun 19í : 332-340 (1973) e Swanson, J., Infect. Immun. 19 : 320-331

66.374

EPGí 11-SCRF

102.1 (1978).

Semearam-se as placas e incubaram-se durante 18 horas numa atmosfera com 57 de COg a 35°C. Recolheram-se os produtos bacterianos obtidos misturando em primeiro lugar com 1,25 ml de tampão tris 5θ mH. /“tris (hidroximetil)aminometano, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO (pH 9,5)_7eni cada placa. Libertaram- se as células nos centros colhidos e transferiram-se para tubos de centrifugação de policarbonato de 5θ ml utilizando uma pipeta de Pasteur e armazenaram-se a 0°C.

Posteriormente, submeteram-se as células armazenadas a vórtex durante 3 minutos para cortar as proteínas de superfície bacterianas. Centrifugou-se em seguida a suspensão resultante durante 20 minutos a 4°C a 10 000 rpm num rotor Beckman JA-20 para se obter um agregado contendo proteína pilina e um sobrenadante contendo GCL-1. Reteve-se o sobrenadante e dialisou-se contra ura tampão de Pili (tris, 150 mlí, NaCl 150 mH, pH 7,5) durante 24 horas a 4°C usando membrana de corte de diálise peso molecular de 6000 a 8000 (Sectropor, Fischer Scientific Co., Springfield, NJ) de modo a efectuar a agregação e precipitação de proteínas. As proteínas precipitadas foram recolhidas na forma de um agregado após centrifugação como previamente descrito. Ressuspendeu-se o agregado em 10 ml de tris 50 mM (pH 9,5) obtendo-se assim um extracto bruto de GCL-1. Armazenou-se o extrato bruto a -20°C.

Preparou-se um absorvente de afinidade para purificar GCL-1 fixando gangliotetraosilceramida a uma matriz sólida. A cada cavidade de uma placa de microtitulação de policloreto de vinilo com 96 cavidades adicionaram-se 5θ microlitros de metanol contendo 200 nanogramas de gangliotetraosilceramida (3upelco,'Inc., Bellefonte, PA). Deixou-se em seguida avaporar o metanol deixando um depósito de gangliotetraosilceramida em cada cavidade. Desbloquearam-se os centros de ligação não especifica nas cavidades adicionando a cada cavidade 5θ microlitros de PB3 contendo 2 7 de albumina de soro de bovino (33A), mantendo as misturas assim obtidas durante 4 horas à temperatura ambiente e removendo em seguida o excesso de solução bloqueante invertendo as cavidades e agitando.

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EPG: 11-SCRF

102.1

Isolou-se GCL-1 por adsorção por afinidade a partir do extracto bruto acima obtido introduzindo em primeiro lugar 50 microlitros de extracto bruto nas cavidades de microtitulação possuindo neles fixada gangliotetraosilceramida. Mantiveram-se as preparações resultantes durante cerca de 8 horas, permitindo assim que a GCL-1 presente no estado bruto se ligasse à gangliotetraosilceramida. Removeram-se posteriormente as proteínas não ligadas invertendo as cavidades e agitando. Lavaram-se em seguida as cavidades 5 vezes com alíquotas de 50 microlitros de PBS.

Eluíu-se a GCL-1 especificamente ligada adicionando 5θ microlitros de PBS contendo 2% de dodecil sulfato de sódio (SDS) a cada cavidade. Mantiveram-se as preparações obtidas desta maneira durante 30 minutos à temperatura ambiente, permitindo assim a ressolvatação da GCL-1 presente. Removeu-se das cavidades a solução contendo GCL-1 e armazenou-se a-20°C. Obteve-se assim aproximadamente um micrograma de GCL-1 isolada por afinidade a partir de cada cavidade de microtitulação.

Em adição, isolou-se também GCL-1 a partir do extracto bruto acima obtido por cromatofocalização de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC). Dialisou-se em primeiro lugar os extractos brutos de GCL-1 obtidos a partir de E.g. não piliada estirpe MS11 variante B2 contra um tampão de equilíbrio FPLC amidizole 25 mM, pll 7,4) durante 24 horas a 4°C, usando a membrana de diálise acima referida de modo a preparar o extracto de GCL-1 para cromatofocalização. Aplicou-se em seguida o extracto de GCL-1 dialisado a uma coluna de cromatofocalização Mono P (Sistema FPLC, Pharmacia Inc., Piscataway, MJ) pré-equilibrada com tampão de equilíbrio FPLC e eluíu-se com Polybuffer 74 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) diluindo 1:8 com água esterilizada e ajustando a pH 4,0.

perfil de eluição de um lote típico de extracto de GOL -1 bruto nessa coluna de cromatofocalização é apresentado na FIGURA 4. Controlaram-se as fracções de eluição para a determinação da presença de proteína medindo a densidade óptica do eluente a 28o nm (0. D. 280) e mediu-se o seu pH. As fracções

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102.1

contendo a proteína eluída a um pH de cerca de 6,1 a 6,4 foram recuperadas e armazenadas a -20°C.

EXEMPLO 2 : Determinação do Peso Molecular da

Lectina Bacteriana Isolada por 3DS-PAGE

Determinou-se o peso molecular relativo da lectina bacteriana purificada produzida no exemplo 1 por SDS-PAGE de acor do com o processo de Laemmli, U.K., Nature 227'· 680.684 (1970)· Para este fim , vasaram-se géis de poliacrilamida a 12$ e a 15$ e processaram-se com aproximadamente 25 a 200 microgramas de proteína total por cada faixa. As proteínas marcadoras de peso molecular seguintes e os seus pesos moleculares aproximados em daltons (d) foram processados numa faixa de controlo ou padrão -lactalbumina, 14 200; inibidor da tripsina de soja

100; tripsinogéneo, 24 000; anidrase carbónica, 29 000; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase 36 000; albumina do ovo, 45 000, e albumina bovina 66 000, todos obtidos de Sigma Chemical Corp., St. Louis, M0.

Após electroforese, revelaram-se as bandas das proteínas com azul brilhante de coomassie (Sigma) ou pela técnica de revelação com prata de Merril et al., Anal. Biochem 105:361 (19θ0) utilizando revelador de prata obtido de Bio-Rad, Richmond, CA.

A análise dos géis revelou uma banda principal na faixa da amostra possuindo uma mobilidade electroforética relativa superior ao tripsinogénio mas inferior ao inibidor de tripsina de soja e um peso molecular relativo de cerca de 22 400 daltons. Esta banda, como se mostra na FIGURA 1, é a lectina bacteriana purificada por afinidade GCL-1.

Em alguns casos, as bandas de proteínas antes da revelação foram fixados electroforeticamente a nitrocelulose (Schleicher & Schuell, Keene, NH, N^s de Catálogo BA 85) para formar manchas de Western como descrito em Tcrcbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:4350-4354 (1979). Detectou-se a proteína GCL-1 fixada a nitrocelulose fazendo em primeiro lugar a imunorreacção das manchas com anticorpos anti-GCL-1 do coelho preparados

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102.1

imunizando coelhos com o extrato bruto de GCL-1 descrito no Exemplo 1. Fizeram-se em seguida imunorreagir os anticorpos anti-GCL-1 de coelho imunologicament© ligados a GCL-1 fixada em nitrocelulose com Ig anti-coelho de cabra marcada com fosfatase alcalina. A presença da marca e portanto a presença da GCL-1, foi visualizada utilizando o sistema immunoblotting de ProtoBlot de Promega Biotech, Madison, WI (1T^S de Catálogo P393O).

Apresentam-se na FIGURA 2 manchas de Western dos produtos obtidos das várias fases ae isolamento do procedimento de afinidade descrito no Exemplo 1. A análise dessas manchas revela que a GCL-1 isolada por afinidade é essencialmente livre de ou tras proteínas associadas com a pilina de gonococos.

Apresenta-se na figura 3 uma mancha de Western de um extracto de proteína bruto de Morexella bovis preparado de modo semelhante ao do extracto bruto de H.g. descrito no exemplo 1. A análise dessa mancha revela que a Morexella bovis produz uma proteína que imunorreage com anticorpos anti-GCL-1 e tem um peso molecular relativo aparente de cerca de 22 400 daltons.

EXEMPLO 3 í Isolamento e caracterização por 2D-PAGE

Isolou-se adicionalmente extracto de proteína de superfície bacteriana purificado por não-afinidade contendo GCL-1 produzido no exemplo 1 e caracterizou-se por 2D-PAGE usando um System 2-D, sistema de gel bidimensional de Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, C.A.. Prepararam-se géis de focalização isoeléctrica (IFE) compreendidos por 6,5% de poliacrilamida e dois conjuntos de anfólitos (LKB Instruments, Inc., Gaithersburg, MD), um conjunto susceptível de produzir um gradiente no valor de pH ãe 3 a 10 e outro susceptível de produzir um gradiente no valor de pH de 4 a 6,5 em tubos de vidro limpos com ácido de 130 x 3 mm» Os geis foram cobertos com uma solução contendo GCL-1 possuindo aproximadamente 25 microgramas de proteína ou com uma solução de controlo contendo as proteínas marcadoras de peso molecular descritas no exemplo 2. Depositou-se em seguida sobre os geis uma solução de cobertura de amostra /ureia 9 M 2% de cada um dos acima

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EPG: 11-3CRF

102.1

descritos anfólitos, e 10% de polietileno (9) octil feniléter (Nonidet P4O)J7. Submeteram-se em seguida as proteínas a elec troforese a uma tensão constante de 400 volt durante 12 horas e 800 volt constantes durante 1 hora.

Removeram-se os geis focalizados dos tubos e lavaram-se duas vezes durante 3° minutos com tratamento de tampão (O,Oó25 M de tris HC1, pH 6,8; 2% de 3DS; 10% de glicerol; $$ de 2-mer captoetanol), obtendo-se assim géis IEF contendo proteínas separadas de acordo com o seu valor isoeléctrico de pH.

Separaram-se em seguida as proteínas focalizadas isoelec tricamente de acordo com os seus pesos moleculares relativos por SD3-PAGE. Fixaram-se os geis IEF na parte superior dos géis a 15% de SDS-PAGE, e processaram-se a 30 miliamperes a uma corrente constante usando 0,1% de fenol vermelho como indicador. Quando o indicador atingiu a parte inferior do gel, terminou a electroforese. Os géis foram em seguida revelados com azul brilhante de coomassie ou revelados com prata como descrito no exemplo 2 ou transferiram-se as proteínas dos geis para nitrocelulose como descrito em Towbin et al.; supra

A análise dos géis revelou uma única mancha de proteína correspondendo a uma proteína possuindo um peso molecular relativo de cerca de 22 400 daltons, isto é o peso molecular relativo da GCL-1. 0 valor de pH isoeléctrico desta proteína de 22 400 daltons é de cerca de 6,1 a cerca de 6,4.

Exemplo 4 : Preparação de

Gangliotetraosilceramida

Pura do Intestino Delgado do Rato

Para a preparação de gangliotetraosilceraniida pura a partir do intestino delgado do rato conduziu-se da forma seguinte uma série de extracções e separações cromatográficas. Os solventes usados foram secos e redistilados antes do uso.

Extracção

Remove-se cirurgicamente o intestino delgado de um rato corta-se em bocados e liofiliza-se até à secura. Submetem-se

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EPG: 11-SCRF

102.1

em seguida cerca de 130 gramas do material liofilizado a extrac ção em 2 passos utilizando um aparelho de Soxhlet que é bem co nhecido da técnica. Em primeiro lugar, misturam-se cerca de 1000 ml de clorofórmio/metanol (2:1, em volume) com o material liofilizado num balão de 2000 ml e aquece-se durante cerca de 24 horas a 70°C num dispositivo de aquecimento eléctrico isolado com amianto. Após decantar o solvente, efectua-se de modo semelhante uma segunda extracção do material usando IJjOO ml de clorofórmio/metanol (1:9, em volume) e decanta-se o solvente e adiciona-se à primeira porção. Em seguida evaporam-se até secura os extractos de solventes combinados numa corrente de azoto.

Degradação alcalina

Degrada-se com uma substância alcalina o extracto intestinal seco dissolvendo o extracto em ml de K0H ϋ,2 M em metanol e mantém-se o extracto dissolvido durante 3 horas à temperatura ambiente numa garrafa de vidro contendo 9 pérolas de vidro que dispersam o extracto seco após agitação ocasional. Em seguida neutraliza-se a mistura obtida com 10 ml de ácido acético glacial, mistura-se com 1000 ml de clorofórmio/ /água (3:2, em volume), e dialisa-se durante 4 dias contra água potável corrente. Evapora-se em seguida o extracto alcalino degradado a 70°C, misturando em primeiro lugar com cer ca de £00 ml de tolueno e em seguida secando a mistura obtida usando um roto-evaporador. Redissolve-se em seguida a amostra seca em cerca de $00 ml de clorofórmio/metanol (2:1, em volume) e filtra-se para remover o material insolúvel. Lava-se o dispositivo de filtração para recolher o extracto residual com cerca de 500 ml de metanol. Combinam-se em seguida os filtrados, evaporam-se sob uma corrente de azoto e redissolvem-se em cerca de 5θ ml de clorofórmio.

Cromatografia com Acido Silícico

Cromotografa-se em seguida o extracto intestinal degradado com substância alcalina em colunas de ácido silícico

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EPG; 11-SCRF

102.1

-30para remover o coles temi e ésteres metílicos de ácidos gordos de glicolípidos e fosfolípidos estáveis em substâncias alcalinas.

Peneira-se o ácido silícico (Malinckrodt Chem. Works, St Louis, MO) de qualidade reagente com 100 malhas em três tamanhos de partículas : inferior a cerca de 44 jmn, cerca de 4474 jim, e acima cerca de 74jum. Lava-se a fracção inferior a cerca de 44 pm suspendendo em metanol (1 kg em 3 litros) seguido de aspiração da camada de metanol passados 30 minutos, para remover pequenas partículas que podiam passar através dos ! filtros de vidro sinterizado na parte do fundo das colunas usadas nos procedimentos que se seguem.

Colocam-se partículas de ácido silícico fraccionadas para um tamanho de cerca de 44 a cerca de 74 um numa coluna de 5o gramas usando clorofórmio, e carrega-se a coluna com extracto degradado, alcalino previamente redissolvido em clorofórmio. Adicionam-se 500 ml de clorofórmio seguido por 500 ml de clorofórmio/metanol (98- 2, em volume), à coluna e deixa-se atravessá-la. Em seguida adicionam-se 500 ml de clorofórmio/metanol (1:3, em volume) seguidos de 5θ0 ml de metanol e recolhe-se o eluente destas duas adições, combinam-se os eluentes e evaporam-se as suas porções líquidas numa corrente de azoto para se obter um extracto seco.

I

Cromatografia de Permuta Iónica

Redissolve-se o extracto seco da coluna de ácido silícico em cerca de 10 ml de clorofórmio/metanol (2:1, em volume) e carrega-se numa coluna de 20 gramas de celulose DEAE (DE - 23, Whatman Inc., Clifton, 1TJ) embalados na forma de acetato utilizando clorofórimo/metanol (2:1, em volume). Passados cerca de 1 a 2 dias, tempo de equilíbrio^na coluna à temperatura ambiente, elui-se a amostra com 400 ml de cloróformio/ /metanol (2:1, em volume) seguido de 400 ml de metanol. Combinam-se os dois eluentes e evapora-se a sua parte líquida numa corrente de azoto para se obter um extracto seco.

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EPGí 11-SCRF

102.1

Acetilação

Efectua-se a acetilação dissolvendo o extracto eluído numa coluna de DEAE e seco em 10 ml de cloroformio, misturando com ele piridina e anidrido acético, 10 ml de cada e mantem-se a mistura no escuro à temperatura ambiente durante cerca de 12 a 18 horas. Após a reacção de acetilação, misturam-se metanol e tolueno 25 ml de cada e evapora-se a amostra em primeiro lugar numa corrente de azoto mantendo a temperatura a cerca de 60°C. seguido de evaporação à secura utilizando um roto-evaporador para se obter um extracto intestinal acetilado.

Cromatografia em Ácido Silícico do Extracto Acetilado

Redissolve-se o extracto intestinal acetilado em cerca de 50 ml de cloroformio e carrega-se numa coluna contendo 5θ gramas de partículas de ácido silícico fraccionadas para um tamanho inferior a cerca de 44 pm e acondicionada em clorofórmio/metanol (98: 2, em volume). Adicionam-se 500 ml de clorofórmio/metanol (95í 5, ^eK1 volume) seguido de 500 ml de clorofórmio/metanol (90: 10, era volume) à coluna e recolhem-se e combinam-se os eluentes, a sua porção líquida é evaporada sob uma corrente de azoto para se obter um extracto acetilado seco.

Desacetilação

Redissolve-se em seguida o extracto acetilado e cromatografado com ácido silícico em cerca de 20 ml de tolueno/metanol/K0HC,2M em metanol (1:1:2, respectivamente, em volume) e mantém-se com agitação ocasional durante 30 minutos à temperatura ambiente para se dar a desacetilação. Após o período reaccional, misturam-se 2 ml de ácido acético glacial e transfere-se a mistura resultante para 8o ml de cloroformio/ /água (1:1, em volume) e dialisa-se durante 4 dias contra água potável corrente. Evapora-se em seguida o extracto desacetilado a 70°C misturando em primeiro lugar cerca de 100 ml de tolueno e secando em seguida a mistura utilizando um rotoevaporador para se obter um extracto seco desacetilado.

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EPG: 11-SCRF X

102.1 ^-£5—,

-32Cromatografia Através de uma Coluna de Celulose DEAE

Redissolve-se o extracto seco aesacetilado em cerca de 10 ml de clorofórmio/metanol (2:1, em volume) e carrega-se numa coluna de 10 gramas celulose DEAE e deixa-se equilibrar como atrás descrito. Adicionam-se em seguida 250 ml de clorofórmio/metanol (2:1, em volume) à coluna seguidos de 2J?0 ml de metanol. Combinam-se os eluentes resultantes e evaporam-se as suas porções líquidas numa corrente de azoto para se obter um resíduo contendo glicolípido.

Cromatografia com Ácido Silícico

Redissolve-se uma alíquota do resíduo acima obtido em 500 ml de clorofórmio/metanol (98:2, em volume) e carrega-se numa coluna de 25 gramas de ácido silícico com tamanho de partícula inferior a cerca de 44 jim que está condicionada no mesmo solvente. Adicionam-se 500 ml de clorofórmio/metanol (98: :2, em volume) à coluna e deixa-se atravessá-la. Em seguida adicionam-se à coluna 2$0 ml de clorofórmio/metanol (1:3, em volume) seguidos de 2$0 ml de metanol e recolhem-se os eluentes destas duas adições, combinam-se e a sua parte líquida é evaporada numa corrente de azoto. 0 material seco resultante é gangliotetraosilceramida substancialmente pura /Hansson et al., FEBS Letters, 139; 291 (1982)_7.

EXEMPLO 5í Produção de GCL-1 Isolada por Clonação do Gene Codiuifiçando a GCL-1 e Expressão em Vectores de DNA Recombinantes gene codificando a GCL-1 contida no ADN de gonococos da variante B2 não piliada da estirpe MS11 de N.g. foi clonada e manipulada em um vector de expressão utilizando procedimentos que são bem conhecidos da técnica e que são descritos com maior detalhe em Maniatis et al., Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories (1982).

Com esse objectivo, isolou-se o ADN da variante de N.g. acima referida, digeriu-se por restrição com a enzima Mbol numa extensão parcial e inseriu-se no centro de restrição

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EPG: 11-SCRF

102.1

-33BamHI do vector de clonação pHSSó descrito pot Seifert et al., Proc. ITatl. Acad Sei. USA 83: 735 (1986). Propagaram-se os pias mídeos recombinantes resultantes em E. coli estirpe HB101 (Bethesda Research Laboratories, Gaithersberg, I4D) como hospedeiro biológico. Escrutinaram-se o conjunto das diferentes E.coli contendo plasmidios como biblioteca para as bactérias que continham um plasmideo com o gene de GCL-1 nelas inserido.

Para identificar as bactérias que contêm um plasmídio com o gene GCL-1 nelas inserido, foi efectuado o ensaio de escrutínio aproveitando a capacidade do produto do gene da GCL-1 para se expressar na E.coli utilizando o próprio promotor de ocorrência natural do gene da GCL-1 para a expressão, Detectou-se a GCL-1 expressa nas colónias de bactérias contendo plasmídios com o gene da GCL-1 por imunoescrutínio da biblioteca de colónias bacterianas utilizando anti-soro criado em coelhos em relação a GCL-1 isolados por cromatofocalização como descrito no EXEMPLO 1.

Para a produção deste anti-soro, inocularam-se cerca de 1C a 20 microgramas de GCL-1 isolada subcutâneamente na pescoço de um coelho. A primeira inoculação foi efectuada com o adjuvante completo de Freund, seguido duas vezes em intervalos de duas semanas com uma inoculação semelhante de adjuvante incompleto de Freund. Identificou-se o anti-soro reagente positivo pela sua capacidade de reconhecer a GCL-1 em extractos brutos em manchas de Western como descrito no EXEMPLO 2.

procedimento de imunoescrutínio para identificar as bactérias E.coli na biblioteca que expressam GCL-1 foi efectua do de acordo com o procedimento de Helfman et al., Focus 6:1-5 (1984), que é aqui incorporado como referência, com poucas excepções referidas a seguir. As excepções foram: substituição por leite seco não gordo em vez de albumina de soro de bovino (BSA) como agente bloqueante como uescrito por Johnson et al., Gene Anal. Techn. 1:3-8 (1984), também aqúi incorporado por referência, e substituição com imunoglobulina anti-coelho de cabra marcada com fosfatase alcalina em vez do segundo anticorpo marcado com 1251 como meio indicador. A presença do marcador, e portanto a presença do GCL-1, foi visualizada utili66 374

EPG: 11-SCRF

102.1

-34zando Protoblot Imnunoblotting System da Promega Biotech, Madison, WI IT^S de Catálogo P393O)·

Recuperaram-se independentemente colónias individuais bac . terianas com reacção positiva contendo GCL-1 determinado pelo procedimento de imunoescrutínio acima mencionado, e purificaram-se em colónias pelo menos uma vez paraassegurar homogeneidade. Analisou-se em seguida adicionalmente cada isolado para a expressão de GCL-1 por manchas de Western como descrito no Exemplo 1. Com esse objectivo, lisaram-se directamente mini-culturas de isolados bacterianos individuais num tampão amostra SDS-PAGE e resolveram-se em manchas de Western que foram reveladas utilizando o anti-soro acima mencionado criado contra GCL-1 isolado por cromatofocalização. As culturas bacterianas representativas assim analisadas e que expressaram a GCL-1 são apresentadas na FIGURA 5·

A mobilidade aparente da GCL-1 expressa em E.coli corresponde a um peso molecular relativo que é ligeiramente superior ao da lectina isolada directamente de extractos de culturas de N.g.. Crê-se que o meio de expressão no hospedeiro E.coli não processa e cliva uma sequência principal da proteína expressada, resultando assim um produto de proteína relativamente grande tal como encontrado no hospedeiro de origem, isto é N. g··

Estas culturas representativas foram ainda analisadas para determinar o tamanho aproximado da inserção de ADII exprimindo a GCL-1 contido dentro do vector plasmídeo residente por técnicas bem conhecidas, incluindo digestão por enzima de restrição com a enzima ITot I. Detectaram-se inserções com tamanho de cerca de 2,8 a cerca de 4,0 quilobases (kb).

Dos dados observados pode inferir-se a presença de numerosas características da sequência estrutural dos vectores plasmídeos não cromossómicos produzidos dado que a natureza geral dessas sequências estruturais é bem conhecida da técnica. Ver, por exemplo, Lewin, Genes, John Wiley â Sons, Ltd., New York., N.Y. (1983)· Mais especificamente as proteínas bacterianas procarióticas são colineares com a sua sequência nucleó tida conhecida sem quaisquer das interrupções encontradas em

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EPG: 11-SCRl·¹

102.1

eucariotas como por exemplo sequências intervenientes, não-codificadoras (isto é, intrões). Assim, pode fazer-se uma estimativa aproximada do número de pares de base nucleótidos que codificam para GCL-1 directamente a partir do peso molecular aparente da lectina resolviua com SDS-PAGE utilizando os factores de conversão de cerca de 110 daltons por resíduo de aminoácido e três pares bases nucleótidos por resíduo de aminoáci do. Por esta conversão a GCL-1, com um tamanho de cerca de 22 400 daltons, contém cerca de 204 aminoácidos e é codificada por cerca de 612 pares de bases nucleótidos.

A expressão de genes em bactérias depende dos sinais de partida e de paragem para a transcrição e tradução. Esses sinais são também designados por sinais de regulação da expressão dado que são sinais contidos na sequência que regula a expressão da sequência codificadora da proteína. Dado que estes sinais não estão presentes à volta do centro de clonação BaraHI do vector plasmideo pHSSó, estas sequências são obtidas pela inserção de ADN nas suas localizações habituais ou próximo dos terminais da porção que codifica para GCL-1. Assim, os fragmentos de ADN inserido incluem uma região de codificação bem como sinais reguladores da expressão operativamente ligados a montante e a jusante (flanco) como adequado para a região co dificadora para a expressão da lectina bacteriana, que são estranhos ao hospedeiro biológico para a inserção de ADI'T.

A presença de um p/ptido principal que é habitual para as proteínas associadas com membranas ou para proteínas a serem segregadas, é evidenciada pelo peso molecular aparente ligeiramente superior da GCL-1 quando expressa em E.coli em vez de no seu hospedeiro biológico natural.

Em adição, uma componente específica dos sinais reguladores de expressão é o promotor que é necessário para iniciar a transcrição do gene aa GCL-1. Esta sequência promotora é normalmente localizada em 5¹ relação ao início da sequência cofificadora. Lado que a sequência promotora foi caracterizada noutros genes bacterianos, crê-se também que o promotor da GCL-1 está ligado relativamente próximo a e localizado dentro dos 100 pares de bases nucleótidos em relação à sequência

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EPG: 11-SCRF

102.1

principal na extremidaue 5' da sequência codificadora.

Deste modo, enquanto as inserções do gene de GCL-1 repre· sentativos caracterizados acima têm uma gama de dimensões de cerca de 2,8 a cerca de 4,0 Kb, e compreendem uma sequência codificadora que codifica para uma proteína lectina com cerca de 22 400 daltons, essas inserções podem ser muito maiores, isto é, da ordem de 10 kb preferivelmente cerca de 6 kb. Pode estar presente uma sequência principal,sinais de inicio e paragem adequados incluindo um promotor, e várias quantidades de sequência de flanco supérfluas adicionais localizadas em cada um ou em ambos os extremos do gene em adição ao próprio gene da GCL-1 dos fragmentos de ADN clonados e isolados contemplados pela presente invenção.

A um isolado de E.coli representativo contendo o plasmídeo pHSSó como vector de expressão com um gene da GCL-1 nela inserido, e que expressava GCL-1 como se mostra na FIGURA 5? foi dada a designação de pGCL-1 para fins de referência. Esta cultura bacteriana foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Líaryland com o Número de Acesso 67 198.

depósito foi efectuado de acordo com os requisitos do Tratado de Budapeste de a duração do depósito ser de 3θ anos a partir da data de depósito ou de 5 anos a partir do último pedido de depósito no depositário ou ser da mesma duração do tempo de validade de uma patente norte-americana que provém deste pedido, escolhendo-se o período que for mais longo.

As células contendo plasmideo recombinante serão substituídas se se tornarem não viáveis no depositário.

Deste modo, a presente invenção, num aspecto, contempla um fragmento de ADN quer isolado quer na forma de fragmento de ADN replicável num hospedeiro biológico, mas estranho a esse hospedeiro, fragmento que codifica para uma lectina bacteriana como acima caracterizada. Este fragmento de AD1T pode incluir os sinais reguladores para a expressão da lectina bacteriana contemplada operativamente ligada à região de codificação para essa lectina presente no fragmento de ADN. Embora estes sinais

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EPG; 11-SCRF

102.1

-37· reguladores de expressão sejam estranhos ao hospedeiro biológico, os sinais são reconhecidos pelo hospedeiro. Numa concre tização preferida deste aspecto particular da presente invenção, a região de codificação é a região de codificação de ocorrência natural para a lectina presente em N.g. para essa lecti na. Mais preferivelmente os sinais de regulação de expressão ou as sequências de pares de bases de sinal que estão presentes no fragmento de ADN são os sinais reguladores de expressão da N.g. de ocorrência natural associados com a região de codificação da N.g. para a lectina.

A região de codificação para a lectina bacteriana contem piada nesta invenção não contém mais do que cerca de 650 pares de base e está associada com regiões de flanco que estão ligadas a ela em ambas as extremidades. As regiões de flanco juntamente com a região de codificação não contêm mais do que cer ca de 10 kb de pares preferivelmente não mais do que cerca de 6 kb de pares.

Um processo adicional da presente invenção contempla um processo de produção de uma lectina bacteriana utilizando os passos de cultivar-se em condições adequadas uma cultura bacte riana que compreende bactérias que contêm um vector plasmídeo não-cromossómico como descrito acima para propagação de ADN no meio de transcrição-tradução e em seguida recolher-se a lectina bacteriana expressa da cultura utilizando técnicas de colheita de proteínas bem conhecidas.

A especificação anterior, incluindo as realizações especificas, pretende ser ilustrativa da presente invenção e não deve tomar-se como limitativa. Podem efectuar-se várias outras variações e modificações sem se desviar do verdadeiro espirito e âmbito da presente invenção.

Claims (17)

1. l^â. - Processo de preparação de uma lectina bacteriana caracterizado por compreender os seguintes passos:

   (1) cultivar uma cultura bacteriana compreendendo bactérias que contêm um vector plasmídeo não-cromossómico para propagação de ADN num meio de transcrição-tradução, contendo o vector um fragmento de ADN susceptível de expressar a lectina bacteriana operativamente ligada a sequências de pares de base que regulam a replicaçao ou expressão do referido fragmen to de ADIT em condições de cultura adequadas para se expressar a lectina bacteriana na referida cultura, e (2) colher-se da cultura bacteriana a lectina bacteriana expressa.
2. 2^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido fragmento de ADIT possuir uma região de codificação para a referida lectina não superior a cerca de 6^0 pares de bases e regiões de flanco ligadas a elas e não contendo, juntamente com a referida região de codificação, mais do que cerca de 10 kpares de bases.
3. 3^â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o fragmento de ADN isolado não conter mais do que cerca de ókpares de bases.
4. 4^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 e 2, no qual a cultura bacteriana compreende bactérias que contêm o vector plasmídeo anteriormente referido e um meio adequado para a expressão da lectina codificada pelo fragmento de ADN contido naquele.
5. 5'^a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, na qual a cultura bacteriana é identificada pelo Número de Acesso ATCC 67198.
6. 6^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a lectina bacteriana isolada, obtenível de gonococos possuir um peso molecular relativo de cerca de 22 400 daltons, determinado pela electroforese de dodecil sulfato de só66 374

   EPG: 11-SCRF

   102.1

   -39dio-gel de poliacrilamida e um valor de pH isoelêctrico na gama de cerca de 6,1 a cerca de 6,4; possuindo a referida lectina a capacidade de ligar especificamente a gangliotetraosilceramida.
7. 7^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se obter a lectina bacteriana na forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

   gs, _ Processo de preparação de uma composição para inoculação, caracterizado por se associar a lectina bacteriana preparada de acordo com a reivindicação 1, com um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. 9^a. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a composição para inoculação estar sob a forma de dosagem unitária, na qual a lectina está presente numa quantidade de cerca de 10 jig a cerca de 5θθ nig.
9. 10^a. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a composição pai.a inoculação estar sob a forma de dosagem unitária, na qual a lectina está presente numa quantidade de cerca de 100 jig a cerca de 500 mg.
10. 11^a. - Processo para a determinação da presença de lectina GCL-1 numa amostra de corpo humano caracterizado por compreender os seguintes passos:

    (a) obter uma amostra cie corpo humano;

    (b) combinar a amostra de corpo obtida cora anticorpos a GCL-1 de modo a formar-se uma mistura de imunorreaçção;

    (c) manter a mistura de imunorreaçção em condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para que os anticorpos anti-GCL-1 se liguem a qualquer GCL-1 presente na referida amostra de corpo, formando-se assim um imunorreagente; e (d) analisar a mistura mantida para a determinação da presença do imunorreagente.
11. 12^a. - Processo para a determinação da presença de anticorpos anti-GCL-1 numa amostra de corpo humano, caracterizado

    66 374

    EPG: 11-SCRF

    102.1 por compreender os seguintes passos:

    (a) obter uma amostra de corpo humano·, (b) combinar a amostra obtida do corpo com uma alíquota de lectina bacteriana isolada, da reivindicação 6, de modo a formar-se uma mistura de imunorreacção;

    (c) manter a mistura formada em condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para a lectina bacteriana isolada se ligar a anticorpos anti-GCL-1 presentes na referida amostra de corpo, obtendo-se assim um imunorreagenteje (d) analisar a mistura obtida para a determinação da pre sença do imunorreagente.
12. 13^a. - Processo de preparação de um conjunto para diagnóstico adequado para determinar a lectina GCL-1 de Neisseria gonorrhoeae, caracterizado por se combinarem: (a) anticorpos à lectina GCL-1 tal como definida na reivindicação 6 com (b) meios indicadores susceptiveis de assinalar uma imunorreacção dos referidos anticorpos com a referida lectina GCL-1.
13. 14^a. - Processo de preparação de um conjunto para ensaio de diagnóstico adequado para a determinação de anticorpos anti-GCL-1 numa amostra de corpo, caracterizado por se combinarem: (a) a lectina bacteriana isolada tal como definida na reivindicação 6 com (b) meios indicadores susceptiveis de assinalar uma imunorreacção dos referidos anticorpos com a lectina.
14. 15^a. - Hospedeiro biológico possuindo um fragmento de ADN replicável que tem uma região ue codificação que codifica a lectina bacteriana da reivindicação 6, sendo o fragmento de ADTT estranho ao referido hospedeiro biológico.
15. 16^a. - Hospedeiro biológico de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido fragmento de ADH incluir ainda sinais reguladores para a expressão da referida lectina que flanqueia a referida região de codificação, sendo os referidos sinais reguladores de expressão reconhecidos pelo referido hospedeiro biológico mas sendo estranhos ao referido

    -41·

    66 374

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    102.1 hospedeiro biológico.
16. 17^§. - Hospedeiro biológico ue acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a referida região codificadora ser a região codificadora de ocorrência natural de Neisseria gonor rhoeae para a referida lectina.
17. 18a. _ Hospedeiro biológico ue acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o referido fragmento de ADN incluir ainda, flanqueando a referida região de codificação de ocorrência natural, os sinais reguladores de expressão de Neisseria gonorrhoeae de ocorrência natural para a expressão da referida lectina.